Wpływ ekspresji antygenów HPA-15 płytek krwi na wykrywanie przeciwciał anty-hpa-15

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str HALINA MICHUR 1, KATARZYNA GUZ 1, KRYSTYNA MAŚLANKA 1, ANDRZEJ MISIAK 2, MAŁGORZATA UHRYNOWSKA 1, ANNA EJDUK 3, EWA BROJER 1 Wpływ ekspresji antygenów HPA-15 płytek krwi na wykrywanie przeciwciał anty-hpa-15 The HPA-15 antigen expression and its effect on the detection of anti-hpa-15 antibodies 1 Z Zakładu Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej, Instytutu Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Ewa Brojer 2 Z Kliniki Chirurgii Ogólnej i Hematologicznej Instytutu Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Kierownik: Doc. dr hab. med. Andrzej Szczepanik 3 Z Kliniki Hematologii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Krzysztof Warzocha STRESZCZENIE Układ antygenowy HPA-15 charakteryzuje się niską ekspresją antygenów na płytkach krwi. Wiadomo jednak, Ŝe antygeny HPA-15 mogą powodować alloimmunizację chorych po wielokrotnych przetoczeniach płytek oraz kobiet w wyniku konfliktu matczyno-plodowego. Ze względu na trudności związane z identyfikacją przeciwciał anty-hpa-15, w pracy zbadano poziom ekspresji antygenów HPA-15 u 33 dawców, w celu wyboru płytek z taką ekspresją, która umoŝliwi wykrywanie przeciwciał anty-hpa15. Zaobserwowano róŝną ekspresję antygenów HPA 15 na płytkach krwi. Wydzielono trzy grup dawców: 8-iu z wysoką 37.4 ± 7.68% FL (mediana 7,85), 22- ze średnią 19.5 ± 6.2% FL (mediana 5.75), 3-ch z niską 6.5 ± 5.9% FL (mediana 3,3). Stwierdzono, Ŝe płytki z wysoką ekspresją najbardziej nadawały się do wykrywania przeciwciał anty-hpa-15 w teście MAIPA. Przy ich uŝyciu wykryto przeciwciała anty-hpa-15 u 3 (2%) pacjentek na 146 zbadanych chorych po wielokrotnych przetoczeniach krwi. SŁOWA KLUCZOWE: Układ antygenowy HPA-15 (Gov) Ekspresja antygenów HPA-15 Wykrywanie przeciwciał anty-hpa-15 alloimmunizacja SUMMARY The HPA-15 (Gov) antigen system is characterized by a low antigen expression on platelets. Nevertheless, it could be implied in fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT), refractoriness to platelet transfusion and post transfusion purpura. Due to the difficulties with the identification of HPA-15 antibodies, we studied the level of the expression of the HPA-15 antigens in 33 healthy donors, with the aim to select platelets with an expression which enables the detection of anti-hpa-15 antibodies. Different expressions of the HPA-15 antigens on platelets were observed. Donors were therefore divided into three groups: 8 with high 37.4 ± 7.68% FL (median 7.85), 22 with medium 19.5 ± 6.2%FL (median 5.75) and 3 with low 6.5 ± 5.9% FL (median 3.3). It was found that platelets with a high expression were best suited for the de-

2 698 H. MICHUR i wsp. tection of HPA-15 antibodies in MAIPA. With those platelets, anti-hpa-15 antibodies were detected in 3 (2%) of 146 patients after multiple transfusions. KEY WORDS: HPA-15 (Gov) antigen system Expression of HPA-15 antigens HPA-15 antibodies detection alloimmunization WSTĘP Układ antygenowy HPA-15 (Gov) płytek krwi jest układem dwuallelicznym, zlokalizowanym na połączonej z kotwicą fosfatydyloinozytolową (GPI) glikoproteinie CD 109. Gen kodujący HPA-15 zajmuje obszar 127 kb i leŝy na chromosomie 6 (6q12-13). Jego allele HPA-15a i HPA-15b róŝnią się na poziomie DNA jednym nukleotydem w pozycji kodującej 2108, która przekłada się na zamianę aminokwasu w pozycji 682: Tyr682Ser [2, 5]. Znaczenie CD 109 nie jest do końca poznane, chociaŝ wiadomo, Ŝe jest on członkiem rodziny alfa 2-makroglobuliny α2m/c3,c4,c5, zawierającym tioester, który moŝe wskazywać na udział CD 109 w oddziaływaniach międzykomórkowych [7]. Antygeny HPA-15 mają niski poziom ekspresji na płytkach (około 2000±400 molekul/na płytkę aktywowaną trombiną) lecz, jak wskazują dane literaturowe, mogą powodować alloimmunizację pacjentów po wielokrotnych przetoczeniach płytek krwi, co prowadzi do odczynów poprzetoczeniowych oraz mogą być przyczyną konfliktu matczyno-płodowego [2, 3, 6]. Ze względu na trudności związane z identyfikacją przeciwciał skierowanych do układu antygenowego płytek HPA-15 celem obecnej pracy była ocena ekspresji tych antygenów na płytkach krwi u dawców i wybór płytek krwi o takiej ekspresji, która pozwoli na wykrywanie przeciwciał anty- HPA-15 u pacjentów. MATERIAŁ I METODY Poziom ekspresji antygenu HPA-15 oceniono u 33 zdrowych dawców, 9-ciu kobiet i 24-ech męŝczyzn, (średnia wieku 50,15 ± 8,87). Przeciwciała anty-hpa-15 zbadano w surowicach: a) 146 pacjentów, w tym 87 kobiet i 59 męŝczyzn (zakres wieku od 18 do 80 lat), wielokrotnych biorców płytek krwi, b) 232 kobiet (zakres wieku od 18 do 40 lat) z podejrzeniem konfliktu matczyno-płodowego w zakresie antygenów plytek krwi. Badania molekularne Antygeny HPA-15 badano na poziomie DNA metodą dyskryminacji alleli techniką Real-time PCR (TagMan) przy uŝyciu alleloswoistych sond znakowanych odmiennymi fluorochromami VIC i FAM. Badania serologiczne Poziom ekspresji antygenów HPA-15 badano metodą immunofluorescencyjną [1] w cytometrze przepływowym FACSCalibur (program CellquestTM Software, Becton

3 Wpływ ekspresji antygenów HPA Dickinson) stosując przeciwciało monoklonalne 15E10 (dar z National Blood Service Cambrige Centre). Ekspresję antygenu HPA-15 u wyselekcjonowanych dawców badano 3 4-krotnie. Średnie wartości ekspresji antygenów HPA-15 wyliczano z co najmniej trzech oznaczeń. Ocenę wpływu ekspresji antygenów HPA-15 u dawcy na wykrywanie przeciwciał anty-hpa-15 dokonano w teście MAIPA (Monoclonal Antibody Immobilization of Platelet Antigen) wg.kiefel i wsp. [4] przy uŝyciu surowic z przeciwciałami anty- HPA-15b i anty-hpa-15a. Wartość ekstynkcji (OD) 3 większa od OD kontroli ujemnej wskazywała na wykrycie przeciwciał anty-hpa 15 w badanej surowicy. W surowicach w których wykryto przeciwciała anty-hpa-15 oceniono takŝe przeciwciała anty-hla klasy I i II przy uŝyciu testu FlowPRA Screening test. Otrzymane wyniki badań poddano analizie statystycznej z zastosowaniem testu t-studenta dla zmiennych zaleŝnych. WYNIKI Ocena ekspresji antygenu HPA-15 u dawców Wyselekcjonowano grupę 33 dawców, homozygotycznych pod względem antygenów HPA-15: piętnastu HPA-15aa (4 kobiet i 11 męŝczyzn) i osiemnastu HPA-15bb (5 kobiet i 13 męŝczyzn). W związku ze zróŝnicowaną ekspresją antygenów HPA-15 (rozrzut Fl od 2,4% do 62,9%) wydzielono arbitralnie trzy grupy dawców z róŝną ekspresją HPA-15: 8-iu z wysoką 37,4 ± 7,68% FL; mediana 7,85, (1 kobieta i 7 męŝczyzn, wiek 51,71 ± 8.3), 22 ze średnią 19,5 ± 6,2% FL; mediana 5,75, (6 kobiet i 16 męŝczyzn, wiek 49,58 ± 10,72), 3-ch z niską 6,5 ± 5,9% FL; mediana 3,3, (2 kobiety i 1 męŝczyzna, wiek 44,6 ± 13,8) (Tabela 1). Tabela 1. Szczegółowe wyniki badań ekspresji antygenów HPA-15 u zdrowych dawców Table 1. Detailed results on the HPA-15 antigen expression in healthy donors Poziom ekspresji Liczba Lp. HPA-15 dawców Genotyp Mediana %FL 1 niska 1 HPA-15aa niska 2 HPA-15bb 3.77 ± ± 3.92 Ogółem 3 HPA-15aa/15bb 3.32 ± ± średnia 10 HPA-15aa 5.9 ± ± średnia 12 HPA-15bb 5.61 ± ± 4.96 Ogółem 22 HPA-15aa/15bb 5.75 ± ± wysoka 4 HPA-15aa 7.39 ± ± wysoka 4 HPA-15bb 8.31 ± ± Ogółem 8 HPA-15aa/15bb 7.85 ± ± 7.68

4 700 H. MICHUR i wsp. A) 9.09% B) 40.5% Ryc. 1. Histogramy cytometrycznego pomiaru ekspresji antygenów HPA-15: A) u dawcy z niską ekspresją, B) u dawcy z wysoką ekspresją antygenów. Fig. 1. Flow cytometric analysis of the HPA-15 expression in donors with: A) low expression of HPA-15 antigens, B) high expression of HPA-15 antigens. Rycina 1 ilustruje histogramy przykładowych dawców z wysoką i niską ekspresją antygenu HPA-15 ocenioną w teście immunofluorescencyjnym. Wyniki badań ekspresji antygenu HPA-15 u dawców i ich podział na osoby z niska, średnia i wysoka ekspresja, ilustruje rycina Poziom ekspresji antygenów HPA-15 (FL%) ± ± ± 5.9 Dawcy HPA-15aa Dawcy HPA-15bb Ryc. 2. Poziomy ekspresji antygenów HPA-15 u dawców homozygotycznych Fig. 2. The HPA-15 expression in homozygous blood donors

5 Wpływ ekspresji antygenów HPA Wstępne badania przeglądowe przeciwciał anty-hpa15 w teście MAIPA, przy uŝyciu płytek homozygotycznych o znanym genotypie HPA15, umoŝliwiły wykrycie przeciwciał anty-hpa-15b u trzech pacjentek. Te surowice pozwoliły na przetestowanie płytek krwi dawców o róŝnej ekspresji antygenu HPA-15, pod względem ich przydatności do wykrywania przeciwciał anty-hpa-15. Wyniki tych badań przedstawia rycina 3. Wartość ekstynkcji (OD) przeciwciał anty- HPA ,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Płytki dawców z ekspresją HPA-15: niską wysoką średnią Ryc. 3. Wpływ poziomu ekspresji antygenu HPA-15 na wykrywalność przeciwciał anty- HPA-15 w teście MAIPA Fig. 3. The effect of HPA-15 expression on anti-hpa-15 antibodies detection Wykazano znamienną statystycznie korelację pomiędzy wartościami ekstynkcji (OD) wykrywanych przeciwciał anty-hpa-15b w MAIPA, a poziomem ekspresji antygenów układu HPA-15. Surowica z przeciwciałami anty-hpa-15 silnie reagowała z płytkami dawców o wysokiej ekspresji antygenów (OD 1500), dwukrotnie słabiej z płytkami dawców ze średnią ekspresją (OD 700) (p<0,05) i praktycznie nie reagowała z płytkami z niską ekspresją antygenów. Wyniki wykrywania w surowicach przeciwciał anty-hpa-15 Na 146 zbadanych surowic od pacjentów po wielokrotnych przetoczeniach krwinek czerwonych (UKKCz) i płytek (UKKP), przeciwciała anty-hpa-15 stwierdzono u 3 (2,05%) pacjentek z opornością na przetaczane płytki. U tych chorych nie stwierdzono przeciwciał przeciwpłytkowych o innej swoistości, natomiast w dwóch surowicach wykryto dodatkowo przeciwciała limfocytotoksyczne. W Ŝadnej z 232 przebadanych surowic od kobiet, które urodziły dzieci z podejrzeniem alloimmunologicznej małopłytkowości nie wykryto przeciwciał anty-hpa-15. Wyniki badań przedstawia tabela 2.

6 702 H. MICHUR i wsp. Tabela 2. Wyniki wykrywania przeciwciał anty- HPA-15 w teście MAIPA Table 2. Detection of anti-hpa-15 antibodies in MAIPA Surowice pacjentów Chorzy, wielokrotni biorcy krwi Ogólna liczba surowic 146 Liczba surowic z przeciwciałami anty-hpa-15 3 (2.05%) (swoistość: 1-anty-HPA- 15a, 1-anty-HPA-15b, 1-anty- HPA15a i anty-hpa-15b) Kobiety z podejrzeniem konfliktu matczyno-płodowego w zakresie antygenów HPA-15 Ogółem DYSKUSJA Z danych literaturowych wiadomo, Ŝe antygen HPA-15 charakteryzuje się niŝszą ekspresją na płytkach krwi dawców heterozygotycznych, w porównaniu do płytek dawców homozygotycznych. Ponadto wiadomo, Ŝe ekspresja tego antygenu nawet na płytkach homozygotycznych bywa róŝna [7]. Obserwacje te były podstawą do podjęcia badań nad oceną wpływu ekspresji antygenu HPA-15 u dawców, których płytki uŝyto w teście MAIPA do wykrywania przeciwciał anty-hpa-15. Nasze badania wykazały, Ŝe homozygotyczne płytki krwi z wysoką ekspresją antygenów HPA-15, inkubowane z surowicą z przeciwciałami anty-hpa-15 pozwalają na uzyskanie takiej wartości ekstynkcji (OD) w teście MAIPA, która umoŝliwia wykrywanie przeciwciał anty-hpa-15. UŜycie do testu płytek krwi ze średnią i niską ekspresją antygenu moŝe prowadzić do uzyskania fałszywie ujemnych wyników badań. Z doniesień Ertel i wsp. [2] wynika, Ŝe alloimmunizację pacjentów po przetoczeniach krwi antygen HPA-15 powoduje częściej (3%), niŝ u kobiet z alloimmunologiczną trombocytopenią noworodków (AIMP/N) (około 0,22 %). W obecnej pracy nie wykryto przeciwciał anty-hpa-15 w surowicach kobiet z podejrzeniem AIMP/N, natomiast stwierdzono przeciwciała u trzech pacjentek, u których ze względu na brak odzysku płytek po kolejnych przetoczeniach stwierdzano oporność na przetoczone płytki krwi. U jednej z kobiet oporność na przetaczania była spowodowana wyłącznie przeciwciałami anty-hpa-15a stwierdzonymi w jej surowicy, a u dwóch innych dwoma rodzajami przeciwciał: anty-hpa-15 i anty-hla klasy I (FlowPRA Screening test). Przeprowadzone przez nas badania wykazały podobną wykrywalność przeciwciał w badanej grupie biorców krwi (2,05%) jak u wyŝej cytowanych autorów [2]. Z doniesień w literaturze wiadomo, Ŝe przeciwciła anty-hpa-15 często współistnieją z przeciwciałami przeciwpłytkowymi o innej swoistości [1, 6]. W badanej przez nas grupie chorych nie stwierdzono takiej zaleŝności. Natomiast nasze badania są zgodne z obserwacjami podanymi przez Berry i wsp., którzy stwierdzili równoczesne występowanie przeciwciał anty-hpa-15 i przeciwciał anty-hla, w większości przez nich badanych surowic. Wyłączna obecność przeciwciał anty-hpa-15 jest stwierdzana rzadko [6],

7 Wpływ ekspresji antygenów HPA tym nie mniej w badaniach własnych wykryto je w jednej z surowic, co potwierdza moŝliwość spowodowania alloimmunizacji przez antygeny układu HPA-15. Podsumowując, uzyskane przez nas wyniki wykazały zaleŝność wykrywania przeciwciał skierowanych do antygenu HPA-15 od jego ekspresji na płytkach krwi dawców panelowych uŝytych do testu oraz potwierdziły immunogenność tego antygenu. Przeprowadzone badania mają aspekt teoretyczny, poniewaŝ potwierdziły występowanie róŝnej ekspresji antygenu HPA-15 na płytkach krwi, oraz aspekt praktyczny, poniewaŝ umoŝliwiają wybór takich płytek krwi, które pozwolą na wykrywanie przeciwciał anty-hpa-15. PIŚMIENNICTWO 1. Berry J.E., Murphy C.M., Smith G.A, Ranasinghe E., Finberg R., Walton J., Brown J., Navarrete C., Metcalfe P., Ouwehand W.H. Detection of Gov system antibodies by MAIPA reveals an immunogenicity similar to the HPA-5 alloantigens. Br J Haematol 2000; 110: Ertel K., Al-Tawil M., Santoso S., Kroll H. Relevance of the HPA-15 (Gov) polymorphism on CD 109 in alloimmune thrombocytopenic syndromes. Transfusion 2005: 45: Kaplan C. Neonatal alloimmune thrombocytopenia: where do we stand? ISBT Science Series 2007; 2: Kiefel V, Santoso S, Weisheit M, Mueller-Eckhardt C. Monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens (MAIPA). A new tool for the identification of platelet antibodies. Blood 1987; 70: Lin M, Sutherland R, Horsfall W, Totty N, Yeo E, Nayar R, Wu X.-F, Schuh A.C. Cell surface antigen CD 109 in a novel member of the α2 makroglobulin/c3, C4, C5 family of thioester-containing proteins. Blood 2002; 99: Mandelbaum M, Koren D, Eilchelberger B, Auerbach L, Panzer S. Frequencies of maternal platelet alloantibodies and autoantibodies in suspected fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia, with emphasis on human platelet antigen-15 alloimmunization. Vox Sang 2005; 89: Smith G, Joutsi-Korhonen L, de Haas M, Berry J, Campbell K, Garner S, Caley N, Schuh A, Watkins N, Ouwehand WH. The Gov MAIPA PIFTALLS and PRATFALLS. Nat. Blood Serv. Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Dr n. biol. Halina Michur Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Instytut Hematologii i Transfuzjologii ul. Chocimska Warszawa tel. (0-22)