(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 13/41 EP B1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 38/28 (06.01) A61K 31/46 (06.01) A61K 31/198 (06.01) A61K 31/4 (06.01) A61K 47/18 (06.01) A61P 3/ (06.01) (4) Tytuł wynalazku: Preparat zawierający insulinę, nikotynamid i argininę () Pierwszeństwo: EP US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 11/27 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/03 (73) Uprawniony z patentu: Novo Nordisk A/S, Bagsværd, DK (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 HELLE BIRK OLSEN, Bagsværd, DK SVEND HAVELUND, Bagsværd, DK ULLA RIBEL, Bagsværd, DK JEPPE STURIS, Bagsværd, DK HELLE NAVER, Bagsværd, DK MORTEN SCHLEIN, Bagsværd, DK SVEND LUDVIGSEN, Bagsværd, DK (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Elżbieta Ostrowska POLSERVICE KANCELARIA RZECZNIKÓW PATENTOWYCH SP. Z O.O. ul. Bluszczańska Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 2 11/P3387PL00 EP B1 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy preparatów farmaceutycznych zawierających związek insulinowy, związek nikotynowy, argininę i bufor fosforanowy. TŁO WYNALAZKU 1 2 [0002] Cukrzyca jest zaburzeniem metabolicznym, w którym utracona jest częściowo lub całkowicie zdolność utylizowania glukozy. Około % ogółu ludności cierpi na cukrzycę i zaburzenie to osiąga rozmiary epidemii. [0003] Od czasu wprowadzenia insuliny w latach 19- tych, w leczeniu cukrzycy wprowadza się ciągłe ulepszenia. W celu zapobieżenia występowaniu wysokich poziomów glukozy we krwi, pacjenci często praktykują leczenie drogą wielokrotnych wstrzyknięć, dzięki którym insulina jest podawana wraz z każdym posiłkiem. Jako, że pacjenci cukrzycowi są leczeni insuliną przez kilka dekad, istnieje ogromne zapotrzebowanie na bezpieczne i poprawiające jakość życia preparaty insuliny. Spośród dostępnych w lecznictwie preparatów insuliny można wymienić preparaty szybko działające, o pośrednim czasie działania i o przedłużonym działaniu. [0004] W leczeniu cukrzycy proponuje się i stosuje wiele odmian preparatów farmaceutycznych insuliny, takich jak insulina o regularnym wchłanianiu (Actrapide ), insulina izofanowa (oznaczona skrótem NPH), zawiesiny insuliny cynkowej (takie jak

3 3 1 2 Semilente, Lente i Ultralente ) oraz dwufazowa insulina izofanowa (taka jak NovoMix ). Opracowano również analogi i pochodne insuliny ludzkiej, zaprojektowane do konkretnego profilu działania, na przykład do działania szybkiego lub działania przedłużonego. Pewne dostępne w lecznictwie preparaty insulinowe zawierające takie szybko działające analogi insuliny obejmują NovoRapid (preparat insuliny ludzkiej B28Asp), Humalog (preparat insuliny ludzkiej B28LysB29Pro) i Apidra (preparat insuliny ludzkiej B3LysB29Glu). [000] W zgłoszeniach międzynarodowych WO 91/09617 i WO 96/417 Novo Nordisk A/S) ujawnione są preparaty insuliny zawierające nikotynamid albo kwas nikotynowy lub jego sól. [0006] Preparaty farmaceutyczne insuliny najczęściej podaje się przez wstrzyknięcie podskórne. Dla pacjenta ważny jest profil działania insuliny oznaczający działanie insuliny na metabolizm glukozy w funkcji czasu od wstrzyknięcia. W profilu tym ważne są między innymi czas do początku działania, wartość maksymalna i całkowity czas działania. W przypadku insulin wstrzykiwanych jako bolus (cała dawka podana szybko), pacjenci życzą sobie i ubiegają się o wiele różnych preparatów insuliny o różnych profilach działania. W tym samym dniu, jeden pacjent może stosować preparaty insuliny o bardzo różnych profilach działania. Pożądany profil działania zależy, na przykład, od pory dnia i od ilości i składu posiłku spożytego przez pacjenta. [0007] Równie ważna dla pacjenta jest stabilność chemiczna preparatów insuliny, na przykład, wynikająca

4 4 1 z szerokiego stosowania urządzeń do wstrzykiwań typu penów, takich jak urządzenia, które zawierają wkłady Penfill, w których preparat insuliny przechowuje się do czasu całkowitego opróżnienia wkładu, co może trwać co najmniej 1 do 2 tygodni dla urządzeń zawierających wkłady o pojemności 1, 3,0 ml. Podczas przechowywania, w strukturze insuliny pojawiają się kowalencyjne zmiany chemiczne. Może to prowadzić do powstania cząsteczek, które mogą być mniej aktywne i/lub potencjalnie immunogenne, takich jak produkty deamidacji i produkty transformacji o wyższej masie cząsteczkowej (dimery, polimery). Poza tym, ważna jest również stabilność fizyczna tych preparatów insulinowych, gdyż długotrwałe przechowywanie może w końcu doprowadzić do tworzenia się nierozpuszczalnych włókien, które są biologicznie nieaktywne i potencjalnie immunogenne. STRESZCZENIE WYNALAZKU 2 [0008] Wynalazek dotyczy preparatów insuliny o korzystnej szybkości wchłaniania i korzystnej stabilności chemicznej i fizycznej. Przedmiotem wynalazku są preparaty insuliny zawierające insulinę ludzką i/lub jej analogi, nikotynamid lub kwas nikotynowy i/lub jego sole, argininę i bufor fosforanowy. [0009] W jednej realizacji, wynalazek odnosi się do preparatu insuliny zawierającego: związek insulinowy związek nikotynowy argininę i bufor fosforanowy.

5 [00] W innej realizacji, ten preparat insuliny może ponadto zawierać kwas glutaminowy. [0011] W innej realizacji, niniejszy wynalazek rozważa tę formulację do stosowania w leczeniu cukrzycy u osoby albo do obniżania poziomu glukozy we krwi u osoby polegające na stosowaniu u osoby lub ssaka preparatu insuliny według wynalazku. OPIS RYSUNKÓW [0012] 1 2 Figura 1 przedstawia powstawanie produktów degradacji, wyrażone jako procent całkowitej zawartości insuliny, podczas 2 tygodni przechowywania preparatów według wynalazku w temperaturze 37 o C. Litera A oznacza preparat porównawczy NovoRapid a pozostałe litery odpowiadają preparatom insuliny aspart opisanym w Tabeli 1 w Przykładzie 1. W porównaniu z preparatem NovoRapid (preparat A), dodanie nikotynamidu (preparaty B i D), prowadzi do zwiększonego tworzenia się produktów degradacji, podczas gdy łączne dodanie nikotynamidu, kwasu glutaminowego i argininy (preparaty C i E) skutkuje w zasadzie podobnym wzorem degradacji przy zmniejszonym powstawaniu produktów o wysokiej masie cząsteczkowej (HMWP). Figura 2 przedstawia powstawanie produktów degradacji, wyrażone jako procent całkowitej zawartości insuliny, podczas 2 tygodni przechowywania preparatów według wynalazku w

6 6 temperaturze 37 o C. Litera A oznacza preparat 1 2 porównawczy NovoRapid a pozostałe litery odpowiadają preparatom insuliny aspart opisanym w Tabeli 1 w Przykładzie 1. Łączne dodanie nikotynamidu, kwasu glutaminowego i argininy w preparatach F, G, H i I, różniących się układem buforowym - buforem fosforanowym albo tris i stężeniem insuliny oraz Zn, odpowiednio: 0,6 mm i 0,3 mm albo 1,2 mm i 0,6 mm, daje wzór degradacji podobny do preparatu NovoRapid (preparat A). Figura 3 przedstawia stężenie glukozy (średnia ± SEM, n=8) w osoczu po podskórnym wstrzyknięciu świniom dawki 1 nmol/kg w punkcie czasowym 0 minut preparatów według wynalazku. Litera A oznacza preparat porównawczy NovoRapid a pozostałe litery odpowiadają preparatom insuliny aspart opisanym w Tabeli 1 w Przykładzie 1. W porównaniu z preparatem NovoRapid (preparat A), początkowa szybkość obniżania poziomu glukozy w osoczu jest wyższa dla preparatu z dodatkiem nikotynamidu (preparat N) a nawet wyższa dla preparatu zawierającego kombinację nikotynamidu i argininy (preparat M). Figura 4 przedstawia stężenie glukozy w osoczu (średnia ± SEM, n=7) po podskórnym wstrzyknięciu świniom dawki 1 nmol/kg w punkcie czasowym 0 minut preparatów według wynalazku. Litera A oznacza preparat porównawczy NovoRapid a pozostałe litery odpowiadają preparatom insuliny aspart opisanym w Tabeli 1 w Przykładzie 1. W porównaniu z preparatem NovoRapid (preparat A), początkowa szybkość

7 7 1 obniżania poziomu glukozy w osoczu jest wyższa dla preparatu z kombinacją nikotynamidu, argininy i kwasu glutaminowego (preparat L) i dla preparatu zawierającego kombinację nikotynamidu i argininy (preparat K). Figura przedstawia stężenie insuliny aspart w osoczu (średnia ± SEM, n=7) po podskórnym wstrzyknięciu świniom dawki 1 nmol/kg w punkcie czasowym 0 minut preparatów według wynalazku. Litera A oznacza preparat porównawczy NovoRapid a pozostałe litery odpowiadają preparatom insuliny aspart opisanym w Tabeli 1 w Przykładzie 1. W porównaniu z preparatem NovoRapid (preparat A), początkowa szybkość wchłaniania komponentu insuliny z preparatów z nikotynamidem (preparat J), z kombinacji nikotynamidu i argininy (preparat K) i z kombinacji nikotynamidu, argininy i kwasu glutaminowego (preparat L) jest znacznie wyższa. OPIS WYNALAZKU 2 [0013] Nieoczekiwanie okazało się, że wchłanianie związku insuliny po wstrzyknięciu podskórnym preparatów insuliny według wynalazku jest szybsze niż z referencyjnych preparatów insuliny. Ta właściwość jest użyteczna dla insulin szybko działających, zwłaszcza w kontekście schematu wstrzyknięć wielokrotnych, gdzie insulina jest podawana przed każdym posiłkiem. Przy szybszym początku działania, tę insulinę można dogodnie podawać w czasie bliższym posiłkowi niż w przypadku konwencjonalnych szybko działających roztworów insuli-

8 8 1 2 ny. Poza tym, szybsze zanikanie insuliny prawdopodobnie zmniejsza ryzyko hipoglikemii poposiłkowej. [0014] Preparaty insuliny według wynalazku są szybko działającymi preparatami insuliny, zawierającymi związek insulinowy, taki jak insulinę aspart, związek nikotynowy, taki jak nikotynamid, aminokwas argininę i bufor fosforanowy. Fakultatywnie, preparaty insuliny według wynalazku mogą zawierać dalsze aminokwasy, takie jak kwas glutaminowy. Te preparaty insuliny mają szybki profil wchłaniania, ściślej naśladujący normalną fizjologię niż obecnie istniejące terapie. Ponadto, preparaty insuliny według wynalazku wykazują stabilność chemiczną i fizyczną odpowiednią dla handlowych preparatów farmaceutycznych. [001] Preparaty insuliny według wynalazku mają nawet szybszy początek działania niż istniejące terapie insuliną. Takie ultra-szybkie preparaty insuliny mają zalety przywracania pierwszej fazy uwalniania insuliny, wygody wstrzykiwania i tłumie wytwarzania glukozy w wątrobie. Preparaty insuliny według wynalazku mają korzystną szybkość wchłaniania z tkanki podskórnej do osocza ze wzrostem początkowej szybkości wchłaniania w zakresie od 1, do razy w porównaniu z preparatami konwencjonalnymi, takimi jak NovoRapid, na co wskazują doświadczenia farmakologiczno/farmakodynamiczne (PK/PD) u świń. Ta wyższa szybkość wchłaniania może poprawić kontrolę glikemiczną i wygodę i może pozwolić na przejście z dawkowania przed posiłkiem na dawkowanie po posiłku. Niniejszy wynalazek opiera się częściowo na zdumiewającym odkryciu, że jakkolwiek dodanie nikotynamidu pozwala na zwiększenie szybkości wchłaniania to ma

9 9 1 2 również ujemny wpływ na stabilność chemiczną przez znaczące zwiększanie ilości HMWP. Preparaty insuliny według wynalazku mają zwiększoną stabilność chemiczną dzięki dodaniu argininy, co odzwierciedla się między innymi w obniżaniu tworzenia się dimerów i polimerów oraz desamido-insulin podczas przechowywania. Preparaty insuliny według wynalazku mogą również wykazywać lepszą stabilność fizyczną, co może być użyteczne do ich stosowania w pompach insulinowych. [0016] Niniejszy wynalazek dostarcza preparatu insuliny zawierającego związek insulinowy według niniejszego wynalazku, występujący w stężeniu od około 0,1 mm do około,0 mm i który to preparat ma wartość ph od 3 do 8,. Preparat zawiera również związek nikotynowy, argi-ninę i bufor fosforanowy. Preparat ten może ponadto za-wierać inhibitor proteazy (inhibitory proteazy), jony metalu, układ buforowy, środek konserwujący (środki konserwujące), środek utrzymujący izotoniczność (środki utrzymujące izotoniczność), środek chelatujący (środki chelatujące), stabilizatory i środki powierzchniowo czynne. [0017] W jednej realizacji, preparaty insuliny zawierają insulinę ludzką, jej analog lub kombinacje, nikotynamid i/lub kwas nikotynowy i/lub jego sole, argininę i/lub jej sole oraz bufor fosforanowy. [0018] W jednej realizacji, preparaty insuliny według wynalazku zawierają wodny roztwór insuliny ludzkiej B28Asp, nikotynamid, argininę i bufor fosforanowy. [0019] Zawartość ludzkiej insuliny B28Asp w roztworach według wynalazku może się zawierać w zakresie od 1 do 00 jednostek międzynarodowych (IU)/ml, korzystnie w zakresie od 0 do 333 IU/ml w preparatach do iniekcji.

10 1 2 Jednakże, do innych celów podawania parenteralnego, zawartość związku insuliny może być wyższa. [00] Opisany jest również preparat insuliny zawierający związek insulinowy, związek nikotynowy, kwas glutaminowy, argininę i bufor fosforanowy. [0021] W niniejszym kontekście, jednostka IU odpowiada 6 nmolom. [0022] Termin insulina aspart oznacza analog insuliny ludzkiej, insulinę ludzką B28Asp. [0023] Termin początek działania odnosi się do czasu od wstrzyknięcia do zmiany krzywej PK w kierunku wzrostu. [0024] Termin szybkość wchłaniania odnosi się do nachylenia krzywej PK. [002] Według wynalazku, związek insulinowy należy rozumieć w niniejszym opisie jako insulinę ludzką, analog insuliny i/lub dowolne ich kombinacje. [0026] Termin insulina ludzka stosowany w niniejszym opisie oznacza ludzki hormon, którego struktura i właściwości są dobrze znane. Insulina ludzka posiada dwa łańcuchy polipeptydowe, które są połączone mostkami dwusiarczkowymi pomiędzy resztami cysteiny, konkretnie łańcuch A i łańcuch B. Łańcuch A jest peptydem 21- aminokwasowym a łańcuch B jest peptydem -aminokwasowym. Te dwa łańcuchy są połączone trzema mostkami dwusiarczkowymi: jednym pomiędzy cysteinami w pozycjach 6 i 11 łańcucha A, drugim pomiędzy cysteiną w pozycji 7 łańcucha A i cysteiną w pozycji 7 łańcucha B i trzecim pomiędzy cysteiną w pozycji łańcucha A i cysteiną w pozycji 19 łańcucha B. [0027] Ten hormon jest syntetyzowany jako jednołańcuchowy prekursor proinsuliny (preproinsulina)

11 składający się z prepeptydu zawierającego 24 aminokwasy, po którym następuje proinsulina zawierająca 86 aminokwasów w konfiguracji: prepeptyd-b-arg-arg-c- Lys-Arg-A, w której C oznacza peptyd łączący o długości 31 aminokwasów. Arg-Arg i Lys-Arg są miejscami odszczepienia do odcięcia peptydu łączącego z łańcuchów A i B. [0028] Analog insuliny w niniejszym opisie oznacza polipeptyd wyprowadzony ze struktury pierwszorzędowej insuliny występującej w stanie naturalnym, na przykład z insuliny ludzkiej przez mutację. Jednej lub większej ilości mutacji dokonuje się przez delecję i/lub substytucję co najmniej jednej reszty aminokwasowej występującej w naturalnej insulinie i/lub przez addycję co najmniej jednej reszty aminokwasowej. Dodane i/lub wymienione reszty aminokwasowe mogą być albo kodowanymi resztami aminokwasowymi albo innymi występującymi w stanie naturalnym resztami aminokwasowymi. [0029] W jednej realizacji, analog insuliny zawiera mniej niż 8 modyfikacji (substytucji, delecji, addycji i ich dowolnych kombinacji) względem insuliny macierzystej, alternatywnie mniej niż 7 modyfikacji względem insuliny macierzystej, alternatywnie mniej niż 6 modyfikacji względem insuliny macierzystej, alternatywnie mniej niż modyfikacji względem insuliny macierzystej, alternatywnie mniej niż 4 modyfikacje względem insuliny macierzystej, alternatywnie mniej niż 3 modyfikacje względem insuliny macierzystej, alternatywnie mniej niż 2 modyfikacje względem insuliny macierzystej.

12 [00] Mutacje w cząsteczce insuliny oznacza się przez podanie łańcucha (A albo B), pozycji i trzyliterowego kodu aminokwasu zastępującego natywny aminokwas. Oznaczenie desb albo B(1-29) oznacza łańcuch B naturalnej insuliny albo jej analog, w którym brakuje reszty aminokwasu B a B28Asp insulina ludzka oznacza ludzką insulinę, w której reszta aminokwasowa w pozycji 28 łańcucha B została zastąpiona przez Asp. [0031] Przykładami analogów insuliny są takie analogi, w których Pro w pozycji 28 łańcucha B jest zmutowana przez Asp, Lys, Leu, Val albo Ala i/lub Lys w pozycji B29 jest zmutowana przez Pro, Glu albo Asp. Ponadto, Asn w pozycji B3 może być zmutowana przez Thr, Lys, Gln, Glu albo Asp. Reszta aminokwasowa w pozycji A21 może być zmutowana przez Gly. Aminokwas w pozycji B1 może być zmutowany przez Glu. Aminokwas w pozycji B16 może być zmutowany przez Glu albo His. Dalszymi przykładami analogów insuliny są analogi delecyjne, np. analogi, w których został usunięty aminokwas B w insulinie ludzkiej (des(b) isulina ludzka), analogi insuliny, w których został usunięty aminokwas B1 w insulinie ludzkiej (des(b1) isulina ludzka), des(b28- B) insulina ludzka i des(b27) insulina ludzka. Przykładami analogów insuliny są również analogi insuliny, w których łańcuch A i/lub łańcuch B mają przedłużenie na N-końcu i analogi insuliny, w których łańcuch A i/lub łańcuch B mają przedłużenia na C-końcu, takie jak dwie reszty argininy dodane do C-końca w łańcuchu B. Dalszymi przykładami są analogi insuliny zawierające kombinacje wyżej wymienionych mutacji. Dalszymi przykładami analogów insuliny są analogi

13 insuliny, w których aminokwasem w pozycji A14 jest Asn, Gln, Glu, Arg, Asp, Gly albo His, aminokwasem w pozycji B2 jest His i które ewentualnie posiadają jedną lub większą ilość dodatkowych mutacji. Analogi insuliny ludzkiej, w których resztą aminokwasową w pozycji A21 jest Gly i w których ten alanog insuliny jest poza tym przedłużony na C-końcu dwiema resztami argininy są również przykładami analogów insuliny. [0032] Dalsze przykłady analogów insuliny obejmują między innymi: DesB insulinę ludzką; AspB28 insulinę ludzką; AspB28, desb insulinę ludzką; LysB3, GluB29 insulinę ludzką; LysB28, ProB29 insulinę ludzką; GlyA21, ArgB31, ArgB32 insulinę ludzką; GluA14, HisB2 insulinę ludzką; HisA14, HisB2 insulinę ludzką; GluA14, HisB2, desb insulinę ludzką; HisA14, HisB2, desb insulinę ludzką; GluA14, HisB2, desb27, desb28, desb29, desb insulinę ludzką; GluA14, HisB2, GluB27, desb insulinę ludzką; GluA14, HisB16, HisB2, desb insulinę ludzką; HisA14, HisB16, HisB2, desb insulinę ludzką; HisA8, GluA14, HisB2, GluB27, desb insulinę ludzką; HisA8, GluA14, GluB1, GluB16, HisB2, GluB27, desb insulinę ludzką i HisA8, GluA14, GluB16, HisB2, desb insulinę ludzką. [0033] Termin związek nikotynowy obejmuje nikotynamid, kwas nikotynowy, niacynę, amid niacyny i witaminę B3 i/lub ich sole i/lub dowolne ich kombinacje. [0034] Według wynalazku, stężenie związku nikotynowego i/lub jego soli zawiera się w zakresie od około 1 mm do około 0 mm albo od około mm do około 0 mm.

14 [003] Termin arginina albo Arg obejmuje aminokwas argininę i/lub jej sól. [0036] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od 1 do 0 mm argininy. [0037] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od 1 do mm argininy. [0038] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od do 90 mm argininy. [0039] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od do 8 mm argininy. [0040] Termin kwas glutaminowy albo Glu obejmuje aminokwas kwas glutaminowy i/lub jego sól. [0041] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od 1 do 0 mm kwasu glutaminowego. [0042] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od do 90 mm kwasu glutaminowego. [0043] W jednej z realizacji, preparat insuliny zawiera od do 8 mm kwasu glutaminowego. [0044] Termin preparat farmaceutyczny albo preparat insuliny oznacza w niniejszym opisie produkt zawierający związek insulinowy, np. insulinę ludzką, jej analog i/lub ich kombinacje oraz związek nikotynowy oraz aminokwas, ewentualnie łącznie z innymi substancjami pomocniczymi, takimi jak środki konserwujące, środki chelatujące, modyfikatory toniczności, środki zwiększające masę, stabilizatory, przeciwutleniacze, polimery i środki powierzchniowo czynne, jony metali, nośniki oleiste i białka (np. albuminę surowicy ludzkiej, żelatynę lub proteiny), przy czym ten preparat insulinowy nadaje się do leczenia, zapobiegania lub zmniejszania ciężkości

15 1 1 2 choroby lub zaburzenia przez stosowanie tego preparatu insulinowego u osoby. Stąd też, preparat insulinowy jest często nazywany w stanie techniki preparatem farmaceutycznym albo kompozycją farmaceutyczną. [004] Bufor może być wybrany z grupy obejmującej między innymi octan sodu, węglan sodu cytrynian, dwuwodorofosforan sodu, wodorofosforan sodu, fosforan sodu i tris(hydroksymetylo)-aminometan, dietyloglicynę (bicine), N-(trihydroksymetylo)metylo)glicynę (tricine), kwas jabłkowy, bursztynian, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas winowy, kwas asparaginowy albo ich mieszaniny. Każdy z tych specyficznych buforów stanowi alternatywną realizację wynalazku. [0046] Preparat insuliny według wynalazku może poza tym zawierać inne składniki powszechnie występujące w preparatach insuliny, na przykład, środki kompleksujące cynk, takie jak cytrynian. [0047] Glicerol i/lub mannitol i/lub chlorek sodu mogą występować w ilości odpowiadającej odpowiednio stężeniom: od 0 do mm, od 0 do 0 mm albo od 0 do 0 mm. [0048] W preparatach insuliny według wynalazku mogą być również obecne stabilizatory, środki powierzchniowo czynne i środki konserwujące. [0049] Preparaty insuliny według wynalazku mogą poza tym zawierać dopuszczalny farmaceutycznie środek konserwujący. Ten środek konserwujący może występować w ilości wystarczającej do uzyskania efektu konserwującego. Ilość środka konserwującego w preparacie insuliny można określić między innymi na podstawie literatury z tej dziedziny i/lub znanych

16 ilości środka konserwującego np. w preparatach handlowych. Każdy z tych specyficznych środków konserwujących stanowi alternatywną realizację wynalazku. Stosowanie środka konserwującego w preparatach farmaceutycznych jest opisane, na przykład, w encyklopedii Remingtona: The Science and Practice of Pharmacy, wydanie XIX, 199. [000] Środkiem konserwującym obecnym w preparacie insuliny według wynalazku może być środek taki jak w dotychczasowych konwencjonalnych preparatach insuliny, na przykład, może to być fenol, m-krezol i metyloparaben. [001] Preparat insuliny według wynalazku może poza tym zawierać środek chelatujący. Stosowanie środków chelatujących w preparatach farmaceutycznych jest dobrze znane specjalistom. Dla wygody, jako odnośnik podaje się encyklopedię Remingtona: The Science and Prectice of Pharmacy, wydanie XIX, 199. [002] Preparat insuliny według wynalazku może ponadto zawierać stabilizator. Termin stabilizator w znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie odnosi się do związków chemicznych dodawanych do preparatów farmaceutycznych zawierających polipeptyd w celu stabilizowania tego peptydu, a więc, wydłużenia czasu składowania i/lub czasu używania takich preparatów po otwarciu opakowania. Dla wygody, jako odnośnik podaje się encyklopedię Remingtona: The Science and Practice of Pharmacy, wydanie XIX, 199. [003] Preparat insuliny według wynalazku może również zawierać środek powierzchniowo czynny. Termin środek powierzchniowo czynny w znaczeniu stosowanym w

17 niniejszym opisie odnosi się do dowolnych cząsteczek lub jonów, które są zawarte w części rozpuszczalnej w wodzie (hydrofilowej), głowie i w segmencie rozpuszczalnym w tłuszczach (lipofilowym). Środki powierzchniowo czynne gromadzą się korzystnie na granicy faz, przy czym część hydrofilowa jest zorientowana w kierunku wody (faza hydrofilowa) a część lipofilowa jest zorientowana w kierunku fazy olejowej albo lipofilowej (szkła, powietrza, oleju i podobnej). Stężenie, przy którym środki powierzchniowo czynne zaczynają tworzyć micele jest znane jako krytyczne stężenie micelarne albo CMC. Poza tym, środki powierzchniowo czynne obniżają napięcie powierzchniowe cieczy. Środki powierzchniowo czynne znane są również jako środki amfipatyczne. Termin detergent jest synonimem stosowanym ogólnie dla środków powierzchniowo czynnych. Stosowanie środka powierzchniowo czynnego w preparatach farmaceutycznych jest dobrze znane specjalistom. Dla wygody, jako odnośnik podaje się encyklopedię Remingtona: The Science and Practice of Pharmacy, wydanie XIX, 199. [004] W dalszej realizacji, wynalazek dotyczy preparatu insuliny stanowiącego roztwór wodny związku insulinowego według wynalazku i buforu fosforanowego, w którym to preparacie związek insulinowy występuje w stężeniu 0,1 mm lub wyższym i który to preparat ma wartość ph od około 3,0 do około 8, w temperaturze pokojowej (~2 o C). [00] Przedmiotem wynalazku są również sposoby wytwarzania preparatów według wynalazku.

18 18 [006] W jednej realizacji, sposób wytwarzania preparatów insuliny według wynalazku obejmuje: 1 2 a) sporządzenie roztworu przez rozpuszczenie związku insulinowego lub mieszaniny związków insulinowych w wodzie lub w buforze; b) sporządzenie roztworu przez rozpuszczenie jonu metalu dwuwartościowego w wodzie lub w buforze; c) sporządzenie roztworu przez rozpuszczenie środka konserwującego w wodzie lub w buforze; d) sporządzenie roztworu przez rozpuszczenie środka nadającego izotoniczność w wodzie lub w buforze; e) sporządzenie roztworu przez rozpuszczenie środka powierzchniowo czynnego i/lub stabilizatora w wodzie lub w buforze; f) zmieszanie roztworu a) z jednym lub z większą liczbą roztworów b), c), d) i e). [007] Na końcu ustawia się ph mieszaniny z punktu f) na żądaną wartość i prowadzi się sterylizację przez filtrację. [008] Preparaty insuliny według wynalazku mogą być stosowane w leczeniu cukrzycy przez podawanie parenteralne. Zaleca się, aby dawkowanie preparatów insuliny według wynalazku, które mają być stosowane u pacjenta było dobrane przez lekarza. [009] Parenteralne stosowanie można wykonywać przez wstrzykiwanie podskórne, śródskórne, dootrzewnowe albo dożylne przy użyciu strzykawki, ewentualnie strzykawki typu penu. Alternatywnie, stosowanie parenteralne może się odbywać przy użyciu pompy infuzyjnej. Jako następną możliwość, preparaty insuliny zawierające związek

19 insulinowy według wynalazku można również dostosować do podawania transdermalnego, np. drogą iniekcji bezigłowej lub z plastra, ewentualnie plastra jontoforetycznego albo przez błony śluzowe, np. przez podawanie podpoliczkowe. [0060] Preparaty insuliny według wynalazku można podawać pacjentowi potrzebującego takiego leczenia w kilku miejscach, na przykład, w miejscach powierzchniowych, na przykład, na skórę i na śluzówkę, w miejscach omijających absorpcję, na przykład, podanie do tętnicy, do żyły, do serca i w miejscach, w których zaangażowane jest wchłanianie, na przykład, podanie do skóry, pod skórę, do mięśnia albo do brzucha. [0061] W jednej z realizacji wynalazku, preparat insuliny jest preparatem wodnym, czyli preparatem zawierającym wodę. Taki preparat jest typowo roztworem albo zawiesiną. W kolejnej realizacji wynalazku, preparat insuliny jest roztworem wodnym. [0062] Termin preparat wodny definiuje się jako preparat zawierający co najmniej 0% wagowych wody. Podobnie, termin roztwór wodny definiuje się jako roztwór zawierający co najmniej 0% wagowych wody a termin zawiesina wodna definiuje się jako zawiesina zawierająca co najmniej 0% wagowych wody. [0063] Zawiesiny wodne mogą zawierać związki aktywne w mieszaninie z substancjami pomocniczymi odpowiednimi do wytwarzania zawiesin wodnych. [0064] W jednej realizacji, preparaty insuliny według wynalazku są dobrze dostosowane do stosowania w urządzeniach typu penu używanych w terapii insulinowej przez wstrzykiwanie.

20 1 2 [006] W jednej realizacji, preparaty insuliny według wynalazku można stosować w pompach do podawania insuliny. [0066] Termin stabilność fizyczna preparatu insuliny stosowany w niniejszym opisie odnosi się do tendencji białka do tworzenia biologicznie nieaktywnych i/lub nierozpuszczalnych agregatów białka w wyniku ekspozycji tego białka na naprężenia cieplne i mechaniczne i/lub na interakcję z powierzchnią rozdziału faz i powierzchniami, które działają destabilizująco, takimi jak powierzchnie i powierzchnie międzyfazowe hydrofobowe. Stabilność fizyczną wodnych preparatów białka ocenia się drogą kontroli wzrokowej i/lub przez pomiary zmętnienia po wystawieniu preparatu umieszczonego w odpowiednich pojemnikach (np. wkładów lub fiolek) na naprężenie mechaniczne/fizyczne (np. wstrząsanie) w różnych temperaturach, przez różne okresy czasu. Kontrolę wzrokową tych preparatów prowadzi się w ostrym świetle zogniskowanym na ciemnym tle. Zmętnienie preparatu ocenia się przez wizualną ocenę punktową stopnia zmętnienia, na przykład, w skali od 0 do 3 (preparat nie wykazujący zmętnienia odpowiada wizualnej ocenie punktowej 0, a preparat wykazujący zmętnienie widoczne w świetle dziennym odpowiada wizualnej ocenie punktowej 3). Preparat klasyfikuje się jako fizycznie niestabilny pod względem agregacji białka jeśli wykazuje on zmętnienie widoczne w świetle dziennym. Alternatywnie, zmętnienie preparatu można ocenić przez zwykłe pomiary zmętnienia dobrze znane specjaliście. Stabilność fizyczną wodnych preparatów białkowych można również ocenić stosując środek

21 spektroskopowy albo sondę stanu konformacyjnego tego białka. Sondą jest korzystnie mała cząsteczka, która wiąże się preferencyjnie z nie-natywnym konformerem tego białka. Przykładem niskocząsteczkowej sondy spektroskopowej struktury białka jest tioflawina T. Tioflawina T jest barwnikiem fluorescencyjnym, który jest szeroko stosowany do wykrywania włókien amyloidowych. W obecności włókien i prawdopodobnie również innych konfiguracji białka, tioflawina T daje nowe maksimum fali wzbudzenia przy długości około 40 nm i wzmocnioną emisję przy około 482 nm jeśli znajduje się w formie związanej z białkiem włókien. Niezwiązana tioflawina T zasadniczo nie wykazuje fluorescencji przy tych długościach fali. [0067] Termin stabilność chemiczna preparatu insuliny stosowany w niniejszym opisie odnosi się do zmian w kowalencyjnej strukturze białka, prowadzących do powstawania produktów degradacji chemicznej o potencjalnie mniejszej sile działania biologicznego i/lub potencjalnie nasilonych właściwościach immunogennych w porównaniu do struktury białka natywnego. Mogą się tworzyć różne produkty degradacji chemicznej, zależnie od typu i rodzaju natywnego białka i środowiska, na które zostało wystawione to białko. Podczas przechowywania i stosowania preparatu białkowego często obserwuje się wzrastające ilości produktów degradacji chemicznej. Większość białek wykazuje skłonność do deamidacji, będącej procesem, w którym grupa amidowa łańcucha bocznego w resztach glutaminylowych lub asparaginylowych ulega hydrolizie tworząc wolny kwas karboksylowy lub reszty

22 asparaginylowe, z powstaniem pochodnej IsoAsp. Inne szlaki degradacji przebiegają z powstawaniem produktów o wysokiej masie cząsteczkowej, w których dwie albo więcej cząsteczek białka wiąże się ze sobą wiązaniami kowalencyjnymi przez transamidację i/lub interakcje grup dwusiarczkowych, prowadzące do tworzenia się kowalencyjnie związanych dimerycznych, oligomerycznych i polimerycznych produktów degradacji ((Stability of Protein Pharmaceuticals (Stabilność białkowych środków farmaceutycznych)), Ahern T., J. & Manning M., C, Plenum Press, Nowy Jork 1992). Należy wskazać na utlenianie (na przykład reszt metioniny) jako na inny wariant degradacji chemicznej. Stabilność chemiczną preparatu białkowego można ocenić przez oznaczenie ilości produktów degradacji chemicznej w różnych punktach czasowych po ekspozycji na różne warunki środowiska (powstawanie produktów rozkładu można często przyspieszyć na przykład przez zwiększenie temperatury). Ilość każdego pojedynczego produktu rozkładu często oznacza się przez rozdzielenie tych produktów rozkładu, zależnie od wielkości cząsteczki i/lub ładunku, wykorzystując różne techniki chromatograficzne (np. chromatografię wykluczania (SEC- HPLC) i/lub HPLC z układem faz odwróconych (RP-HPLC). Jako że produkty HMWP są potencjalnie immunogenne i nieaktywne biologicznie, korzystne są niskie poziomy tych HMWP. [0068] Termin preparat stabilizowany odnosi się do preparatu o zwiększonej stabilności fizycznej, zwiększonej stabilności chemicznej albo zwiększonej stabilności fizycznej i chemicznej. W zasadzie,

23 preparat musi być stabilny podczas stosowania i przechowywania (zgodnie z zalecanymi warunkami stosowania i przechowywania) aż do czasu wygaśnięcia daty ważności. [0069] Termin cukrzyca obejmuje cukrzycę typu 1, cukrzycę typu 2, cukrzycę ciążową (podczas ciąży) i inne stany powodujące hiperglikemię. Termin ten stosuje się do zaburzenia metabolicznego, w którym trzustka produkuje niewystarczające ilości insuliny albo w którym komórki ciała nie reagują odpowiednio na insulinę, przez co komórki nie mogą absorbować glukozy. W rezultacie, glukoza gromadzi się we krwi. [0070] Cukrzyca typu 1, zwana również cukrzycą insulino-zależną (IDDM) i cukrzyca młodzieńcza są spowodowane zniszczeniem komórek B, prowadzącym zwykle do całkowitego braku insuliny. [0071] Cukrzyca typu 2, zwana również cukrzycą insulino-niezależną (NIDDM) i cukrzyca dorosłych, jest związana z przeważającą opornością na insulinę, a więc ze względnym niedoborem insuliny i/lub z przeważającym defektem wydzielniczym z opornością na insulinę. [0072] Termin dopuszczalny farmaceutycznie oznacza w niniejszym opisie: dostosowany do normalnych zastosowań farmaceutycznych, czyli nie zwiększający jakichkolwiek poważnych niepożądanych wydarzeń u pacjentów. [0073] Stosowany w niniejszym opisie termin leczenie choroby oznacza prowadzenie i opiekę nad pacjentem, u którego rozwinęła się choroba, wystąpił stan lub zaburzenie i obejmuje leczenie, zapobieganie lub łagodzenie przebiegu choroby. Celem leczenia jest

24 zwalczenie choroby, stanu lub zaburzenia. Leczenie obejmuje stosowanie związków aktywnych dla wyeliminowania lub opanowania choroby, stanu lub zaburzenia jak również łagodzenie objawów lub komplikacji związanych z tą chorobą, stanem lub zaburzeniem i zapobieganie chorobie, stanowi lub zaburzeniu. [0074] W innej realizacji, stosuje się analog insuliny według wynalazku jako lek do opóźniania lub zapobiegania rozwojowi choroby w cukrzycy typu 2. [007] W jednej z realizacji niniejszego wynalazku, preparat insuliny według wynalazku jest przeznaczony jako lek do leczenia lub zapobiegania hiperglikemii, obejmującej hiperglikemię wywołaną stresem, cukrzycę typu 2, zaburzoną tolerancję glukozy, cukrzycę typu 1 oraz w oparzeniach, ranach operacyjnych oraz w innych chorobach albo urazach, w leczeniu których potrzebne jest działanie anabolizujące, w zawale mięśnia sercowego, udarze, w chorobie wieńcowej serca i w innych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. [0076] W innej realizacji niniejszego wynalazku, ten preparat insuliny jest przeznaczony do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu hiperglikemii, w tym hiperglikemii wywołanej stresem, cukrzycy typu 2, zaburzonej tolerancji glukozy, cukrzycy typu 1 oraz w oparzeniach, ranach operacyjnych oraz w innych chorobach albo urazach, w leczeniu których potrzebne jest działanie anaboliczne, w zawale mięśnia sercowego, w chorobie wieńcowej serca i w innych zaburzeniach sercowo-naczyniowych, w udarze, które to stosowanie obejmuje podawanie pacjentowi potrzebującemu takiego

25 2 1 2 leczenia skutecznej w takim leczeniu ilości preparatu insuliny według wynalazku. [0077] Leczenie preparatem insuliny według wynalazku może być również połączone z drugimi albo bardziej aktywnymi farmakologicznie substancjami, np. wybranymi spośród środków przeciwcukrzycowych, środków przeciw otyłości, środków regulujących apetyt, środków przeciwnadciśnieniowych, środków do leczenia i/lub zapobiegania komplikacjom wynikającym z lub związanych z cukrzycą oraz środków do leczenia i/lub zapobiegania komplikacjom i zaburzeniom wynikającym z lub związanym z otyłością. [0078] Leczenie preparatem insuliny według wynalazku można również łączyć z chirurgią bariatryczną chirurgią, która wpływa na poziomy glukozy i/lub na homeostazę, taką jak podwiązanie żołądka albo przepływ żołądkowy omijający. [0079] Wytwarzanie polipeptydów, np. insuliny, jest dobrze znane w stanie techniki. Analog insuliny według wynalazku można na przykład wytwarzać klasyczną metodą syntezy peptydów, np. metodą syntezy peptydu w fazie stałej, wykorzystując chemię t-boc albo Fmoc bądź inne dobrze ustalone techniki, patrz np.: Greene i Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis (Grupy ochronne w syntezie organicznej), John Wiley & Sons, Analog insuliny można również wytworzyć sposobem, który polega na hodowli komórki gospodarza niosącej sekwencję DNA kodującą ten analog i zdolnej do ekspresji tego analogu insuliny w odpowiednim medium pożywki w warunkach umożliwiających ekspresję tego analogu insuliny. W przypadku analogów insuliny

26 zawierających reszty nie-naturalnych aminokwasów, komórka rekombinantowa powinna być tak zmodyfikowana, aby te nie-naturalne aminokwasy były wbudowane do analogu, na przykład przez użycie mutantów trna. Tak więc, podsumowując, analogi insuliny według wynalazku wytwarza się analogicznie do wytwarzania znanych analogów insulinowych. [0080] Do wytwarzania insuliny ludzkiej i analogów ludzkiej insuliny można wykorzystać kilka sposobów. Przykładowo, trzy główne sposoby stosowane do wytwarzania insuliny w mikroorganizmach są ujawnione w WO 08/ W dwóch z nich wykorzystuje się Escherichia coli albo z ekspresją dużego białka fuzyjnego w cytoplazmie [Frank i wsp., (1981) w publikacji: Peptides: Proceedings of the 7th American Chemistry Symposium (wydawca: Rich & Gross), Pierce Chemical Co., Rockford, III, strony )] albo z użyciem peptydu sygnałowego dla umożliwienia wydzielania do przestrzeni periplazmatycznej [Chan i wsp., (1981) PNAS 78: ]. W trzecim sposobie wykorzystuje się Saccharomyces cerevisiae do wydzielenia prekursora insuliny do pożywki [Thim i wsp. (1986) PNAS 83: ]. W stanie techniki ujawnionych jest wiele prekursorów insuliny, których ekspresja przebiega albo w E. coli albo w Saccharomyces cerevisiae; patrz: US , WO 9/16708, EP 0094, EP , EP i EP [0081] Analogi insulinowe wytwarza się przez ekspresję sekwencji DNA kodujących dany analog insuliny w odpowiedniej komórce gospodarza, jak ujawniono np. w US Ten analog insuliny jest wytwarzany albo

27 bezpośrednio albo jako cząsteczka prekursora posiadająca wydłużenie na N-końcu łańcucha B albo wydłużenie C-końcowe w łańcuchu B. Wydłużenie N-końcowe może posiadać funkcję zwiększania wydajności produktu wytwarzanego bezpośrednio i może mieć długość do 1 reszt aminokwasowych. To wydłużenie N-końcowe ma być odszczepione in vitro po izolacji z brzeczki hodowli, a więc, będzie miało miejsce rozszczepienia za miejscem B1. Wydłużenie N-końcowe typu odpowiedniego w niniejszym wynalazku są ujawnione w US i w EP Wydłużenie C-końcowe może mieć funkcję ochrony cząsteczki dojrzałej insuliny albo analogu insuliny przed wewnątrzkomórkowym przetwarzaniem proteolitycznym przez egzoproteazy komórki gospodarza. To wydłużenie C-końcowe ma być odszczepione albo poza komórką w brzeczce hodowli przez wydzielaną, aktywną karboksypeptydazę albo in vitro po izolacji z brzeczki hodowli. Sposób wytwarzania dojrzałej insuliny i analogu insuliny z wydłużeniami C-końcowymi w łańcuchu B usuwanymi przez karboksypeptydazę jest ujawniony w WO 08/ Docelowym produktem insuliny w tym procesie może być albo dwu-łańcuchowa insulina ludzka albo analog dwu-łańcuchowej insuliny ludzkiej, który może ale nie musi posiadać C-końcowego wydłużenia w łańcuchu B. Jeśli docelowy produkt insuliny nie będzie miał C- końcowego wydłużenia w łańcuchu B, to wówczas to C- końcowe wydłużenie powinno mieć zdolność następnego odszczepienia z łańcucha B przed etapami dalszego oczyszczania.

28 28 [0082] W niniejszym wynalazku rozważa się również następującą nie-ograniczającą listę realizacji, które są dalej opisane w innej części niniejszego opisu: 1. Preparat insuliny zawierający: związek insulinowy związek nikotynowy argininę i bufor fosforanowy Preparat insuliny według realizacji 1, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina albo analog insuliny. 3. Preparat insuliny według dowolnej z powyższych realizacji, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina B28Asp. 4. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina B28LysB29Pro.. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina B3LysB29Glu. 6. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w zakresie wybranym z następujących: 0,1,0 mm; 0,1 3,0 mm; 0,1 2, mm; 0,1 2,0 mm; 0,1 1, mm; 0,2 2, mm; 0,2 2,0 mm; 0,2 1, mm; 0,3 3,0 mm; 0,3 2, mm; 0,3 2,0 mm; 0,3 1, mm; 0, 1,3 mm i 0,6 1,2 mm. 7. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,1 mm do około,0 mm.

29 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,1 mm do około 3,0 mm. 9. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,1 mm do około 2, mm.. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,1 mm do około 2,0 mm. 11. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,1 mm do około 1, mm. 12. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,2 mm do około 2, mm. 13. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,2 mm do około 2,0 mm. 14. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,2 mm do około 1, mm. 1. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,3 mm do około 3,0 mm. 16. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,3 mm do około 2, mm. 17. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,3 mm do około 2,0 mm.

30 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,3 mm do około 1, mm. 19. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0, mm do około 1,3 mm.. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,3 mm do około 1,2 mm. 21. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,6 mm do około 1,2 mm. 22. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości około 0,6 mm albo około 1,2 mm. 23. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości około 0,3 mm. 24. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości około 0,6 mm. 2. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek insulinowy występuje w ilości około 1,2 mm. 26. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek nikotynowy jest wybrany z grupy obejmującej nikotynamid, kwas nikotynowy, niacynę, amid niacyny i witaminę B3 oraz/lub ich sole i/lub ich połączenia. 27. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek nikotynowy jest wybrany

31 spośród nikotynamidu i kwasu nikotynowego oraz/lub ich soli i/lub ich połączeń. 28. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym związek nikotynowy występuje w zakresie wybranym z następujących: 1 0 mm; 0 mm; 40 1 mm, mm albo 80 1 mm. 29. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 1 mm do około 0 mm związku nikotynowego.. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 8 mm do około 260 mm związku nikotynowego. 31. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 0 mm związku nikotynowego. 32. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 1 mm do około 10 mm związku nikotynowego. 33. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około mm związku nikotynowego. 34. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 1 mm związku nikotynowego. 3. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 40 mm do około 1 mm związku nikotynowego. 36. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 40 mm związku nikotynowego.

32 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 60 mm do około 80 mm związku nikotynowego. 38. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 70 mm do około 140 mm związku nikotynowego. 39. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 80 mm do około 1 mm związku nikotynowego. 40. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 8 mm, mm, 0 mm albo 1 mm związku nikotynowego. 41. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 8 mm związku nikotynowego. 42. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm, 0 mm albo 1 mm związku nikotynowego. 43. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm związku nikotynowego. 44. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 0 mm związku nikotynowego. 4. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 1 mm związku nikotynowego. 46. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 10 mm związku nikotynowego.

33 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający następujące zakresy związku argininy: 1 0 mm, 1 mm, 8 8 mm, 90 mm, 90 mm, 8 mm, 60 mm, albo 40 mm. 48. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający następujące zakresy związku argininy: 1 1 mm, 8 8 mm albo 1 40 mm. 49. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 1 mm do około 1 mm argininy. 0. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 1 mm do około 0 mm argininy. 1. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 1 mm argininy. 2. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 90 mm argininy. 3. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 8 mm argininy. 4. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 8 mm do około 8 mm argininy.. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 60 mm argininy.

34 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około mm do około 40 mm argininy. 7. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający od około 1 mm do około 40 mm argininy. 8. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym arginina występuje w zakresie wybranym z następujących: 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, mm, 1 mm, mm, 2 mm, mm, 3 mm albo 40 mm, 4 mm, 0 mm albo 60 mm. 9. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 1 mm argininy. 60. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 2 mm argininy. 61. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 3 mm argininy. 62. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 4 mm argininy. 63. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm argininy. 64. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 6 mm argininy. 6. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 7 mm argininy. 66. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 8 mm argininy. 67. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 9 mm argininy. 68. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm argininy.

35 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 1 mm argininy. 70. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm argininy. 71. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 2 mm argininy. 72. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm argininy. 73. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 3 mm argininy. 74. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 40 mm argininy. 7. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 4 mm argininy. 76. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 0 mm argininy. 77. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około mm argininy. 78. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający około 60 mm argininy. 79. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, zawierający ponadto kwas glutaminowy. 80. Preparat insuliny według realizacji 79, w którym to preparacie kwas glutaminowy występuje w zakresie wybranym z następujących: 1 0 mm, 90 mm, 90 mm, 8 mm albo 0 mm. 81. Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający od około 1 mm do około 0 mm kwasu glutaminowego. 82. Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający od około mm do około 90 mm kwasu glutaminowego.

36 Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający od około mm do około 8 mm kwasu glutaminowego. 84. Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający od około mm do około 0 mm kwasu glutaminowego. 8. Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający około mm albo 0 mm kwasu glutaminowego. 86. Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający około mm kwasu glutaminowego. 87. Preparat insuliny według realizacji 79, zawierający około 0 mm kwasu glutaminowego. 88. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, który to preparat ponadto zawiera jon metalu, środek konserwujący (środki konserwujące), środek nadający izotoniczność (środki nadające izotoniczność), stabilizator (stabilizatory), środek powierzchniowo czynny (środki powierzchniowo czynne) i bufor (bufory). 89. Preparat insuliny według realizacji 88, w którym stabilizatorem jest niejonowy środek powierzchniowo czynny. 90. Preparat insuliny według realizacji 89, w którym środkiem powierzchniowo czynnym jest polisorbat (Tween ) albo polisorbat 80 (Tween 80). 91. Preparat insuliny według realizacji 89, w którym środkiem powierzchniowo czynnym jest polisorbat (Tween ). 92. Preparat insuliny według realizacji 89, w którym środkiem powierzchniowo czynnym jest polisorbat 80 (Tween 80). 93. Preparat insuliny według którejkolwiek realizacji od 89 do 92, zawierający od około do 0 ppm, od około do około 0 ppm albo od około do około ppm polisorbatu.

37 Preparat insuliny według realizacji 88, zawierający ponadto związek fenolowy. 9. Preparat insuliny według realizacji 94, w którym ten związek fenolowy występuje w ilości od około 0 do około 6 mg/ml albo od około 0 do około 4 mg/ml. 96. Preparat insuliny według realizacji 88, zawierający ponadto m-krezol. 97. Preparat insuliny według realizacji 96, w którym m- krezol występuje w ilości od około 0, do około 4,0 mg/ml albo od około 0,6 do około 4,0 mg/ml. 98. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph jest obojętne do słabo zasadowego. 99. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi od około 7,0 do około 8,0. 0. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,0. 1. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,1. 2. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,2. 3. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,3. 4. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,4.

38 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,. 6. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,6. 7. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,7. 8. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,8 9. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 7,9. 1. Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, w którym to preparacie ph wynosi około 8, Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, do stosowania w zmniejszaniu poziomu glukozy we krwi u ssaków przez podawanie pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia aktywnej leczniczo dawki preparatu insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, do stosowania w cukrzycy u osoby, obejmującego podawanie pacjentowi preparatu insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji albo zastosowanie według realizacji 111 albo 112 do podawania parenteralnego.

39 Preparat insuliny według którejkolwiek z powyższych realizacji, do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu hiperglikemii, obejmującej hiperglikemię wywołaną stresem, cukrzycy typu 2, zaburzonej tolerancji glukozy, cukrzycy typu 1 oraz w oparzeniach, ranach operacyjnych oraz innych chorobach albo urazach, w leczeniu których potrzebne jest działanie anabolizujące, w zawale mięśnia sercowego, udarze, w chorobie wieńcowej serca i w innych zaburzeniach sercowo-naczyniowych oraz w leczeniu krytycznie chorych pacjentów cukrzycowych i nie-cukrzycowych. [0083] Wynalazek jest w dalszej części zilustrowany poniższymi przykładami, które nie powinny być interpretowane jako zawężające. 1 2 PRZYKŁADY Przykład 1 Sporządzanie preparatów farmaceutycznych [0084] Preparaty farmaceutyczne według wynalazku można sporządzać w postaci roztworu wodnego. Wodne medium doprowadza się do izotoniczności, na przykład chlorkiem sodu lub glicerolem. Poza tym, to wodne medium może zawierać jony cynku, na przykład dodane w postaci octanu cynku albo chlorku cynku, bufory i środki konserwujące. Arginina może być dodana w postaci chlorowodorku (Arg HCl). Wartość ph tego preparatu doprowadza się do żądanej wartości. Może ona wynosić od około 3 do około 8,, od około 3 do około albo od około 6, do około 7,, zależnie od punktu izoelektrycznego, pi, konkretnej insuliny.

40 40 Tabela 1. Porównanie preparatów insuliny według wynalazku ph 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 7,4 Dostępny na rynku NovoRapid Kwas glutaminowy (mm) 0 0 Nikotynamid (mm) Arginina HCl (mm) Glicerol (% wag./obj. 1,6 1,3 0,77 0,24 1,13 Tris (mm) Fosforan (mm) NaCl (mm) m- krezol (mm) Fenol (mm) Zn (mm) 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,6 0,6 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 Insulina Aspart (mm) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 1,2 1,2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 A* B C D E F G H I J K L M N

41 41 Tabela 2. Skład dalszych preparatów insuliny według wynalazku Nr preparatu [Insulina aspart] mm [Zn 2+ ] mm [fenol] mm [Arg] mm [Gly] mm [Glu] mm [His] mm [Nikotynamid] mm 1 0,6 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0, ,6 0, Przykład 2 Analiza stabilności chemicznej insuliny Chromatografia wykluczania (SEC) 1 [008] Ilościowe oznaczenie białka o wysokiej masie cząsteczkowej (HMWP) i monomeru insuliny aspart przeprowadzono na kolumnie Waters do insuliny (0 x 7,8 mm, numer części katalogowej 149); stosowano eluent zawierający 2, M kwasu octowego, 4 mm L- argininy i % objętościowych acetonitrylu; eluowanie prowadzono z szybkością przepływu 1 ml/min w temperaturze 40 o C. Detekcję prowadzono z użyciem przestrajalnego detektora absorbancji (Waters 486) przy 276 nm. Objętość nastrzyku wynosiła 40 µl i 600 µm standardu insuliny ludzkiej. W każdym punkcie pobierania próbek oznaczano HMWP i stężenie preparatów.

42 42 Chromatografia w układzie faz odwróconych (ultra-szybka chromatografia cieczowa, UPLC) 1 2 [0086] Oznaczanie zanieczyszczeń pochodzących od insuliny aspart prowadzono w układzie UPLC, na kolumnie BEH RP C8 (2,1 x 0 mm, średnica ziarna 1,7 µm) firmy Waters, numer części w katalogu , prowadząc eluowanie z szybkością 0, ml/min w temperaturze 40 o C i detekcję przy 2 nm. Eluowanie prowadzono fazą ruchomą o następującym składzie; A. % (wag./obj.) acetonitrylu, 2,8% (wag.) siarczanu sodu, 0,3% (wag.) kwasu o-forforowego, ph 3,; B. 70% (wag./obj.) acetonitrylu. Eluowanie prowadzono w następującym gradiencie: w 0-11 minucie przepływ izokratyczny roztworu 73%/27% (A/B), w minucie przepływ ze zmianą liniową na 2%/48% (A/B), w 13-1 minucie przepływ ze zmianą liniową na 73%/27% (A/B), w 1- minucie przepływ izokratyczny eluentu 73%/27% (A/B). [0087] Ilości B28-izoasparaginianu, desamido-związku i innych pokrewnych zanieczyszczeń oznaczano jako pole absorbancji wyrażone jako procent całkowitego pola powierzchni absorbancji oznaczonego po wyeluowaniu środków konserwujących. Metoda RP-UPLC jest równoważna z metodą analityczną stosowaną do kontroli analitycznej preparatów farmaceutycznych insuliny aspart wprowadzanych do obrotu przez Novo Nordisk. [0088] Dodanie argininy zmniejsza ilość powstałych produktów degradacji, zwłaszcza HMWP i form des-amido, zwiększanie stężenia argininy w zakresie do 0 mm

43 43 prowadzi do dalszego zmniejszenia degradacji. Stabilność fizyczną oznaczano jako czas martwy (lag time) w analizie z tioflawiną T (ThT). Czas martwy zmniejsza się w wyniku dodania argininy i zmniejszenie to wzrasta wraz ze wzrostem stężenia argininy. Ogólna korzyść z dodania 0 mm argininy jest wyższa niż 0 mm glicyny, 0 mm kwasu glutaminowego albo 0 mm histydyny w odniesieniu do redukcji tworzenia się produktów rozkładu, co jest uwidocznione w poniższej tabeli 3. Tabela 3. Dane dotyczące stabilności fizycznej i chemicznej preparatów insuliny 1-9 z Tabeli 2 (Przykład 1) Nr preparatu Stabilność fizyczna, czas martwy (min) w Stabilność chemiczna Zawartość produktu rozkładu (%) oznaczana jako różnica pomiędzy zawartością po inkubacji przez 2 tygodnie w 37 o C i w 4 o C analizie ThT B28 izoasp formy desamido Inne pokrewne HMWP zanieczyszcze- nia ,17 3,67 1,73 1, , 3,0 0,82 0, , 2,49 0,64 0, ,31 2,26 0,79 0, 60 1,27 2,27 0,37 0, ,36 1,99 0,47 0, ,26 4,72 2,21 1, ,39 3,41 1,07 0, ,7 6,99 2,22 1,01 1 Przykład 3 Badania farmakokinetyczno (PK)/farmakodynamiczne (PD) na modelu świń LYD i próba analizy osocza

44 44 Badania PK/PD na świniach LYD 1 [0089] Badania PK/PD prowadzono na domowych samicach świń, krzyżówkach LYD o masie od do 1 kg. Świniom zakładano cewniki do żyły szyjnej przez żyłę uszną na co najmniej dwa dni przed rozpoczęciem badania. Ostatnie pożywienie przez rozpoczęciem badania podano zwierzętom około 18 godzin przed wstrzyknięciem testowanego preparatu. Zwierzęta miały wolny dostęp do wody przez cały czas okresu głodzenia i okresu badania. [0090] W godzinie 0 podano testowany preparat podskórnie w boczną stronę karku. Pobierano próbkę krwi przed dozowaniem i następnie w regularnych odstępach czasu po dozowaniu. Próbki pobierano z cewnika i podawano do 1, ml probówek szklanych wstępnie powleczonych heparyną. Próbki krwi utrzymywano w wodzie z lodem do czasu rozdzielenia osocza przez wirowanie przez minut z prędkością 00 rpm, w temperaturze 4 o C, co wykonano w ciągu pierwszych minut. Próbki osocza przechowywano w temperaturze 4 o C przez krótki 2 czas (2-3 godziny) albo w temperaturze -18 o C przy długim okresie przechowywania i analizowano na zawartość glukozy w analizatorze biochemicznym YSI albo Konelab i i na stężenie insuliny Aspart metodą LOCI. Luminescencyjna próba immunologiczna z kanałowaniem tlenu (LOCI) do ilościowego oznaczania insuliny Aspart [0091] Próba LOCI oznaczania insuliny Aspart jest sandwiczową próbą immunologiczną opartą na przeciwciele monoklonalnym, wykorzystującą sąsiedztwo dwóch perełek, powleczonych europem perełek akceptorowych i

45 4 1 powleczonych streptawidyną perełek donorowych. Perełki akceptorowe są powleczone przeciwciałem swoistym przeciw insulinie ludzkiej i rozpoznają insulinę Aspart w próbkach osocza. Drugie biotynylowane przeciwciało wiąże się swoiście z insuliną Aspart i razem z perełkami powleczonymi streptawidyną tworzy sandwicz. Oświetlenie kompleksu immunologicznego: perełkiagregat, uwalnia z perełek donora synglet tlenu, który kieruje się do perełek akceptorowych i inicjuje chemiluminescencję. Tę chemiluminescencję oznacza się a ilość generowanego światła jest proporcjonalna do stężenia insuliny Aspart. [0092] W porównaniu do handlowego produktu NovoRapid, początkowa szybkość obniżania poziomu glukozy w osoczu jest wyższa dla preparatów według wynalazku (Fig. 3 i 4). Podobnie, w porównaniu z NovoRapid, początkowa szybkość wchłaniania komponentu insuliny z preparatów według wynalazku jest znacząco większa (Fig. ). Przykład 4 2 Ogólne wprowadzenie do prób tworzenia włókien w analizie ThT do oceny stabilności fizycznej formulacji białkowych [0093] Niska stabilność fizyczna peptydu może prowadzić do tworzenia się włókien amyloidowych, co obserwuje się jako regularnie ułożone, podobne do nitek struktury makromolekularne w próbce, powodujące w końcu powstawanie żelu. Tradycyjnie oznaczano je przez kontrolę wzrokową próbki. Ten sposób oznaczania jest jednak bardzo subiektywny i zależny od osoby prowadzącej obserwację. Dlatego znacznie bardziej

46 Fluorescencja ThT 46 korzystne jest zastosowanie sondy wskaźnika o małej cząsteczce. Taką sondą jest tioflawina T (ThT). Ma ona wyróżniające cechy charakterystyczne fluorescencji po związaniu z włóknami [Naiki i wsp. (1989) Anal. Biochem. 177, ; LeVine (1999) Methods Enzymol. 9, ]. Przebieg czasu tworzenia się włókien można opisać jako krzywą esowatą wyrażoną wzorem [Nielsen i wsp. (01) Biochemistry 40, ]: Wzór (1) 1 [0094] We wzorze tym, F oznacza fluorescencję ThT w czasie t. Stała t 0 jest czasem potrzebnym do osiągnięcia 0% maksymalnej fluorescencji. Dwoma ważnymi parametrami opisującymi tworzenie się włókien są: czas martwy wyliczony jako t o -2τ i pozorna stała szybkości k app = 1/τ. Czas martwy = t 0-2τ t 0 Czas

47 47 [009] Uważa się, że ogólnym mechanizmem inicjującym powstawanie włókienek jest tworzenie się częściowo sfałdowanych produktów pośrednich peptydu. Niektóre z tych produktów pośrednich tworzą zarodki, tworząc matrycę, na której mogą się dobudowywać dalsze produkty pośrednie i w sten sposób postępuje proces tworzenia się włókien. Czas martwy (lag time) odpowiada przedziałowi czasu, w którym buduje się masa krytyczna zarodka a pozorna stała szybkości jest szybkością, z jaką tworzy się samo włókienko. Przygotowanie próbki 1 2 [0096] Sporządzano świeże próbki przed każdym oznaczeniem. Skład każdej kompozycji jest opisany w każdym przykładzie. Doprowadzano ph próbki do żądanej wartości stosując odpowiednie ilości stężonego NaOH i HClO 4 albo HCl. Do próbek dodawano tioflawinę T z roztworu podstawowego w H 2 O do końcowego stężenia 1 µm. [0097] Ilości próbek po 0 µl umieszczano w 96- dołkowej płytce do mikromiareczkowania (Packard Opti- Plate -96, z białego polistyrenu). Zwykle umieszczano cztery albo osiem replik tej samej próbki (odpowiadającej jednemu warunkowi testu) w jednej kolumnie wgłębień. Płytkę szczelnie zamykano pokrywką zaciskową Scotch Pad (Qiagen). Inkubacja i pomiar fluorescencji [0098] Inkubację w danej temperaturze, wytrząsanie i pomiar emisji fluorescencji ThT prowadzono w czytniku fluorescencyjnym do płytek Fluoroskan Ascent FL albo w czytniku do płytek Varioskan (Thermo Labsystems).

48 48 Temperaturę ustawiano na 37 o C. We wszystkich prezentowanych danych wstrząsanie orbitalne było ustawione na 960 rpm z amplitudą 1 mm. Pomiary fluorescencji prowadzono stosując wzbudzenie przez filtr 444 nm i pomiar emisji przez filtr 48 nm. [0099] Każdą serię rozpoczynano przez inkubację płytki w temperaturze danego pomiaru przez minut. Pomiar płytki wykonywano co minut przez żądany okres czasu. Pomiędzy każdym pomiarem, płytkę wytrząsano i ogrzewano w sposób opisany. Obróbka danych 1 2 [00] Dane z każdego punktu pomiarowego zachowywano w formacie Microsoft Excel do dalszego przetworzenia a wykreślenie i dopasowanie wykresów prowadzono przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Emisja tła pochodzącego z ThT przy braku włókienek była nieznaczna. Dane z punktów pomiaru są na ogół średnimi z czterech albo ośmiu próbek i są przedstawione ze słupkami odchyleń standardowych. Na tym samym wykresie są przedstawione tylko te dane, które otrzymano z tego samego doświadczenia (czyli z próbek na tej samej płytce), co zapewnia porównywalne oznaczenie powstawania włókien w poszczególnych doświadczeniach. [01] Zbiór danych może pasować do wzoru (1). Jednakże, ponieważ w czasie prowadzenia pomiarów nie zawsze uzyskiwano pełne krzywe esowate, to czasy martwe (lag times) oznaczano wizualnie na podstawie krzywej fluorescencji ThT, jako punkt czasowy, w którym fluorescencja ThT zaczyna się różnić od poziomu tła. Pomiar stężeń początkowych i końcowych

49 49 [02] Stężenie peptydu w każdej z testowanych formulacji oznaczano zarówno przed zastosowaniem w próbie ThT tworzenia włókien ( Początkowe ) i po zakończeniu tworzenia włókien w próbie ThT ( Po próbie ThT ). Stężenia oznaczano metodami HPLC w układzie faz odwróconych, stosując wzorzec pramlintydu jako związek odniesienia. Przed pomiarem i po jego zakończeniu, z każdej repliki próbki pobierano po 10 µl i przenoszono do próbowek Eppendorfa. Próbówki te wirowano z prędkością 000 G przez 40 minut. Supernatanty filtrowano przez filtr 0,22 µm po czym wprowadzano do układu HPLC.

50 0 Zastrzeżenia patentowe 1. Preparat insuliny zawierający: związek insulinowy związek nikotynowy argininę i bufor fosforanowy. 2. Preparat insuliny według zastrz. 1, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina albo analog insuliny Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina B28Asp. 4. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina B28LysB29Pro.. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym związkiem insulinowym jest ludzka insulina B3LysB29Glu. 6. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,2 mm do około 2,0 mm. 7. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym związek insulinowy występuje w ilości od około 0,3 mm do około 1,2 mm Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym związek nikotynowy jest wybrany z grupy obejmującej nikotynamid, kwas

51 1 nikotynowy, niacynę, amid niacyny i witaminę B3 i/lub ich sole i/lub ich połączenia. 9. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, zawierający od około 1 mm do około 10 mm związku nikotynowego.. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, zawierający od około 1 mm do około 8 mm argininy Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, zawierający ponadto kwas glutaminowy. 12. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, który to preparat ponadto zawiera jon metalu, środek konserwujący (środki konserwujące), środek nadający izotoniczność (środki nadające izotoniczność), stabilizator (stabilizatory) oraz środek powierzchniowo czynny (środki powierzchniowo czynne). 13. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, w którym to preparacie bufor fosforanowy jest wybrany spośród dwuwodorofosforanu sodu, wodorofosforanu sodu albo fosforanu sodu. 14. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, do stosowania w obniżaniu poziomu glukozy we krwi u ssaków przez podawanie pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia aktywnej leczniczo dawki tego preparatu insuliny.

52 2 1. Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, do stosowania w leczeniu cukrzycy u osoby, polegającym na podawaniu pacjentowi tego preparatu insuliny Preparat insuliny według któregokolwiek z poprzednich zastrzeżeń, do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu któremukolwiek: hiperglikemii, cukrzycy typu 2, zaburzonej tolerancji glukozy, cukrzycy typu 1, chorobom albo urazom, w leczeniu których potrzebne jest działanie anabolizujące, zaburzeniom sercowonaczyniowym i w leczeniu krytycznie chorych pacjentów. 17. Preparat insuliny do stosowania według zastrzeżenia 16, który to preparat insuliny jest przeznaczony do stosowania w leczeniu lub zapobieganiu któremukolwiek: hiperglikemii wywołanej stresem, oparzeniom, ranom operacyjnym, zawałowi mięśnia sercowego, udarowi, chorobie wieńcowej serca i w leczeniu krytycznie chorych pacjentów cukrzycowych i nie-cukrzycowych. Novo Nordisk A/S Pełnomocnik: 2

53 Zawartość (%) po 2 tyg. w 37 o C w stos. do wartości początkowej 3 B28 IzoAsp formy des-amido inne pokrewne zanieczyszczenia HMWP Fig. 1/