Tlen: toksyczny pierwiastek życia

Transkrypt

1 Tlen: toksyczny pierwiastek życia Wykład 1 Biochemia stresu oksydacyjnego Literatura: Grzegorz Bartosz Druga twarz tlenu Barry Halliwell & John Gutteridge Free radicals in biology and medicine

2 Trochę o tlenie Spośród kilkunastu izotopów tlenu trzy są stabilne: 16 O (>99%) 17 O (0.04%) 18 O (0.2%) Konfiguracja elektronowa atomu tlenu elektrony sparowane są to dwa elektrony o przeciwnej orientacji spinów należące do tego samego poziomu orbitalnego elektron niesparowany jest to elektron znajdujący się na poziomie orbitalnym, na którym nie ma innego elektronu reguła Hunda: jak najwięcej elektronów niesparowanych w danej podpowłoce reguła Pauliego: dwa elektrony w jednym poziomie orbitalnym muszą mieć przeciwną orientację spinu

3 Paradoks tlenowy Z wyjątkiem organizmów anaerobowych i aerotolerancyjnych, wszystkie zwierzęta, rośliny i bakterie potrzebują O 2 do produkcji energii. Z drugiej strony, tlen ze względu na swoją konfigurację elektronową, jest potencjalnie toksyczny. wytworzyć mechanizmy antyoksydacyjne = przetrwać w nieprzyjaznym środowisku tlenu pomimo istnienia mechanizmów antyoksydacyjnych i naprawczych, uszkodzenia oksydacyjne pozostają nieuniknioną konsekwencją życia w warunkach tlenowych

4 Dawno, dawno temu.. - Wczesna atmosfera była bogata w metan i wodór, czyli miała nadmiar czynników redukujących. - Pierwsze organizmy były heterotrofami zależnymi od abiotycznych źródeł związków organicznych lub chemotrofami uzyskującymi energię z wodoru, siarkowodoru i metanu, wykorzystującymi jako akceptory elektronów dwutlenek węgla lub siarczany.

5 Dawno, dawno temu.. - Beztlenowe bakterie fotosyntetyzujące (bakterie purpurowych i zielone bakterie siarkowe) wykorzystywały związki siarki (siarkowodór, siarkę, tiosiarczan), wodór lub kwasy organiczne do pozyskiwania energii. Prawdopodobnie były pierwszymi organizmami fotosyntezującymi. - Około miliarda lat temu pojawiły się sinice, które mogły wykorzystywać energię słoneczną do utleniania wody. Uwolniony wodór potrzebny był do przeprowadzenia metabolicznych reakcji redukcji. Reakcja utleniania wody prowadziła do powstania jednej cząsteczki tlenu z dwóch cząsteczek wody w procesie czteroelektronowego utlenienia.

6 Dawno, dawno temu.. Miliony lat temu 3500 Promieniowanie słoneczne bombarduje powierzchnię Ziemi Początki życia anaerobowego >2500 Cyjanobakterie uwalniają O 2 : 2H 2 O O 2 + 4H + + 4e Poziom tlenu atmosferycznego osiąga 1% Początek ewolucji eukarinotów 500 Poziom tlenu atmosferycznego osiąga 10% Warstwa ozonowa pochłania wystarczająco dużo UV, aby umożliwić wyjście organizmów na ląd 65 Pojawienie się naczelnych 5 Poziom tlenu atmosferycznego osiąga 21% Pojawienie się człowieka Zysk przejścia do życia tlenowego: efektywna produkcja energii

7 Właściwości chemiczne tlenu Dawno, dawno temu.. - Tlen stanowi ok. 1/4 masy Ziemi (53.8% atomów skorupy Ziemi to atomy tlenu) i ok. 3/4 masy ciała ssaków. - W dolnych warstwach atmosfery tlen stanowi 21% objętości (w 1 L powietrza jest 210 ml tlenu). - Jest 5-8 razy lepiej rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych niż w wodzie (uszkodzenia oksydacyjne w obrębie hydrofobowego środowiska membran biologicznych) - Po raz pierwszy został otrzymany w stanie czystym w 1774 roku przez Josepha Priestleya z tlenku rtęci. W atmosferze tlenu: * świeca płonęła bardziej jaskrawo, * mysz zamknięta pod szczelnym kloszem żyła dłużej, * Josephowi Priesley'owi oddychało się przyjemniej. Joseph Priestley

8 Dawno, dawno temu.. Element patriotyczny prof. Karol Olszewski Uzyskanie ciekłego tlenu: 29 marca 1883, Uniwersytet Jagielloński prof. Zygmunt Wróblewski

9 Pojemność oddechowa: Tlen: pierwiastek życia - W spokojnym oddechu człowiek wdycha ok. 500 ml powietrza. - Maksymalny wdech to ok. 3.5 L powietrza, pojemność życiowa to ok. 4.8 L. - W spoczynku człowiek przepuszcza przez płuca ok. 6-8 L powietrza na minutę (wentylacja minutowa). Podczas intensywnego wysiłku - do 120 L powietrza % wdech wydech 10 0,03 4 0, azot tlen dwutlenek węgla pozostałe gazy W.Z. Traczyk (red): Fizjologia człowieka z elementami fizjologii stosowanej i klinicznej

10 Tlen: pierwiastek życia

11 Tlen: pierwiastek życia Zawartość tlenu w tkankach i płynach ustrojowych: - Ciśnienie parcjalne tlenu w krwi żylnej to 40 mm Hg (53.3 hpa, 53 µmol/l, 15.3%). - Wewnątrz komórek istnieje gradient tlenu: najwyższe stężenie jest pod plazmalemmą, najniższe w mitochondriach. - Tlen jest ok. 5-8 razy lepiej rozpuszczalny w rozpuszczalnikach organicznych (także w lipidach błon komórkowych) niż w wodzie. Zawartość tlenu w narządach: - Krew tętnicza: 20% - Krew żylna: 15.3% - Wątroba, serce, nerki: 4-14% - Mózg: 0.5-7% - Oko (siatkówka, ciało szkliste): 1-5% - Szpik kostny: 0-4% Ivanovic Z. J Cell Physiol 2009.

12 Tlen: pierwiastek życia Tlenowce - Organizmy wymagające do przeżycia tlenu: * np. my Beztlenowce względne - Organizmy mogące żyć w atmosferze tlenowej i beztlenowej, w tym mikroaerofile lepiej rosnące przy zmniejszonej zawartości tlenu: * Campylobacter jejuni (wywołuje biegunki) * Treponema pallidum (krętek blady - wywołuje kiłę) Beztlenowce bezwzględne - Organizmy mogące żyć wyłącznie w atmosferze beztlenowej * Clostridium tetani (pałeczka tężca)

13 Terapia hiperbaryczna Zgorzel gazowa - Zgorzel gazowa jest gwałtownie postępującym zakażeniem wywoływanym przez toksyny Clostridium perfringens, Clostridium septicum, Clostridium histolyticum lub Clostridium novyi. Clostridium perfringens - Do najczęstszych czynników predysponujących należą ciężkie urazy penetrujące lub zmiażdżenie tkanek z towarzyszącym upośledzeniem ukrwienia. - Zgorzel gazowa może spowodować martwicę skóry, tkanki podskórnej i mięśni. Występowanie fioletowych pęcherzy skórnych, oddzielanie się fragmentów martwiczej skóry, znaczny obrzęk i objawy toksemii ogólnoustrojowej stanowią wskazanie do natychmiastowej interwencji chirurgicznej. Jednocześnie stosuje się leki przeciwbakteryjne. rozwijająca się zgorzel gazowa komora hiperbaryczna

14 Trudnogojące się rany Terapia hiperbaryczna - Przykład leczenia - pacjenci: * 94 pacjentów w wieku 33 do 76 lat (średnio 42 lata) z cukrzycą od 1.5 do 32 lat powikłaną zespołem stopy cukrzycowej, poddanych hiperbarycznej terapii tlenowej (HBO). * U 9.6% pacjentów rozpoznano przed terapią HBO znacznego stopnia zaburzenia przepływu krwi w tętnicach nóg z powodu miażdżycy, z czego u 5 wykonano przed terapią zabiegi naczyniowe (pomostowanie, stenty). - Przykład leczenia - procedura: * wyrównanie cukrzycy i towarzyszących zaburzeń metabolicznych, * chirurgiczne opracowanie rany * hiperbaria tlenowa (od 2 do 60 ekspozycji) * terapia przeciwbakteryjna. - Przykład leczenia - wyniki: * u 27.7% pacjentów rany zagoiły się całkowicie, * u 39.4% doszło do znacznej poprawy stanu miejscowego. * w trakcie leczenia u 11.6% pacjentów wykonano amputacje * u wszystkich pacjentów poddanych leczeniu w komorze hiperbarycznej doszło do redukcji objawów infekcji w ranie. Polskie Towarzystwo Chirurgii Naczyniowej

15 Zatrucie tlenkiem węgla Terapia hiperbaryczna - W każdym przypadku zatrucia tlenkiem węgla pacjentowi powinien być podany czysty tlen, tak szybko, jak to tylko możliwe. - Główną zaletą terapii hiperbarycznej w leczeniu zatrucia tlenkiem węgla jest zapobieganie długotrwałym efektom działania tlenku węgla takich jak: problemy z pamięcią, utrzymaniem równowagi i koordynacją ruchów. Terapia może również pomóc powrócić do zdrowia szybciej, niż w normalnych warunkach atmosferycznych. W ciężkich przypadkach zatruć terapia ta ratuje pacjentom życie. - W stanach zatrucia tlenkiem węgla tlen hiperbaryczny wspomaga usuwanie CO z komórek i krwi drogą oddechową i redukuje uszkodzenia spowodowane przez tlenek węgla. Zwiększone ciśnienie redukuje obrzęk w obszarze uszkodzonych tkanek. Weaver at al. NEJM 2002

16 Tlen: pierwiastek życia "Bary tlenowe" - Lista korzyści, które właściciele barów tlenowych obiecują w swoich ulotkach reklamowych, jest imponująca. Dzięki kuracji tlenowej zapewniają wzmocnisz swój system immunologiczny, dotlenisz serce, zwiększysz sprawność fizyczną i psychiczną, odtrujesz organizm, zredukujesz skutki stresu, opóźnisz starzenie. Kuracja taka działa też wspomagająco w stwardnieniu rozsianym, odchudzaniu, chorobach niedokrwienia mózgu i siatkówki oka, obniża natężenie migren, jest niezastąpioną formą kosmetyki, chroni przed zespołem przewlekłego zmęczenia, łagodzi dolegliwości związane z menopauzą i andropauzą oraz zmienia punkt pracy komputera w mózgu (Polityka 48; 2002). * pomarańczowy- usuwa zmęczenie i pomaga na depresję * jabłkowy- jest cudownym lekiem na kaca oraz migrenę * cytrynowy walczy z przeziębieniem * marchewkowy poprawia nam koncentrację

17 Tlen: pierwiastek (krótkiego) życia Właściwości chemiczne tlenu - Czysty tlen (0.3 atm) zmniejsza długość życia Drosophila malanogaster. Przy ciśnieniu 1 atm jest dla niej letalny. - U ssaków oddychanie czystym tlenem przez kilkadziesiąt godzin powoduje: * uszkodzenie i obrzęk pęcherzyków płucnych * obumieranie nabłonka płucnego * nasilone wytwarzanie kolagenu i włóknienie płuc * pęcznienie mitochondriów i uszkodzenie miofibryli mięśnia sercowego * pęcznienie mitochondriów w hepatocytach * uszkodzenie kłębuszków nerkowych - Rośliny naczyniowe rosnące w podwyższonym stężeniu tlenu wykazują: * zahamowanie rozwoju chloroplastów * zmniejszenie żywotności nasion i wzrostu korzeni * nasilone opadanie liści * zwiększona częstość anomalii wzrostu

18 Tlen: pierwiastek (krótkiego) życia 20h, 100% O 2, 1 atm 40h, 100% O 2, 1 atm Barber, R. E., Lee, J. & Hamilton, W. K Oxygen Toxicity in Man. NEJM

19 Tlen: pierwiastek (krótkiego) życia Skutki hyperoksji u myszy uszkodzenie płuc przepuszczalność naczyń obrzęk zawartość kolagenu naciek neutrofili Sue et al. J Immunol 2004

20 Choroby wywoływane podwyższonym stężeniem tlenu Retinopatia wcześniaków (zwłóknienie pozasoczewkowe, choroba Terry'ego) - Jest obustronną zmianą, która występuje u wcześniaków trzymanych w inkubatorach z wysokim ciśnieniem tlenu. Prowadzi to do: * skurczu naczyń siatkówki, * zniszczenia komórek śródbłonka naczyń siatkówki * następowego obrzęku tkanek * zaniku funkcjonalnych naczyń - Hyperoksja hamuje syntezę śródbłonkowego czynnika wzrostu (VEGF vascular endothelial growth factor) w niedojrzałych naczyniach siatkówki. Obniżenie poziomu VEGF wywołuje apoptozę śródbłonka. - Gdy noworodek zaczyna oddychać normalnym powietrzem, następuje: * wzrost produkcji VEGF * proliferacja naczyń w siatkówce * bliznowacenie i odklejenia siatkówki

21 Choroby wywoływane podwyższonym stężeniem tlenu Retinopatia wcześniaków - Aktywna faza choroby zaczyna się zwykle między 10 a 28 dniem życia po okresie skurczu naczynia siatkówki ulegają poszerzeniu i skręceniu. - Po zaprzestaniu tlenoterapii w ogniskach uszkodzenia siatkówki przez niedotlenienie dochodzi do neowaskularyzacji (obserwuje się krwinkotoki i włóknienie). - W miarę postępu choroby - siatkówka z nowo utworzonymi naczyniami i tkanką włóknistą oddzielają się i przesuwają do przodu (do przestrzeni poza soczewką zwłóknienie pozasoczewkowe) Możliwości terapeutyczne: * retinopatia może ustąpić samoistnie * aby zapobiec odklejeniu siatkówki może być niezbędna krioterapia lub laseroterapia * może wystąpić krótkowzroczność lub ślepota (przy odklejeniu siatkówki)

22 Choroby wywoływane podwyższonym stężeniem tlenu Retinopatia wcześniaków Naczynia z widocznymi ogniskami proliferacji (strzałki) i akumulacją tkanki mezenchymalnej (gwiazdka). Odwarstwienie siatkówki

23 Co jest przyczyną toksycznego efektu tlenu? Pierwsze sugestie wyjaśniające toksyczność O 2 dotyczyły bezpośrednioego hamowania enzymów komórkowych przez tlen cząsteczkowy, np. nitrogenazę (kompleks enzymatyczny katalizujący reakcje wiązania azotu) u Clostridium pasteurianum. Jednak u tlenowców większość enzymów pozostaje niewrażliwa na O 2. W 1954 roku Gershman i Gilbert zaproponowali, że większość toksycznych efektów O 2 jest związanych z utworzeniem rodników tlenowych, np. anionorodnik ponadtlenowy hamuje enzymy cyklu Krebsa: akonitazę i fumarazę.

24 Co to jest wolny rodnik? Wolny rodnik to atom lub cząsteczka zdolna do samodzielnego istnienia, mająca jeden lub więcej niesparowanych elektronów na orbicie walencyjnej. Obecność niesparowanego elektronu powoduje, że wolne rodniki są przyciągane (choć słabo) przez pole elektromagnetyczne - wykazują właściwości paramagnetyczne. Cząsteczka tlenu ma dwa niesparowane elektrony jest birodnikiem. Wolne rodniki charakteryzuje zwykle wysoka reaktywność: dążąc do sparowania elektronów, zazwyczaj szybko wchodzą w reakcje.

25 Jak powstaje wolny rodnik? 1. Utrata pojedynczego elektronu przez nie-rodnik X e - + X + 2. Zyskanie pojedynczego elektronu przez nie-rodnik Y + e - Y - 3. Rozszczep homolityczny wiązania kowalencyjnego A : B A + B (każdy atom dostaje jeden elektron z wiązania kowalencyjnego)

26 Rozszczep homolityczny i heterolityczny wody ROZSZCZEP HETEROLITYCZNY H : O : H jonizacja wody oba elektrony dla atomu tlenu (O) H + + OH - Jon wodorowy 1 proton 0 elektronów (ładunek dodatni) Jon hydroksylowy 9 protonów 10 elektronów (ładunek ujemny) radioliza wody jeden elektron dla tlenu jeden dla wodoru ROZSZCZEP HOMOLITYCZNY H rodnik wodorowy 1 proton 1 elektron (ładunek zerowy) + OH rodnik hydroksylowy 9 protonów 9 elektronów (ładunek zerowy)

27 Definicja stresu oksydacyjnego Stres oksydacyjny - Stres oksydacyjny to zaburzenie homeostazy prowadzące do wzrostu stężeń reaktywnych form tlenu. Prowadzi to do zaburzenia równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej w kierunku reakcji utlenienia.

28 Stres oksydacyjny

29 ROS i RNS Reaktywne formy tlenu: - anionorodnik ponadtlenkowy (O 2.- ) - nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) - rodnik hydroksylowy (. OH) - tlen singletowy ( 1 O 2 ) - rodnik peroksylowy (LOO. ) - rodnik alkoksylowy (LO. ) - wodoronadtlenek lipidowy (LOOH) - nadtlenoazotyn (ONOO - ) - kwas podchlorawy (HOCl) - ozon (O 3 ) Reaktywne formy azotu: - tlenek azotu (. NO) - nadtlenoazotyn (ONOO - ) - dwutlenek azotu (. NO 2 ) Endogenne źródła ROS i RNS: - oksydazy NADPH - mitochondria (łańcuch transportu elektronów i oksydazy) - oksydoreduktaza ksantynowa - cytochromy P450 - syntazy tlenku azotu - peroksysomy

30 Tlen i jego pochodne σ*2p π*2p π2p σ2p σ*2s σ2s σ*1s σ1s O 2-2 delta sigma tlen trypletowy anionorodnik ponadtlenkowy jon nadtlenkowy rodnik hydroksylowy tlen singletowy tlen singletowy

31 Reaktywność tlenu

32 Tlen trypletowy i tlen singletowy Stan singletowy, czyli stan bez niesparowanych elektronów, nie jest w przypadku tlenu O 2 stanem podstawowym, lecz wzbudzonym, o wyższej energii, natomiast stanem podstawowym jest stan trypletowy. Jest to układ odwrotny niż dla większości cząsteczek chemicznych. Dlaczego tlen trypletowy jest mało reaktywny? Aby tlen trypletowy utlenił inną cząsteczkę i uległ dwuelektronowej redukcji, musi przyjąć od niej dwa elektrony. Zgodnie z prawami mechaniki kwantowej, oba te elektrony muszą mieć równoległe spiny, antyrównoległe w stosunku do spinów niesparowanych elektronów w cząsteczce tlenu => utleniana cząsteczka też musi być w stanie trypletowym (o co nie jest łatwo) lub musi nastąpić odwrócenie spinu jednego z elektronów takiej cząsteczki (co wymaga energii). Dlatego tlen trypletowy jest mało reaktywny.

33 Tlen trypletowy i tlen singletowy tlen singletowy Σ 157 kj/mol tlen singletowy 94 kj/mol tlen trypletowy Tlen singletowy powstaje w wyniku wzbudzenia cząsteczki tlenu trypletowego. Dostarczona energia musi wystarczyć na przegrupowania elektronów w cząsteczce (wypadkowy spin = 0). Wzbudzenie cząsteczki do stanu singletowego może nastąpić po zaabsorbowaniu kwantu promieniowania nadfioletowego (lub promieniowania o wyższej energii) lub w wyniku niektórych reakcji chemicznych. TLEN SINGLETOWY MOŻE ŁATWO REAGOWAĆ Z INNYMI CZĄSTECZKAMI SINGLETOWYMI

34 Redukcja tlenu - Całkowita redukcja tlenu to przyłączenie do cząsteczki tlenu 4 elektronów i 4 protonów, w wyniku czego powstają 2 cząsteczki wody: O 2 + 4e - + 4H + 2H 2 O Reakcja jest egzoergiczna, a powstająca woda jest nieaktywna względem składników komórki. - Powyższa reakcja nie zachodzi jednak łatwo (kłopot ze znalezieniem partnerów do reakcji dwuelektronowych). Dlatego tlen trypletowy reaguje ze związkami jednoelektronowo, a produktem jest anionorodnik ponadtlenkowy. O 2 + e - O 2 -

35 Redukcja tlenu - Tlen tripletowy może reagować z wieloma związkami jednoelektronowo. Powstaje wówczas:. * anionorodnik ponadtlenkowy 0 2, wolny rodnik będący anionem. O 2 + e - O 2 superoxide radical anion - Anionorodnik ponadtlenkowy w roztworze wodnym może też przyłączyć proton, tworząc obojętny: * rodnik ponadtlenkowy (rodnik wodoronadtlenkowy) O 2. + H + HO 2. hydroperoxyl radical - Przyłączenie kolejnego elektronu do anionorodnika ponadtlenkowego daje (po dołączeniu do produktu reakcji protonów): * nadtlenek wodoru H 2 O 2, mniej reaktywny od większości rodników, ale bardziej reaktywny niż tlen cząsteczkowy. Jest produktem dwuelektronowej redukcji tlenu.. O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + e- + 2H + hydrogen peroxide - Przyłączenie trzech elektronów do cząsteczki tlenu daje: * rodnik hydroksylowy, jedną z najbardziej reaktywnych cząstek w układach biologicznych. H 2 O 2 + e - + H + H 2 O + OH hydroxyl radical

36 Redukcja tlenu 2e - 2H + Reaktywne formy tlenu są produktami kolejnych stopni redukcji cząsteczki tlenu. Produkty redukcji i wzbudzenia tlenu są bardziej reaktywne niż tlen trypletowy. Reaktywne formy tlenu lepsza nazwa, niż wolne rodniki tlenowe, gdyż tlen sigletowy (bardzo reaktywny) i nadtlenek wodoru (reaktywny) nie są rodnikami. Reaktywne formy tlenu reagują ze składnikami organizmów żywych.

37 Reakcje wolnorodnikowe - Są z reguły szybkie, ale mało specyficzne (zwykle im szybsze tym mniej specyficzne) - Reakcje wolnorodnikowe obejmują: * Reakcje inicjacji * Reakcje propagacji * Reakcje terminacji Reakcje inicjacji Reakcje, w których z cząsteczek nie będących wolnymi rodnikami powstają wolne rodniki. Zachodzą w wyniku: * Homolizy * Radiolizy * Fotolizy * Sonolizy * Jednoelektronowych reakcji redoks

38 Reakcje wolnorodnikowe Homoliza - Rozpad cząsteczek zawierających słabe wiązania, w którego wyniku z dwu elektronów zaangażowanych w utworzenie wiązania powstające fragmenty otrzymują po jednym... A B A + B - W temperaturze fizjologicznej tylko związki o bardzo słabych wiązaniach mogą ulegać homolizie. - Homoliza inicjatorów nie ma znaczenia jako fizjologiczne źródło wolnych rodników. - Rozpad homolityczny może być wykorzystywany do uzyskiwania wolnych rodników w pracach doświadczalnych. Np. * AAPH (2,2'-azo-bis(2-amidynopropan) * AMNV (2,2'-azo-bis(2,4-dimetylowaleronitryl). Ich rozpad daje rodniki alkilowe R, które w reakcji z tlenem tworzą rodniki. nadtlenkowe ROO

39 Radioliza Reakcje wolnorodnikowe - Rozpad cząsteczek po wpływem promieniowania jonizującego. Fotoliza - Rozpad cząsteczek związku chemicznego wywołany absorbcją fotonu. Sonoliza - Rozpad cząsteczek związku chemicznego pod wpływem ultradźwięków. Jednoelektronowe reakcje redoks - Zredukowane formy wielu związków niskocząsteczkowych (RH 2 ) reagują z tlenem ulegając jednoelektronowemu utlenieniu, co prowadzi do powstania anionorodnika ponadtlenkowego i wolnego rodnika: RH 2 + O 2 RH + H + + O Reakcje tego typu są główną drogą powstawania rodnika ponadtlenkowego w komórkach.

40 Jednoelektronowe reakcje redoks Reakcje wolnorodnikowe - Szczególnie ważne w komórkach są tego typu reakcje z udziałem: * zredukowanej ryboflawiny * zredukowanych nukleotydów flawinowych (FMNH 2 i FADH 2 ) * katecholamin (DOPA, adrenalina, noradrenalina) * tetrahydrobiopteryny * cysteiny * glutationu * glukozy Jednoelektronowe utlenianie ksenobiotyków - Wytwarzanie reaktywnych form tlenu wewnątrz komórek jest efektem działania: * herbicydów (np. parakwat, dikwat) * fungicydów (np. mykotoksyna, sprydesmina) * insektycydów (np. rotenon) * leków przeciwnowotworowych (np. bleomycyna) * składników pożywienia (np. kwas kofeinowy, kwas chlorogenowy) Derys trujący (Paraderris ecliptica)

41 Rotenon - Powszechnie dostępne wskazówki jak unikać niedobrej chemii i wykorzystywać rozwiązania ekologiczne: To i owo czyli bardzo ziołowo W ochronie ziół przed chorobami i szkodnikami najczęściej używa się metod ekologicznych, unika się stosowania środków chemicznych... Możemy zastosować organiczne środki owadobójcze np. Rotenon używając je przeciw: - przędziorkom, - gąsienicom motyli i ciem, - larwom pilarzy i mszycom, - pchełkom ziemnym.. - rybom, - neuronom dopaminergicznym Derys trujący (Paraderris ecliptica)

42 Anionorodnik ponadtlenkowy - Powstaje w wyniku jednoelektronowej redukcji tlenu.. O 2 + e - O 2 - Jego aktywność jako czynnika utleniającego jest niewielka, częściej działa jako czynnik redukujący. - Może utleniać: * centra siarkowo-żelazowe enzymów (np. akonitazy) ich utlenienie prowadzi do utlenienia żelaza i inaktywacji enzymów; * NO powstaje nadlenoazotyn - W roztworach wodnych znajduje się w równowadze ze swą uprotonowaną formą, rodnikiem wodoronadtlenkowym.. O 2 + H + HO 2 - W ph=7.4 ok. 0.2% anionorodników ponadtlenkowych jest w formie uprotonowanej, łatwiej przenikającej przez błony niż obdarzony ładunkiem anionorodnik ponadtlenkowy.

43 Anionorodnik ponadtlenkowy - Stężenie bazalne anionorodnika ponadtlenkowego w typowej komórce to ok mol/l, w chloroplastach ok mol/l. - W obecności żelaza reaguje z nadtlenkiem wodoru dając rodnik hydroksylowy (reakcja Habera-Weissa) Lub: (reakcja Fentona) - Anionorodnik ponadtlenkowy reaguje z większą liczba substancji i zwykle znacznie szybciej niż tlen. Może też reagować sam ze sobą. - Ulega spontanicznej dysmutacji do nadtlenku wodoru i tlenu; reakcja ta jest katalizowana przez dysmutazy ponadtlenkowe (SOD)

44 Nadtlenek wodoru - Powstaje w wyniku spontanicznej lub katalizowanej przez SOD transmutacji anionorodnika ponadtlenkowego. - Nie jest silny utleniaczem, ale może bezpośrednio utleniać: * grupy siarkowo-wodorowe (SH) enzymów, prowadząc do zahamowania aktywności np. fosfataz. - W stanie czystym jest niebieskawym, lepkim płynem, wrzącym w temperaturze +150C, absorbującym światło w zakresie UV. - Jest stosunkowo stabilny, ale w obecności metali przejściowych może ulegać dysproporcjonowaniu: H 2 O 2 + H 2 O 2 H 2 O + O 2

45 Nadtlenek wodoru - Jest źródłem rodnika hydroksylowego powstającego w obecności żelaza w reakcji Fentona lub w obecności miedzi Cu + : Fe 2+ + H 2 O 2 'OH + OH - + Fe 3+ Cu + + H 2 O 2 'OH + OH - + Cu 2+ - Reaguje z jonem chlorkowym Cl - tworząc kwas podchlorawy w reakcji katalizowanej przez mieloperoksydazę (zwłaszcza w fagocytach): - Jest rozkładany do wody przez: * katalazy * peroksydazy glutationowe * peroksyredoksyny

46 Nadtlenek wodoru - Stężenie H 2 O 2 w typowej komórce to ok mol/l. - Skrajnie wysokie stężenia obserwuje się w zdrowych soczewkach oka ludzi - ok µmol/l. - - Wysokie stężenia są również w moczu (ok. 100 µmol/l - efekt antyseptyczny), zwłaszcza po wypiciu kawy i herbaty - czarnej lub zielonej (i kawa i herbata zawierają dużo H 2 O 2 - ok. 100 µmol/l). - Sporo H 2 O 2 jest też w miodzie (efekt antyseptyczny).

47 - Powstaje w wyniku: Rodnik hydroksylowy * jednoelektronowej redukcji nadtlenku wodoru (najważniejsze źródło rodnika hydroksylowego w komórkach) H 2 O 2 + e - + H +. H 2 O + OH * homolizy wody pod wpływem promieniowania promieniowania jonizującego * homolizy nadtlenku wodoru pod wpływem światła UV * reakcji kwasu podchlorawego z anionorodnikiem ponadtlenkowym (reakcja istotna zwłaszcza w fagocytach)

48 Rodnik hydroksylowy - Jest jednym z najbardziej reaktywnych utleniaczy i może reagować praktycznie ze wszystkimi substancjami w komórce. - Reakcje są bardzo szybkie i mało specyficzne - OH utleni prawdopodobnie pierwszą cząsteczkę organiczną (lub jon metalu), którą napotka.

49 Rodnik hydroksylowy - Powstaje w wyniku: * rozkładu kwasu nadtlenoazotawego (powstającego w wyniku protonowania nadtlenoazotynu) * reakcji wzbudzonego dwutlenku azotu z wodą: - Ze względu na reaktywność jest bardzo nietrwały. - Stężenia rodnika hydroksylowego w komórkach są tak małe, że nie można go wykryć metodami bezpośrednimi

50 Tlen singletowy - Tlen singletowy jest wzbudzoną formą tlenu cząsteczkowego, nie jest wolnym rodnikiem. - Powstaje w wyniku: * reakcji fotouczulania, w której endogenny fotouczulacz (PS) (np. porfiryna) jest wzbudzany (PS*) pod wpływem światła. Energia wzbudzenia przekazywana jest następnie na tlen, przekształcając go w tlen singletowy. Fotouczulacz powraca natomiast do stanu podstawowego. * wybuchu tlenowego w fagocytach, kiedy w trakcie reakcji zapalnej powstaje kwas podchlorawy, reagujący z nadtlenkiem wodoru. * peroksydacji lipidów reakcji dwóch rodników peroksylowych (z jednoczesnym tworzeniem alkoholu (LOH) i ketonu (LO):

51 Tlen singletowy - Tlen singletowy oddziałuje z innymi cząsteczkami poprzez: * przekazanie energii wzbudzenia (przechodzi przy tym w stan tripletowy; jest to tzw. gaszenie tlenu singletowego) * wejście w rekcję chemiczną - Tlen singletowy jest silnym utleniaczem. Reaguje z: * lipidami (prowadząc do peroksydacji) * białkami (prowadząc do utleniania łańcuchów bocznych, inaktywacji, złego fałdowania, nasilonej degradacji w proteasomach) * kwasami nukleinowymi (prowadząc do modyfikacji zasad i pęknięć nici) - Najbardziej podatne na uszkodzenie przez tlen singletowy są: * reszty histydyny * reszty metioniny * reszty tryptofanu * reszty tyrozyny * reszty cysteiny * guanina - Tlen singletowy reaguje z antyoksydantami. Inaktywowany jest również przez karotenoidy (z marchewek) i lykopen (z pomidorów).

52 Terapia fotodynamiczna Opryszczka - Wiele maści przeciwko opryszczce zawiera barwnik uczulający (czerwień obojętną, proflawinę). Wnikają one do komórek i wiążą się z DNA. Po naświetleniu uszkadzają DNA. Łuszczyca - Jednymi z leków stosowanych w łuszczycy są psoraleny. Psoraleny są wzbudzane światłem UV ( nm), co jest podstawa terapii PUVA (psoralen + ultrafiolet A).

53 Tlenek azotu - Tlenek azotu jest wolnym rodnikiem (ma niesparowany elektron). - Odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu układu krążenia, układu nerwowego i i układu odpornościowego: * jest wazodylatorem * jest neurotransmiterem * jest czynnikiem toksycznym dla patogenów - Produkowany jest: * przez syntazy tlenku azotu (NOS) * z azotanów i azotynów - Tlenek azotu reaguje z białkami, zwłaszcza zawierającymi: * centra żelazowo-siarkowe * jony metali przejściowych * grupy hemowe - Tlenek azotu może uwalniać żelazo z ferrytyny

54 Tlenek azotu

55 Tlenek azotu - Tlenek azotu jest nietrwały w obecności tlenu. W natlenionych roztworach wodnych jego okres półtrwania wynosi kilka sekund, a tlenek azotu reaguje z tlenem dając dwutlenek azotu: 2NO + O 2 2NO 2 - Dwutlenek azotu reaguje ze związkami nienasyconymi tworząc wolne rodniki, w których niesparowany elektron jest zlokalizowany na atomie węgla. - W roztworach wodnych o ph obojętnym dwutlenek azotu ulega dysproporcjonowaniu, tworząc anion azotynowy i azotanowy: NO + H 2 O NO 2- + NO H + - Tlenek azotu bardzo szybko reaguje z anionorodnikiem ponadtlenkowym tworząc nadtlenoazotyn: NO + O 2- ONOO -

56 Nadtlenoazotyn - Nadtlenoazotyn jest silnym utleniaczem, reagującym przede wszystkim z: * grupami SH i centrami żelazowo-siarkowymi białek * resztami nienasyconych kwasów tłuszczowych lipidów * anionem HCO 3-, tworząc rodnik wodorowęglanowy H + + ONOO - + HCO 3 - HCO 3 + NO 2 + OH - - Rodnik węglanowy jest silnym utleniaczem i ze względu na dużą zawartość CO 2 w komórkach może odgrywać ważną rolę w uszkodzeniach wywoływanych przez nadtlenoazotyn. - Może być źródłem rodnika hydroksylowego - Nadtlenoazotyn jest nietrwały (okres półtrwania to ok. 1 s), ale może dyfundować na znaczne odległości w komórce. - Charakterystyczna reakcja nadtlenoazotynu to nitrowanie reszt tyrozynowych w białkach.

57 Nadtlenoazotyn - Nadtlenoazotyn hamuje działanie między innymi: * oksydazy cytochromowej (i innych składników łańcucha oddechowego) * akonitazy (kluczowego enzymu cyklu Krebsa) * innych białek zawierających centra żelazowo-siarkowe. - Najważniejszym antyoksydantem usuwającym nadtlenoazotyn jest glutation i reakcje katalizowane przez peroksyredoksyny i peroksydazy glutationowe.

58 Nadtlenoazotyn - Jest mało selektywnym oksydantem utleniającym wszystkie typy makrocząsteczek i antyoksydanty niskocząsteczkowe.

59 Rodniki peroksylowe i alkoksylowe - Powstają w wyniku peroksydacji lipidów przez rodnik hydroksylowy. Rodnik odbiera atom wodoru z cząsteczki lipidu (LH), prowadząc do utworzenia rodnika w alkilowego (L ). W obecności tlenu rodnik ten przekształca się w rodnik peroksylowy (LOO ). - Rodnik peroksylowy i alkoksylowy może odbierać atom wodoru z sąsiednich cząsteczek lipidów, prowadząc do propagacji peroksydacji. Jednocześnie rodnik peroksylowy jest redukowany do nadtlenku lipidu. Rozkład nadtlenku lipidu w obecności jonów metali prowadzi do powstawania rodnika alkoksylowego (LO ) lub peroksylowego (LOO ).

60 Rodniki peroksylowe i alkoksylowe - Są silnymi utleniaczami. Wywołują: * peroksydację lipidów * utleniania białek (prowadzące do dysfunkcji białek strukturalnych i inaktywacji enzymów) * utlenianie DNA (prowadzące do modyfikacji zasad azotowych) - Reagując ze sobą rodniki peroksylowe dostarczają tlen singletowy. - Inaktywacja rodników peroksylowych i alkoksylowych zachodzi poprzez reakcje z przeciwutleniaczami: * witaminą E * witaminą C * glutationem * bilirubiną

61 Kwas podchlorawy - Kwas podchlorawy powstaje w reakcji nadtlenku wodoru i chlorku, w reakcji katalizowanej przez mieloperoksydazę w fagocytach. - MPO wykorzystuje również nadtlenek wodoru do utleniania bromku i tiocjanku w wyniku czego powstają silne utleniacze: * kwas podbromawy HOBr * kwas podtiocyjanawy HOSCN - Kwas podchlorawy jest silnym utleniaczem, reagującym z białkami, lipidami, kwasami nukleinowymi i węglowodanami. - Produkcja kwasu podchlorawego w czasie wybuchu tlenowego w fagocytach stanowi istotny mechanizm obrony przed patogenami. W warunkach chronicznego zapalenia (np. w miażdżycy) może prowadzić do uszkodzenia tkanek organizmu. - Inaktywacja kwasu podchlorawego zachodzi w wyniku reakcji z glutationem lub tauryną (obecną zwłaszcza w neutrofilach).

62 Działanie reaktywnych form tlenu i azotu - ROS i RNS mogą uszkadzać komórki, reagując z białkami, lipidami i kwasami nukleinowymi. - Reagując z białkami powodują: * zmiany aktywności enzymów * zmiany strukturalne białek i ich nieprawidłowe fałdowanie * nasiloną degradację białek - Reagując z lipidami powodują: * peroksydację lipidów prowadzącą do uszkodzeń błony komórkowej * powstawanie toksycznych i mutagennych aldehydów (dialdehydu malonowego, 4- hydroksy-2-nonenalu, akroleiny) - Reagując z kwasami nukleinowymi powodują: * modyfikacje zasad azotowych * pęknięcia nici DNA * tworzenie nietypowych wiązań DNA-DND i DNA-białka

63 Działanie reaktywnych form tlenu i azotu

64 Działanie reaktywnych form tlenu i azotu - ROS i RNS mogą powodować: * zaburzenia funkcji komórek * starzenie się komórek * cytotoksyczność * transformację nowotworową - Szkodliwe efekty ROS i RNS są ograniczane dzięki: * enzymom antyoksydacyjnym * endogennym związkom przeciwutleniającym * przeciwutleniaczom zawartym w pożywieniu - ROS i RNS mogą być ważnymi regulatorami szlaków transdukcji sygnałów, niezbędnymi dla prawidłowej aktywności komórek.

65 Zapraszam na wykład 2 Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

66 Anionorodnik ponadtlenkowy NBT reduction assay Malech et al. PNAS 1997

67 Wolne rodniki i reaktywne formy tlenu Metody doświadczalne stosowane w celu wywołania stresu oksydacyjnego w komórkach: * podwyższone ciśnienie parcjalne tlenu * kontakt z aktywowanymi fagocytami * ekspozycja na substancje utleniane jednoelektronowo przez tlen (np. dihydroksyfumaran) lub ulegające cyklom redoks w komórkach (np. alloksan, parakwat) * ekspozycja na dym papierosowy * ekspozycja na ozon * ekspozycja na nadtlenek wodoru lub nadtlenki organiczne (np. wodoronadtlenek kumenu) * ekspozycja na układ oksydaza ksantynowa + substrat alloksan

68

69

70 Multipletowość stanu elektronowego Multipletowość w mechanice kwantowej, odpowiada różnym stopniom degeneracji danego układu wieloelektronowego Jeśli całkowity spin elektronów określa liczba S, to jego rzut może przyjmować 2S+1 możliwości Zgodnie z prawami mechaniki kwantowej w przypadku cząsteczki, której liczba całkowitego spinu wynosi 1, możliwe są jej trzy orientacje względem kierunku zewnętrznego pola magnetycznego. Tym ustawieniom odpowiadają trzy różne poziomy energetyczne cząsteczki. Stan podstawowy cząsteczki tlenu jest stanem trypletowym.