RECENZIA pracy doktorskiej mgr Marty Grzechowiak pt.

Transkrypt

1 Prof. dr hab.marianna Turkiewicz emery.towany profe so r Instytutu B i o chemi i Techni cznej Politechniki L6dzkiej tr 6d2,5 wrze5nia 2015r RECENZIA pracy doktorskiej mgr Marty Grzechowiak pt.,rarabidopsis thaliana proteins involving in signalling pathways: structural and functional studies", wykonanej w Laboratorium Inrynierii Bialek Katedry Krystalografii Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu pod kierunkiem doc. dr hab. Michala M. Sikorskiego Ocena problematyki rozprarw Arabidopsis thaliana jest roslin4 modelow4 wykorzystywanq od kilku dziesiecioleci w badaniach fizjologii i biochemii roslin. Jej genom zostal zsekwencjonowany jako pierwszy genom roslinny, a to z kolei umozliwilo znaczne poszerzenie modelowych badan z zakresu funkcjonalnej genomiki i proteomiki. Szczeg6lne zainteresowanie badaczy budzq zagadnienia zwiqzane z identyfikacj4 i regulacjq szlak6w sygnalizacji kom6rkowej charakterystycznych dla organizm6w roslinnych, kt6rych wlasciwe dzialanie umo2liwia przystosowanie sie ustroju do zmiennych warunk6w Srodowiska, zar6wno biotycznych, jak i abiotycznych. Tym wla5nie zagadnieniom jest poswigcona przedlo2ona mi do oceny praca doktorska Pani mgr Marty Grzechowiak. Dotyczy ona dw6ch klas bialek - duzej rodziny bialkowych czynnik6w transkrypcji z motywem sekwencyjnym WRKY, uczestniczqcych w regulacji ekspresji gen6w zwiqzanych z adaptacj4 do stresu oraz pirofosfataz, kt6re s4 niezbgdne dla prawidlowego przebiegu metabolizmu fosforu w ro5linie. Gt6wnym celem tych badan bylo okreslenie molekularnej struktury przedstawicieli tych dw6ch grup waznych metabolicznie biatek oraz wykazanie funkcjonalnosci ich form rekombinowanych, uzyskanych na drodze heterologicznej ekspresji w systemie bakteryjnym. Podjgte przez Doktorantkp badania nale?y uznac za w pelni zasadne, tak z poznawczego,jak i praktycznego punktu widzenia, a ich wyniki za istotne nie tylko dla poglebienia wiedzy o metabolizmie roslinnym, ale wulne r6wnie2 dla rozwoju biotechnologii roslin. Ocena formalna Rozprawa, liczqca 186 stron maszynopisu, z formalnego punktu widzenia w pelni odpowiada standardom przyjetym w publikowaniu prac doswiadczalnych. Jest napisana w jezyku angielskim i sklada sig z dw6ch czesci, z kt6rych kulda ma tradycyjny uklad, to znaczy obejmuje rozdzial wstgpny, bgdqcy przeglqdem literatury z obszaru badan, dalej

2 prezentowane sq ich cele i nastgpuje om6wienie wynik6w oraz ich dyskusja, kt6ra w pierwszej czgsci dysertacji, poswiqconej bialkom WRKY, stanowi osobny rozdzial, natomiast w drugiej jest wl4czona do rozdzialu omawiajqcego rezultaty doswiadczeri. Kuzda czgs(, dysertacji zawiera rozdzial poswiecony opisowi material6w i metod i koriczy siq streszczeniami w jezyku angielskim i polskim oraz bibliografi4 licz4cq w czgsci l. 2Ol pozycji, a w czqsci II. - I 11, gl6wnie publikowanych po roku CzpS(, pierwsz4 ilustrujq 3 tabele i 25 rysunk6w, czgsi d*ge - 6 tabel i 20 rysunk6w. Rozdzialy wstppne zajmuj4 w obu czpsciachlqcznie 36 stron, om6wienie wynik6w wraz z dyskusjami - 65 stron (w tym dyskusja w czgsci pierwszej - 19 stron), opis metod - 46 stron. Obie czpsci spaja przedmowa. Dysertacja jest napisana bardzo starannie. Schematy i rysunki, w tym zdjgcia z rozdzial6w elektroforetycznych biatek i ich kompleks6w z DNA s4 bardzo dobrej i dobrej jakosci. Ocena merytoryczna Przeglqdy literatury, rozpoczynajqce ku;zdq z czgsci manuskryptu, kompetentnie wprowadzaj4 czytelnika w tematyke badan i co wazne, s4 napisane bardzo ciekawie, bez dlu7yzn. W czqsci poswigconej bialkom WRKY Autorka omawia ich rozpowszechnienie, klasyfikacjq w oparciu o cechy struktury, biologicznq funkcje z uwzglgdnieniem roli w obronie roslin przed patogenami oraz udzialu w odpowiedzi na abiotyczny stres i w koricu rodzaje interakcji, w kt6rych te bialka uczestniczq. Lektura tej czpsci pracy uzmyslawia czytelnikowi jak bardzo ambitny cel, w Swietle nielicznych danych dotyczqcych struktury bialek WRKY, kodowanych w A. thaliana przez 74 geny, czyli okreslenie struktury petnej dfugosci przynajmniej jednego ztych bialek, postawila sobie mgr Grzechowiak. Te nieliczne dane to jedna zdeponowana dotychczas w PDB struktura domeny wiqzqcej DNA biatka AtWRKYI, rozwiqzarra krystalografrcznie i dwie struktury tej domeny bialka AtWRKY4 okreslone z ulyciem NMR. W czgsci poswipconej enzymom zaangalowanym w metabolizm fosforu Autorka prezentuje rolg fosforu w roslinach, omawia homeostaze fosforanow4 i pirofosfatazy roslinne, kt6rych mechanizm dzialania jest znany, natomiast - do czasu jej badan - nie rozwiqzano struktury Zadnego ztych enzym6w. Opis metod wykorzystanych przez Paniq mgr Grzechowiak jest kompletny i na tyle dokladny, 2e umozliwia ewentualne powt6rzenie eksperyment6w. Podoba mi sig nieco szersze om6wienie podstaw niekt6rych z nich, jak chodby metod stosowanych w krystalografii bialek czy tez metody statycznego i dynamicznego rozpraszania Swiatla oraz

3 izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego, co moze ulatwid czytelnikowi, kt6ry ich w swojej praktyce laboratoryjnej nie stosowal, lepsze zrozumienie istoty eksperymentu. Z przyjemnosci4 podkreslam, 2e metody wykorzystane przez doktorantkg w badaniach zostaly wlasciwie dobrane, byly nowoczesne i zr62nicowane. Obejmowaly nie tylko standardowe metody mikrobiologiczne i analityczne (hodowla szczepbw, oznaczarie aktywnosci pirofosfatazy, elektroforeza w zelu poloakryloamidowym bialek w warunkach denaturujqcych, elektroforeza kompleks6w bialek z DNA w warunkach natywnych), ale takhe:. metody molekularne stosowane w manipulacjach genetycznych (konstrukcja serii wektor6w z genarni docelowych bialek, transformacja kompetentnych kom6rek kilku szczepiw Escherichia coli, wykorzystanych w charakterze gospodarzy, wreszcie dob6r warunk6w wydajnej ekspresj i);. metody preparatyki bialek (ich izolacja z systemu ekspresyjnego, oczyszczenie metodami chromatograficznymi do stanu umozliwiajqcego dalsze badania, przede wszystkim rentgenografrczne, przygotowanie pr6b do sekwencjonowania N-kofca, ograniczona proteoliza) oraz preparatyki RNA, cdna i oligonukleotyd6w DNA, zawierajqcych specyficzny motyw (,,W-box") niezbgdny dla ich wiqzariaprzez bialka WRKY;. metody spektroskopowe (dichroizm kolowy - CD, dynamiczne rczpraszatie Swiatla DLS) i fizykochemiczne (wspomniane jul izotermiczne miareczkowanie kalorymetryczne,pozwalaj4ce okreslid stal4dysocjacji kompleksow DNA-bialko); o metody krystalograficzne (ustalanie warunk6w krystalizacji wybranych bialek, zbieranie danych dyfrakcyjnych i ich obliczeniowa analiza zmierzajqca do zbudowania i udokladnienia modelu czqsteczki);. metody bioinformatyczne (projektowanie starter6w do reakcji PCR, przyr6wnania sekwencyjne pirofosfataz r62nego pochodzenia, ustalanie in silico stopnia uporzqdkowania czqsteczki bialka na poziomie struktury ll-rzgdowej). Jak juz wspomnialam, pierwszym celem badan Pani mgr Grzechowiak byla konstrukcja bakteryjnego systemu ekspresji gen6w bialek WRKY A. thaliana, izolacja tych bialek z kom6rek transformant6w i oczyszczenie, a nastepnie opracowanie warunk6w krystalizacji i rentgenografrczne rozwiqzanie struktury. Eksperymenty zmierzajqce do tego celu zostaly dobrze zaplanowane i wykonane. Doktorantka dokonala na wstqpie wyboru 20

4 gen6w sposr6d 74 koduj4cych te bialka w genomie A. thaliana, przyjmuj4c jako kryterium ich zro2,nicowarrie klasyfikacyjne, masp czqsteczkow4 i punkt izoelektryczny. Kolejnym etapem byla konstrukcja serii kilku rodzaj6w wektor6w z wybranymi genami, przy czp 5 z tych gen6w wyizolowala wlasnorgcznie z cdna, natomiast pozostale otrzymala z Instytutu Maxa Plancka w Kolonii w postaci wklonowanej do plazmidu pdonr. Stosuj4c trzy rsime podejscia, migdzy innymi klonowanie niezalezne od ligazy, zbudowala 49 konstrukt6w, kt6rymi transformowala kom6rki E.coli. Ekspresja, mimo pr6b optymalizacji procesu, dala w wigkszosci przypadk6w nierozpuszczalne fo.-y bialek fuzyjnych, bqd? bia\ek WRKY po odcipciu fuzyjnego znacznika, kt6rym, zaleznie od konstruktu, byla metka histydynowa, bialko wi474ce maltoze, bialko NusA lub tioredoksyna. Tylko w trzech przypadkach byly to formy rozpuszczalne (AtWRKY50, domeny wi4zqce DNA bialek AtWRKY30 i l8), a w szesciu - formy tworzqce rozpuszczalne agregaty (AtWRKY 18, 29,43,50, 53, 56). Autorka tg czg(c wynik6w zawarla na 5 stronach, obejmujqcych 1 tabele i 4 rysunki, nie opisuj4c szczeg6towo przeprowadzonych pr6b optymalizacji ekspresji, a jak rozbudowane i pracochlonne byly te pr6by mohna sie dopiero dowiedziei z odpowiedniego fragmentu dyskusji. Dziqki takiemu ujgciu opis wynik6w jest bardziej przejrzysty i mniej nuz4cy. W oparciu o renitaty transformacji mgr Grzechowiak wybrala do kolejnego etapu badari dwa bialka - pelnej dlugosci bialko AIWRKY5} oruz domenq wiqzqcqdna bialka AtWRKY18. Wyizolowala te bialka z transformowanych kom6rek E.coli, oczyscila je i podjgta pr6by krystalizacji. W przypadku krysztal6w pelnej dlugosci biatka AtWRKY5} rozdzielczofi( dyfrakcji - 8A - byla zbyt niska, aby molna bylo okresli6 grupq przestrzenrrq kryszalu i rozmiary kom6rki elementarnej. Pr6by kokrystalizacji tego bialka w kompleksie ze specyficznym DNA, jak r6wniezkrystalizacji zmodyfikowanych jego form, otrzymanych na drodze reduktyumej metylacji reszt lizyny oraz ograniczonej proteolizy z wykorzystaniem elastazy i pepsyny, byly r6wnie2 nieudane. Pewne wltlumaczenie niepowodzefi w otrzymaniu odpowiedniej jakosci krysztal6w bialka AtWRKY50 sugerujq wyniki pomiar6w dichroizmu kolowego i analizy bioinformatycznej, kt6re s4 zbielne i wskazuj4 2e znaczna czgs6 jego czqsteczki (ok. 60% poczynajqc od N-korica) ma charakter nieuporz4dkowany, czyli odznacza sig duz4 gigtkosci4 co moze utrudnia6 krystalizacjg, mimo 2e 40Yo czryteczki przy C-koricu ma charakter globularny. Dopelnieniem badan krystalograficznych biatka AIWRKY5O bylo wykazanie, 2e jego rekombinowana forma zachowala swojq natywnq funkcjg i mo2e wiqzat, oligonukleotydowy DNA zawierajqcy specyficzny motyw W-box. Autorka pracy wykazalato z uzyciem dwu metod - przesunigcia ruchliwosci elektroforetycznej kompleks6w w odniesieniu do ruchliwosci tak pojedynczych, jak i podw6jnych nici DNA, atakze za pomoce

5 izotermicznego miareczkowania kalorymetrycznego. Nieudane byly r6wnie2proby okreslenia struktury domeny wi474cej DNA bialka nr 18 (krysztaty o nieodpowiedniej jakosci, precypitacja kompleks6w tej domeny z DNA), cho6 i ona nie utracila powinowactwa do DNA, tworzec znim kompleksy. RekompensatE tych niepowodzeri moge stanowi6 wyniki drugiej czgsci badan przeprowadzonych przez Paniq mgr Grzechowiak w ramach projektu doktorskiego i dotyczqcych jednej z piqciu pirofosfataz A. thaliana. Zostal opracowany wydajny system ekspresji AtPPAlw E. coli, procedura jego oczyszczania, warunki krystalizacji i dyfrakcji promieni Roentgena z wysok4 rozdzielczosci4 (1,9 A), co umo2liwilo rozttriryanie struktury bialka metodq podstawienia czqsteczkowego, tj. okreslenie element6w struktury drugorzqdowej i topologii calej czqsteczki. Autorka wykazala,ze rekombinowany enzym jest aktywny oraz - dzieki wprowadzeniu odpowiednich mutacji do genu pirofosfatazy - ze istotne dla aktywnosci enzymu s4 dwie reszty kwasu asparaginowego obecne w aktywnym centrum i bior4ce udzial w wi4zaniu jonu metalu, jako 2e pirofosfatazy nalehq do metaloenzym6w. Udowodnila ponadto, ze AIPPAI jest homotrimerem o masie 75 V,Da, podczas gdy bakteryjne pirofosfatazy tworzq heksametry, a enzymy dro2daowe - dimery. Nalezy podkresli6, ie pirofostaza I A. thaliana jest pierwszq roslinn4 pirofosfatazq o rozrlipzanej strukturze molekularnej. Jest to niewqtpliwie bardzo duze osiqgnipcie Autorki pracy. Najlepsz4 czpsciq dysertacji jest w mojej opinii dyskusja wynik6w zawartych w pierwszej czgsci, dotyczqcej bialkowych czynnik6w transkrypcji z motywem WRKY. Autorka krytycznie i wnikliwie, a nawet drobiazgowo, rozpatrzyla w odniesieniu do literatury przedmiotu, wszystkie rezultaty swoich badan. Ten rozdzial dowodzi dojrzalosci badawczej i bardzo dobrego przygotowania mgr Grzechowiak do pracy naukowej. Nale2y miei nadziejq, 2e jej dalsza kariera bedzie sig pomy6lnie rozwijad. Od recenzenta oczekuje sig zwykle wypunktowania ewentualnych krytycznych uwag pod adresem doboru metod, interpretacji wynik6w, redakcji tekstu. Mimo uwaznej lektury pracy trudno mi takie uwagi sformulowai, w kazdym razie nie dotyczq one zasadniczych kwestii, poruszanych w rozprawie, a jedynie spraw marginalnych, nie maj4cych absolutnie Zadnego wplywu na moj4 wysok4 ocenq dysertacji, dlatego pozwole sobie je pominq6. Prosilabym jedynie o wyjasnienie przyczyn, dla kt6rych nie zostal wykorzystany w badaniach wektor pdonr, kt6ry jest wektorem klonuj4cym dedykowanym E.coli, zapewniajqcym dobrq wydajnosd transformacji i dobrq wydajnosi ligacji ortv wygodne metody selekcji pozytywnych klon6w. Moje pytanie jest zwiqgane z faktem otrzymariaprzez Pani4magister

6 Grzechowiak konstrukt6w tego wektora z genami 13' bialek WRKY z Instytutu Maxa PIancka. Reasumui4c - moje og6lne wrazenie odnosnie zakresu badan i ich sekwencji oraz prawidlowosci interpretacji wynik6w jest po lekturze rozprawy bardzo dobre' Nie od rzeczy bgdzie wspomnie6. ze badania wykonan e przez Pani4 mgr Grzechowiak zostaly dofinansow ane ptzez UniE Europejsk4 w ramach Funduszu Rozwoju Regionalnego (lnternational PhD Program, nadzorowany przez Fundac.lg Nauki Polskie-i) oraz prze/' roczlly grant dla mlodych naukowc6w ptzyznany przezministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyzszego' pewien niedosyt budzi fakt, ze dotychczas wyniki te.i dobrei pracy nie zostaly.ieszcze w pelni opublikowane, zostala jedynie zdeponowana w bazie PDB sekwencja pirofosfatazy AtppAl oraztkazala sie w 2013 r. w czasopismie BioTechnologia 3-stronicowa purblikac.ia wsp6lautorstwa m gr Grzechowi ak, doty czeca p iro fosfatazy ro Sl innej. Wniosek kolicowv Stwierdzam z pelnym przekonaniem, ze praca doktorska Pani mgr Marty Grzechowiak spelnia wszelkie ustawowe wymagania stawiane pracom doktorskim - prezentuie bardzo wysoki poziom naukowy, zawieraelementy nowosci naukowej, ma duz4 wartosc poz-nawczq i daje podstawy do podjgcia kolejnych badari. zwlaszcza obejmuj4cych modyfikacjq system6w ekspresji bialek WRKY, ktore pozwolilyby je otrzyn-rai w stabilne.i rozpuszczalne.i fbrmie, umo2liwiaj4cej ich wydajne oczyszczenie, opracowanie metod krystalizacji i w koricu rozwiqzanie struktury metodami rentgenograficznymi. co w kontekscie fi{ologiczne.i roli tych bialek mialoby duae znaczenie dla rozwoju biologii molekularnej i biotechnologii roslin. R6wniez badania nad pirofosfatazami A. thaliana powinny byc kontynuowane w oparciu o doswiadczenie zdobyte w pracy z AtPPAl. Ich wyniki mialyby duze znaczenie dla ustalenia nie tylko ewentualnych r6znic w budowie tych enzym6w, ale takze dla okreslenia roli poszczeg6lnych pirofb sfataz w og6hiym metabolizmie fosfbru w Arabidoltsis thuliunu' BiorQc powyzsze pod uwagq wnoszg o przyjgcie pracy doktorskie.i rngr Marty Grzechowi ak przez Radg Naukow4 Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN w Poznaniu i dopuszczenie Autorki dysertac. i clo kole.inych etap6w przewodu cioktorskiego' A-.- r \ \ /V\A\4^/U^& t W irof. dr hab. Marianna Turkiewicz