(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) IntCl7 A61K 35/78 A61K 33/26 (54) Sposób otrzymywania ferrytyny roślinnej (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/98 (73) Uprawniony z patentu: Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań, PL (72) Twórcy wynalazku: Joanna Smól, Poznań, PL Tomasz Twardowski, Kiekrz, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/03 (74) Pełnomocnik: Passowicz Marek, Biuro Usług Prawno-Technicznych, Dr. A. Au and Co. PL B1 (57) 1. Sposób otrzymywania ferrytyny roślinnej, znamiennej tym, że ze skiełkowanych nasion roślin z klasy dwuliściennych, korzystnie nasion łubinu żółtego lub też nasion szarłatu szorstkiego, poprzez zabiegi homogenizacji w homogenizatorze, przesączania przez filtr, wirowania w wirówce, wysalania roztworem soli amonowej i ponownego wirowania w wirówce, uzyskuje się osad, który po rozpuszczeniu w roztworze buforowym podgrzewa się aż do momentu wytrącenia osadu zdenaturowanego białka, po czym, po ostudzeniu i odwirowaniu, osad usuwa się, zaś pozostały supematant, po zakwaszeniu i wytrąceniu, poddaje się dalszemu wirowaniu, a następnie uzyskany osad, po rozpuszczeniu w roztworze buforowym, oczyszcza się poprzez ultrawirowanie i klarowanie.

2 Sposób otrzymywania ferrytyny roślinnej Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania ferrytyny roślinnej, znamiennej tym, że ze skiełkowanych nasion roślin z klasy dwuliściennych, korzystnie nasion łubinu żółtego lub też nasion szarłatu szorstkiego, poprzez zabiegi homogenizacji w homogenizatorze, przesączania przez filtr, wirowania w wirówce, wysalania roztworem soli amonowej i ponownego wirowania w wirówce, uzyskuje się osad, który po rozpuszczeniu w roztworze buforowym podgrzewa się aż do momentu wytrącenia osadu zdenaturowanego białka, po czym, po ostudzeniu i odwirowaniu, osad usuwa się, zaś pozostały supernatant, po zakwaszeniu i wytrąceniu, poddaje się dalszemu wirowaniu, a następnie uzyskany osad, po rozpuszczeniu w roztworze buforowym, oczyszcza się poprzez ultrawirowanie i klarowanie. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces skiełkowania nasion przeprowadza się korzystnie na podłożu nasyconym siarczanem żelazawym. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że nasiona, w celu skiełkowania, sterylizuje się powierzchniowo poprzez przemycie 70% etanolem i intensywne płukanie wodą destylowaną a następnie kąpie sieje przez okres od 3 do 9 godzin, w temperaturze pokojowej, w 10 do 50 mm roztworze siarczanu żelazawego, przy czym stężenie roztworu przyjmuje się na podstawie indeksu tolerancji nasiona dla roztworów tej soli według następującej zależności: indeks tolerancji = uzyskana długość korzeni w testowanym roztworze/uzyskana d ł u g o ś ć k o r z e n i w w o d z i e d e s t y l o w a n e j x 100%, po czym wysterylizowane i spęcznione nasiona rozmieszcza się na nasyconym mm roztworem siarczanu żelazawego podłożu, na okres od 5 do 10 dni, prowadząc proces kiełkowania przy świetle dziennym. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że skiełkowano nasiona, przed rozpoczęciem procesu izolacji ferrytyny, zamraża się. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że zabieg homogenizacji przeprowadza się w homogenizatorze, przy zastosowaniu roztworu buforowego A, który zawiera od 30 do 100 mm Tris-HCl o ph od 7,5 do 8,5 oraz od 20 do 40 mm chlorku sodu, po czym po przesączeniu uzyskanego homogenatu, wiruje się go na wirówce przez okres od 40 do 100 min., z prędkością od 3000 do rpm, a następnie, po wysoleniu siarczanem amonu do 65% wysycenia w temperaturze pokojowej i odstawieniu na okres od kilku do kilkunastu godzin w temperaturze bliskiej 0 C, uzyskany supematant ponownie poddaje się wirowaniu przez okres od 80 do 150 min., z prędkością od 3000 do rpm, aż do uzyskania osadu, który rozpuszcza się w roztworze buforowym A, zaś uzyskany roztwór, delikatnie mieszając, podgrzewa się do temperatury 65 do 75 C, a następnie po wytrąceniu osadu denaturowanego białka, mieszaninę schładza się i poddaje wirowaniu przez okres od 10 do 40 min., z prędkością od 3000 do rpm, po czym, po usunięciu osadu, supematant zakwasza się octanem sodu o ph od 4 do 5 i wytrąca siarczanem amonu, w zakresie od 0-50% wysycenia, oraz poddaje się wirowaniu przez okres od min., z prędkością od 3000 do rpm, a uzyskany na koniec osad rozpuszcza się w roztworze buforowym A. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że uzyskany wskutek izolacji ferrytyny preparat oczyszcza się poprzez ultrawirowanie na ultrawirówce przez okres od 1,5 do 3 godzin, z prędkością od do rpm, a następnie klaruje się go poprzez wirowanie na wirówce przez okres od 0,75 do 1,5 godz., z prędkością od 4000 do 7000 rpm. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że zabiegi oczyszczania i klarowania powtarza się wielokrotnie. * * *

3 Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ferrytyny roślinnej, zwłaszcza na drodze biotechnologicznej obróbki nasion roślin z klasy dwuliściennych, korzystnie nasion łubinu żółtego, a także nasion szarłatu szorstkiego. Ferrytyna jest rozpuszczalnym w wodzie kompleksem wodorotlenku żelazawego i białka - apoferrytyny, przy czym kompleksy ferrytyny roślinnej mają postać ziarenek o średnicy około 12 nm, utworzonych z cząstek o średnicy 5,5-7 nm, zaś każda cząstka stanowi strukturę składająca się z 6 podjednostek o średnicy 1,5 nm. Z kolei podjednostki są usytuowane w sześciu narożach ośmiościanu, który stanowi jej żelazowe jądro, otoczone płaszczem o grubości 2 nm z apoferrytyny. To centralne żelazowe jądro ma postać dużego wgłębienia, w którym jest lokowane magazynowane żelazo. Ferrytyna, występująca powszechnie w świecie organizmów żywych, a więc w komórkach kręgowców i bezkręgowców, u bakterii, grzybów i w roślinach wyższych, jest wyjątkowym białkiem ze względu na zdolność gromadzenia ogromnych ilości żelaza, tj. do 4500 atomów na cząstkę białka. Może służyć jako zbiornik i źródło żelaza dla wielu procesów metabolicznych komórki wymagających tego pierwiastka, np. do transportu elektronów i tlenu, redukcji azotu oraz syntezy DNA. Ferrytyna roślinna występuje głównie w tkankach nie uczestniczących w fotosyntezie, mających za zadanie detoksyfikację układu biologicznego w przypadku nadmiaru żelaza, a więc w korzeniach i brodawkach roślin motylkowych, nasionach, w komórkach generatywnych i starzejących się oraz w mezofilu liści aktywnych fotosyntetycznie przy wysokim poziomie żelaza w ksylemie. Właściwości ferrytyny, zarówno roślinnej jak i zwierzęcej, jej znaczenie w procesach zachodzących w organizmach żywych, zostały między innymi opisane przez A. Korcz, T. Twardowskiego w Tomie 16, Nr 2, 1989 ( ) Postępów biologii komórki, w art. pt.: Mechanizmy regulacji biosyntezy białka na przykładzie ferrytyny. Dotychczas ferrytynę roślinną zlokalizowano wewnątrzkomórkowo w plastydach. np. amyloplastach soi i innych roślin motylkowych, w chloroplastach fasoli oraz w tkance brodawek korzeniowych. Według znanego stanu techniki nie ma możliwości otrzymywania ferrytyny roślinnej, którą byłoby można wykorzystać zarówno dla celów badawczych jak i farmaceutycznych. Istota wynalazku polega na tym, że ze skiełkowanych nasion roślin z klasy dwuliściennych, korzystnie nasion łubinu żółtego lub też nasion szarłatu szorstkiego, poprzez zabiegi homogenizacji w homogenizatorze, przesączania przez filtr, wirowania w wirówce, wysalania roztworem soli amonowej i ponownego wirowania w wirówce, uzyskuje się osad, który po rozpuszczeniu w roztworze buforowym podgrzewa się aż do momentu wypadnięcia osadu zdenaturowanego białka, po czym, po ostudzeniu i odwirowaniu, osad usuwa się, zaś pozostały supematant, po zakwaszeniu i wytrąceniu, poddaje się dalszemu wirowaniu, a następnie uzyskany osad, po rozpuszczeniu w roztworze buforowym, oczyszcza się poprzez ultrawirowanie i klarowanie. Korzystnym jest gdy proces skiełkowania nasion przeprowadza się korzystnie na podłożu nasyconym siarczanem żelazawym. Jednocześnie korzystnym jest gdy nasiona, w celu skiełkowania, sterylizuje się powierzchniowo poprzez przemycie 70% etanolem i intensywne płukanie wodą destylowaną, a następnie kąpie się je przez okres od 3 do 9 godzin, w temperaturze pokojowej, w 10 do 50 mm roztworze siarczanu żelazawego, przy czym stężenie roztworu przyjmuje się na podstawie indeksu tolerancji nasiona dla roztworów tej soli według następującej zależności: indeks tolerancji = uzyskana długość korzeni w testowanym roztworze/ uzyskana długość korzeni w wodzie destylowanej x10%, po czym wysterylizowane i spęcznione nasiona rozmieszcza się na nasyconym mm roztworem siarczanu żelazawego podłożu, na okres od 5 do 10 dni, prowadząc proces kiełkowania przy świetle dziennym.

4 Korzystnym jest także gdy skiełkowano nasiona, przed rozpoczęciem procesu izolacji ferrytyny, zamraża się. Ponadto korzystnym jest gdy zabieg homogenizacji przeprowadza się w homogenizatorze, przy zastosowaniu roztworu buforowego A, który zawiera od 30 do 100 mm Tris-HCl o ph od 7.5 do 8,5 oraz od 20 do 40 mm chlorku sodu, po czym, po przesączeniu uzyskanego homogenatu, wiruje się go na wirówce przez okres od 40 do 100 min, z prędkością od 3000 do rpm, a następnie, po wysoleniu siarczanem amonu do 65% wysycenia w temperaturze pokojowej i odstawieniu na okres do kilku do kilkunastu godzin w temperaturze bliskiej 0 C, uzyskany supematant ponownie poddaje się wirowaniu przez okres od 80 do 150 min, z prędkością od 3000 do rpm, aż do uzyskania osadu, który rozpuszcza się w roztworze buforowym A, zaś uzyskany roztwór, delikatnie mieszając, podgrzewa się do temperatury od 65 do 75 C, a następnie, po wypadnięciu osadu zdenaturowanego białka, mieszaninę schładza się i poddaje wirowaniu przez okres od 10 do 40 min, z prędkością od 3000 do rpm, po czym, po usunięciu osadu, supematant zakwasza się octanem sodu o ph od 4,0 do 5,0 i wytrąca siarczanem amonu, w zakresie od 0 do 50% wysycenia oraz poddaje się wirowaniu przez okres od 40 do 100 min, z prędkością od 3000 do rpm, a uzyskany na koniec osad rozpuszcza się w roztworze buforowym A. Dalej korzystnym jest gdy uzyskany wskutek izolacji ferrytyny preparat oczyszcza się poprzez ultrawirowanie na ultrawirówce przez okres od 1,5 do 3 godz., z prędkością od do rpm, a następnie klaruje się go poprzez wirowanie na wirówce przez okres od 0,75 do 1,5 godz., z prędkością od 4000 do 7000 rpm. Na koniec korzystnym jest gdy zabiegi oczyszczania i klarowania powtarza się wielokrotnie. Przedstawiony sposób umożliwia uruchomienie produkcji ferrytyny roślinnej na skalę laboratoryjną. Natomiast użycie w procesie produkcji wzbogaconego siarczanem żelazawym podłoża, które czterokrotnie intensyfikuje wydajność tego procesu - w porównaniu z wynikami uzyskanymi z użyciem podłoża nasączonego wodą destylowaną, uzasadnia podjęcie produkcji ferrytyny roślinnej co najmniej na skalę półprzemysłową. Z kolei prowadzenie procesu produkcyjnego na skalę ponad laboratoryjną umożliwia uzyskanie ferrytyny roślinnej nie tylko dla celów badawczych lecz także dla celów konsumpcyjnych, zwłaszcza w postaci preparatów farmaceutycznych, zawierających - nie spotykane do tej pory w tego typu specyfikach - szczególnie korzystne dla organizmów żywych żelazo trójwartościowe. Sposób według wynalazku zostanie przedstawiony na podstawie 2-ch przykładów, z zastosowaniem nasion łubinu żółtego w pierwszym przykładzie oraz nasion szarłatu szorstkiego w drugim przykładzie. Ponadto, w celu lepszego zobrazowania sposobu, załączono do opisu zdjęcia, na których przedstawiono: - na fig. 1 - widok 7-dniowych kiełków nasion łubinu żółtego hodowanych na podłożu nasączonym wodą destylowaną, - na fig. 2 - widok 7-dniowych kiełków nasion łubinu żółtego hodowanych na podłożu wzbogaconym 25 mm siarczanem żelazawym, - na fig. 3 - obraz elektroforetyczny ferrytyny wyizolowanej z kiełków pokazanych na fig. 2. Przykład 1 Nasiona łubinu żółego - odmiana Topaz poddawano powierzchniowej sterylizacji przez przemycie 70% etanolem, potem płukano je intensywnie wodą destylowaną. Następnie pozostawiano je na 3-9 godzin w temperaturze pokojowej w mm roztworze siarczanu żalazawego. Stosowano ml FeSO4, na 100 g nasion. Stężenie FeSO4, stosowane w doświadczeniach wybrano na podstawie określenia indeksu tolerancji łubinu dla roztworów tej soli oznaczonego wg wzoru: indeks tolerancji = uzyskana długość korzeni w testowanym roztworze/uzyskana d ł u g o ś ć k o r z e n i w w o d z i e d e s t y l o w a n e j x 100%,

5 Po spęcznieniu nasiona przenoszono na kuwety wyłożone ligniną, którą zwilżano świeżo przygotowanym roztworem mm FeSO4. Hodowlę prowadzono przy świetle dziennym przez 5-10 dni. Do doświadczeń używano skiełkowanych nasion pozbawionych okrywy nasiennej. Materiał biologiczny zamrażano w zamrażarce lub szokowo w ciekłym azocie. Nasiona stosowane w doświadczeniach miały siłę kiełkowania ok. 98%. Ferrytynę izolowano ze skiełkowanych nasion łubinu hodowanych na FeSO4 otrzymując ferrytynę (bogatą w żelazo). Izolację ferrytyny prowadzono zgodnie z następującą procedurą: g materiału biologicznego homogenizowano porcjami w ml buforu A zawierającego mm Tris - HCl ph 7,5-8,5 i mm NaCl, przy użyciu homogenizatora. Po homogenizacji homogenat przesączano przez podwójną gazę i wirowano min/ rpe w wirówce preparatywnej Beckman (rotor JS 7,5). Supematant wysalano siarczanem amonu do 65% wysycenia w temperaturze pokojowej i pozostawiono na noc w temperaturze bliskiej zera. Następnie preparat wirowano min/ rpm, supematant odrzucono, osad natomiast rozpuszczano w ml buforu A. Roztwór podgrzewano na łaźni wodnej do temperatury C, delikatnie mieszając termometrem, aż do wypadnięcia osadu zdenaturowanego białka. Mieszaninę chłodzono i wirowano min/ rpm. Osad odrzucano, a supematant zakwaszano 0,5-1,5 M octanem sodu ph 4,0-5,0 i wytrącano siarczanem amonu w zakresie 0-50% wysycenia. Preparat po wysoleniu wirowano min/ rpm, odrzucano supematant, a osad rozpuszczano w ml buforu A otrzymując preparat o zawartości ferrytyny ok %. Preparat ten zamrażano lub bezpośrednio poddawano oczyszczaniu. Preparat oczyszczano przez ultrawirowanie na ultrawirówce Beckman (rotor 50.1 Ti) przez 1,5-3 godz/ rpm. Po ultrawirowaniu supematant odrzucano, osad starannie rozpuszczano i klarowano przez wirowanie na wirówce preparatywnej Beckman (rotor JA 17) przez 0,75-1,5 godz/ rpm. Procedurę ultrawirowania i klarowania powtarzano (zazwyczaj czterokrotnie), aż do otrzymania homogennego preparatu ferrytyny zawierającego 2 podjednostki, co stwierdzono przy pomocy elektroforezy, której obraz przedstawiono na fig. 3. Poszczególne kolumny na tym obrazie oznaczają: 1. surowy ekstrakt 2. po I ultrawirowaniu i klarowaniu 3. po II ultrawirowaniu i klarowaniu 4. po III ultrawirowaniu i klarowaniu 5. po IV ultrawirowaniu i klarowaniu 6. standardy ciężaru cząsteczkowego: 97,5 kda; 66 kda; 45 kda; 31 kda; 21,5 kda; 14 kda Po każdym etapie procesu oczyszczania mierzono charakterystyczne parametry właściwe dla procesu. Pozwoliło to na dokonanie bilansów oczyszczania ferrytyny, co uwidoczniono w tab.1 i 2. Z porównania bilansów oczyszczania wynika, że żelazo spowodowało 4-krotną stymulację syntezy ferrytyny. Otrzymano bowiem 4 razy więcej białka z łubinu hodowanego na FeSO4. Tabela 1 Bilans oczyszczania ferrytyny wyizolowanej ze 452 g skiełkowanych nasion łubinu żółtego hodowanych na wodzie destylowanej Etap oczyszczania ml c [mg/ml] Totalna ilość białka [mg] wydajność % 0 - surowy ekstrakt* , , I - ultrawirowanie 62 7,62 472,44 3,6 II - ultrawirowanie 32 2,49 79,68 0,6 III- ultrawirowanie 20 1,1 26,2 0,2 IV - ultrawirowanie 19,9 0,75 14,63 0,1

6 Tabela 2 Bilans oczyszczania ferrytyny wyizolowanej ze 125g skiełkowanych nasion łubin żółtego hodowanych na FeSO4 Etap oczyszczania ml c [mg/ml] Totalna ilość białka [mg] Wydajność % 0 - surowy ekstrakt* ,6 4375,8 100 I - ultrawirowanie 62 3,69 228,78 5,2 II - ultrawirowanie 32 1,43 45,76 1,04 III- ultrawirowanie 20 1,19 23,8 0,5 IV - ultrawirowanie 19,5 0,68 13,26 0,3 po odwracalnej denaturacji termicznej i kwasowej oraz po wysalaniu (NH4)2SO4 Przykład 2 Kolejnym materiałem badawczym był szarłat szorstki (Amaranthus retroflexus). Materiał do izolacji przygotowano zgodnie z metodą postępowania stosowaną wcześniej w przypadku łubinu żółtego. Głównym materiałem były nasiona. Hodowano je na FeSO4, i na H2O destylowanej. Otrzymane siewki poddawano izolacji metodą opracowaną dla łubinu. W trakcie podgrzewania białka otrzymano zdenaturowany osad białka. Ferryty na ta (podobnie jak łubinowa) ulegała odwracalnej denaturacji. Można stąd wnioskować, że również ona charakteryzuje się dużą stabilnością termiczną (porównywalną ze stabilnością ferrytyny łubinowej). W następnym etapie supematant zakwaszano octanem sodu. Spowodowało to identyczną zmianę ph jak w przypadku łubinu. Ferrytyna z szarłatu również podczas tego procesu ulegała odwracalnej denaturacji. Wykazuje więc jednocześnie stabilność kwasową. Jest to kolejny dowód na jej podobieństwo do ferrytyny łubinowej. Podczas izolacji obie ferrytyny (izolowana z siewek na FeSO4 i z siewek na H2O destylowanej) zachowywały się identycznie - to następny dowód jej podobieństwa do łubinowej. Również i w tym przypadku otrzymany po izolacji surowy preparat ferrytyny poddawano oczyszczaniu poprzez ultrawirowanie i klarowanie. Do otrzymania homogennego preparatu ferrytyny szarłatowej wystarczył jeden cykl oczyszczania. Czystość preparatu określano stosując także elektroforezę białkową w warunkach denaturujących. Po izolacji i oczyszczaniu zmierzono objętość otrzymanego supematantu i oznaczono w nim zawartość białka. Pozwoliło to na dokonanie bilansu oczyszczania ferrytyny szarłatowej (porównaj tab. 3 i 4). Z porównania bilansów oczyszczania wynika, że żelazo również i w przypadku szarłatu szorstkiego spowodowało prawie 4-krotną stymulację syntezy ferrytyny. Tabela 3 Bilans oczyszczania ferrytyny wyizolowanej ze 25 g skiełkowanych nasion szarłatu szorstkiego hodowanych na FeSO 4 Etap oczyszczania ml c [mg/ml] Totalna ilość białka [mg] Wydajność % 0 - surowy ekstrakt 45 1, I - ultrawirowanie 35 0,8 13,3 24,6 Tabela 4 Bilans oczyszczania ferrytyny wyizolowanej z 15 g skiełkowanych nasion szarłatu szorstkiego hodowanych na H2O destylowanej Etap oczyszczania ml c [mg/ml] Totalna ilość białka [mg] Wydajność % 0 - surowy ekstrakt 25 0, ultrawirowanie 20 0, po odwracalnej denaturacji termicznej i kwasowej oraz po wysalaniu (NH4)2SO4

7 Fig. 3

8 Fig. 1 Fig. 2 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.