Zastosowanie techniki SPR (pomiar rezonansu plazmonów powierzchniowych) w badaniu oddziaływań międzycząsteczkowych w czasie rzeczywistym

Transkrypt

1 Zastosowanie techniki SPR (pomiar rezonansu plazmonów powierzchniowych) w badaniu oddziaływań międzycząsteczkowych w czasie rzeczywistym BIACORE SPR Detection Sensor Chips IFC Microfluidic Opracowanie: dr Maria Rąpała-Kozik i mgr Marta Kujda, Zakład Biochemii Analitycznej, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ

2 SYSTEM BIACORE łączy w sobie elementy chromatografii powinowactwa z nowym sposobem detekcji oddziałujących molekuł wykorzystującym zjawisko optyczne zwane powierzchniowym rezonansem plazmonowym - SPR (ang. surface plasmon resonanse). specyficzna matryca sensora (dekstran) Złoto 50 nm Szkło

3 Zjawiska optyczne wykorzystywane w aparacie BIACORE Kąt graniczny θ zjawisko całkowitego wewnętrznego odbicia ośrodek o większej gęstości optycznej (pryzmat) warstwa metalu (złota) ośrodek o mniejszej gęstości optycznej (bufor) powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) Pewne metale (np. złoto czy srebro) posiadają chmury elektronowe (plazmony) będące powierzchniowymi falami elektromagnetycznymi, które mogą rezonować ze światłem padającym pod odpowiednim kątem. W warunkach rezonansu ściśle określona ilość energii padającej fali świetlnej jest pochłaniana przez plazmony, co skutkuje spadkiem energii fali odbitej.

4 Zastosowanie SPR w urządzeniach typu BIACORE Rezonans plazmonowy jest bardzo czuły na zmiany właściwości dielektrycznych ośrodka optycznie rzadszego. KaŜda zmiana stałej dielektrycznej tego ośrodka wiąŝe się ze zmianą warunków rezonansu plazmonowego, a więc ze zmianą intensywności światła odbitego i kąta odbicia światła pochłanianego rezonansowo. Źródło światła Detektor Powierzchnia sensora Pryzmat Próbka Celka przepływowa

5 Do jakich pomiarów słuŝy system BIACORE StęŜenie ile badanej substancji znajduje się w próbce Specyficzność jaka jest specyficzność i selektywność tworzonego kompleksu Kinetyka Powinowactwo Termodynamika dlaczego dochodzi do oddziaływania jak szybko ono zachodzi z jaką mocą wiąŝą się składniki kompleksu

6 Praktyczne zastosowania systemu BIACORE Charakterystyka oddziaływań w układach: Ligand Receptor Antygen - Przeciwciało Białko Białko RNA Białko DNA Białko Komórka Białko poszukiwanie skutecznych leków monitorowanie w czasie rzeczywistym ekspresji genów

7 Oznaczenia z wykorzystaniem systemu BIACORE wymagają następujących etapów Przygotowanie powierzchni Proces analityczny

8 Przygotowanie powierzchni sensora immobilizacja liganda a n a ly te a n a ly t e lig a n d lig a n d c a p tu r in g m o le c u le Bezpośrednio Pośrednio

9 Immobilizacja bezpośrednia na powierzchni dekstranu Immobilizacja kowalencyjna

10 Powierzchnie chipów stosowanych w immobilizacji pośredniej Immobilizacja substancji biotynylowanych za pośrednictwem obecnej na powierzchni chipu - streptawidyny Immobilizacja białek błonowych za pośrednictwem liposomów Immobilizacja białek zaopatrzonych w etykietę histydynową, poddawanych nadekspresji w komórkach bakteryjnych, bez konieczności ich oczyszczania

11 Sensogram

12 Informacje płynące z sensogramu: A/ czy oddziaływanie zachodzi B/ jaka jest kinetyka oddziaływania jaka jest jego specyficzność jaka jest jego moc ile analitu ulega związaniu Wybrana wartość Kształt krzywej informuje o kinetyce oddziaływania Sygnał (RU) sygnał wiązania Linia podstawowa czas assocjacja dysocjacja bufor próbka bufor

13 Cykl analityczny Wprowadzenie analitu i pomiar sygnału rezonansu Regeneracja powierzchni chipu Optymalizacja wiązania i regeneracja sensora: Analiza danych Zasady podobne do chromatografii powinowactwa Zmiana przepływu buforu, zmiana ph, jony chaotropowe, detergenty

14 ZASTOSOWANIA (A1) Oznaczanie specyficzności oddziaływania róŝnych analitów z tym samym ligandem Zestaw sensogramów dla róŝnych typów lektyn oddziałujących z tyroglobuliną

15 ZASTOSOWANIA (A2) Oznaczanie stęŝenia badanego analitu Mierzony sygnał (RU) x x x x x stęŝenie próbka Zestaw sensogramów dla analitu o róŝnych stęŝeniach oraz dla badanej próbki

16 ZASTOSOWANIA (A3) Badanie powinowactwa Jak mocne jest wiązanie w stanie równowagi r - określenie stałej dysocjacji kompleksu KD Signal [RU] Time [s] Wiązanie furosemidu do anhydrazy węglanowej

17 ZASTOSOWANIA (A4) Badanie oddziaływań w układach wieloskładnikowych Analyte Ligand 2 nd Binder Response [RU] Time [s] - mapowanie epitopów rozpoznawanych przez badane przeciwciała (test selektywności przeciwciał) - testowanie powierzchni antygenu - identyfikacja sekwencji biorącej udział w oddziaływaniu - moŝliwość zmiany (wzrostu) limitu detekcji badanego ligandu

18 ZASTOSOWANIA (A3) Oznaczanie aktywności ekspresjonowanych białek SDS-PAGE Fr. App Western blot

19 ZASTOSOWANIA (B) Analiza kinetyczna A + B k a k d AB Jak szybko zachodzi proces tworzenia kompleksu» k a k on (rozpoznawanie cząsteczek - asocjacja)» k d k off (stabilność kompleksu - dysocjacja)» K D = k d /k a (stała równowagi)

20 Badanie kinetyki procesu tworzenia kompleksu Badania kinetyczne wprowadzają unikalną moŝliwość doboru leku z uwzględnieniem jego farmakokinetyki i wielkości dawki K D 10 nm To samo powinowactwo moŝe być wynikiem róŝnych procesów kinetycznych Całkowite wysycenie k a k d [M -1 s -1 ] [s -1 ] nm 1 µm 30 min 60 min 30 min 60 min

21 ZASTOSOWANIA (B1) Wpływ mutacji punktowej na kinetykę oddziaływań między domenami Kaff*1e-7 1/M Affinity measurements 3,5 3 2,5 2 Resonance signal (RU) 1, Native L17D Time (s) 0,5 0 Z Z(L17D) Z(N28A) Z(F30A) Z(I31A) Z(K35A) BIACORE Binding assay

22 Zastosowanie Biacore w badaniach proteomicznych Ligand Fishing SPR/MS Receptor Recovery Enzymatic digestion HPLC separation MS Express 6-24 months Kinetics, Affinity Structure-Activity studies BIACORE Classical Applications

23 PODSUMOWANIE Rezonans plazmonów powierzchniowych umoŝliwia detekcję tworzenia oddziaływań między analitem i ligandem poprzez pomiar zmiany masy przy powierzchni sensora Pomiary kinetyczne w czasie rzeczywistym Oznaczenia ilościowe Pomiar stęŝenia Informacje o zaleŝnościach struktury i aktywności tworzenia kompleksu Eliminacja znakowania ligandów Minimalne zuŝycie próbek Większa szybkość oznaczeń w porównaniu z metodami konwencjonalnymi (np.elisa, RIA)

24 Spektrometr Masowy HCTultra S Oliwia Bocheńska

25 Spektrometria masowa Spektrometria masowa jest techniką analityczną umożliwiającą dokładny pomiar masy i jednoznaczną identy=ikację substancji. Spektrometr masowy wytwarza i separuje jony ze względu na stosunek masy do ładunku (m/z). Umożliwia: Szczegółową analizę składników w mieszaninie; Oznaczenie struktury cząsteczek organicznych; Uzyskanie informacji o sekwencji peptydów i białek; Uzyskanie informacji o mody=ikacjach potranslacyjnych; Wykrywanie substancji endogennych na poziomie piko/femtomolowym. Znajduje zastosowanie w dziedzinach: biochemia, ochrona środowiska, analiza składu, medycyna, toksykologia, chemia sądowa, itp.

26 Schemat blokowy budowy MS iniekcja próbki źródło jonów transfer jonów analizator detektor system próżni elektronika, rejestrator

27 HCTultra firmy Bruker Spektrometr masowy typu ESI- IT: Jonizacja typu electrospray (ESI); Analizator typu pułapka jonowa (ang. Ion Trap IT); Możliwość rozbudowy do: ETD (Electron Transfer Dissociation); PTR (Proton Transfer Reaction); Zakres pomiaru od 50 do 3000 m/z a nawet 6000 m/z (!) dla analiz MS i MS/MS. Programy do zapisu i analizy widm: Compass 1.3; DataAnalysis 4.0, BioTools 3.2

28 Jonizacja Wytwarzanie typu jonów ESI - nebulizacja Łagodna metoda jonizacji minimalna fragmentacja analitów; Jonizacja w warunkach ciśnienia atmosferycznego możliwość sprzęgnięcia z HPLC (techniki połączone); Jonizację substancji w roztworach; Powstawanie jonów wielokrotnie naładowanych możliwość analizy dużych cząsteczek jak białka i peptydy; Prosta konstrukcja źródła jonów;

29 Pułapka Jonowa (IT) Analizator impulsowy; Izolacja i fragmentacja jonów w tej samej przestrzeni; Możliwość wielokrotnych fragmentacji jonów (do MS/MS 11); Wysoka czułość gromadzenie jonów w pułapce pozwala na skanowanie i fragmentację w krótszym czasie z lepszą rozdzielczością (>I/s); Stosowany głównie w analizie struktury i sekwencji złożonych cząsteczek;

30 Zastosowanie HCTultra Proteomika: analiza i identy=ikacja peptydów; identy=kacja białek poprzez trawienie tryspyną zarówno z żelu, jak i w roztworze ; Analiza małych cząsteczek związków organicznych;

31 Dziękuję