Polimorfizm epsilon genu apolipoproteiny E i polimorfizm insercyjno-delecyjny genu ACE a udar niedokrwienny mózgu u dzieci: pilotowe badanie związków

Transkrypt

1 CHILD NEUROLOGY NEUROLOGIA DZIECIĘCA Vol. / Nr PRACA ORYGINALNA/ORIGINAL ARTICLE Polimorfizm epsilo geu apolipoproteiy E i polimorfizm isercyjo-delecyjy geu ACE a udar iedokrwiey mózgu u dzieci: pilotowe badaie związków Epsilo polymorphism of apolipoprotei E gee ad isertio-deletio polymorphism of ACE gee ad brai ischemic stroke i childre: associatio pilot-study Iwoa Żak, Aa Balcerzyk, Beata Sarecka, Paweł Niemiec, Iloa Kopyta, Ewa Emich-Widera, Elżbieta Marszał Katedra i Zakład Biochemii i Geetyki Medyczej Śląskiej Akademii Medyczej w Katowicach Kierowik: dr hab.. med. I. Żak Katedra i Kliika Pediatrii i Neurologii Wieku Rozwojowego Śląskiej Akademii Medyczej w Katowicach Kierowik: prof. dr hab.. med. E. Marszał Streszczeie Słowa kluczowe: udar iedokrwiey mózgu, apolipoproteia E, kowertaza agiotesyowa, polimorfizm Abstract Key words: brai ischemic stroke, APOE, ACE, polymorphism Vol. /, Nr Cel pracy: Aaliza związku polimorfizmów epsilo geu APOE i I/D geu ACE z dokoaym udarem iedokrwieym mózgu u dzieci z uwzględieiem ciężkości stau pacjeta. Materiał i metody: Badaiami objęto osób rasy kaukaskiej, w tym: dzieci po udarze iedokrwieym mózgu ( = ), ich rodziców ( = ) oraz grupę kotrolą ( = ). Grupa dzieci po udarze mózgu została podzieloa a podgrupy w zależości od ciężkości stau kliiczego pacjeta w okresie ostrym oraz dalszego przebiegu choroby i odległych astępstw oraz pod względem płci. Grupę kotrolą rówież podzieloo a podgrupy: dzieci zdrowe ( = ) oraz dobrowolych dawców krwi ( = ). Polimorfizm epsilo geu APOE aalizowao techiką RFLP-PCR, polimorfizm isercyjo/delecyjy geu ACE metodą PCR. Wyiki: Wykazao, że w grupie dzieci po udarze iedokrwieym mózgu ość allelu ε geu apolipoproteiy E jest zamieie wyższa w porówaiu zarówo z całą grupą kotrolą (, vs,, p =,, OR =,), jak i podgrupą osób zdrowych do roku życia (,, p =,, OR =,). Szczególie duże różice w ościach allelu ε oraz osicieli tego allelu stwierdzoo między podgrupami płci męskiej (p =, dla allelu i p =, dla osicielstwa). Różice wykazao także pomiędzy podgrupami chorych wyodrębioymi a podstawie ciężkości stau pacjeta. Stwierdzoo zaczie iższą ość allelu ε w grupie w staie kliiczym ciężkim iż w grupie w staie dość dobrym (p =,). Wykazao, że ość allelu I polimorfizmu ACE jest wyższa w podgrupie pacjetów w staie kliiczym ciężkim (,) w porówaiu do pacjetów w staie kliiczym dość dobrym (,). Po zróżicowaiu badaych grup ze względu a płeć stwierdzoo, że ość allelu I jest zamieie wyższa w podgrupie dziewcząt po udarze (,) w porówaiu do podgrupy dziewcząt zdrowych (,9) (p =,, OR =,). Wyiki te wymagają potwierdzeia a licziejszej grupie pacjetów. Aim: Aalysis of associatio betwee epsilo polymorphism of APOE gee ad I/D polymorphism of ACE gee ad brai ischemic stroke i childre with cosiderig of state after stroke ad geder. Material ad methods: The study icluded Caucasia subjects: childre with brai ischemic stroke ( = ), their parets ( = ) ad cotrol group ( = ). Study group of childre after brai stroke was divided ito two subgroups depedetly o the state of patiets i acute phase ad i further developmet of the disease ad oticeable distat cosequeces ad cosiderig geder. Cotrol group were also divided ito two subgroups: healthy subjects aged < years ( = ) ad aged years ( = ). The epsilo polymorphism of APOE gee was aalyzed usig PCR-RFLP method ad isertio/deletio polymorphism i ACE gee was aalyzed usig PCR. Results: There was show sigificatly higher frequecy of ε allele of APOE

2 Iwoa Żak, Aa Balcerzyk, Beata Sarecka et al. gee i group of childre after brai ischemic stroke i compariso to etire cotrol group (. vs., p =., OR =.), as well as to healthy subjects up to years old (., p =., OR =.). Especially sigificat differeces i the frequecy of ε allele ad ε allele carriers were observed betwee male subgroups (p =. for allele ad p =. for carriers). The differeces were also obtaied betwee subgroups of patiets divided depedetly o the state of patiets. There was sigifficatly lower frequecy of ε allele i the subgroup of patiets i serious state comparig to patiets i good state (p =.). We also demostrate that frequecy of I allele of ACE I/D polymorphism is sigificatly higher i subgroup of patiets i serious state (.) compared to patiets i good state (.). After cosiderig the geder we foud that frequecy of I allele is sigificatly higher i subgroup of girls after stroke (.) compared to subgroup of healthy girls (.9) (p =., OR =.).These results eed cofirmatio o larger group of patiets. Wstęp Udar iedokrwiey mózgu jest trzecią co do ości przyczyą zgoów osób dorosłych. Chociaż choroba ta u dzieci występuje zaczie rzadziej (z ością około / /rok) pozostaje ważym problemem społeczym ze względu a deficyty eurologicze, które pozostają u ok. połowy pacjetów. Etiologia udarów u dzieci jest słabo pozaa i składają się a ią prawdopodobie licze czyiki środowiskowe i geetycze. Za udziałem tych ostatich przemawia fakt, że udary iedokrwiee mózgu pięciokrotie częściej występują u par bliźiąt jedojajowych w porówaiu z dwujajowymi []. Czyik geetyczy może być szczególie istoty u osób młodych, u których udział czyików środowiskowych ie jest jeszcze tak zaczący. W ieliczych przypadkach do powstaia udarów u dzieci mogą prowadzić rzadkie choroby uwarukowae jedogeowo, p. rodzia hipercholesterolemia [] czy aemia sierpowata []. Wśród zaburzeń geetyczych mogących odgrywać rolę w etiopatogeezie udaru iedokrwieego mózgu u dzieci szczególa rola jest przypisywaa polimorfizmom w geach fibryogeu [], reduktazy metyleetetrahydrofoliaowej, czyików krzepięcia V i VII [] oraz kowertazy agiotesyowej []. Jedak ajczęściej geetycze podłoże udarów iedokrwieych mózgu jest uwarukowae wielogeowo. W światowej literaturze iewiele jest doiesień a te temat. Podłoże geetycze chorób aczyń mózgowych mogą staowić gey polimorficze, których produkty białkowe uczesticzą w patogeezie choroby [, ]. Geów kadydatów chorób aczyń mózgowych poszukuje się między iymi wśród geów kodujących białka biorące udział w zaburzeiach gospodarki lipidowej oraz wśród geów kodujących składiki układu reia-agiotesya (RAS). Poza rzadko występującym schorzeiem moogeowym hipercholesterolemią rodzią, uwarukowaą mutacjami w geie receptora LDL, stężeie cholesterolu i iych lipidów w osoczu może być wyikiem fukcjoalego współdziałaia ze sobą wielu geów. Do ważiejszych czyików geetyczych, wpływających a poziom cholesterolu w osoczu, ależy polimorfizm geu apolipoproteiy E (apo E). Apo E jest sytetyzowaa główie w wątrobie, występuje w rematach chylomikroów i VLDL, umożliwiając ich usuwaie z krążeia, dzięki pełioej fukcji ligada dla dwóch ważych receptorów dla lipoprotei, miaowicie receptora LDL i receptora LRP. Polimorfizm geu APOE odpowiedzialy jest za istieie trzech izoform tej apolipoproteiy: E, E, E, które kodowae są przez trzy allele ε, ε, ε. Ze względu a róże powiowactwo poszczególych izoform do receptora lipoprotei, polimorfizm te wpływa a profil lipidowy osocza. W mózgu i płyie mózgowo-rdzeiowym, gdzie brakuje główych osoczowych trasporterów lipidów edogeych, lipoprotei o iskiej gęstości (LDL), apoe, która jest podstawową apoproteią płyu mózgowo-rdzeiowego, pełi fukcję białkowego trasportera lipidów. Fukcje apo E wykraczają jedak zaczie poza jej udział w regulacji metabolizmu lipidów. Licze prace dowodzą, że apo E jest zaagażowaa w modulowaie odpowiedzi zapalej, regulację fukcji płytek krwi, zjawiska apoptozy i stresu oksydacjego [9]. Kowertaza agiotesyowa (ACE) bierze udział w proteolityczym przekształceiu agiotesyy I w aktywą agiotesyę II, jak rówież w iaktywacji bradykiiy []. Agiotesya II pobudza wzrost i proliferację miocytów aczyiowych, a także skurcz mięśi gładkich ściay tętic. Posiada rówież właściwości aktywowaia śródbłoka aczyiowego, maifestowae sytezą i ekspresją a powierzchi błoy receptorów adhezyjych (VCAM, ICAM, CD-E) oraz sekrecją chemoki (MCP-). Zjawiska stymulowae przez agiotesyę II ależą do kluczowych w patogeezie miażdżycy. Wykazao, że polimorfizm isercyjo-delecyjy (I/D) w geie ACE ma związek ze stężeiem ACE w osoczu []. Homozygoty DD charakteryzują się aktywością ACE większą co ajmiej dwukrotie, w porówaiu do homozygot II. Heterozygoty ID charakteryzują się aktywością pośredią. Bazując a powyższych iformacjach wykazao, że geotyp DD może być czyikiem ryzyka choroby iedokrwieej serca i zawału mięśia sercowego w iektórych populacjach [, ]. Związek te został potwierdzoy i udokume- Neurologia Dziecięca

3 Polimorfizm epsilo geu apolipoproteiy E i polimorfizm isercyjo-delecyjy geu ACE... toway badaiami własymi w populacji pacjetów kardiologiczych z Górego Śląska []. Wpływ polimorfizmu geu ACE a ryzyko wystąpieia choroby iedokrwieej serca może sugerować jego udział w tworzeiu geetyczego podłoża udarów iedokrwieych mózgu, zarówo u dorosłych, jak i u dzieci. Autorzy prowadzą badaia ad geetyczym podłożem chorób aczyń mózgowych, w tym udaru iedokrwieego mózgu u dzieci. Celem iiejszej pracy jest aaliza związku polimorfizmów epsilo geu apolipoproteiy E oraz isercyjo/delecyjego geu kowertazy agiotesyowej (ACE) z dokoaym udarem iedokrwieym mózgu u dzieci z uwzględieiem ciężkości stau pacjeta i astępstw. Materiał i metody Badaiami objęto białych osób rasy kaukaskiej, w tym dzieci po dokoaym udarze iedokrwieym mózgu, ich rodziców, osoby zdrowe do roku życia bez kliiczych objawów eurologiczych i bez obciążeń rodziych chorobami sercowo-aczyiowymi w wywiadzie oraz dobrowolych dawców krwi w wieku lat bez obciążeń rodziymi chorobami sercowo-aczyiowymi w akiecie. Grupę pacjetów staowiło siedemaścioro dzieci i młodych dorosłych w wieku od do lat (9 dziewcząt, chłopców), którzy byli hospitalizowai w ostrej fazie iedokrwieia mózgu w Kliice Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM w Katowicach i adal są objęci opieką ambulatoryją. Dokoay udar iedokrwiey mózgu rozpozao zgodie z obowiązującymi kryteriami kliiczymi i potwierdzoo badaiami euroobrazującymi (TK i MR). Oceę eurologiczą stau pacjetów (grupa ) przeprowadzao w skali Orgogozo, azywaej przez autora skalą tęticy środkowej mózgu. Skala ta pozwala a dokoaie obiektywej ocey stau świadomości, kotaktu słowego, ruchów oraz apięcia mięśiowego w obrębie kończyy górej i dolej, a także ruchów głowy i gałek oczych. Uzyskaie puktów ozacza, iż pacjet jest w pełym, logiczym kotakcie słowym, ie stwierdza się także deficytów eurologiczych (porażeia/iedowłady kończy oraz mięśi twarzy), a ruchy głowy i gałek oczych są prawidłowe. Miejsza od liczba puktów ozacza z kolei obecość deficytów ruchowych, zaburzeń świadomości i/lub zaburzeń mowy. Grupę pacjetów podzieloo a dwie podgrupy w zależości od ciężkości stau pacjeta w okresie ostrym, od początku wystąpieia objawów kliiczych oraz dalszego przebiegu choroby i widoczych odległych astępstw: pacjetów w staie ciężkim (śpiączka, porażeie lub iedowład zaczego stopia, poiżej puktów w skali Orgogozo; = 9; wiek w czasie ostatich badań kotrolych od do lat) podgrupa a; pacjetów w Vol. /, Nr staie dość dobrym (iedowład średio lub słabo wyrażoy, bez zaburzeń świadomości, powyżej puktów w skali Orgogozo; = ; wiek w czasie ostatich badań kotrolych od do lat) podgrupa b. Dwie pacjetki spośród całej grupy chorych ie mogą być zakwalifikowae do żadej z podgrup ze względu a brak widoczych astępstw poudarowych. Grupę rodziców pacjetów staowiło trzydziestu trzech zdrowych rodziców w wieku od do lat. Matka jedego pacjeta zmarła z powodu tętiaków tętic erkowych (grupa ). Grupę kotrolą staowiło sto sześćdziesiąt osiem osób bez kliiczych objawów eurologiczych i bez obciążeń rodziymi chorobami sercowo-aczyiowymi w wywiadzie w wieku od do lat ( = 9, = 9). Osoby te były rekrutowae spośród pacjetów Kliiki Neurologii Wieku Rozwojowego ŚAM w Katowicach oraz dobrowolych dawców krwi (grupa ). Grupę tę podzieloo a dwie podgrupy w zależości od wieku: osoby do roku życia, =, =, = (grupa a), osoby między a rokiem życia, =, =, = 9 (grupa b). Wszystkie osoby włączoe do badań wyraziły chęć uczesticzeia w ich zgodie z zasadami etyczymi i orgaizacją badań aukowych, a które uzyskao zgodę Komisji Bioetyczej przy Śląskiej Akademii Medyczej. Aalizy biochemicze Krew do badań pobierao z żyły odłokciowej po -godziej przerwie w przyjmowaiu pokarmów. Stężeia wskaźików gospodarki lipidowej: cholesterolu całkowitego, cholesterolu HDL i trójglicerydów ozaczao w świeżej surowicy za pomocą gotowych zestawów firmy Aalco i spektrofotometru UV-VIS MINI firmy Schimadzu. Stężeie cholesterolu LDL obliczoo wg wzoru Friedewalda []. Aalizy geetycze Izolację DNA z limfocytów krwi obwodowej wykoywao z użyciem gotowego zestawu MasterPure TM Geomic DNA Purificatio Kit (Epicetre Techologies). Stężeie i czystość izolatów DNA mierzoo spektrofotometryczie przy λ = / m. Polimorfizm epsilo geu APOE geotypowao techiką PCR-RLFP (Polymerase Chai Reactio Restrictio Fragmets Leght Polymorphism), która obejmuje astępujące etapy: Reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), która umożliwia amożeie badaego fragmetu geu APOE. Wykorzystao astępującą parę oligoukleotydowych starterów []: -ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACAC-,

4 Iwoa Żak, Aa Balcerzyk, Beata Sarecka et al. -TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA- Reakcję prowadzoo w termocyklerze gradietowym Tgradiet 9 firmy Biometra w astępujących warukach: ) wstępa deaturacja DNA: 9 C mi, ) deaturacja: 9 C mi, ) przyłączaie starterów: C mi, ) wydłużaie ici DNA: C mi, etapy,, powtarzao dwukrotie, obiżając temp. przyłączaia starterów o stopień co cykle aż do temp. C, ) deaturacja: 9 C mi, ) przyłączaie starterów: C mi, ) wydłużaie ici DNA: C mi, etapy,, powtarzao cykliczie razy, ) końcowe wydłużaie C mi. Trawieie ezymem restrykcyjym HhaI produktu reakcji PCR. Restrykcję przeprowadzao w temp. C, przez godzi, używając, U ezymu a, μl amplifikatu. Na skutek trawieia uzyskiwao astępujące fragmety: dla allelu ε,, 9 par zasad (pz), dla ε,,, 9 pz, dla ε,,, pz. Elektroforezę i wizualizację DNA, umożliwiające detekcję określoej formy polimorficzej. Produkty trawieia rozdzielao elektroforetyczie a % żelu poliakrylamidowym z % glicerolem w buforze xtbe o ph,. DNA po elektroforezie barwioo azotaem srebra zgodie ze stadardową procedurą dla DNA. Następie żele suszoo i dokumetowao za pomocą systemu UV i VIS Docprit firmy Vilber Lourmat. Polimorfizm isercyjo/delecyjy geu ACE geotypowao techiką PCR (ag. polymerase chai reactio), obejmującą astępujące etapy:. Reakcję PCR, która umożliwia amożeie badaego fragmetu geu kowertazy agiotesyy I z parą oligoukleotydowych starterów opisaych wcześiej []. Reakcję przeprowadzao w termocyklerze gradietowym Tgradiet 9 firmy Biometra w warukach wg własego opracowaia: wstępa deaturacja w 9 o C przez mi; cykli obejmujących: deaturację w 9 o C przez mi, przyłączaie starterów w o C przez mi, wydłużaie w o C przez mi. s; końcowe wydłużaie w o C przez mi; schłodzeie w o C. Wielkość produktu allelu I wyosi 9 par zasad (pz), atomiast allelu D wyosi 9 pz.. Elektroforezę i wizualizację DNA. Produkty reakcji PCR rozdzielao elektroforetyczie a % żelu agarozowym w roztworze buforowym TBE x o ph,. Rozdzieloe fragmety DNA uwidacziao a elektroforogramach bromkiem etydyy. Żele suszoo i dokumetowao przy użyciu systemu dokumetacji żeli Docprit core UV-Vis firmy Vilber Lourmat. Aaliza statystycza Uzyskae wyiki aalizowao za pomocą programu EpiIfo- (WHO). Częstości alleli ustaloo a podstawie ości geotypów. Zgodość rozkładu z rówowagą Hardy-Weiberga określoo za pomocą testu χ. Porówaie ości geotypów i alleli między grupami badaymi wykoao testem χ. W przypadku gdy liczba daych była miejsza iż, stosowao dodatkowo test dokłady Fishera. Za istote statystyczie różice przyjmowao te wartości, dla których p <,. Siłę asocjacji poszczególych alleli i geotypów z dokoaym udarem iedokrwieym mózgu określoo a podstawie wartości współczyika ilorazu szas (ag. odds ratio OR) z przedziałem ufości 9% CI. Wyiki i dyskusja Wiek poszczególych pacjetów w chwili wystąpieia ostrego iedokrwieia mózgu wahał się w graicach od miesiąca życia do roku życia. Badaia kotrole przeprowadzao w warukach ambulatoryjych, ostatie po upływie miesięcy do lat od wystąpieia udaru, odpowiedio w wieku pacjetów do lat. Udar mózgu u wszystkich pacjetów dotyczył przediego krągu uaczyieia mózgu PACI (ag. Partial Aterior Circulatio Ifarct). Pełą charakterystykę pacjetów pod względem kliiczym i biochemiczym przedstawioo we wcześiejszej publikacji, gdzie szczegółowo opisao objawy udaru w fazie ostrej i ajsze odległe astępstwa udaru oraz szczegóły kliiczych badań kotrolych []. We wcześiejszym doiesieiu wykazao [], że u badaych dzieci z dokoaym udarem iedokrwieym mózgu współwystępowało wiele różych czyików ryzyka chorób aczyiowych mózgu, ajczęściej dyslipidemie, w tym hipercholesterolemia u pacjetów, hipertrójglicerydemia u, hiperlipoproteiemia u, dyslipidemia mieszaa u jedego pacjeta, dodatkowo zespół atyfosfolipidowy u pacjetów, deficyt białka S u pacjetów, oporość a aktywą postać białka C APCR (ag. Activated Protei C Resistace) u dwóch pacjetów i deficyt białka C u jedego pacjeta. Stwierdzoo współwystępowaie przyajmiej dwóch czyików ryzyka u 9 dzieci. Wyiki wskaźików gospodarki lipidowej surowicy przedstawioo w tabeli I. Stwierdzoo istotą statystyczie różicę pomiędzy grupą chorych (gr. ) a zdrowymi dziećmi (gr. a) w stężeiu cholesterolu całkowitego oraz cholesterolu LDL (p =, i p =,). Zdrowi rodzice dzieci po udarze iedokrwieym mózgu ie odbiegają zacząco od ormy pod względem parametrów gospodarki lipidowej surowicy, ie wykazao zamieych statystyczie różic w porówaiu z krwiodawcami (tab. I). Polimorfizm APOE. Rozkłady ości geotypów i alleli geu apolipoproteiy E w badaych grupach oraz rozkłady w podgrupach z uwzględieiem płci przedstawioo w tabeli II. Rozkłady we wszystkich Neurologia Dziecięca

5 Tab. I. Wskaźiki gospodarki lipidowej w surowicy wśród badaych grup. Parameters of serum lipids levels amog study groups mediaa lub średia Mediaa (mi.-max.) Mediaa (mi.-max.) Mediaa (mi.-max.) Cholesterol całkowity (mmol/l) Cholesterol HDL (mmol/l) pacjeci (grupa ) Cholesterol LDL (mmol/l) Trójglicerydy (mmol/l), (,,9)*, (,,), (,,)*, (,,) pacjeci w staie ciężkim (podgrupa a), (,9,9), (,,), (,,), (,,) pacjeci w staie dość dobrym (podgrupa b), (,,), (,,), (,,), (,,) rodzice pacjetów (grupa ) Średia ± SD,9 ±,, ±,, ±,, ±, Mediaa (mi.-max.) Polimorfizm epsilo geu apolipoproteiy E i polimorfizm isercyjo-delecyjy geu ACE... dzieci zdrowe (podgrupa a),9 (,,), (,,9), (,9,),9 (,,) dobrowoli dawcy krwi (podgrupa b) Średia ± SD,9 ±,, ±,9, ±,, ±, * Dae są zamiee statystyczie. * Statistically sigificat data Tab. II. Dystrybucja ości geotypów i alleli polimorfizmu epsilo geu APOE wśród badaych grup. Distributio of geotypes ad alleles frequecies of epsilo polymorphism i APOE gee amog study groups GRUPA GENOTYPY* ALLELE εε εε εε εε εε ε ε ε Pacjeci (),9,,,,,, 9,,,,,,,,,,, (a) w staie ciężkim 9,9,,9, (b) w staie dość dobrym,,,,, Vol. /, Nr 9

6 Iwoa Żak, Aa Balcerzyk, Beata Sarecka et al. Rodzice pacjetów (),,,,,, Gr. kotrola (),,,9,,,,,,,,,, 9,,,9, 9,,9 9, (a) do lat,,9,9,,,9,,,9,,, 9,,,9,9 (b) - lat, 9,,,,,9, 9,9,,,9,, 9,,9,, 9,,, Porażeie lub iedowład zaczego stopia, śpiączka, poiżej puktów w skali Orgogozo. Niedowład średio lub słabo wyrażoy, bez zaburzeń świadomości, powyżej puktów w skali Orgogozo. * Nie uwzględioo geotypu εε poieważ ie obserwowao takiego geotypu w żadej grupie. Tab. III. Dystrybucja ości geotypów i alleli polimorfizmu isercyjo/delecyjego geu ACE wśród badaych grup. Distributio of geotypes ad alleles frequecies of isertio/deletio polymorphism i ACE gee amog study groups GRUPA GENOTYPY ALLELE II ID DD I D Pacjeci () ość,,,,, 9 ość,,,,, ość,,,,, (a) w staie ciężkim 9 ość,,,, (b) w staie dość dobrym ość,,,,, Neurologia Dziecięca

7 Polimorfizm epsilo geu apolipoproteiy E i polimorfizm isercyjo-delecyjy geu ACE... Rodzice pacjetów () ość,,,,, Gr. kotrola () ość,,,,, 9 ość,9,,,, 9 ość,,,, 9, (a) do lat ość, 9,,,, ość,,,,9, ość,,,,, (b) - lat ość, 9,,,, ość,,,9,, 9 ość,, 9, 9,, Porażeie lub iedowład zaczego stopia, śpiączka, poiżej puktów w skali Orgogozo. Niedowład średio lub słabo wyrażoy, bez zaburzeń świadomości, powyżej puktów w skali Orgogozo. Tab. IV. Porówaie ości allelu ε i osicieli allelu ε geu APOE oraz ości allelu I geu ACE między pacjetami a grupą kotrolą z uwzględieiem płci oraz między pacjetami w staie ciężkim a pacjetami w staie dość dobrym za pomocą testu χ i testu dokładego Fishera. Compariso of ε allele ad ε allele carriers of APOE gee ad allele I of ACE gee betwee patiets ad cotrol group cosiderig geder ad betwee patiets i serious state ad patiets i rather good state usig χ test ad Fisher s exact test POLIMORFIZM EPSILON GENU APOE test ALLEL ε osiciele allelu ε (εε + εε) Pacjeci po udarze () = / zdrowe dzieci (a) = χ (p) Fisher jedostroy Fisher dwustroy OR (9% CI),9 (p =,)* p =,* p =,*, (,,), (p =,) p =, p =, Pacjeci po udarze () = / cała grupa kotrola () = χ (p) Fisher jedostroy Fisher dwustroy OR (9% CI), (p =,)* p =,* p =,*, (,,9), (p =,) p =, p =, po udarze () = / zdrowe dzieci (a) = χ (p) Fisher jedostroy Fisher dwustroy 9, (p =,)* p =,* p =,*,9 (p =,)* p =,* p =,* Vol. /, Nr

8 Iwoa Żak, Aa Balcerzyk, Beata Sarecka et al. Pacjeci w staie ciężkim (a) = 9 / Pacjeci w staie dość dobrym (b) = χ (p) Fisher jedostroy Fisher dwustroy OR (9% CI), (p =,)* p =,* p =,*, (,,), (p =,)* p =, p =,9, (,,) POLIMORFIZM INSERCYJNO/DELECYJNY GENU ACE test ALLEL I po udarze () = 9 / zdrowe (a) = χ (p) OR (9% CI), (p =,)*, (,,) Pacjeci w staie ciężkim (a) = 9 / Pacjeci w staie dość dobrym (b) = χ (p) Fisher jedostroy Fisher dwustroy OR (9% CI), (p =,)* p =, p =,,9 (,,) * Różice są zamiee statystyczie. * Statistically sigificat data. badaych grupach, z wyjątkiem chorych, były zgode z rówowagą Hardy-Weiberga. Istote statystyczie różice w ościach alleli i geotypów między badaymi grupami przedstawioo w tabeli IV. Porówaie grupy chorych dzieci () z grupą zdrowych osób do roku życia (a) wykazało istote statystyczie różice w ościach allelu ε (, vs,, p =,). Nieco miejsze różice, ale rówież istote, stwierdzoo porówując chorych z całą grupą kotrolą (, vs,, p =,). Częstość osicieli allelu ε (geotypy εε, εε) była rówież wyższa wśród chorych (,9) zarówo w porówaiu z młodymi, zdrowymi osobami (,9), jak i z całą grupą kotrolą (,), różice te jedak ie były istote statystyczie. Szczególie duże różice w ościach allelu ε oraz osicieli tego allelu stwierdzoo między podgrupami płci męskiej. Częstość allelu ε u chorych chłopców wyosiła,, a ość osicieli tego allelu,, podczas gdy wśród zdrowych chłopców ie stwierdzoo osicieli allelu ε (p =, oraz p =, odpowiedio). Różice w rozkładzie ości geotypów i alleli pomiędzy grupą rodziców a grupą kotrolą ie były istote statystyczie. Zaczące różice stwierdzoo atomiast pomiędzy podgrupami chorych wyodrębioymi a podstawie ciężkości stau pacjeta w okresie ostrym, od początku wystąpieia objawów kliiczych oraz dalszego przebiegu choroby i widoczych astępstw odległych. W podgrupie w staie dość dobrym ość allelu ε była zaczie wyższa w porówaiu z podgrupą w staie ciężkim (, vs,, p =,). Podobe różice dotyczyły ości osicieli allelu ε (, vs,). Polimorfizm ACE. Dystrybucję wariatów polimorfizmu isercyjo/delecyjego geu ACE w badaych grupach przedstawia tabela III. Istote statystyczie różice w ościach alleli i geotypów między badaymi grupami przedstawioo w tabeli IV. W grupie pacjetów stwierdzoo wyższą ość allelu isercyjego oraz osicieli tego allelu iż w grupie kotrolej. Aaliza podgrup pacjetów w zależości od stau wykazała, że homozygotyczy geotyp II występuje zaczie częściej u pacjetów w staie ciężkim (,) w porówaiu do grupy pacjetów w staie dość dobrym (,). W podgrupie pacjetów w staie ciężkim ie stwierdzoo występowaia geotypu DD. W podgrupach kotrolych (a i b) ość geotypu II jest a porówywalym poziomie (odpowiedio, i,) i w porówaiu do grupy rodziców jest prawie -krotie iższa (,). Wykazae różice ie są zamiee statystyczie. Podobe tedecje zaobserwowao w dystrybucji alleli aalizowaego polimorfizmu geu ACE. Częstość allelu I jest wyższa w grupie pacjetów (,) iż w grupie kotrolej (,). Częstość allelu I w podgrupie pacjetów w staie ciężkim jest prawie dwukrotie wyższa w porówaiu do pacjetów w staie dość dobrym (, vs,). Nie stwierdzoo zamieych różic w ościach allelu I między rodzicami chorych dzieci (,) a podgrupą dobrowolych dawców krwi (,). Cała grupa pacjetów ( = ) charakteryzuje się ajiższą ością występowaia heterozygot ID. Częstości heterozygot ID w podgrupie pacjetów w staie dość dobrym (,) są iezaczie wyższe w porówaiu z podgrupą pacjetów w staie ciężkim (,). U rodziców pacjetów i w grupie kotrolej wartości te są a porówywalym poziomie (, vs,). Neurologia Dziecięca

9 Polimorfizm epsilo geu apolipoproteiy E i polimorfizm isercyjo-delecyjy geu ACE... Liczba osicieli allelu I (osoby z geotypami II + ID) w grupie pacjetów jest taka sama jak w grupie rodziców (, vs,). Najwyższą ość występowaia osicieli allelu I zaobserwowao w podgrupie pacjetów w staie ciężkim (,), ajiższą charakteryzuje się podgrupa pacjetów w staie dość dobrym (,). Różica ta ie jest istota statystyczie. Pomiędzy pozostałymi badaymi grupami ie stwierdzoo zamieych różic w występowaiu osicieli polimorficzego wariatu I polimorfizmu isercyjo/delecyjego geu ACE. Po zróżicowaiu badaych grup pod względem płci wykazao, że ajwyższą ością występowaia allelu I charakteryzuje się podgrupa dziewcząt po udarze i jest to wartość prawie dwukrotie wyższa w porówaiu do ości allelu I w grupie dziewcząt zdrowych (, vs,9, p =,). Liczba osicieli allelu I jest iezaczie wyższa u pacjetek po udarze (.9) w porówaiu do dziewcząt zdrowych (,). Nie stwierdzoo istotych różic w ości występowaia allelu I i osicieli allelu I między chorymi dziewczętami a dobrowolymi dawcami krwi płci żeńskiej, jak rówież pomiędzy chłopcami po udarze a chłopcami zdrowymi. W podgrupach płci męskiej ości występowaia allelu I i osicieli allelu I są a podobym poziomie. Otrzymae wyiki sugerują związek pomiędzy osicielstwem allelu ε a udarem iedokrwieym mózgu, szczególie u dzieci płci męskiej. Związek taki stwierdzoo w iektórych pracach u ludzi dorosłych [9]. W populacjach chorych dzieci ie badao do tej pory wpływu polimorfizmu geu APOE a ryzyko wystąpieia udaru. Nasze wstępe badaia wykazują, że geotyp APOE ma także wpływ a ciężkość stau pacjeta. Nieco zaskakujący może być fakt, że osoby w staie dobrym charakteryzują się zaczie wyższą ością osicieli allelu ε iż pacjeci w staie ciężkim. Być może wskazówką do wyjaśieia tego faktu są wyiki badań osób dorosłych po przebytym udarze iedokrwieym mózgu, które dowodzą, że z allelem ε związae jest zwiększoe przeżycie []. Jeśli podoby związek istiałby wśród chorych dzieci, możliwe byłoby, że wśród badaych przez as osób zwiększoa ość allelu ε jest wyikiem zwiększoego przeżycia pacjetów będących osicielami ε. Mogłoby to rówież wyjaśiać iską ość tego allelu w podgrupie w staie ciężkim. Dodatkowo iezgodość rozkładu geotypów i alleli z rówowagą Hardy-Weiberga może wskazywać, że pewe geotypy mogą być elimiowae z populacji chorych dzieci w związku ze śmiertelością. Obiecujące wyiki badań pilotowych, przedstawioe w iiejszej pracy, wymagają potwierdzeia a zaczie licziejszej populacji pacjetów. Aaliza większej liczby chorych dzieci wraz z rodzicami pozwoliłaby dodatkowo a potwierdzeie ewetualego związku daego polimorfizmu z chorobą przy użyciu wewątrzrodziego testu powiązań TDT (ag. trasmissio/disequilibrium test). Poieważ w populacji wieku rozwojowego schorzeia aczyiowe mózgu występują rzadziej iż u ludzi dorosłych, zamierzamy objąć badaiami geetyczymi przypadki udaru iedokrwieego mózgu u dzieci z iych regioów Polski. Piśmieictwo [] Brass L.M., Isaacsoh J.L., Merikagas K.R. et al.: A study of twis ad stroke. Stroke, 99:,. [] Kaste M., Koivisto P.: Risk of brai ifarctio i familial hypercholesterolemia. Stroke, 9:9, 9. [] Hoppe C., Klitz W., Cheg S. et al.: Gee iteractios ad stroke risk i childre with sickle cell aemia. Blood, :, 9. [] Liu Y., Pa J., Wag S. et al.: Beta-fibrioge gee -A/G polymorphism ad plasma fibrioge level i Chiese stroke patiets. Chi. Med. J. (Egl.), :,. [] Nowak-Gottl U., Strater R., Heiecke A. et al.: Lipoprotei (a) ad geetic polymorphisms of clottig factor V, prothrombi, ad methyleetetrahydrofolate reductase are risk factors of spotaeous ischemic stroke i childhood. Blood, 999:9,. [] Sharma P.: Meta-aalysis of the ACE gee i ischaemic stroke. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry., 99:,. [] Bedarska-Makaruk M., Wehr H.: Geetyka udarów. Czy. Ryzyka., :, 9. [] Człokowska A., Sarzyńska-Długosz I.: Geetycze podłoże udaru mózgu. [w:] Geetyka chorób układu krążeia. Red. Ciechaowicz A., Medycya Praktycza, Kraków, 9. [9] Balcerzyk A., Żak I.: Apolipoproteia E rola polimorfizmu w patogeezie liczych chorób. Postępy Biochemii, :,. [] Ruiz-Ortega M., Lorezo O., Ruperez M. et al.: Role of rei-agiotesi system i vascular diseases. Hypertesio, :,. [] Rigat B., Hubert C., Alhec-Gelas F. et al.: A isertio/deletio polymorphism i the agiotesi I-covertig ezyme gee accoutig for half the variace of serum ezyme levels. J. Cli. Ivest., 99:,. [] Cambie F., Poirier O., Lecerf L. et al.: Deletio polymorphism i the gee for agiotesi-covertig ezyme is a potet risk factor for myocardial ifarctio. Nature, 99:9,. Vol. /, Nr

10 Iwoa Żak, Aa Balcerzyk, Beata Sarecka et al. [] Arbustii E., Grasso M., Fasai R. et al.: Agiotesi covertig ezyme gee deletio allele is idepedetly ad strogly associated with coroary atherosclerosis ad myocardial ifarctio. Br. Heart J., 99:,. [] Żak I., Niemiec P., Sarecka B. et al.: Carrier-state of D allele i ACE gee isertio/deletio polymorphism is associated with coroary artery disease, i cotrast to the C T trasitio i the MTHFR gee. Acta Biochimica Poloica, :,. [] Friedewald W.T., Levy R.I., Fredrickso D.S.: Estimatio of the cocetratio of low-desity lipoprotei cholesterol i plasma without the use of preparative cetrifuge. Cli. Chem., 9:, 99. [] Hixso J.E., Verier D.T.: Restrictio isotypig of huma apolipoprotei E by gee amplificatio ad cleavage with HhaI. J. Lipid. Res., 99:,. [] Żak I., Sarecka B., Balcerzyk A. et al.: Polimorfizm PstI A C geu selektyy-e i udar iedokrwiey mózgu u dzieci: pilotowe badaia związków, część I. Neurol. Dziec., :,. [] Kopyta I., Emich-Widera E., Marszał E.: Udar iedokrwiey mózgu u dzieci aaliza przypadków ze szczególym uwzględieiem czyików ryzyka. Neurol. Dziec., :,. [9] McCarro M.O., Delog D., Alberts M.J.: APOE geotype as a risk factor for ischemic cerebrovascular disease: a metaaalysis. Neurology, 999:,. [] McCarro M.O., Muir K.W., Weir C.J. et al.: The apolipoprotei E epsilo allele ad outcome i cerebrovascular disease. Stroke, 99:9,. Adres autora: Katedra i Zakład Biochemii i Geetyki Medyczej - Katowice, ul. Medyków e mail: chembioch@slam.katowice.pl Neurologia Dziecięca