(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/36 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 9/04 ( ) C07K 14/34 ( ) C12P 13/08 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Zmutowane allele genu ZWG (G6PDH) z bakterii maczugowatych do zwiększonego wytwarzania lizyny (30) Pierwszeństwo: DE WO PCT/EP2006/ (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/49 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/02 (73) Uprawniony z patentu: Evonik Degussa GmbH, Essen, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 BRIGITTE BATHE, Salzkotten, DE NATALIE SCHISCHKA, Bielefeld, DE GEORG THIERBACH, Bielefeld, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska JAN WIERZCHOŃ & PARTNERZY BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. ul. Żurawia 47/ Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 15028/12/P-RO/MW/KM EP Zmutowane allele genu ZWG (G6PDH) z bakterii maczugowatych do zwiększonego wytwarzania lizyny Opis [0001] Przedmiotem wynalazku są mutanty i allele genu zwf bakterii maczugowatych kodującego warianty podjednostki Zwf dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (EC: ) oraz sposób wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny i L-tryptofanu przez zastosowanie bakterii, które zawierają te allele. Stan techniki [0002] Aminokwasy znajdują zastosowanie w medycynie człowieka, w przemyśle farmaceutycznym, w przemyśle spożywczym a szczególnie w żywieniu zwierząt. [0003] Wiadomo, że aminokwasy są wytwarzane przez fermentację szczepów bakterii maczugowatych, w szczególności Corynebacterium glutamicum. Ze względu na wielkie znaczenie stale pracuje się nad ulepszeniem sposobu wytwarzania. Ulepszenia sposobu mogą dotyczyć przemysłowych środków fermentacji jak na przykład, mieszania i zaopatrzenia w tlen, lub składu pożywek, jak na przykład stężenia cukru podczas fermentacji, lub obróbki do postaci produktu na przykład przez chromatografię jonowymienną lub same wewnętrzne cechy wydajności mikroorganizmu. [0004] Dla ulepszenia cech wydajności tych mikroorganizmów wykorzystane są sposoby mutagenezy, selekcji i doboru mutantów. Tak otrzymuje się szczepy, które są oporne na antymetabolity lub auksotroficzne dla ważnych dla regulacji metabolitów i wytwarzają aminokwasy. Znanym antymetabolitem jest analog lizyny S-(2-aminoetylo)-L-cysteina (AEC). [0005] Od kilku lat stosowane są również sposoby techniki rekombinowanego DNA dla ulepszania szczepów ze szczepów Corynebacterium wytwarzających L-aminokwasy przez wzmacnianie poszczególnych genów biosyntezy aminokwasów i badanie oddziaływania na wytwarzanie aminokwasów. Podsumowujące przedstawienie najbardziej zróżnicowanych aspektów genetyki, przemiany materii oraz biotechnologii Corynebacterium glutamicum znajduje się w Pühler (chief ed.) w Journal of Biotechnology 104 (1-3), 1-338, [0006] Sekwencja nukleotydów genu kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową Corynebacterium glutamicum jest ogólnie dostępna między innymi w banku danych National Center for Biotechnology Information (NCBI) National Library of Medicin (Bethesda, MD, USA). Może ona być poza tym wzięta z WO 01/00844 jako sekwencja NO 243 (= AX065117). [0007] W WO 01/70995 opisane jest ulepszenie wytwarzania fermentacyjnego L-aminokwasów przez bakterie maczugowate przez wzmocnienie genu zwf. [0008] W WO 01/98472, WO 03/ i US 2003/ A1 donosi się o nowych mutacjach w genie zwf.

3 - 2 - [0009] Moritz i wsp. (European Journal of Biochemistry 267, (2000)) donoszą o badaniach fizjologicznych i biochemicznych dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z Corynebacterium glutamicum. Według badań Moritza i wsp. dehydrogenaza glukozo-6- fosforanowa składa się z podjednostki Zwf oraz podjednostki OpcA. [0010] Mikrobiologiczna biosynteza L-aminokwasów w bakteriach maczugowatych jest złożonym układem połączonym w komórce wielowarstwowo z różnymi innymi szklakami przemiany materii. Stąd nie można wcześniej przewidzieć, która mutacja zmienia aktywność katalityczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej w ten sposób, że ulepszane jest wytwarzanie L-aminokwasów. Dlatego pożądane jest mieć do dyspozycji kolejne warianty dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. [0011] W celu większej przejrzystości przedstawiona jest sekwencja nukleotydów genu zwf ("dzikiego typu genu") kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową względnie podjednostkę Zwf dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej z Corynebacterium glutamicum według danych banku danych NCBI w SEQ ID NO:1 oraz powstała z niej sekwencja aminokwasów kodowanej w SEQ ID NO:2 i 4 dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej. W SEQ ID NO:3 podane są dodatkowo położone zgodnie z kierunkiem (upstream) i przeciwnie do kierunku (downstream) sekwencje nukleotydów. Zadanie wynalazku [0012] Wynalazcy postawili sobie za zadanie zapewnić nowe środki do ulepszenia wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny i L-tryptofanu. Opis wynalazku [0013] Przedmiotem wynalazku są uzyskane, względnie izolowane mutanty bakterii maczugowatych, które wydzielają korzystnie aminokwasy, oraz które zawierają gen lub allel, który koduje polipeptyd z aktywnością dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, charakteryzujący się tym, że polipeptyd obejmuje sekwencję aminokwasów według SEQ ID NO:2, przy której na pozycji 321 zawarta jest L-lizyna. [0014] Polipeptyd, który zawarty jest w mutantach, może być również określany jako polipeptyd Zwf lub podjednostka Zwf dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. [0015] U bakterii maczugowatych korzystny jest gatunek Corynebacterium. Szczególnie korzystne są szczepy wydzielające aminokwasy, w oparciu o następujące rodzaje: Corynebacterium efficiens, jak na przykład szczep DSM44549, Corynebacterium glutamicum, jak na przykład szczep ATCC13032, Corynebacterium thermoaminogenes jak na przykład szczep FERM BP-1539, i Corynebacterium ammoniagenes, jak na przykład szczep ATCC6871, przy czym rodzaj Corynbacterium glutamicum jest szczególnie bardzo korzystny. [0016] Niektórzy przedstawiciele rodzaju Corynebacterium glutamicum są znani w stanie techniki również pod innymi określeniami rodzaju. Tutaj należą przykładowo:

4 - 3 - Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, i Brevibacterium divaricatum ATCC [0017] Znanymi przedstawicielami szczepów bakterii maczugowatych wydzielających aminokwasy są przykładowo szczepy wytwarzające L-lizynę Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) opisane w EP , Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) opisane w Menkel i wsp. (Applied and Environmental Microbiology 55(3), (1989)), Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) opisany w EP , Corynebacterium glutamicum NRRL B opisany w US 4,275,157 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP-3304) opisany w US 5,250,423, lub wytwarzające L-tryptofan szczepy Corynebacterium glutamicum K76 (=FermBP-1847) opisane w US 5,563,052, Corynebacterium glutamicum BPS13 (=FermBP-1777) opisany w US 5,605,818, i Corynebacterium glutamicum FermBP-3055 opisany w US 5,235,940. [0018] Dane o klasyfikacji taksonomicznej szczepów tej grupy bakterii znajdują się między innymi w Seiler (Journal of General Microbiology 129, (1983)), Kämpfer i Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, (1996)), Liebl i wsp. (International Journal of Systematic Bacteriology 41, (1991)) oraz w US-A- 5,250,434. [0019] Szczepy z oznaczeniem "ATCC" mogą być powiązane z American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Szczepy z oznaczeniem "DSM" mogą być powiązane z Niemieckim Zbiorem Mikroorganismów i Hodowli Komórkowej (DSMZ, Braunschweig, Niemcy). Szczepy z oznaczeniem "NRRL" można uzyskać od Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US). Szczepy z oznaczeniem "FERM" można uzyskać z National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japonia). Wymienione szczepy Corynebacterium thermoaminogenes (FERM BP-1539, FERM BP- 1540, FERM BP-1541 i FERM BP-1542) są opisane w US-A 5,250,434. [0020] Przez proteinogenne aminokwasy rozumie się aminokwasy, które występują w naturalnych białkach, to znaczy białkach mikroorganizmów, roślin, zwierząt i ludzi. Należą tu zwłaszcza L-aminokwasy, wybrane z grupy kwasu L-asparaginowego, L-asparaginy, L-treoniny, L-seryny, kwasu L-glutaminowego, L-glutaminy, glicyny,

5 - 4 - L-alaniny, L-cysteiny, L-waliny, L-metioniny, L-isoleucyny, L-leucyny, L-tyrozyny, L-fenyloalaniny, L-histydyny, L-lizyny, L-tryptofanu, L-proliny i L-argininy. Do L-aminokwasów należy również L-homoseryna. [0021] Mutanty według wynalazku wydzielają korzystnie wymienione proteinogenne aminokwasy, w szczególności L-lizynę i L-tryptofan. Termin aminokwasy obejmuje rownież ich sole, jak przykładowo monochlorowodorek lizyny lub siarczan lizyny w przypadku aminokwasu lizyny. [0022] Przedmiotem wynalazku są ponadto mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który obejmuje sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO:2, przy czym na pozycji 321 zawarta jest L-lizyna. Ewentualnie sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera ponadto w pozycji 8 substytucję aminokwasu L-seryny na inny aminokwas białkotwórczy, korzystnie L-treoninę. Opis ujawnia ponadto mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycji odpowiadającej pozycji 321 sekwencji aminokwasów SEQ ID NO:2 każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, korzystnie L-serynę, przy czym gen obejmuje sekwencję nukleotydów, która jest identyczna z sekwencją nukleotydów polinukleotydu, który można otrzymać poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy zastosowaniu pary primerów, których sekwencja nukleotydów obejmuje każdorazowo co najmniej 15 następujących po sobie nukleotydów, które wybierane są z sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 1 a 307 z SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11 i z komplementarnej sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 2100 a 1850 SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11. Przykłady tego rodzaju odpowiednich par primerów przedstawione są w SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:18 i w SEQ ID NO:19 i SEQ ID NO:20. Jako materiał wyjściowy ("szablonowe"-dna) korzystne jest DNA chromosomalne bakterii maczugowatych, które w szczególności zostało poddane działaniu mutagenu. Szczególnie korzystne jest chromosomalne DNA gatunku Corynebacterium i w szczególności korzystne rodzaju Corynebacterium glutamicum. [0023] Opis ujawnia ponadto mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej, który obejmuje sekwencję aminokwasów o długości 514 L-aminokwasów, przy czym na pozycji 321 zawarty jest każdy białkotwórczy L-aminokwas z wyjątkiem glicyny, korzystnie L-seryna. Ewentualnie sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera ponadto substytucję aminokwasu L-seryny na inny aminokwas, korzystnie L-treoninę, na pozycji 8. [0024] Opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycjach 312 do 330 sekwencji aminokwasów sekwencję aminokwasów odpowiadającą pozycji 312 do 330 SEQ ID NO:6 lub 8. Korzystnie sekwencja aminokwasów

6 - 5 - kodowanego polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasów odpowiadającą pozycji 307 do 335 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 292 do 350 z SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 277 do 365 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 262 do 380 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 247 do 395 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 232 do 410 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 202 do 440 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 172 do 470 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 82 do 500 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 2 do 512 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 2 do 513 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 2 do 514 SEQ ID NO:6 lub 8. Szczególnie bardzo korzystnie długość kodowanego polipeptydu obejmuje 514 aminokwasów. [0025] Opis ujawnia ponadto mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej, który zawiera na pozycji 321 względnie w odpowiedniej pozycji sekwencji aminokwasów każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, przy czym korzystna jest substytucja na L-serynę i ta sekwencja aminokwasów jest poza tym przynajmniej w 92% lub co najmniej w 94%, i szczególnie bardzo korzystnie w co najmniej 97% lub co najmniej w 98% lub co najmniej w 99% identyczna z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO:6. Przykładem sekwencji aminokwasów, które mają co najmniej 99% identyczności z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO:6 jest pokazana w SEQ ID NO: 8 i 10. Polipeptyd tej dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej ma dodatkowo do substytucji aminokwasów w pozycji 321 substytucję aminokwasu L- seryny na L-treoninę w pozycji 8. [0026] Opis ujawnia ponadto mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej, który zawiera na pozycji 321 względnie w odpowiedniej pozycji sekwencji aminokwasów każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, przy czym korzystna jest substytucja na L-serynę i ta sekwencja aminokwasów jest poza tym przynajmniej w 92% lub co najmniej w 94%, i szczególnie bardzo korzystnie w co najmniej 96% lub co najmniej w 97% lub co najmniej w 98% lub co najmniej w 99% identyczna z sekwencją nukleotydów SEQ ID NO:5, jest pokazana w SEQ ID NO:7. Sekwencja nukleotydów tego allelu zwf ma dodatkowo do substytucji nukleotydu guaniny na adeninę w pozycji 961 (patrz SEQ ID NO:5), substytucję nukleotydu tyminy na adeninę w pozycji 22 (patrz SEQ ID NO:7). Kolejnym przykładem sekwencji nukleotydów allelu zwf, który ma przynajmniej 99% identyczności z sekwencją nukleotydów z SEQ ID NO:5, jest pokazana w SEQ ID NO:9. Sekwencja nukleotydów tego allelu zwf ma dodatkowo do substytucji nukleotydu guaniny na adeninę w pozycji 961(patrz SEQ ID NO:5) i substytucji nukleotydu tyminy na adeninę w pozycji 22 (patrz SEQ ID NO:7) substytucje nukleotydów cytozyny na tyminę w pozycji 138, cytozyny na tyminę w pozycji 279, tyminy na cytozynę w pozycji 738, cytozyny na tyminę w pozycji 777 i guaniny na adeninę w pozycji 906 (patrz SEQ ID NO:9). [0027] Wiadomo, że konserwatywne substytucje aminokwasów mogą zmieniać aktywność enzymu jedynie nieznacznie. W związku z tym zawarty w mutantach allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-

7 - 6 - fosforanowej zawiera dodatkowo do pokazanej w SEQ ID NO:6 i SEQ ID NO:8 względnie SEQ ID NO:10 sekwencji aminokwasów jedną (1) lub więcej konserwatywną(ych) wymian aminokwasu(ów). Korzystnie polipeptyd zawiera co najwyżej dwie (2), co najwyżej trzy (3), co najwyżej cztery (4) lub co najwyżej pięć (5) konserwatywnych wymian aminokwasów. [0028] Przy aminokwasach aromatycznych mówi się o wymianach konserwatywnych, jeżeli wymienione zostają na siebie fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna. Przy aminokwasach hydrofobowych mówi się o wymianach konserwatywnych, jeżeli wymienione zostają na siebie leucyna, izoleucyna i walina. Przy aminokwasach polarnych mówi się o wymianach konserwatywnych, jeżeli wymienione zostają na siebie glutamina i asparagina. Przy aminokwasach zasadowych mówi się o wymianach konserwatywnych, jeżeli wymienione zostają na siebie arginina, lizyna i histydyna. Przy aminokwasach kwaśnych mówi się o wymianach konserwatywnych, jeżeli wymienione zostają na siebie kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Przy aminokwasach zawierających grupy hydroksylowe mówi się o wymianach konserwatywnych, jeżeli wymienione zostają na siebie seryna i treonina. [0029] Przykładem konserwatywnej substytucji aminokwasu jest wymiana seryny na treoninę w pozycji 8 SEQ ID NO:6, która prowadzi do sekwencji aminokwasów według SEQ ID NO:8, względnie SEQ ID NO:10. [0030] Przy pracy nad niniejszym wynalazkiem stwierdzono przez porównanie sekwencji aminokwasów za pomocą oprogramowania Clustal (Thompson i wsp., Nucleic Acids Research 22, (1994)), że sekwencje aminokwasów dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej różnych bakterii jak przykładowo Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Streptomyces coeliclor, Streptomyces avermitilis, Corynebacterium efficiens i Corynebacterium glutamicum zawierają motyw sekwencji składający się z sekwencji Val-Ile-Phe-Gly-Ali-Afa-Gly-Asp- Leu, motyw sekwencji składający się z sekwencji Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys i również motyw sekwencji składający się z sekwencji Arg-Trp-Ala-Gly-Val-Pro-Phe-Tyr- Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg. Oznaczenie "Ali" oznacza aminokwasy Ala lub Val, oznaczenie "Afa" aminokwasy Lys lub Thr a oznaczenie "Bra" aminokwasy Ile lub Leu. [0031] Korzystne są odpowiednie takie mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, kodujący polipeptyd o aktywności enzymatycznej dehydrogenazy glukozo-6- fosforanowej, który obejmuje co najmniej jedną sekwencję aminokwasów wybraną z grupy Val-Ile-Phe-Gly-Ali-Afa-Gly-Asp-Leu, Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys i Arg- Trp-Ala-Gly-Val-Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg i na pozycji 321 przykładowo odpowiedniej lub porównywalnej pozycji sekwencji aminokwasów każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, korzystnie L-serynę. Ewentualnie sekwencja aminokwasów polipeptydu ma substytucję aminokwasu L-seryny na inny aminokwas białkotwórczy, korzystnie L-treoninę, w pozycji 8 według SEQ ID NO:2. [0032] Motyw sekwencji aminokwasów Val-Ile-Phe-Gly-Val-Thr-Gly-Asp-Leu jest zawarty przykładowo w SEQ ID NO:6, 8 lub 10 w pozycji 32 do 40. Motyw sekwencji

8 - 7 - aminokwasów Arg-Ile-Asp-His-Tyr-Leu-Gly-Lys jest zawarty przykładowo w SEQ ID NO:6, 8 lub 10 w pozycji 203 do 210. Motyw sekwencji aminokwasów Arg-Trp-Ala-Gly- Val-Pro-Phe-Tyr-Leu-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg jest zawarty przykładowo w SEQ ID NO:6, 8 lub 10 w pozycji 354 do 367. [0033] Przedmiotem wynalazku są wreszcie mutanty bakterii maczugowatych, które zawierają allel zwf, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który obejmuje sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO:6 lub SEQ ID NO:8, ewentualnie SEQ ID NO:10. [0034] Wiadomo, że przez właściwe dla gospodarza enzymy, tak zwane aminowertydazy, zostaje usunięta obecna na końcu metionina przy syntezie białek. [0035] Pod pojęciem "pozycji odpowiedniej do pozycji 321 sekwencji aminokwasów" lub "pozycji porównywalnej do pozycji 321 sekwencji aminokwasów" rozumie się fakt, że przez insercję lub delecję kodującego aminokwas kodonu w obszarze N-końcowym (w zależności od pozycji 321 SEQ ID NO:6, 8 lub 10) kodowanego polipeptydu specyfikacja pozycji lub specyfikacja długości może być podniesiona w przypadku insercji formalnie o jedną jednostkę lub w przypadku delecji zmniejszona o jedną jednostkę. Przykładowo przez delecję kodującego aminokwas L-asparaginę kodonu AAC w pozycji 4 SEQ ID NO:6, 8 lub 10 L-seryna przesuwa się z pozycji 321 na pozycję 320. Specyfikacja długości wynosiłaby wówczas: 513 aminokwasów. W taki sam sposób przez insercję lub delecję kodującego aminokwas kodonu w obszarze C-końcowym (w zależności od pozycji 321) kodowanego polipeptydu specyfikacja długości może być podniesiona w przypadku insercji formalnie o jedną jednostkę lub w przypadku delecji zmniejszona o jedną jednostkę. Tego rodzaju porównywalne pozycje dają się łatwo identyfikować przez porównanie sekwencji aminokwasów w postaci "alignments" (wyrównań) przykładowo za pomocą oprogramowania Clustal. [0036] Przez tego rodzaju insercje i delecje aktywność enzymatyczna nie jest istotnie dotknięta. "Nie jest istotnie dotknięta" oznacza, że aktywność enzymatyczna wymienionego wariantu różni się o maksymalnie 5%, maksymalnie 2,5% lub maksymalnie 1% od aktywności polipeptydu o sekwencją aminokwasów SEQ ID NO:6 lub 8, względnie 10. [0037] Przedmiotem wynalazku są odpowiednio mówiąc również allele zwf, które kodują warianty SEQ ID NO:6 lub 8 względnie 10, które zawierają jedną lub maksymalnie 5, maksymalnie 4, maksymalnie 3 lub maksymalnie 2 insercje lub delecje aminokwasów. [0038] Motywy sekwencji Val-Ile-Phe-Gly-Ali-Afa-Gly-Asp-Leu, i Arg-Ile-Asp-His-Tyr- Leu-Gly-Lys i Arg-Trp-Ala-Gly-Val-Pro-Phe-Tyr-Bra-Arg-Thr-Gly-Lys-Arg nie są korzystnie rozrywane przez tego rodzaju insercje/delecje. [0039] Do wytwarzania mutantów według wynalazku mogą być użyte klasyczne procesy mutagenezy in-vivo z populacjami komórek bakterii maczugowatych przy zastosowaniu substancji mutagennych, jak przykładowo N-metylo-N -nitro-n-nitrozoguanidyna (MNNG), siarczan etylometanu (EMS), 5-bromouracyl, lub światło ultrafioletowe.

9 - 8 - Sposobami mutagenezy są przykładowo opisane w Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard i wsp. (Eds.), American Society for Microbiology, Washington, DC, USA, 1981) lub w Tosaka i wsp. (Agricultural and Biological Chemistry 42 (4), (1978)) lub w Konicek i wsp. (Folia Microbiologica 33, (1988)). Typowe mutagenezy przy zastosowaniu MNNG obejmują stężenia od 50 do 500 mg/l lub również wyższe stężenia aż do maksymalnie 1 g/l, czas inkubacji od 1 do 30 minut przy ph od 5,5 do 7,5. W tych warunkach liczna zdolnych do życia komórek zostaje zredukowana o udział wynoszący ok. 50% do 90% lub ok. 50% do 99% lub ok. 50% do 99,9% lub więcej. [0040] Z mutagenizowanych populacji komórek zostają pobrane i rozmnożone mutanty względnie komórki. Korzystnie w dalszym etapie zostaje zbadana ich zdolność do wydzielania, w hodowli osadowej (batch) przy zastosowaniu odpowiedniej pożywki, aminokwasów, korzystnie L-lizyny lub L-tryptofanu. Odpowiednie pożywki i warunki badawcze są opisane między innymi w US 6,221,636, w US 5,840,551, w US 5,770,409, w US 5,605,818, w US 5,275,940 oraz w US 4,224,409. Przy zastosowaniu odpowiednich systemów robotycznych, jak przypadkowo opisane w Zimmermann i wsp. (VDI Berichte Nr 1841, Wydawnictwo VDI, Düsseldorf, Niemcy 2004, ) lub Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), (2005)) mogą być zbadane liczne mutanty w krótkim czasie. Zazwyczaj bada się maksymalnie 3000, maksymalnie 10000, maksymalnie lub również maksymalnie mutantów lub ewentualnie również więcej. W ten sposób identyfikowane są mutanty, które w porównaniu ze szczepem rodzicielskim ewentualnie niezmutagenizowanym szczepem wyjściowym wydzielają więcej aminokwasów do pożywki lub do wnętrza komórki. Należą tutaj przykładowo takie mutanty, których sekrecja aminokwasów jest podwyższona co najmniej o 0,5%. [0041] Wreszcie dostarcza się DNA z mutantów, ewentualnie izoluje i za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy przy zastosowaniu par primerów, które pozwalają na wzmocnienie genu zwf ewentualnie allelu zwf według wynalazku lub mutacji według wynalazku w pozycji 321, które syntetyzuje odpowiedni polinukleotyd. Korzystnie DNA zostaje wyizolowany z takich mutantów, które wydzielają aminokwasy w sposób zwiększony. [0042] Do tego mogą być wybrane dowolne pary primerów z położonej zgodnie z kierunkiem i przeciwnie do kierunku mutacji wynalazku sekwencji nukleotydów i komplementarnej do niej sekwencji nukleotydów. Primer pary primerów obejmuje tutaj korzystnie co najmniej 15, co najmniej 18, co najmniej 20, co najmniej 21 lub co najmniej 24 następujących po sobie nukleotydów wybranych z sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 1 i 1267 SEQ ID NO:3. Należący do niej drugi primer pary primerów obejmuje co najmniej 15, co najmniej 18, co najmniej 20, co najmniej 21 lub co najmniej 24 następujących po sobie nukleotydów wybranych z komplementarnej sekwencji nukleotydów od pozycji 2100 i 1271 SEQ ID NO:3. Jeżeli amplifikacja regionu kodowania jest pożądana, to para primerów jest wybierana korzystnie z sekwencji

10 - 9 - nukleotydów między pozycją 1 i 307 SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11 i z komplementarnej sekwencji nukleotydów między pozycją 2100 i 1850 SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11. Jeżeli pożądana jest amplifikacja części regionu kodowania, jak przykładowo przedstawione w SEQ ID NO:14 i 15, to para primerów jest korzystnie wybierana z sekwencji nukleotydów między pozycją 309 i 1267 z SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11 i z komplementarnej sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 1848 i 1271 z SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11. Odpowiednimi parami primerów są przykładowo przedstawione przez SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:18 pary primerów zwf-k1 i zwf-k2 lub przedstawione przez SEQ ID NO:19 i SEQ ID NO:20 para primerów zwf-l1 i zwf- L2. Primer może być ponadto wyposażony w miejsce rozpoznawania enzymów restrykcyjnych, grupę biotyny lub dalsze akcesoria, jakie opisane są w stanie techniki. Łączna długość primery wynosi ogólnie maksymalnie 30, 40, 50 lub 60 nukleotydów. [0043] Do wytwarzania polinukleotydów przez amplifikację wybranych sekwencji, jak allelu zwf według wynalazku, z przedstawionego przykładowo chromosomalnego DNA ("template DNA") przez amplifikację za pomocą PCR, stosowane są ogólnie termostabilne polimerazy DNA. Przykładowmi tego rodzaju polimeraz DNA są polimerazy Taq z Thermus aquaticus, które są rozprowadzanie między innymi przez firmę Qiagen (Hilden, Niemcy), polimeraza Vent z Thermococcus litoralis, która jest rozprowadzana między innymi przez firmę New England Biolabs (Frankfurt, Niemcy) lub polimeraz Pfu z Pyrococcus furiosus, która jest rozprowadzana między innymi przez firmę Stratagene (La Jolla, USA). Korzystne są polimerazy z aktywnością "proofreading". Aktywność "proof-reading" oznacza, że te polimerazy są w stanie rozpoznawać błędnie wbudowane nukleotydy i usuwać te błędy poprzez ponowną polimeryzację (Lottspeich i Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Niemcy (1998)). Przykładami polimeraz z aktywnością "proof-reading" są polimeraza Vent i polimeraza Pfu. [0044] Warunki w mieszaninie reakcyjnej zostają ustawione według danych producenta. Polimerazy są zazwyczaj dostarczane przez producentów wraz ze stosowanym buforem, który ma zazwyczaj stężenia wynoszące mm Tris/HCl i 6-55 mm KC1 przy ph 7,5-9,3. Chlorek magnezu zostaje dodany w stężeniu wynoszącym 0,5-10 mm, o ile nie jest zawarty w dostarczonym przez producenta buforze. Do mieszaniny reakcyjnej zostają dodane dalej trójfosforany dezoksynukleozydów w stężeniu wynoszącym 0,1-16,6 mm. Primery umieszczane są w mieszaninie reakcyjnej w stężeniu końcowym wynoszącym od 0,1-3 µm a szablonowe DNA w optymalnym przypadku w 102 do 105 kopiach. Mogą być użytych również 106 do 107 kopii. Odpowiednia polimeraza zostaje dodana do mieszaniny reakcyjnej w ilości od 2-5 jednostek. Typowa mieszanina reakcyjna ma objętość wynoszącą µl. [0045] Jako dalsze dodatki mogą być dodane do reakcji albuminy surowicy bydlęcej, Tween-20, żelatyna, gliceryna, formamid lub DMSO (Dieffenbach i Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA 1995). [0046] Typowy przebieg PCR składa się z trzech różnych, powtarzających się

11 następująco po sobie etapów temperaturowych. Najpierw reakcja jest rozpoczynana z podwyższeniem temperatury do 92 C - 98 C na 4 do 10 minut, aby zdenaturować obecne DNA. Następnie następują powtarzająco najpierw etap denaturacji obecnego DNA wynoszący sekund przy około C, następnie etap wiązania primera do obecnego DNA wynoszący sekund przy określonej, zależnej od primerów temperaturze ("temperatura wyważania"), która wynosi według wynalazku od 50 C do 60 C i może być obliczona dla każdej pary primerów. Dokładne informacje na ten temat specjalista znajdzie w Rychliki wsp. (Nucleic Acids Research 18 (21): ). Wreszcie następuje etap syntezy dla wydłużenia obecnego primera ("przedłużanie") przy podanym każdorazowo dla polimerazy optimum aktywności, zazwyczaj w zależności od polimerazy w zakresie od 73 C do 67 C korzystnie 72 C do 68 C. Czas trwania tego etapu wydłużania zależy od wydajności polimerazy i długości wydłużanego produktu PCR. W typowej PCR etap ten trwa 0,5-8 minut, korzystnie 2-4 minuty. Te trzy etapy zostają powtórzone 30 do 35 razy, ewentualnie aż do 50 razów. Zakańczający etap "wydłużający" trwający 4-10 minut kończy reakcję. Utworzone w ten sposób polinukleotydy zostają również określone jako amplifikaty;określenie fragment kwasu nukleinowego jest również w użyciu. [0047] Dalsze instrukcje i informacje o PCR specjalista znajdzie przykładowo w podręczniku "PCRStrategies" (Innis, Felfand und Sninsky, Academic Press, Inc., 1995), w podręczniku Diefenbach i Dveksler "PCR Primer - a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995), w podręczniku Gait "Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, UK, 1984) oraz w Newton und Graham "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1994.). [0048] Sekwencja nukleotydów jest następnie określana przykładowo według procesu rozrywania łańcuchów Sanger i wsp. (Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74, (1977)) z podanymi przez Zimmermann i wsp. (Nucleic Acids Research 18, 1067pp (1990)) modyfikacjami, a zakodowany przez tą sekwencję nukleotydów polipeptyd poddany analizie w szczególności odnośnie sekwencji aminokwasów. Do tego sekwencja nukleotydów zostaje umieszczona w programie do przekładu sekwencji DNA na sekwencję aminokwasów. Odpowiednimi programami są przykładowo program "Patentin", który dostępny jest w urzędach patentowych, przykładowo w urzędzie patentowym USA (USPTO), lub "Translate Tool", które dostępne jest na serwerze ExPASy Proteomics w World Wide Web (Gasteiger i wsp., Nucleic Acids Research 31, (2003)). [0049] Tak identyfikowane są mutanty, których allele zwf kodują polipeptydy z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, które zawierają w pozycji 321 sekwencji aminokwasów względnie odpowiedniej lub porównywalnej pozycji każdy aminokwas białkotwórczy z wyjątkiem glicyny. Korzystna jest wymiana na L-serynę. Ewentualnie sekwencja aminokwasów zawiera ponadto substytucję aminokwasu L-seryny na inny aminokwas białkotwórczy, korzystnie L-treoninę, w pozycji 8 względnie w odpowiedniej lub porównywalnej pozycji.

12 [0050] Przedmiotem wynalazku jest odpowiednio mówiąc mutant bakterii maczugowatej, który można otrzymać poprzez następujące etapy: a) działanie na bakterię maczugowatą, która ma zdolność wydzielania aminokwasów, czynnikiem mutagennym, b) izolowanie i rozmnażanie uzyskanych w a) mutantów, c) dostarczenie kwasu nukleinowego z uzyskanych w b) mutantów, d) wytworzenie cząsteczki kwasu nukleinowego/ amplifikatu/ fragmentu kwasu nukleinowego przy zastosowaniu reakcji łańcuchowej polimerazy, kwasu nukleinowego z c), i pary primerów składającej się z pierwszego primera obejmującego co najmniej 15 następujących po sobie nukleotydów wybranych z sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 1 a 1267 z SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11 oraz drugiego primera obejmującego co najmniej 15 następujących po sobie nukleotydów wybranych z komplementarnej sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 2100 i 1271 z SEQ ID-NO:3, lub 11. e) określenie sekwencji nukleotydów otrzymanej w e) cząsteczki kwasu nukleinowego, i określenie kodowanej sekwencji aminokwasów, f) ewentualnie porównywania określonej w f) sekwencji aminokwasów z SEQ ID NO:6, 8 oraz 10, i g) identyfikacja mutanta, który zawiera polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycji odpowiadającej pozycji 321 SEQ ID NO:2 L-serynę. [0051] Otrzymane w ten sposób mutanty zawierają typowo jedną (1) kopię jednego z opisanych alleli zwf. W SEQ ID NO:5, 7 i 9 powielany jest przykładowo region kodowania allelu zwf mutanta według wynalazku. Region kodowania genu typu dzikiego jest powielany jako SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 zawiera w pozycji 961 zasadę nukleinową guaninę, w pozycji 962 zasadę nukleinową guaninę i w pozycji 963 zasadę nukleinową cytozynę. SEQ ID NO:1 zawiera w pozycji 961 do 963 kodujący aminokwas glicynę kodon GGC. SEQ ID NO:5 zawiera w pozycji 961 zasadę nukleinową adeninę. Przez tę tranzycję guanina adenina powstaje w pozycji 961 do 963 kodujący aminokwas L-serynę kodon AGC. [0052] SEQ ID NO:1 zawiera w pozycji 22 zasadę nukleinową tyminę, w pozycji 23 zasadę nukleinową cytozynę i w pozycji 24 zasadę nukleinową cytozynę. SEQ ID NO:1 zawiera odpowiednio w pozycji 22 do 24 kodujący aminokwas serynę kodon TCC. SEQ ID NO:7 zawiera w pozycji 22 zasadę nukleinową adeninę. Przez tę transwersję tyminaadenina powstaje w pozycji 22 do 24 kodujący aminokwas L-serynę kodon AGC. [0053] Stąd przedstawione w SEQ ID NO: 5 i 7 sekwencje nukleotydów mogą zawierać dalsze substytucje zasad, które powstały poprzez działanie mutagenezą, nie manifestują się jednak w zmienionej sekwencji aminokwasów. Tego rodzaju mutacje są określane w świecie specjalistycznym jako mutacje milczące lub neutralne. Takie mutacje milczące

13 mogą być już tak samo zawarte w zastosowanej do działania mutagenezą bakterii maczugowatej. Przykładami tego rodzaju milczących mutacji są tranzycja cytozynatymina w pozyzcji 138, tranzycja cytozyna-tymina w pozycji 279, tranzycja tyminacytozyna w pozycji 738, tranzycja cytozyna-tymina w pozycji 777 i tranzycja guaninaadenina w pozycji 906, jak przedstawiono w SEQ ID NO:9 [0054] Zastosowane do mutagenezy bakterie maczugowate mają juz korzystnie zdolność do wydzielania pożądanych aminokwasów do otaczającej jej pożywki ewentualnie bulionu fermentacyjnego lub do wzbogacania wnętrza komórki. [0055] Wytwarzające L-lizynę bakterie maczugowate mają typowo oporną na sprzężenie zwrotne ewentualnie niewrażliwą kinazę asparaginianową. Przez oporne na sprzężenie zwrotne kinazy asparaginianowe rozumie się kinazy asparaginianowe, które w porównaniu z postaciami dzikimi wykazują niewielką wrażliwość na hamowanie przez mieszaniny lizyny i treoniny lub mieszaniny AEC (aminoetylocysteiny) i treoniny lub samą lizynę lub samą AEC. Geny ewentualnie allele kodujące te niewrażliwe kinazy asparaginianowe są również określane jako allele lyscfbr. W stanie techniki (Tabela 1) opisane są liczne allele lyscfbr, które kodują warianty kinazy asparaginianowej, które mają substytucje aminokwasów w porównaniu z białkiem typu dzikiego. Region kodowania dzikiego typu genu lysc Corynebacterium glutamicum odpowiadający numerowi dostępu AX w banku danych NCBI jest przedstawiony w SEQ ID NO:21 i kodowane przez ten gen białko w SEQ ID NO:22. Tabela 1 Allele LysCFBR kodujące oporne na sprzężenie zwrotne kinazy asparaginianowe Oznaczenie allelu Inne dane Odniesienie Numer dostępu lysc FBR -E05108 JP A (sekwencja 1) lysc FBR -E06825 lysc A279T JP A (sekwencja 1) lysc FBR -E06826 lysc A279T JP A (sekwencja 2) lysc FBR -E06827 JP A (sekwencja 3) lysc FBR -E08177 JP A ( sekwencja 1) E05108 E06825 E06826 E06827 E08177

14 Allele LysCFBR kodujące oporne na sprzężenie zwrotne kinazy asparaginianowe lysc FBR -E08178 lysc A279T JP A ( sekwencja 2) lysc FBR -E08179 lysc A279V JP A ( sekwencja 3) lysc FBR -E08180 lysc S301F JP A ( sekwencja 4) lysc FBR -E08181 lysc T308I JP A ( sekwencja 5) lysc FBR -E08182 JP A ( sekwencja 6) lysc FBR -E12770 JP A ( sekwencja 13) lysc FBR -E14514 JP A ( sekwencja 9) lysc FBR -E16352 JP A ( sekwencja 3) lysc FBR -E16745 JP A ( sekwencja 3) lysc FBR -E16746 JP A ( sekwencja 4) lysc FBR US A ( sekwencja 1) lysc FBR -I74589 lysc A279T US A ( sekwencja 2) lysc FBR -I74S90 US A ( sekwencja 7) lysc FBR -I74591 lysc A279T US A ( sekwencja 8) lysc FBR -I74592 US A (sekwencja 9) E08178 E08179 E08180 E08181 E08182 E12770 E14514 E16352 E16745 E16746 I74588 I74589 I74590 I74591 I74592

15 Allele LysCFBR kodujące oporne na sprzężenie zwrotne kinazy asparaginianowe lysc FBR -I74593 lysc A279T US A (sekwencja 10) lysc FBR -I74594 US A (sekwencja 11) lysc FBR -I74595 lysc A279T US A (sekwencja 12) lysc FBR -I74596 US A (sekwencja 13) lysc FBR -I74597 lysc A279T US A (sekwencja 14) lysc FBR -X57226 lysc S301Y EP Kalinowski i wsp., Molecular and General Genetics 224: (1990) lysc FBR -L16848 lysc G345D Follettie and Sinskey NCBI Nucleotide Database (1990) I74594 I74595 I74596 I74597 X57226 L16848 lysc FBR L27125 lysc R320G lysc G345D Jetten i wsp., Applied Microbiology Biotechnology 43:76-82 (1995) L27125 lysc FBR lysc T311I WO (sekwencja 17) lysc FBR lysc S301F US lysc FBR lysc S381F EP lysc FBR lysc S317A US (sekwencja 1) lysc FBR lysc T380I WO 01/49854 [0056] Wydzielające L-lizynę bakterie maczugowate mają typowo jedną lub więcej wymienionych w Tabeli 1 wymian aminokwasów.

16 [0057] Korzystne są następujące allele lyscfbr: lysc A279T (wymiana alaniny w pozycji 279 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na treoninę), lysc A279V wymiana alaniny w pozycji 279 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na walinę), lysc S301F (wymiana seryny w pozycji 301 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na fenyloalaninę), lysc T308I (wymiana treoniny w pozycji 308 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na izoleucynę), lysc S301Y (wymiana seryny w pozycji 308 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na tyrozynę), lysc G345D (wymiana glicyny w pozycji 345 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na kwas asparaginowy), lysc R320G (wymiana argininy w pozycji 320 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na glicynę), lysc T311I (wymiana treoniny w pozycji 311 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na izoleucynę), lysc S381F (wymiana seryny w pozycji 381 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na fenyloalaninę) i lysc S317A (wymiana seryny w pozycji 317 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na alaninę). [0058] Szczególnie korzystne są allel lyscfbr lysc T311I wymiana treoniny w pozycji 311 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na izoleucynę) i allel lyscfbr zawierający przynajmniej jedną substytucję wybraną z grupy A279T (wymiana alaniny w pozycji 279 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na treoninę), S381F (wymiana seryny w pozycji 381 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na fenyloalaninę) i S317A (wymiana seryny w pozycji 317 kodowanego białka kinazy asparaginianowej według SEQ ID NO: 22 na alaninę). [0059] Allel lyscfbr lysc T311I jest zawarty w zdeponowanym w DSMZ szczepie DM1797. DM1797 jest mutantem Corynebacterium glutamicum ATCC [0060] Szczep NRRL B ma allel lysc FBR, który koduje białko kinazy asparaginianowej, który zawiera substytucje aminokwasów A279T i S381F. [0061] Według wyżej opisanego sposobu został wyizolowany, wychodząc ze szczepu DM1797, oznaczony jako DM1816 mutant, który zawiera allel zwf, który koduje polipeptyd, w którym zawarta jest w pozycji 321 sekwencji aminokwasów L-seryna. Sekwencja nukleotydowa regionu kodowania allelu zwf mutanta DM1816 jest przedstawiona jako SEQ ID NO:9 a sekwencja aminokwasowe kodowanego polipeptydu jako SEQ ID NO:10 względnie 12. Mutant DM1816 zawiera zatem substytucje nukleotydowe w sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 1 do 307 SEQ ID NO:3. Te substytucje nukleotydów przedstawione są w SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:11 zawiera w pozycji 208 guaniną zamiast adeniny, w pozycji 235 adeninę zamiast guaniny, w pozycji 345 cytozynę zamiast tyminy, w pozycji 257 guaninę zamiast adeniny i w pozycji 299 guaninę zamiast adeniny. SEQ ID NO:11 zawiera ponadto w pozycji 329 adeninę zamiast tyminy, w pozycji 445 tyminę zamiast cytozyny, w pozycji 586 tyminę zamiast cytozyny, w pozycji 1045 cytozynę zamiast tyminy, w pozycji 1084 tyminę zamiast cytozyny, w

17 pozycji 1213 adeninę zamiast guaniny i w pozycji 1268 adeninę zamiast guaniny. [0062] Według wyżej opisanego sposobu został ponadto wyizolowany, wychodząc ze szczepu NRRL B-11474, oznaczony jako DM1889 mutant, który zawiera allel zwf, który koduje polipeptyd, w którym zawarta jest w pozycji 321 sekwencji aminokwasów L- seryna. [0063] Zatem mogą być stosowane wydzielające L-lizynę bakterie maczugowate, które mają osłabioną dehydrogenazę homoserynową lub kinazę homoserynową lub mają inne właściwości, jak są one znane w stanie techniki. [0064] Wytwarzające L-tryptofan bakterie maczugowate mają typowo oporną na sprzężenie zwrotne ewentualnie niewrażliwą syntazę antranilanową. Przez oporne na sprzężenie zwrotne syntazy antranilanowe rozumie się syntazy antranilanowe, które w porównaniu z postaciami dzikimi mają niewielką wrażliwość na hamowanie (5 do 10%, 10% do 15% lub 10% do 20%) przez tryptofan lub 5-fluorotryptofan (Matsui i wsp., Journal of Bacteriology 169 (11): (1987)) lub podobne analogi. Geny ewentualnie allele kodujące te niewrażliwe syntazy antranilanowe są również określane jako allele trpe FBR. Przykłady takich mutantów ewentualnie alleli są opisane przykładowo w US i EP [0065] Otrzymane mutanty wykazują w porównaniu do szczepu wyjściowego ewentualnie szczepu rodziców zwiększone wydzielanie ewentualnie wytwarzanie pożądanych aminokwasów w procesie fermentacji. [0066] Przedmiotem wynalazku jest tak samo izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd według SEQ ID NO:2 z aktywnością dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycji 321 sekwencji aminokwasów SEQ ID NO:2 L-serynę. [0067] Polinukleotyd według wynalazku może być wyizolowane z mutanta według wynalazku. [0068] Ponadto do mutagenezy genu zwf mogą być zastosowane procesy in-vitro. Przy zastosowaniu procesów in-vitro otrzymane polinukleotydy, które zawierają gen zwf bakterii maczugowatej, korzystnie opisany w stanie techniki gen typu dzikiego z Corynebacterium glutamicum, zostają poddane działaniu mutagennemu. [0069] Przy wyizolowanych polinukleotydach może się przykładowo rozchodzić o izolowane całe DNA ewentualnie chromosomalne DNA lub również o amplifikaty genu zwf, które zostały wytworzone za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Tego rodzaju amplifikaty są również określane jako produkty PCR. Instrukcje amplifikacji sekwencji DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy specjalista znajdzie między innymi w podręczniku Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) w Newton i Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1994). Jest tak samo możliwe następnie wbudowanie mutagenizowanego genu zwf do wektora, przykładowo do bakteriofaga lub do plazmidu. [0070] Odpowiednimi procesami dla mutagenezy in-vitro są między innymi działanie

18 hydroksyloaminą według Millera (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), zastosowanie oligonukleotydów mutagennych (T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 i R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, (1995)) oraz zastosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy przez użycie polimerazy DNA, która wykazuje wysoki współczynnik błędu. Tego rodzaju polimerazą DNA jest przykładowo mutazym polimerazy DNA (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, nr ) firmy Stratagene (LaJolla, CA, USA). [0071] Dalsze instrukcje i przewodniki do wytwarzania mutacji in-vivo lub in-vitro mogą być wzięte ze znanych w stanie techniki podręczników genetyki i biologii molekularnej jak np. podręcznik von Knippersa ("Molekulare Genetik", Wydanie 6., Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Niemcy, 1995), Winnacker'a ("Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Niemcy, 1990) lub Hagemann'a ("Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Przedmiotem wynalazku jest ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który obejmuje sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO:2, przy czym na pozycji 321 zawarta jest L-seryna. Ewentualnie sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera ponadto substytucję aminokwasu L-seryny na inny aminokwas, korzystnie L-treoninę, na pozycji 8. [0072] Opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który obejmuje sekwencję aminokwasów o długości 514 aminokwasów i przy czym na pozycji 321 zawarty jest każdy bialkotwórczy L-aminokwas z wyjątkiem glicyny, korzystnie L- seryna. [0073] Opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycjach 312 do 330 sekwencji aminokwasów sekwencję aminokwasów odpowiadającą pozycji 312 do 330 SEQ ID NO:6 lub 8. Korzystnie sekwencja aminokwasów kodowanego polipeptydu zawiera sekwencję aminokwasów odpowiadającą pozycji 307 do 335 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 292 do 350 z SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 277 do 365 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 262 do 380 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 247 do 395 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 232 do 410 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 202 do 440 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 172 do 470 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 82 do 500 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 2 do 512 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 2 do 513 SEQ ID NO:6 lub 8 lub pozycji 2 do 514 SEQ ID NO:6 lub 8. Szczególnie bardzo korzystnie długość kodowanego polipeptydu obejmuje 514 aminokwasów. [0074] Opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycji 312 sekwencji aminokwasów względnie odpowiedniej lub porównywalnej

19 pozycji każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, korzystnie L-serynę i obejmuje sekwencję nukleotydów, która jest identyczna z sekwencją nukleotydów polinukleotydu, który można otrzymać poprzez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy zastosowaniu pary primerów, których sekwencja nukleotydów obejmuje każdorazowo co najmniej 15 następujących po sobie nukleotydów, które wybierane są z sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 1 a 307 z SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11 i z komplementarnej sekwencji nukleotydów pomiędzy pozycją 2100 a 1850 SEQ ID NO:3 lub SEQ ID NO:11. Przykłady tego rodzaju odpowiednich par primerów przedstawione są w SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:18 i w SEQ ID NO:19 i SEQ ID NO:20. Jako materiał wyjściowy ("szablonowe"-dna) korzystne jest DNA chromosomalne bakterii maczugowatych, które w szczególności zostało poddane działaniu mutagenu. Szczególnie korzystne jest chromosomalne DNA gatunku Corynebacterium i w szczególności korzystne rodzaju Corynebacterium glutamicum. [0075] opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który jest poddawany hybrydyzacji komplementarną do SEQ ID NO:5, 7 lub 9 sekwencją nukleotydów w ścisłych warunkach i kodujący polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fossforanowej, którego sekwencja aminokwasów zawiera w pozycji 321 względnie odpowiedniej lub porównywalnej pozycji każdy aminokwas białkotwórczy z wyjątkiem glicyny, korzystnie L-serynę, i ewentualnie w pozycji odpowiadającej pozycji 8 każdy aminokwas białkotwórczy oprócz L-seryny, korzystnie L-treoninę. [0076] Instrukcje hybrydyzacji kwasów nukleinowych ewentualnie polinukleotydów specjalizta znajdzie między innymi w podręczniku "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy, 1993) i w Liebl i wsp. (International Journal of, Systematic Bacteriology 41: (1991)). Hybrydyzowanie ma miejsce w warunkach ścisłych, to znaczy, że zostają utworzone hybrydy, przy których próbnik tzn. polinukleotyd obejmujący komplementarne do SEQ ID NO:5, 7 lub 9 sekwencję nukleotydów i docelową sekwencja, tzn. poddane działaniu sondy ewentualnie identyfikowane polinukleotydy są co najmniej w 90% identyczne. Wiadomo, że na ścisłość hybrydyzacji włączając etapy płukania ma wpływ lub jest określana przez różnicowanie składu buforu, temperatury i stężenia soli. Reakcja hybrydyzacji zostaje przeprowadzona ogólnie przy relatywnie niskiej ścisłości w porównaniu z etapami płukania (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). [0077] Dla reakcji hybrydyzacji może być użyty przykładowo bufor odpowiadający buforowi 5x SSC w temperaturze wynoszącej ok. 50 C - 68 C. Przy tym próbnik mogą być również poddawanie hybrydyzacji z polinukleotydami, które wykazują mniej niż 90% identyczności z sekwencją nukleotydów zastosowanego próbnika. Takie hybrydy są mniej stabilne i zostają usunięte przez płukanie w warunkach uściślonych. Może to być przykładowo osiągnięte przez obniżenie stężenia soli do 2x SSC i ewentualnie następnie do 0,5x SSC (The DIG System User s Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Niemcy, 1995), przy czym ustawiona zostaje temperatura

20 wynosząca ok. 50 C - 68 C, ok. 52 C - 68 C, ok. 54 C - 68 C, ok. 56 C - 68 C, ok. 58 C - 68 C, ok. 60 C - 68 C, ok. 62 C - 68 C, ok. 64 C - 68 C, ok. 66 C - 68 C. Korzystne są zakresy temperatury wynoszące ok. 64.C - 68 C lub ok. 66 C - 68 C. Jest ewentualnie możliwe aby obniżać stężenie soli aż do stężenia odpowiadającego 0,2x SSC lub 0,1x SSC. Ewentualnie bufor SSC zawiera siarczan dodecylu sodu (SDS) w stężeniu wynoszącym 0,1%. Przez etapowe podwyższenie temperatury hybrydyzacji w etapach o ok. 1-2 C z 50 C do 68 C mogą być wyizolowane fragmenty polinukleotydów, które mają co najmniej 90% lub co najmniej 91%, korzystnie co najmniej 92% lub co najmniej 93% lub co najmniej 94% lub co najmniej 95% lub co najmniej 96% i szczególnie bardzo korzystnie co najmniej 97% lub co najmniej 98% co najmniej 99% identyczności z sekwencją ewentualnie komplementarną sekwencją zastosowanego próbnika i kodują polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera substytucje aminokwasów według wynalazku. Sekwencja nukleotydów otrzymanego w ten sposób polinukleotydu zostaje określona znanymi sposobami. Dalsze instrukcje hybrydyzacji są dostępne na rynku w postaci tak zwanego zestawu (np. DIG Easy Hyb firmy Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy, Katalog Nr ). Otrzymane w ten sposób sekwencje nukleotydowe kodują polipeptydy z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, które są w co najmniej w 90%, co najmniej w 92% lub przynajmniej w 94% lub przynajmniej w 96%, i szczególnie bardzo korzystnie przynajmniej w 97% lub przynajmniej w 98% lub przynajmniej w 99% identyczne z sekwencją aminokwasów z SEQ ID NO: 6 lub SEQ ID NO:8 i zawierają substytucję aminokwasów według wynalazku. [0078] Opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycji 321 względnie w odpowiedniej lub porównywalnej pozycji sekwencji aminokwasów każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, przy czym korzystna jest wymiana na L-serynę i który obejmuje sekwencję aminokwasów, która jest co najmniej w 92% lub co najmniej w 94%, i szczególnie bardzo korzystnie w co najmniej 97% lub co najmniej w 98% lub co najmniej w 99% identyczna z sekwencją aminokwasów SEQ ID NO:6. Przykładem polipeptydu z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej obejmującego sekwencję aminokwasów, która jest w co najmniej 99% identyczna pokazany jest w SEQ ID NO:8 lub SEQ ID NO: 10. [0079] Opis ujawnia ponadto izolowany polinukleotyd, który koduje polipeptyd z aktywnością enigmatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, który zawiera na pozycji 321 względnie w odpowiedniej lub porównywalnej pozycji sekwencji aminokwasów każdy białkotwórczy aminokwas z wyjątkiem glicyny, przy czym korzystna jest wymiana na L-serynę i który obejmuje sekwencję nukleotydów, która jest poza tym w co najmniej w 90%, lub w co najmniej w 92% lub w co najmniej w 94%, lub w co najmniej w 96% i szczególnie bardzo korzystnie w co najmniej 97% lub co najmniej w 98% lub co najmniej w 99% identyczna z sekwencją nukleotydów SEQ ID NO:5. Przykładem polinukleotydu, który koduje polipeptyd z aktywnością enzymatyczną dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej według wynalazku i ma sekwencję