MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 23-28

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: Przydatność wielokierunkowej diagnostyki mikrobiologicznej na przykładzie jednoczesnego zakażenia czterema herpeswirusami jako powikłania po allogenicznym przeszczepieniu komórek krwiotwórczych opis przypadku Usefulness of wide-range microbiological diagnostics proceedings in case of simultaneous infection with four herpesviruses after allogeneic haematopoietic stem cell transplantation a case report Tomasz Dzieciątkowski 1,2, Maciej Przybylski 1,2, Patrycja Rusicka 3, Krzysztof Mądry 3, Piotr Boguradzki 3, Halina Marchel 1, Wiesław W. Jędrzejczak 3, Grażyna Młynarczyk 2 1 Zakład Mikrobiologii SP CSK w Warszawie 2 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 3 Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Warszawski Uniwersytet Medyczny Opisano przypadek śmiertelnych zakażeń potransplantacyjnych, spowodowanych przez cztery herpeswirusy u 49-letniego mężczyzny poddanego zabiegowi przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych z powodu wystąpienia zespołu mielodysplastycznego. Przeprowadono pełne badania wirusologiczne z wykorzystaniem techniki real-time PCR w kierunku wirusów opryszczki zwyczajnej, ospy wietrznej/półpaśca, herpeswirusa typu 6 oraz wirusa Epsteina-Barr. Wiremia spowodowana przez HSV-1 oraz VZV narastała pomimo stosowanego doustnego leczenia acyklowirem. Wykazano przydatność wielokierunkowych badań z użyciem real-time PCR w wykrywaniu i monitorowaniu zakażeń spowodowanych przez herpeswirusy, zwłaszcza o niskim poziomie replikacji. Słowa kluczowe: herpeswirusy, zakażenia potransplantacyjne, immunosupresja, real-time PCR ABSTRACT Introduction: Infections caused with a variety of bacteria, fungi and viruses are still responsible for high level of mortality and morbidity in immunosupressed individuals. A case of fatal post-transplant reactivation with four herpesviruses in 49-year-old immunocompromised

2 24 T. Dzieciątkowski i inni Nr 1 male with MDS-RAEB2, subjected to allogeneic haematopoietic stem cell transplantation was described. Methods: Full microbiological examination of was performed in different types of clinical samples (whole blood, stool). Sera specimens were tested for the presence of different viral DNA using the real-time PCR assays. Results and conclusions: DNA of HSV-1, VZV, HHV-6 and EBV in serum samples was detected using molecular biology techniques. Viral level of HSV-1 and VZV was constantly increasing despite routine applied oral acyclovir therapy. These findings underline the value of real-time PCR technique used in current therapeutic procedures and for monitoring of antiviral therapy with nucleoside analogs. We found that real-time PCR is a useful tool in detection and monitoring of disseminated herpesviral infection, especially for the detection of low-copy viraemia in clinical specimens. Key words: herpesviruses, post-transplant infections, immunosuppression, real-time PCR WSTĘP Zabieg przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych jest terapią z wyboru w przypadku wielu chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, chorób limfoproliferacyjnych czy zespołów niewydolności szpiku (5). U osób z chorobami nowotworowymi obserwujemy wiele dysfunkcji układu immunologicznego, które mogą być przyczyną zwiększonego zagrożenia ze strony mikroorganizmów. Zakażenia powodowane przez herpeswirusy u pacjentów hematologicznych mają często postać atypową, co utrudnia postawienie prawidłowej diagnozy na podstawie obrazu klinicznego (8). Alfaherpeswirusy są zazwyczaj pierwszymi wirusami, które reaktywują się u około 25-40% biorców przeszczepu, najczęściej pomiędzy 2-4 tygodniem po transplantacji (4). W licznych badaniach wykazano, że DNA wirusa cytomegalii zostało wykryte w 15-70% przypadków po zabiegu allogenicznego przeszczepienia komórek krwiotwórczych, średnio dnia po przeszczepieniu, a więc dużo później niż pozostałych betaherpeswirusów (7). Infekcje wywołane przez herpeswirusa typu 6 dotyczą 38-60% biorców komórek krwiotwórczych, zaś wiremia występuje w ciągu pierwszych 4-6 tygodni po zabiegu i wiązana jest z wieloma jednostkami chorobowymi, począwszy od stanów gorączkowych aż do neuroinfekcji (7). Reaktywacja wirusa Epsteina-Barr kojarzona jest przede wszystkim z wystąpieniem poprzeszczepowej choroby limfoproliferacyjnej (Post-transplant lymphoproliferative disorder - PTLD), która obserwowana jest wśród 1-3% osób po transplantacji komórek krwiotwórczych, jednak podczas stosowania immunosupresji ryzyko wystąpienia reaktywacji wzrasta aż do 24% (6). W pracy przedstawiamy celowość wykorzystania wielokierunkowej diagnostyki molekularnej w monitorowaniu potransplantacyjnych zakażeń wirusowych u pacjenta z ostrą białaczką szpikową, poddanego przeszczepieniu komórek krwiotwórczych pochodzących od dawcy spokrewnionego.

3 Nr 1 Przydatność wielokierunkowej diagnostyki mikrobiologicznej 25 OPIS PRZYPADKU Pacjent w wieku 49 lat pozostawał pod opieką Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych WUM z powodu zespołu mielodysplastycznego (MDS RAEB2). Wdrożono leczenie cytostatyczne (doksorubicyna + arabinozyd cytozyny), które nie doprowadziło do remisji choroby podstawowej. W związku z pogarszającym się stanem chorego, postanowiono wykonać zabieg przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych od dawcy spokrewnionego (1). W okresie przygotowania pacjenta do zabiegu przeszczepienia stwierdzono podwyższony poziom dehydrogenazy mleczanowej (278 U/ml) i białka C-reaktywnego (80,6 mg/l). Na przestrzeni dwóch tygodni poprzedzających zabieg obserwowano wzrost poziomu gamma- -glutamylotransferazy ( U/l) oraz bilirubiny (0,3 5,2 mg/dl) przy prawidłowych wartościach transaminaz. Pacjent był żywiony pozajelitowo z powodu stałych nudności i wymiotów występujących praktycznie po każdym posiłku oraz rozwijającego się bolesnego zapalenia błon śluzowych jamy ustnej i przełyku. Z posiewów pobranych z miejsc zmienionych chorobowo w obrębie jamy ustnej wyizolowano C. albicans, K. pneumoniae i A. baumanii. W okresie bezpośrednio poprzedzającym zabieg stan chorego był ciężki: mimo podawania koncentratów czerwonokrwinkowych i płytkowych parametry krwi obwodowej były niezadowalające (WBC 0,1 G/l, Hb 7,7 g/dl, PLT 6,0 G/l), obserwowano niewydolność krążeniową, a w dniu wykonania zabiegu doszło do chwilowego zatrzymania akcji serca. U chorego stosowano schemat kondycjonowania CLAMM 2, z użyciem arabinozydu cytozyny, mitoksantronu oraz melfalanu i cyklosporyny. Wykonanie zabiegu przeszczepienia komórek progenitorowych było powikłane wystąpieniem wstrząsu septycznego wywołanego zakażeniem Escherichia coli, wrażliwej na cefalosporyny II i III generacji, piperacylinę z tazobaktamem, amikacynę, ciprofloksacynę oraz karbapenemy. Po wdrożeniu leczenia przeciwbakteryjnego stan pacjenta ustabilizował się, natomiast w próbkach kału wykryto toksynę Clostridium difficile z powodzeniem zastosowano terapię przy użyciu metronidazolu oraz wankomycyny. W dziesiątym dniu po przeszczepieniu, z próbki krwi obwodowej wyhodowano oporny na wankomycynę szczep Enterococcus faecium (VRE), w związku z czym zastosowano leczenie linezolidem i.v. Stan pacjenta był nadal ciężki, ale stabilny po upływie kolejnych 2 dni usunięto wkłucie centralne zakażone Trichosporon asahii, natomiast w posiewach krwi wykryto Candida krusei oraz ponownie E.coli. Od 17 dnia po transplantacji zaobserwowano dalsze pogarszanie się stanu ogólnego pacjenta. Stwierdzono kliniczne cechy zapalenia płuc: w badaniu obrazowym wykonanym techniką tomografii komputerowej opisano zmiany sugerujące etiologię grzybiczą; do leczenia włączono kaspofunginę. Poczynając od drugiego dnia po zabiegu przeszczepienia, zgodnie z zaleceniami EBMT, rozpoczęto monitorowanie DNA wirusa cytomegalii w surowicy krwi obwodowej (12). W żadnej próbce pobranej od chorego nie wykryto DNA CMV. Pogarszający się stan kliniczny chorego oraz współwystępujące liczne czynniki ryzyka ciężkich zakażeń wirusowych (nowotwór, immunosupresja, uogólnione zakażenia bakteryjne i grzybicze) były wskazaniem do wykonania dodatkowych badań wirusologicznych: pobrane dla celów monitorowania CMV próbki surowicy krwi zbadano również w kierunku występowania DNA wirusów opryszczki zwykłej typu 1 i 2 (HSV-1 i -2), wirusa ospy wietrznej i półpaśca (VZV), wirusa Epsteina-Barr (EBV) oraz ludzkiego herpeswirusa typu 6 (HHV-6).

4 26 T. Dzieciątkowski i inni Nr 1 W 20 dobie po przeszczepieniu zaobserwowano dalsze pogarszanie się stanu pacjenta, połączone z narastającą niewydolnością oddechową. Zgon nastąpił po upływie kolejnych 24 godzin w wyniku nagłego zatrzymania krążenia. METODY BADAWCZE ZASTOSOWANE W DIAGNOSTYCE WIRUSOLOGICZNEJ Całkowite DNA uzyskane z 200 ml surowicy krwi przy użyciu DNA Mini Kit (Qiagen), zawieszano w 50 ml wody do zastosowań w biologii molekularnej. Izolację DNA przeprowadzano zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta. Do badań wirusologicznych z użyciem techniki real-time PCR w kierunku identyfikacji HSV-1/2, VZV, CMV, EBV oraz HHV-6 używano po 10 ml wyizolowanego DNA. Wykrywanie wirusowego DNA prowadzono techniką real-time PCR na aparacie Light- Cycler 2.0 (Roche Diagnostics) za pomocą komercyjnych testów ilościowych HSV-1/2 LC PCR Kit, VZV LC PCR Kit i CMV LC PCR Kit (Artus/Qiagen) oraz EBV Qual Kit (Roche Diagnostics), za wyjątkiem metody wykrywającej DNA herpeswirusa typu 6, opracowanej w Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Lekarskiej WUM (2). Wirusowe DNA wykrywano ogółem w 4 próbkach surowicy, pobranych w 2, 9, 16 i 20 dobie po przeszczepieniu. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE W wyniku amplifikacji metodą real-time PCR DNA izolowanego z surowicy krwi pacjenta zaobserwowano początkowo produkty specyficzne dla ludzkiego wirusa opryszczki typu 1 oraz wirusa ospy wietrznej/półpaśca. W kolejnej próbce oprócz zwiększania się poziomu tych wirusów ( kopii/ml dla HSV-1 oraz kopii/ml dla VZV), wykryto także na niskim poziomie (<200 kopii/ml) materiał genetyczny wirusa Epsteina-Barr oraz herpeswirusa typu 6. Rutynowo wykonywane testy w kierunku CMV wykluczyły natomiast obecność DNA tego patogenu. Odnotować należy w opisywanym przypadku wcześnie występującą wiremię VZV, przy jednoczesnym braku typowych dla α-herpeswirusów objawów miejscowych oraz obecności podwyższonych wartości parametrów enzymów wątrobowych, co jednak mogło być efektem prowadzonego leczenia. Pozostałe objawy infekcji spowodowanych przez herpeswirusy mogły być maskowane przez ogólny zły stan pacjenta i współwystępujące zakażenia bakteryjne oraz grzybicze. PODSUMOWANIE Stosowanie leczenia immunosupresyjnego u pacjentów poddanych przeszczepieniu komórek krwiotwórczych, poprzez wpływ na szlaki sygnalizacji komórkowej oraz zaburzanie normalnych funkcji komórek efektorowych układu odpornościowego, jest najpoważniejszym czynnikiem zwiększającym ryzyko zakażeń objawowych powodowanych przez wszystkie ludzkie herpeswirusy (8,11). Zakażenia te u pacjentów poddanych immunosupresji występują najczęściej podczas mielosupresji (od pierwszego do trzeciego tygodnia po transplantacji), lecz okres ten może wydłużać się do kliku tygodni u pacjentów, u których konsekwencją leczenia immunosupresyjnego jest przewlekła mielosupresja oraz neutropenia (8,11).

5 Nr 1 Przydatność wielokierunkowej diagnostyki mikrobiologicznej 27 W omawianym przypadku obserwowano synergistyczny wpływ wielu czynników ryzyka ciężkich zakażeń (choroba podstawowa nie odpowiadająca na chemioterapię, immunosupresja i wynikająca stąd neutropenia). Szybka i miarodajna diagnostyka zakażeń wywołanych przez herpeswirusy u osób poddanych terapii immunosupresyjnej jest podstawowym narzędziem służącym do wykrycia czynnika odpowiedzialnego za zakażenie, a co za tym idzie, postawienia prawidłowego rozpoznania i określenia rokowania (10). Odpowiednio czułe i swoiste metody diagnostyczne wykazują także przydatność w monitorowaniu stanu pacjenta w przebiegu leczenia, a zwłaszcza w okresie podawania leków przeciwwirusowych. Zastosowanie techniki real- -time PCR pozwala na bardzo wczesne wykrycie wiremii HSV/VZV w przebiegu zakażenia, pozwalając na wprowadzenie stosownej terapii przeciwwirusowej i odroczenie kolejnego etapu kuracji sterydowej do czasu wygaśnięcia objawów i negatywizacji wyników PCR (10). Acyklowir jest uznawany za lek pierwszego rzutu w terapii zakażeń alfaherpeswirusami, znajduje także szerokie zastosowanie w chemioprofilaktyce zakażeń wywoływanych przez wirusy z tej podrodziny. U pewnego odsetka pacjentów obserwuje się zakażenia szczepami alfaherpeswirusów opornych na acyklowir (3). Oporność na acyklowir jest najczęściej skutkiem wystąpienia pojedynczej mutacji lub serii mutacji punktowych w obrębie genu kinazy tymidynowej (TK). Największy odsetek szczepów opornych wykrywa się u biorców szpiku kostnego, szczególnie od dawców niespokrewnionych (14-29%), mniejsze prawdopodobieństwo zakażeń szczepami opornymi na acyklowir występuje u biorców narządów unaczynionych (4-8%) oraz u pacjentów zakażonych HIV (5%) (3,10). Poważnym problemem z punktu widzenia terapii jest standaryzacja wyników oznaczeń lekowrażliwości uzyskiwanych przy użyciu różnych metod fenotypowych, uzyskanie zadowalającej powtarzalnosci tych wyników oraz dokładne określenie punktu cut-off pozostającego w dobrej korelacji klinicznej ze stosowanymi dawkami acyklowiru. Dopóki bowiem stosowane obecnie testy służące do oceny oporności na acyklowir in vitro nie zostaną zastąpione przez szybsze i tańsze metody biologii molekularnej, podjęcie decyzji o zmianie schematu leczenia przeciwwirusowego w ogromnej większości przypadków bazować będzie (tak jak do tej pory) na kryteriach klinicznych (9). W tej sytuacji istnieje silna potrzeba wprowadzenia do praktyki klinicznej testu, który od strony praktycznej byłby w zasięgu większości laboratoriów wirusologicznych, a także cechowałby się wysoką powtarzalnością wyników i możliwością określenia korelacji klinicznej przy użyciu danych parametrycznych. Obecnie metody wykorzystujące technikę real-time PCR zyskują coraz większą popularność w szeroko pojętych badaniach wirusologicznych, ze względu na wysoką czułość i rozdzielczość analityczną, dobrą przepustowość oraz łatwość użycia od strony technicznej. Opisywane dotychczas testy real-time PCR stosowane do wykrywania szczepów alfaherpeswirusów opornych na acyklowir wykorzystują standardowe warunki powielania DNA, zbliżone do warunków używanych w testach służących do rutynowego wykrywania i identyfikacji herpeswirusów w próbkach klinicznych (9). PIŚMIENNICTWO 1. Deeg HJ, Bartenstein M. Allogeneic hematopoietic cell transplantation for myelodysplastic syndrome: current status. Arch Immunol Ther Exp 2012; 60:

6 28 T. Dzieciątkowski i inni Nr 1 2. Dzieciątkowski T, Przybylski M, Gieryńska M i inni. Wykorzystanie metody real-time PCR do wykrywania DNA ludzkiego herpeswirusa typu 6. Med Dośw Mikrobiol 2008; 60: Field HJ. Herpes simplex virus antiviral drug resistance-current trends and future prospects. J Clin Virol 2001; 21: Karabin K, Chudzik E, Dzieciątkowski T. Zakażenia alfaherpeswirusami u pacjentów z upośledzeniem odporności. Post Mikrobiol 2010; 49: Ljungman P, Bregni M, Brune M i inni. Allogeneic and autologous transplantation for haematological diseases, solid tumours and immune disorders: current practice in Europe Bone Marrow Transplant 2009; 45: Loren AW, Porter DL, Stadtmauer EA i inni. Post-transplant lymphoproliferative disorder: a review. Bone Marrow Transplant 2003; 31: Osińska E, Tomaszewska A, Dzieciątkowski T. Zakażenia betaherpeswirusami u osób z niedoborami odporności. Post Mikrobiol 2009; 48: Rovira M, Mens J, Carreras E. Infections after HSCT. W: Haemopoetic stem cell transplantation. The EBMT Handbook 6 th Edition. Red. Apperley J, Carreras E, Gluckman E, Masszi T. Forum Service Editore, Genoa, 2012, Stranska R, van Loon AM, Polman M i inni. Application of real-time PCR for determination of antiviral drug susceptibility of herpes simplex virus. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46: Styczynski J, Reusser P, Einsele H i inni. Management of HSV, VZV and EBV infections in patients with hematological malignancies and after SCT: guidelines from the Second European Conference on Infections in Leukemia. Bone Marrow Transplant 2009; 43: Wood MJ. Viral infections in neutropenia: current problems and chemotherapeutic control. J Antimicrob Chemother 1998; 41: Otrzymano: 15 I 2014 r. Adres Autora: Warszawa, ul. Chałubińskiego 5, Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny