MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: 29-38

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2015, 67: Porównanie metody Real-Time PCR i hodowli bakteryjnej w laboratoryjnej diagnostyce rzeżączki u pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego The Comparison of Real-Time PCR and bacterial culture in laboratory diagnostics of gonorrhoea in patients of Department of Dermatology and Venereology Medical University of Warsaw Ewa Skulska 1, Beata Młynarczyk-Bonikowska 1, Szymon Walter de Walthoffen 2, Grażyna Młynarczyk 2, Magdalena Malejczyk 1, Sławomir Majewski 3 1 Zakład Diagnostyki Chorób Przenoszonych Drogą Płciową Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego 3 Klinika Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Rzeżączka należy do najczęstszych bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową. Celem pracy było porównanie metody Real Time PCR oraz hodowli bakteryjnej w laboratoryjnej diagnostyce zakażeń N. gonorhoeae. Zbadano materiał pochodzący od 93 pacjentów. Zgodne wyniki Real Time PCR i hodowli uzyskano w przypadku 85,9% wszystkich badanych próbek. W pozostałych przypadkach, przy dodatnich wynikach Real Time PCR uzyskiwano ujemne wyniki hodowli. Zgodne wyniki występowały częściej w przypadku próbek pochodzących od mężczyzn (96.8% zgodności) niż od kobiet (85% zgodności). W przypadku próbek uzyskanych od pacjentów po antybiotykoterapii wyniki Real Time PCR i hodowli były zgodne w 81%. Przeprowadzone badania wykazały, że metoda Real Time PCR jest czulsza od hodowli ale w niektórych przypadkach może być od niej mniej swoista. Słowa kluczowe: Neisseria gonorrhoeae, Real-Time PCR, hodowla, diagnostyka laboratoryjna ABSTRACT Introduction: Gonorrhoea is one of the most common sexually transmitted diseases in the world. Fast and effective laboratory diagnostics of the infection is very important. The aim

2 30 E. Skulska i inni Nr 1 of the study was to compare Real-Time PCR and bacterial culture in diagnostics of Neisseria gonorrhoeae infections in patients of Department of Dermatology and Venereology Medical University of Warsaw. Methods: The urethral, cervical, anal and pharyngeal specimens from 93 patients of Department of Dermatology and Venereology Medical University of Warsaw were examined by two methods. The bacterial culture was performed on chocolate agar plates with antibiotics in the 5% CO 2 atmosphere at 37 C. N. gonorrhoeae was identified by colony morphology, Gram stain and oxidase reaction, followed by carbohydrate utilization test. The DNA Bact Extra Pure Kit (Euroclone ) to isolate DNA was used. Real-Time PCR DUPLICα Real- Time Neisseria gonorrhoeae 2nd Generation Detection Kit (Euroclone ) was performed using Smart Cycler Dx. Results: In 85.9% of results of Real-Time PCR and culture were identical. The remaining 14.1% of samples were culture negative and PCR positive. The results of the Real-Time PCR and culture were more often concordant in the case of samples obtained from men (96.8%) than from woman (85%). In patients after treatment with antibiotics the concordance of the results obtained with these two methods was 81%. Conclusions: In laboratory diagnostics of N. gonorrhoeae infections, Real-Time PCR was more sensitive than the culture, but in some cases it was less specific. Key words: Neisseria gonorrhoeae, Real-Time PCR, isolation of bacteria, laboratory diagnosis WSTĘP Zakażenia N. gonorrhoeae należą do najczęściej występujących bakteryjnych chorób przenoszonych drogą płciową. Według danych WHO liczba przypadków rzeżączki na świecie rośnie i w 2008 roku zrównała się z liczbą zakażeń Chlamydia trachomatis (odpowiednio 106 i 105 milionów nowych przypadków) (19). W Europie wciąż częściej występują infekcje C. trachomatis. W 2012 roku, średnio w 25 krajach UE notowano na 100 tysięcy mieszkańców 199 przypadków zakażeń C. trachomatis, natomiast tylko 13 przypadków zakażeń N. gonorrhoeae (6). Badania przeprowadzone we Francji u bezobjawowych, seksualnie aktywnych osób poniżej 30 roku życia, wykazały, że 0,36% spośród nich było zakażonych rzeżączką (5). W Polsce w 2013 roku, zachorowalność na rzeżączkę wg Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny, wynosiła 1,17 na 100 tys. mieszkańców (wwww.pzh.gov.pl/page/index.php?id=8). Jednak dane dotyczące Polski nie są w pełni wiarygodne, ze względu na brak diagnostyki przesiewowej i brak zgłaszania wszystkich leczonych przypadków. Zakażenie N. gonorrhoeae wiąże się z ryzykiem groźnych powikłań, w tym bezpłodności i zwiększonej liczby ciąż pozamacicznych. Ciężkie zapalenie spojówek u zakażonych okołoporodowo noworodków może grozić utratą wzroku. Dlatego, tak ważne jest szybkie rozpoznanie i leczenie infekcji (7). Pierwszymi metodami używanymi w diagnostyce zakażeń N. gonorrhoeae były: ocena preparatu mikroskopowego wydzieliny z cewki moczowej (Neisser 1879) oraz izolacja

3 Nr 1 Real-Time PCR i hodowla bakteryjna w diagnostyce rzeżączki 31 zarazka metodą hodowli bakterii (Leistikow i Loeffler 1882). Przez wiele lat hodowla była złotym standardem w laboratoryjnej diagnostyce rzeżączki. Pojawienie się metod opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych (nucleic acid amplification tests, NAAT) było swego rodzaju rewolucją w diagnostyce chorób zakaźnych, w tym chorób przenoszonych drogą płciową. Obecnie CDC (Centersfor Disease Control and Prevention, USA) w diagnostyce rzeżączki na pierwszym miejscu zaleca NAAT, w tym Real-Time PCR, dopuszczając jednak możliwość używania hodowli. Jako metody niezalecane wymienione są metody inne niż NAAT i hodowla. Podkreślana jest konieczność zachowania metody opartej na hodowli przez laboratoria w przypadku podejrzenia niepowodzenia w leczeniu rzeżączki, ze względu na możliwość oznaczenia wrażliwości na antybiotyki. Według zaleceń CDC dodatni wynik uzyskany jedną metodą jest wystarczająco wiarygodny i nie ma konieczności wykonywania testu potwierdzającego, który podwyższałby koszty badania nie mając znaczącego wpływu na swoistość (14, 16). IUSTI (The International Union against Sexually Transmitted Infections) również zaleca w diagnostyce rzeżączki NAAT lub hodowlę, podkreślając, że w przypadku podejrzenia niepowodzenia w leczeniu lepszą metodą jest hodowla (możliwość zbadania wrażliwości bakterii na antybiotyki), a w przypadkach bezobjawowych oraz gdy konieczny jest transport materiału do laboratorium zalecane jest wykonanie NAAT. Wykonanie testu potwierdzającego, przy dodatnim wyniku NAAT jest zalecane gdy PPV (positive predictive value, pozytywna wartość predykcji) dla danej populacji i stosowanego testu wynosi poniżej 90%. Taka sytuacja występuje rzadko i może mieć miejsce w przypadku stosowania testu o stosunkowo niskiej swoistości, małej liczby przypadków rzeżączki w badanej populacji oraz próbek pobranych z gardła lub odbytu (2). Celem przeprowadzonych badań było porównanie efektywności metody opartej na hodowli z metodą Real-Time PCR, w laboratoryjnej diagnostyce rzeżączki u chorych zgłaszających się do Poradni przy Klinice Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego MATERIAŁ I METODY Badano materiał pochodzący z wymazów z cewki moczowej, szyjki macicy, gardła lub odbytu pobrany od 92 pacjentów Kliniki Dermatologii i Wenerologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Spośród tych pacjentów, 22 osoby zgłosiły się na badanie kontrolne po antybiotykoterapii. Wśród wcześniej nieleczonych pozostałych 70 pacjentów, 47 miało objawy mogące sugerować zakażenie N. gonorrhoeae (wyciek, pieczenie lub dyskomfort w cewce moczowej, ból gardła, ból lub wydzielina zapalna z okolicy odbytu, u kobiet upławy, pobolewanie w dole brzucha), 8 osób nie miało objawów ale zgłaszało ekspozycję na zakażenie, a 15 ani nie wykazywało objawów ani nie miało kontaktów seksualnych z osobami chorymi. Materiał do posiewu pobierano za pomocą ez jednorazowego użytku (cewka moczowa, szyjka macicy) lub wymazówek bawełnianych (odbyt, gardło). Posiew wykonywano bezpośrednio po pobraniu materiału. Bakterie hodowano na agarze czekoladowym z antybiotykami (biomérieux), w atmosferze zawierającej 5% CO 2, w temperaturze 37 C i identyfikowano

4 32 E. Skulska i inni Nr 1 na podstawie morfologii kolonii, morfologii komórek w preparatach mikroskopowych barwionych metodą Grama, wyników testu oksydazowego, oraz testu fermentacji cukrów (API NH, biomérieux). Materiał do Real-Time PCR pobierano za pomocą wymazówek transportowych Transystem firmy Copan Italia S.p.A. i przechowywano w temperaturze 5-8 o C maksymalnie przez 24 godz. Do izolacji DNA użyto zestawu DNA Bact Extra Pure Kit firmy Euroclone. Procedurę przeprowadzono przestrzegając metodyki zalecanej przez producenta. Uzyskane DNA było przechowywane w temperaturze 20 o C. Amplifikację przeprowadzano na termocyklerze Smart Cycler Dx, używając komercyjnego zestawu amplifikacyjnego DUPLICα RealTime Neisseria gonorrhoeae 2nd Generation Detection Kit (Euroclone ) zgodnie z zaleceniami producenta. Startery i sonda użyte do badań w kierunku N. gonorrhoeae służą do wykrywania sekwencji DNA w obrębie plazmidu pjd1 i genu 16S rrna. Dokładna sekwencja starterów oraz sond oraz dokładne miejsce ich przyłączenia stanowią tajemnicę firmy. Sonda typu TaqMan używana do wykrycia N. gonorrhoeae została wyznakowana fluorochromem typu FAM (6-carboxy-fluorescein) a sonda wykorzystywana w kontroli wewnętrznej fluorochromem typu HEX (hexachloro-6-carboxyfluorescein). Jako wygaszacza użyto BHQ-1. WYNIKI Wyniki uzyskane dla poszczególnych grup pacjentów przedstawiono szczegółowo w tabelach I i II. Ogółem dla wszystkich badanych prób, w 85,1%, uzyskano zgodność wyników przy zastosowaniu obu metod. W przypadku próbek pochodzących od 70 osób nieleczonych, zgodność ta była wyższa i wynosiła 87,1% wyników identycznych w przypadku Real-Time PCR i hodowli. We wszystkich przypadkach niezgodności, wyniki hodowli były ujemne, a Real-Time PCR dodatnie (tabela I). Dla 22 osobowej grupy osób po leczeniu, zgodne wyniki uzyskano w przypadku 81,82% wszystkich próbek, w pozostałych przypadkach dodatni był tylko wynik Real-Time PCR (tabela I). Wyniki hodowli i PCR były zgodne częściej dla próbek materiału pochodzącego od mężczyzn (96,9%) niż od kobiet (85%) (tabela II). Dokonano również analizy wyników otrzymanych na podstawie barwienia rozmazów wykonanych z wydzieliny z cewki moczowej oraz osobnej analizy wyników uzyskanych z badania materiału pochodzącego z lokalizacji pozagenitalnych. Tylko u 8 z badanych 47 pacjentów z objawami, stwierdzono dwoinki rzeżączki w preparacie mikroskopowym, wykonanym z wydzieliny z cewki moczowej. W przypadku 6 spośród tych pacjentów uzyskano dodatnie wyniki badania zarówno metodą Real-Time PCR jak i posiewu. W przypadku jednego z pozostałych dwóch chorych, uzyskano dodatni wynik Real-Time PCR, a ujemny wynik hodowli. Pacjent ten zgłosił się do poradni następnego dnia po przyjęciu antybiotyku (azytromycyny). W drugim przypadku, zarówno Real-Time PCR jak i posiew dawały ujemne wyniki, ale pacjent zgłaszał objawy sugerujące problemy urologiczne (hemospermia). W tym przypadku preparat zabarwiono tylko błękitem metylenowym i nie można wykluczyć fałszywie dodatniego wyniku preparatu z powodu innej infekcji, w tym bakteriami Gram-dodatnimi. Wśród 11 wymazów uzyskanych z lokalizacji pozagenitalnych, siedem pochodziło z gardła, a cztery z odbytu. Wśród czterech wymazów z gardła, pozytywne wyniki uzy-

5 Nr 1 Real-Time PCR i hodowla bakteryjna w diagnostyce rzeżączki 33 Tabela I. Porównanie wyników posiewu w kierunku N. gonorrhoeae z wynikami metody Real-Time PCR, w poszczególnych grupach pacjentów. Wynik Liczba prób (%) Wyniki zgodne (%) % wyników zgodnych w obrębie wyników dodatnich PCR Pacjenci objawowi Łącznie 47 (100) 40 (85,1) 41,7 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 35 (74,5) 35 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 5 (10,6) 5 (100) 100 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 7 (14,9) 0 (0) 0 Kontakty Łącznie 8 (100) 6 (75) 60,0 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 3 (37,5) 3 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 3 (37,5) 3 (100) 100,0 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 2 (25,0) 0 (0) 0 Pacjenci po leczeniu Łącznie 22 (100) 18 (81,0) 50,0 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 14 (63,6) 14 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 4 (18,2) 4 (100) 100 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 4 (18,2) 0 (0) 0 Wszyscy pacjenci, z wyłączeniem grupy po leczeniu Łącznie 70 (100) 61 (87,1) 47,1 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 53 (75,7) 53 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 8 (11,40) 8 (100) 100 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 9 (12,9) 0 (0) 0 Pacjenci bezobjawowi, nie kontakty, nieleczeni (grupa kontrolna) Łącznie 15 (100) 15 (100) 0 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 15 (100) 15 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 0 (0) 0 (0) 0 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 0 (0) 0 (0) 0 Wszyscy badani Łącznie 92 (100) 79 (85,9) 48,0 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 67 (72,8) 67 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 12 (13,1) 12 (100) 100 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 13 (14,1) 0 (0) 0 Objaśnienia: (+) wynik dodatni, (-) wynik ujemny

6 34 E. Skulska i inni Nr 1 Tabela II. Porównanie wyników Real-Time PCR i posiewu w kierunku rzeżączki zależnie od płci pacjentów Wynik Wyniki % wyników zgodnych Liczba prób zgodne w obrębie wyników dodatnich (%) (%) PCR Mężczyźni Łącznie 71 (100) 61 (85,9) 52,4 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 50 (70,4) 50 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 11 (15,5) 11 (100) 100 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 10 (14,1) 0 (0) 0 Kobiety Łącznie 21 (100) 17 (81,0) 0 Posiew (-)/Real-Time PCR (-) 17 (81,0) 17 (100) 0 Posiew (+)/Real-Time PCR (+) 0 (0) 0 (0) 0 Posiew (-)/Real-Time PCR (+) 4 (19,0) 0 (0) 0 Objaśnienia: (+) wynik dodatni, (-) wynik ujemny skano w przypadku dwóch. W jednym przypadku uzyskano wyniki dodatnie przy użyciu obu metod, a w drugim stwierdzono dodatni Real-Time PCR, a ujemny posiew. Z czterech próbek pobranych z odbytu, w przypadku dwóch uzyskano wyniki dodatnie, a w przypadku dwóch ujemne, przy zgodności wyników obu metod. U osób z grupy, w której osoby nie pochodziły z kontaktów, nie występowały u nich objawy sugerujące rzeżączkę i nie były leczone, (grupa kontrolna) nie uzyskano dodatnich wyników żadną ze stosowanych metod. DYSKUSJA W wielu krajach przeprowadzano badania porównujące NAAT i hodowlę. Wyniki mogły znacznie się różnić, zależnie od badanej grupy, materiału, częstości występowania rzeżączki w danej populacji, rodzaju wykonywanego NAAT i innych czynników. W Indiach, wykonywano posiewy i badanie PCR w kierunku zakażenia N. gonorrhoeae z wymazów z szyjki macicy od 250 kobiet, z upławami lub bólem w dole brzucha. Posiew był dodatni tylko w jednym przypadku, a PCR aż w 17 przypadkach (17). W Bułgarii, metodami PCR (test opracowany przez laboratorium wykonujące badanie) i hodowli w kierunku rzeżączki, zbadano 617 próbek różnego materiału, pochodzącego od objawowych i bezobjawowych pacjentów, w tym 96 mężczyzn i 521 kobiet. Dodatni wynik PCR stwierdzono w przypadku sześciu próbek od mężczyzn i ośmiu od kobiet, z czego dla 12 spośród tych przypadków dodatni był również posiew (13). W Bangladeszu zbadano wymazy z cewki moczowej od 183 pacjentów z objawami urethritis. U 27,57% znaleziono dwoinki rzeżączki w preparacie mikroskopowym, posiew był dodatni u 26,49%, a za pomocą opracowanego we własnym zakresie przez laboratorium testu Multiplex PCR Ng, stwierdzono zakażenie u 30,27% (11). W kolejnym badaniu, przeprowadzonym w USA zestawiono wyniki testów w kierunku rzeżączki z materiału z okolic pozagenitalnych (gardło, odbyt) u mężczyzn wykonane w 2010

7 Nr 1 Real-Time PCR i hodowla bakteryjna w diagnostyce rzeżączki 35 metodą hodowli i w 2011, zgodnie z nowymi zaleceniami CDC, z użyciem NAAT (Aptima- Combo2). Wykazano, że w 2011 roku wykryto o 8% więcej infekcji odbytu i o 12% więcej infekcji gardła niż w roku poprzednim, co może świadczyć o wyższej czułości NAAT (1). Wieloośrodkowe badanie w wielkiej Brytanii wykazało, że posiew w kierunku rzeżączki był dodatni w przypadku 47% z 3076 próbek w których NAAT były dodatnie. Dodatni posiew częściej współistniał z dodatnim wynikiem PCR u heteroseksualnych mężczyzn niż u kobiet i MSM (Men who have sex with men) (12). Uzyskana w powyższym badaniu zgodność wyników dodatnich była zbliżona do zbiorczych wyników uzyskanych w naszym ośrodku (48%). W innych badaniach przeprowadzonych w Wielkiej Brytanii, obejmujących 251 mężczyzn i 105 kobiet z rzeżączką, porównano NAAT Aptima Combo 2 (AC2) wykrywający N. gonorrhoeae i C. trachomatis z hodowlą w odniesieniu do Aptima GC, wykrywającego tylko zakażenie N. gonorrhoeae. Czułość metod AC2 i hodowli była najwyższa w przypadku badania wymazu z cewki moczowej u mężczyzn z objawami i wynosiła odpowiednio 99% i 79%. U bezobjawowych mężczyzn w tym samym badaniu, czułość wynosiła 94% i 29%, odpowiednio dla AC2 i posiewu. W wymazach z odbytu, czułość AC2 i posiewu wynosiły odpowiednio 91% i 55% u mężczyzn objawowych i 75% i 44% u bezobjawowych. U kobiet, czułość AC2 wyniosła 100%, a hodowli odpowiednio 53% i 47%, dla pacjentek objawowych i bezobjawowych (9). Testy oparte na poszukiwaniu kwasów nukleinowych mogą różnić się czułością i swoistością. W Australii porównano czułość i swoistość sześciu komercyjnie dostępnych NAAT: Gen-Probe APTIMA COMBO 2, APTIMA GC, Roche COBAS Amplicor CT/NG, COBAS 4800 CT/NG testy, BD ProbeTec GC Qx amplified DNA assay i Abbott Real-Time CT/NG. Testów użyto do zbadania 450 izolatów, w tym 234 dwoinek rzeżączki, a pozostałe z innych gatunków należących do rodzaju Neisseria lub innych zbliżonych genetycznie bakterii. Niemal wszystkie testy odznaczały się 100% czułością (w przypadku COBAS Amplicor CT/NG wynosiła ona 98,1%). Wszystkie testy dawały pewien odsetek wyników fałszywie dodatnich, w przypadku badania izolatów innych niż dwoinki rzeżączki. Odsetek ten wynosił odpowiednio 14,1%, 11%, 2,1%, 1,7%, 1% i 1% dla COBAS Amplicor, ProbeTec, APTIMA COMBO 2, APTIMA GC, Abbott Real-Time i Roche COBAS Autorzy pracy zalecali wykonanie testu potwierdzającego w przypadku wykrycia N. gonorrhoeae metodami opartymi na amplifikacji kwasów nukleinowych, szczególnie jeśli próbki pobrano z gardła (duże prawdopodobieństwo występowania innych gatunków należących do rodzaju Neisseria) (18). W Chinach porównano wyniki uzyskane przy użyciu testów Abbott Real-Time CT/NG i Roche Cobas Amplicor CT/NG assay. Czułość i swoistość tego pierwszego testu wynosiła odpowiednio 95,45% i 99,90%, a PPV (Positive predictive value) 95,5% (8). Inne badania dotyczące 188 izolatów N. gonorrhoeae z Walii wykazały swoistość Roche Cobas 4800 NG 99,7% oraz PPV 96% dla próbek pochodzących z okolicy urogenitalnej, 96,4% z okolicy odbytu i 88,6% z gardła. Oznacza to, że powyższe testy (być może poza próbkami z gardła) są wystarczająco swoiste i nie wymagają potwierdzenia (15). W Nowej Zelandii uzyskano zbliżone wyniki, (czułość - 98,7%, swoistość - 100%, PPV - 95,6% z okolicy urogenitalnej i odpowiednio - 100%, 99,8%, 92,9% z okolicy pozagenitalnej) w badaniach próbek z okolicy genitalnej i 666 z pozagenitalnej, przy użyciu Roche Cobas 4800 NG. Ponadto, stwierdzono, że powyższy test wykrył o 33% więcej przypadków rzeżączki w próbkach z okolicy urogenitalnej i o 30% więcej w wymazach z odbytu niż równolegle wykonywana hodowla (4).

8 36 E. Skulska i inni Nr 1 W Australii zbadano wymazy od pacjentów po 7 i 14 dniach po leczeniu rzeżączki zlokalizowanej w gardle lub odbycie. W przypadku materiału z gardła, po 7 dniach utrzymywały sie dodatnie wyniki u 13% badanych, a po 14 dniach już tylko u 8%. Może to świadczyć o pozostawaniu w niektórych przypadkach materiału genetycznego jeszcze 7 dni po leczeniu. Dodatnie wyniki po 14 dniach interpretowano jako niepowodzenie w leczeniu lub o reinfekcję (3). Inne badania dotyczące wymazów z pochwy od kobiet leczonych z powodu różnych zakażeń w tym rzeżączki, również wykazały, że DNA patogenów może utrzymywać się względnie długo po leczeniu. W przypadku rzeżączki, ujemny wynik pojawiał się średnio po 6 dniach, jednak autorzy sugerowali, że najlepiej kontrolne badanie wykonywać około 3 tygodnie po leczeniu (20). Według zaleceń IUSTI, badanie kontrolne metodą NAAT, należy wykonywać ok 2 tygodnie po leczeniu. Pacjenci Poradni Kliniki Dermatologii Wenerologii, na pierwsze badanie kontrolne zgłaszali się zwykle 3-7 dni od zakończenia leczenia, dlatego istniała potencjalna możliwość utrzymywania się u części z nich materiału genetycznego dwoinek rzeżączki. Posiew w kierunku N. gonorrhoeae, jest czułą metodę diagnostyczną, ale do możliwych przyczyn obniżenia jej czułości należą: zbyt mała ilość materiału (zakażenie bezobjawowe, okres wylęgania, materiał z cewki moczowej pobrany bezpośrednio po oddaniu moczu), nieprawidłowe pobranie materiału (np. z pochwy a nie z szyjki macicy u kobiet), problemy z transportem materiału (np. zbyt długi odstęp czasu między posiewem materiału na podłoże, a umieszczeniem go w cieplarce). Hodowla jest metodą wysoce swoistą, chociaż opisywano sporadyczne przypadki błędnej identyfikacji bakterii, wynikające głównie z błędów laboratoryjnych (2, 14, 16). Można wymienić kilka możliwych przyczyn zmniejszonej swoistości metod opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych. Jedną z ważniejszych są reakcje krzyżowe z DNA innych drobnoustrojów. W przypadku wielu testów komercyjnych używanych w diagnostyce N. gonorrhoeae stwierdzono mniejszy lub większy odsetek wyników fałszywie dodatnich. Dotyczyły one głównie wymazów z gardła i wynikały najczęściej z reakcji krzyżowych z innymi gatunkami z rodzaju Neisseria. Swoistość NAAT może być również znacznie zmniejszona przez kontaminację. W przypadku osób po leczeniu przyczyną fałszywie dodatnich NAAT mogło być utrzymywanie się DNA N. gonorrhoeae w organizmie pacjenta przez pewien czas po skutecznym leczeniu (2, 14,16, 18). Znacznie rzadziej występują fałszywie ujemne wyniki NAAT. Jedną z przyczyn mogą być mutacje w poszukiwanych fragmentach bakteryjnego genomu. Opisano przypadek fałszywie ujemnego wyniku PCR, którego przyczyną była ewolucja wysoce konserwatywnego pseudogenu pora, będącego częstym miejscem docelowym starterów i sond stosowanych w reakcji (10). Coraz więcej NAAT obecnie używanych w diagnostyce rzeżączki, poszukuje fragmentów w obrębie więcej niż jednego genu N. gonorrhoeae, co w dużym stopniu eliminuje ten problem. W podsumowaniu, ze względu na możliwość oznaczania wrażliwości na antybiotyki oraz w niektórych przypadkach nieco wyższą swoistość hodowli, a jednocześnie wyższą czułość NAAT, optymalne byłoby równoczesne stosowanie obu metod. Jednak z przyczyn technicznych i finansowych często jest to niemożliwe.

9 Nr 1 Real-Time PCR i hodowla bakteryjna w diagnostyce rzeżączki 37 PIŚMIENNICTWO 1. Barbee LA, Dombrowski JC, Kerani R, Golden MR. Effect of nucleic acid amplification testing on detection of extragenital gonorrhea and chlamydial infections in men who have sex with men sexually transmitted disease clinic patients. Sex Transm Dis 2014; 41: Bignell C, Unemo M. European STI Guidelines Editorial Board.2012 European guideline on the diagnosis and treatment of gonorrhoea in adults. Int J STD AIDS 2013; 24: Bissessor M, Whiley DM, Fairley CK i inni. Persistence of Neisseria gonorrhoeae DNA following treatment for pharyngeal and rectal gonorrhea is influenced by antibiotic susceptibility and reinfection. Clin Infect Dis 2015; 60: Bromhead C, Miller A, Jones M, WhileyD. Comparison of the cobas 4800 CT/NG test with culture for detecting Neisseria gonorrhoeae in genital and nongenital specimens in a low-prevalence population in New Zealand. J Clin Microbiol 2013; 51: Clarivet B, Picot E, Marchandin H i inni. Prevalence of Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and Mycoplasma genitalium in asymptomatic patients under 30 years of age screened in a French sexually transmitted infections clinic. Eur J Dermatol 2014; 24: European Centre for Disease Prevention and Control. Annual epidemiological report sexually transmitted infections, including HIV and blood-borne viruses. ECDC Stockholm Gaydos C, Hardick J. Point of care diagnostics for sexually transmitted infections: perspectives and advances. Expert Rev Anti Infect Ther 2014; 12: Han Y, Yin YP, Shi MQ i wsp. Evaluation of Abbott Real-Time CT/NG assay for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in cervical swabs from female sex workers in China. PLoS One 2014; 9: e Harryman L, Scofield S, Macleod J i inni. Comparative performance of culture using swabs transported in Amies medium and the Aptima Combo 2 nucleic acid amplification test in detection of Neisseria gonorrhoeae from genital and extra-genital sites: a retrospective study. Sex Transm Infect 2012; 88: Ison CA, Golparian D, Saunders P i inni. Evolution of Neisseria gonorrhoeae is a continuing challenge for molecular detection of gonorrhoea: false negative gonococcal pora mutants are spreading internationally. Sex Transm Infect 2013; 89: Jahan F, Shamsuzzaman SM, Akter S. Diagnosis of common bacterial causes of urethritis in men by Gram stain, culture and multiplex PCR. Malays J Pathol 2014; 36: Mohammed H, Ison CA, Obi C i inni. Frequency and correlates of culture-positive infection with Neisseria gonorrhoeae in England: a review of sentinel surveillance data. Sex Transm Infect 2014; doi: /sextrans Ouzounova-Raykova V, Jordanov D, El-Tibi M, Mitov I. Gonococcal infection in symptomatic and asymptomatic persons seeking medical clinics in Sofia--a 3-year study APMIS 2011; 119: Papp JR, Schachter J, Gaydos CA, Van Der Pol B. Recommendations for the laboratory-based detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae MMWR 2014; 63: Perry MD, Jones RN, Corden SA. Is confirmatory testing of Roche Cobas 4800 CT/NG test Neisseria gonorrhoeae positive samples required? Comparison of the Roche Cobas 4800 CT/NG test with an opa/pap duplex assay for the detection of N gonorrhoeae. Sex Transm Infect 2014; 90: Recommendations for the laboratory-based detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep 2014; 63: 1-19.

10 38 E. Skulska i inni Nr Sood S, Verma R, Mir SS i inni. Nucleic acid amplification tests (NAATs) for gonorrhoea diagnosis in women: experience of a tertiary care hospital in north India. Indian J Med Res 2014; 140: Tabrizi SN, Unemo M, Limnios AE i inni. Evaluation of six commercial nucleic acid amplification tests for detection of Neisseria gonorrhoeae and other Neisseria species. J ClinMicrobiol 2011; 49: WHO. Global incidence and prevalence of selected curable sexually transmitted infections World Health Organization 2012; Williams JA, Ofner S, Batteiger BE i inni. Duration of polymerase chain reaction-detectable DNA after treatment of Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, and Trichomonas vaginalis infections in women. Sex Transm Dis 2014; 41: Otrzymano: 19 III 2015 r Adres Autora: Warszawa, ul. Koszykowa 82a, Zakład Diagnostyki Chorób Przenoszonych Drogą Płciową Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego