Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych

Transkrypt

1 Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 3, zeszyt 2, , 2010 Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych KRZYSZTOF SZCZAŁUBA, EWA OBERSZTYN, TADEUSZ MAZURCZAK Streszczenie W patomechanizmie wad rozwojowych istotną rolę odgrywają czynniki genetyczne, a wśród nich aberracje chromosomowe. Do niedawna ich identyfikacja możliwa była jedynie poprzez zastosowanie rutynowych technik diagnostyki cytogenetycznej, takich jak analiza prążkowa chromosomów. W świetle udokumentowanych w ostatnich latach możliwości diagnostycznych, jakie stwarzają technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), MLPA oraz najnowsza technika porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy (acgh), należy przypuszczać, że submikroskopowe rearanżacje chromosomowe, takie jak mikrodelecje i mikroduplikacje, spełniają ważną rolę w etiopatogenezie wrodzonych wad rozwojowych. U większości chorych dzieci, w tym noworodków, przyczyna wystąpienia wad rozwojowych, które fenotypowo nie odpowiadają określonym zespołom genetycznym, pozostaje nieznana. Wiele spośród tych wad, w szczególności wtedy, gdy występują w postaci mnogich wad rozwojowych, ma charakter letalny, czyli skutkuje wczesnym zgonem dziecka, nierzadko przed wdrożeniem procesu diagnostycznego. W pracy przedstawiono obecny stan wiedzy na temat przydatności nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w identyfikacji przyczyn wrodzonych wad rozwojowych. Zaproponowano także sposób postępowania diagnostycznego w przypadku stwierdzenia dużej wady rozwojowej lub mnogich wad wrodzonych u noworodka. Słowa kluczowe: wada rozwojowa, aberracja chromosomowa, FISH, MLPA, CGH Wrodzone wady rozwojowe jako problem kliniczny Termin wrodzona wada rozwojowa oznacza wewnętrzną lub zewnętrzną nieprawidłowość morfologiczną dotyczącą struktur ciała, powstałą w okresie życia wewnątrzmacicznego i obecną przy urodzeniu, niezależnie od patogenezy, etiologii i czasu rozpoznania [1]. W praktyce klinicznej jest więc to każde wrodzone odstępstwo od prawidłowej budowy anatomicznej powstałe w wyniku zaburzenia złożonych mechanizmów rozwojowych na różnych etapach embriogenezy. Wśród nich wymienia się: deformacje, malformacje, przerwania i dysplazje [2]. Wrodzone wady rozwojowe mogą występować pojedynczo jako wady izolowane lub jako wady mnogie (wielowadzie). Szacuje się, że 2/3 wszystkich wad rozwojowych to wady izolowane, a pozostałą 1/3 stanowią mnogie wady wrodzone. Według Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych (PRWWR) wada izolowana to jedna lub kilka wad w obrębie jednego układu [3]. Wielowadzie definiowane jest natomiast jako obecność dwóch lub więcej dużych wad rozwojowych dotyczących co najmniej dwóch z wymienionych układów: sercowo-naczyniowego, moczowopłciowego, szkieletowego, pokarmowego, oddechowego lub ośrodkowego układu nerwowego. W zależności od patogenezy, wyróżnia się różnego typu defekty morfologiczne występujące pod postacią mnogich wad rozwojowych, takie jak zespoły, sekwencje, skojarzenia (asocjacje) oraz kompleksy wad wrodzonych [2]. Do najlepiej poznanych zespołów wad, czyli różnych defektów morfologicznych o wspólnej, najczęściej genetycznej etiologii należą m.in. zespół Downa, Edwardsa, Williamsa lub Smitha-Lemlego-Opitza. W sekwencjach (np. Potter lub Pierre a Robina) pojedynczy defekt (np. agenezja nerek lub małożuchwie) zapoczątkowuje kaskadę określonych wad rozwojowych. Skojarzenie wad oznacza nielosowe, częstsze niż przypadkowe i niestałe występowanie wad o nieznanej etiologii (np. w asocjacji VATER, w której współistnieją wady kręgów, zarośnięcie odbytu, przetoka tchawiczo-przełykowa, wady nerek). Termin określający skojarzenie jest zazwyczaj akronimem pochodzącym od nazw występujących w nim wad. Duże wady rozwojowe, czyli takie, które powodują poważne następstwa dla zdrowia płodu lub noworodka w wielu przypadkach mają charakter letalny. Z kolei, małe wady (tzw. drobne anomalie lub cechy dysmorficzne) z reguły nie zagrażają życiu lub zdrowiu, jednak mogą mieć znaczenie w diagnostyce tzw. zespołów dysmorficznych. Do tej grupy zalicza się takie anomalie jak m.in. polidaktylia, syndaktylia, wyrośla przeduszne, hiperteloryzm lub szczelina tęczówki. W praktyce klinicznej i poradnictwie genetycznym uznaje się, iż pojedyncza wada rozwojowa u prawidłowo fizycznie i umysłowo rozwijającej się osoby ma etiologię wieloczynnikową. Oznacza to, że o powstaniu izolowanej wady wrodzonej decyduje predyspozycja genetyczna uwarunkowana obecnością zmian w wielu genach i wyzwalana działaniem trudnych do zdefiniowania czynników środowiskowych. Nierzadko jednak z pojedynczym defektem rozwojowym (lub częściej z wielowadziem) współ- Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie

2 Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych 109 istnieje niepełnosprawność intelektualna, zaburzenia rozwoju fizycznego oraz cechy dysmorfii (z ang. Multiple Congenital Anomalies/Mental Retardation syndromes MCA/ MR). Identyfikacja u chorego dziecka powyższych objawów powinna sugerować podejrzenie choroby jednogenowej lub zespołu aberracji chromosomowej (tzw. fenotyp chromosomowy). Przytoczona powyżej klasyfikacja wad rozwojowych częściowo uwzględnia ich patogenezę. Przyjmuje się, iż do rozwoju wady przyczyniają się zarówno czynniki egzo-, jak i endogenne, co ilustruje tabela 1. Zgodnie z przytoczonymi w niej danymi, aż w 70% przypadków etiologia wad rozwojowych pozostaje nieznana, a jedynie u 30% chorych możliwe jest ustalenie ich przyczyny. Warto zaznaczyć, iż przedstawione w tabeli 1 dane oznaczają relatywny wpływ danego czynnika w odniesieniu do ogólnej częstości wad rozwojowych, bez uwzględnienia podziału na wady izolowane i mnogie. Tabela 1. Czynniki etiologiczne wrodzonych wad rozwojowych [28]. W tabeli nie uwzględniono podziału na wady izolowane lub mnogie (komentarz w tekście) nieznane (w tym prawdopodobne uwarunkowanie wielogenowe lub wieloczynnikowe) genetyczne, w tym: 2a jednogenowe 2b aberracje chromosomowe środowiskowe (w tym choroby matki, leki, infekcje, substancje chemiczne, hipertermia, czynniki mechaniczne) 70% 20% 15% 5% 10% Zgodnie z danymi PRWWR dotyczącymi obszaru 13 województw Polski w latach , częstość występowania wszystkich dużych wad rozwojowych wynosiła 200,1 na urodzeń, co oznacza, że w Polsce rodzi się rocznie ponad 7000 dzieci z co najmniej jedną poważną wadą rozwojową. Wśród najczęściej występujących wad wrodzonych wymienia się wady serca (74,4 na żywo urodzonych noworodków), nieco rzadziej rozszczep wargi i/lub podniebienia (15,6 na ) oraz wady cewy nerwowej (8,1 na ). Poważne skutki kliniczne większości wad wrodzonych powodują, że stanowią one obecnie jedną z najczęstszych przyczyn hospitalizacji oraz główną przyczynę śmiertelności u 20% noworodków i niemowląt [4]. W roku 2004 w USA hospitalizacje osób we wszystkich grupach wiekowych z powodu wad rozwojowych były średnio o 1,4 dnia dłuższe (6,3 vs. 4,9) i o ponad $ droższe ( $ vs $) w porównaniu z wszystkimi pobytami szpitalnymi w danym okresie [5]. Poza aspektem medycznym i społecznym, jaki niesie ze sobą urodzenie dziecka z wadą/wadami rozwojowymi, należy zwrócić uwagę na często bardzo dramatyczny wymiar rodzinny tego problemu. Rodzice chorego dziecka nie tylko pragną ustalić optymalny sposób postępowania terapeutycznego, ale także poznać przyczynę wystąpienia wady oraz ryzyko jej powtórzenia w przypadku kolejnej ciąży. Tymczasem, jak wykazują badania, nawet u około połowy chorych etiopatogeneza stwierdzanych defektów rozwojowych pozostaje nieznana. Z badań epidemiologicznych wynika także, że około 10-15% płodów dotkniętych jest pojedynczą lub mnogą wadą wrodzoną, podczas gdy częstość ich występowania u żywo urodzonych noworodków wynosi 2-3%. Świadczy to o tym, że wiele spośród tych wad ma charakter letalny, czyli skutkuje zgonem dziecka w okresie okołoporodowym zanim zostanie ustalone rozpoznanie choroby. Bywa, że rodzina, której ten problem dotyczy, nigdy nie uzyskuje wiarygodnej, zależnej od właściwego rozpoznania choroby, porady genetycznej. W tym kontekście szczególne znaczenie ma znajomość nie tylko etiologii wad wrodzonych, ale również współczesnych możliwości wykorzystania różnych metod diagnostyki cytogenetyczno-molekularnej. Ze względu na fakt, iż to najczęściej neonatolodzy lub pediatrzy inicjują opiekę nad rodzinami ryzyka genetycznego, powinni oni mieć świadomość złożonych i nierzadko trudnych aspektów poradnictwa genetycznego w tych rodzinach. Dotyczy to w szczególności wyboru właściwych, czyli umożliwiających weryfikację rozpoznania klinicznego, badań cytogenetycznych i molekularnych, a w dalszej kolejności umiejętności interpretacji uzyskanych wyników oraz udzielenia wiarygodnej porady genetycznej. Celem niniejszej pracy jest przybliżenie aktualnego stanu wiedzy o nowoczesnych technikach cytogenetyki molekularnej, które znajdują zastosowanie w diagnostyce noworodka lub dziecka z wadą (-ami) rozwojową (-ymi). Rola cytogenetyki klasycznej w diagnostyce przyczyn wad rozwojowych Aberracje chromosomowe stwierdza się u około 0,9% żywo urodzonych noworodków. W okresie płodowym występują one jednak znacząco częściej (50-60%), o czym świadczą wyniki badań kariotypu płodów z poronień samoistnych [6]. Najczęstszą przyczyną wczesnych (tj. w I trymestrze ciąży) poronień samoistnych jest w takich przypadkach występowanie u płodu dużej wady / mnogich wad rozwojowych uniemożliwiającej(-ych) jego dalsze przeżycie. Istotny udział w tej patologii mają liczbowe i strukturalne aberracje chromosomowe powodujące brak lub zaburzenie funkcji genów znajdujących się w odpowiednich regionach chromosomów. Prowadzi to w konsekwencji do ujawnienia tzw. fenotypu chromosomowego pod postacią wad wrodzonych, cech dysmorficznych oraz opóźnienia rozwoju psychoruchowego. Klasyczne techniki cytogenetyczne polegają na analizie obrazu prążkowego chromosomów, uzyskiwanego dzięki zastosowaniu specjalnych technik barwienia. Każda para chromosomów ma specyficzny, charakterystyczny dla siebie, układ poprzecznych prążków, różniących się

3 110 K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak wielkością i intensywnością zabarwienia. Liczba uzyskanych w standardowym badaniu kariotypu prążków (zazwyczaj w haploidalnym zestawie chromosomów) decyduje o czułości badania i w efekcie o wielkości rozpoznawanych aberracji. W praktyce oznacza to możliwość identyfikacji zmian o wielkości nie mniejszej niż 5 milionów par zasad (Mpz). Niekiedy, przy zastosowaniu technik o wysokiej rozdzielczości (HRT, z ang. High Resolution Techniques), przy uzyskiwanej liczbie prążków, można wykazać obecność rearanżacji o wielkości do około 3 Mpz. Szacuje się, że tradycyjne techniki cytogenetyczne umożliwiają identyfikację przyczyny zaburzeń u około 3-4% chorych wykazujących cechy niepełnosprawności intelektualnej, wady rozwojowe oraz dysmorfię w budowie ciała. Nowoczesne techniki cytogenetyki molekularnej i ich aplikacje kliniczne W latach 80. ubiegłego wieku powstała nowa gałąź cytogenetyki klinicznej cytogenetyka molekularna. Wykorzystuje ona osiągnięcia biologii molekularnej, takie jak klonowanie i automatyczne powielanie sklonowanych fragmentów DNA metodą PCR. Uzyskane w ten sposób określone sekwencje DNA wykorzystywane są jako sondy molekularne komplementarne do odpowiednich regionów chromosomów, co stanowi podstawę techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH, z ang. Fluorescence In Situ Hybridization) [7]. Technika FISH znajduje zastosowanie w przypadkach klinicznego podejrzenia określonego zespołu genetycznego uwarunkowanego niewidocznymi w rutynowym badaniu cytogenetycznym submikroskopowymi aberracjami, takimi jak mikrodelecje lub mikroduplikacje. Nowocześniejszą alternatywą dla FISH jest technika multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligazy (MLPA, z ang. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) oraz porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH, z ang. Comparative Genomie Hybridization) [8, 9]. Metodę MLPA wykorzystuje się obecnie głównie do identyfikacji zmian w obrębie końców chromosomów (tzw. aberracji subtelomerowych) oraz znanych zespołów mikrodelecyjnych. Jest to technika charakteryzująca się dużą wydajnością wyrażoną liczbą analizowanych w jednym badaniu regionów chromosomowych (do 48 loci genowych), a także przystępną ceną. Zdecydowanie szersze zastosowanie ma technika CGH, umożliwiająca analizę całego genomu z praktycznie nieograniczoną rozdzielczością. W tabeli 2 porównano różne techniki cytogenetyczno-molekularne stosowane obecnie w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych. Technika FISH w praktyce klinicznej W technice FISH stosuje się różnego typu sondy molekularne, których wybór zależy od wymagającego wyjaśnienia problemu diagnostycznego. Z punktu widzenia zarów- Tabela 2. Techniki cytogenetyczne i cytogenetyczno-molekularne stosowane w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych (uwzględniono rozdzielczość wyrażoną w milionach lub tysiącach par zasad) Technika Analiza kariotypu (do 550 prążków) Analiza kariotypu metodą HRT (do 800 prążków) Metoda HR-CGH Metoda FISH Metoda MLPA subtelomerowe acgh z sondami BAC acgh z sondami oligonukleotydowymi Mpz milion par zasad; Kpz tysiąc par zasad Rozdzielczość >5 Mpz >3 Mpz >3 Mpz >0,04-0,25 Mpz śr. 40 Kpz >1 Mpz >0,001 Mpz (śr Kpz) Tabela 3. Wybrane aberracje submikroskopowe z towarzyszącymi wadami rozwojowymi identyfikowane przy użyciu techniki FISH a) zespół Williamsa del 7q11.23 b) zespół Beckwitha-Wiedemanna del 11p15 c) zespół Millera-Diekera del 17p13.3 d) zespół DiGeorge a del 22q11.2 e) zespół monosomii 1p36 del 1p36 f) zespół kociego krzyku del 5p g) zespół Smitha-Magenis del 17p11.2 h) zespół Wolfa-Hirschhorna del 4p i) zespół Pradera-Williego/Angelmana del 15q11-13 równo klinicznego, jak i cytogenetycznego, istotne jest wyróżnienie tzw. sond locus-specyficznych (celowanych na określone miejsce chromosomu), centromerowych oraz malujących. Należy podkreślić, że niezbędnym warunkiem użycia sond hybrydyzujących do określonego fragmentu chromosomu jest uprzednie sformułowanie klinicznego podejrzenia obecności aberracji tego regionu. Zastosowanie sond locus-specyficznych w diagnostyce przyczyn wad wrodzonych umożliwiło identyfikację szeregu nowych zespołów mikrodelecyjnych/mikroduplikacyjnych, a więc takich, w których defekt ma zwykle charakter submikroskopowy, tzn. nie jest widoczny przy stopniu rozdzielczości obrazu prążkowego chromosomów możliwym do uzyskania w rutynowej ocenie kariotypu. Wybrane, częściej występujące, zespoły mikrodelecyjne/mikroduplikacyjne o znanym fenotypie przedstawiono w tabeli 3. Choć niektóre z przedstawionych aberracji mogą być identyfikowane rutynowymi metodami badaniu kariotypu, wielkość zmiany może być na tyle mała, że dopiero zastosowanie techniki FISH umożliwia ostateczne potwierdzenie lub wykluczenie rozpoznania klinicznego. Zarówno z punktu naukowego, jak i klinicznego istotne jest także wykorzystanie metody FISH w celu określenia minimalnej

4 Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych 111 wielkości tzw. regionu krytycznego warunkującego określony zespół kliniczny. Umożliwia to zawężenie badanego regionu do zaledwie kilku-kilkunastu genów, wyodrębnienie tzw. genów kandydujących, odpowiedzialnych za ekspresję określonych objawów klinicznych oraz dokonanie oceny korelacji genotypowo-fenotypowej. W kontekście konieczności sformułowania rozpoznania klinicznego oraz wskazania określonego regionu w genomie, w którym spodziewamy się aberracji, szczególnie ważna jest prawidłowa ocena kliniczna chorego. Uwzględniać ona powinna specyfikę określonych wad występujących w różnych zespołach mikrodelecyjnych, np. wady stożka tętniczego w mikrodelecji 22q11.2, nadzastawkowe zwężenie aorty w mikrodelecji 7q11.23, otwór w przegrodzie międzyprzedsionkowej lub międzykomorowej w mikrodelecji 4p (zespół Wolfa-Hirschhorna). Znajomość specyfiki obrazu klinicznego poszczególnych zespołów mikrodelecyjnych, w tym współistniejących cech dysmorficznych oraz fenotypu behawioralnego, stanowi jeden z warunków określających skuteczność techniki FISH dla weryfikacji rozpoznania. Sondy locus-swoiste stosowane są także w celu identyfikacji aberracji w regionach subtelomerowych chromosomów. Używa się w tym celu zestawu 48 sond molekularnych specyficznych dla końcowych fragmentów chromosomów, których rearanżacje są trudne do uwidocznienia w rutynowym badaniu kariotypu. Wykorzystanie sond subtelomerowych umożliwiło m.in. identyfikację i/lub scharakteryzowanie szeregu nowych zespołów mikrodelecyjnych, w tym zespołu monosomii fragmentu krótkiego ramienia chromosomu 1 pary (del1p36), monosomii fragmentu długiego ramienia chromosomu 2 pary (del2q37) oraz monosomii fragmentu długiego ramienia chromosomu 22 pary (del22q13). Przyczyniło się również do wykrycia submikroskopowych, często o charakterze rodzinnym, rearanżacji strukturalnych w regionach subtelomerowych, m.in. translokacji (przemieszczeń materiału genetycznego pomiędzy chromosomami) lub inwersji (odwrócenia fragmentu chromosomu). Według danych z piśmiennictwa medycznego, u 6% nosicieli zrównoważonych aberracji chromosomowych za patologię kliniczną odpowiadają submikroskopowe aberracje w punktach złamań chromosomów lub zaburzenie funkcji genu (-ów) w regionie złamania [10]. Do zaburzenia funkcji genu dochodzi w mechanizmie przerwania genu lub jego sekwencji regulatorowej (tzw. efekt pozycji) lub wskutek ujawnienia fenotypu choroby autosomalnej recesywnej (defekt także na chromosomie homologicznym niezaangażowanym w translokację). Ocenia się, iż z pomocą techniki FISH z sondami subtelomerowymi możliwa jest identyfikacja przyczyny zaburzeń u około 5-6% chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi, cechami dysmorfii w budowie oraz prawidłowym wynikiem analizy kariotypu [11]. Opracowano nawet szczegółowe, wyrażone w skali punktowej, kryteria kwalifikacji chorych do badań [12]. Uwzględniają one wywiad rodzinny niepełnosprawności intelektualnej, pre- i postnatalne zaburzenia wzrastania, obecność wad rozwojowych oraz cech dysmorfii w budowie. Obecnie technika FISH w diagnostyce aberracji subtelomerowych została zastąpiona nowszymi technikami cytogenetyczno-molekularnymi, tzw. MLPA subtelomerowym (omówione w dalszej części pracy) oraz CGH do mikromacierzy. W odróżnieniu od FISH z sondami locus-swoistymi, sondy centromerowe wykorzystywane są głównie do identyfikacji aberracji liczbowych chromosomów oraz tzw. chromosomów markerowych. Spośród zastosowań FISH z sondami centromerowymi w cytogenetyce klinicznej, szczególnie istotne było opracowanie szybkich testów w diagnostyce pre- i postnatalnej częściej występujących zespołów aneuploidii chromosomów 13, 18, 21 pary oraz X i Y, ze względu na towarzyszące tym zespołom wady rozwojowe. Otrzymanie wyniku badania już po godzinach jest możliwe dzięki zastosowaniu FISH w niedzielących się komórkach interfazowych. W praktyce, szybkie testy FISH z powodzeniem wykorzystuje się głównie w diagnostyce prenatalnej, przy czym czułość i specyficzność badania są zbliżone do uzyskiwanych innymi technikami [13]. Wadą tych metod jest jednak istotny odsetek wyników fałszywie ujemnych w porównaniu z rutynowym badaniem kariotypu (około 1 na 100 niezidentyfikowanych techniką FISH aberracji w amniocytach oraz około 1 na 40 w komórkach trofoblastu) [14]. Należy także pamiętać, iż badanie techniką FISH w komórkach interfazowych jest badaniem celowanym, czyli dotyczy identyfikacji tylko aneuploidii określonych chromosomów. Nie wyklucza zatem obecności innych aberracji chromosomowych w badanym materiale. W praktyce, w ramach diagnostyki prenatalnej zaleca się zatem stosowanie techniki FISH z jednoczasową oceną standardowego kariotypu [14]. Powyższa wskazówka dotyczy także metody ilościowego fluorescencyjnego PCR (QF-PCR, z ang. Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction), która w wielu ośrodkach z powodzeniem zastąpiła FISH interfazową. Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ występuje w różnych modyfikacjach, spośród których najbardziej znane są metody wielobarwnej oceny chromosomów (m.in. M-FISH oraz SKY) wykorzystujące tzw. sondy malujące. Ich podstawową zaletą jest identyfikacja wszystkich chromosomów podczas jednej hybrydyzacji, co czyni je szczególnie przydatnymi w charakterystyce nadliczbowych chromosomów markerowych, dodatkowego materiału genetycznego (addycji) oraz translokacji [7]. Zastosowanie sond malujących umożliwia m.in. szybką weryfikację pochodzenia chromosomu markerowego i określenie jego znaczenia klinicznego w świetle opisywanych u dziecka cech fenotypowych lub, w ramach diagnostyki prenatalnej, w sytuacji identyfikacji chromosomu markerowego u płodu. Ostateczna charakterystyka chromosomu

5 112 K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak markerowego z użyciem sond malujących często umożliwia prognozowanie przebiegu choroby oraz udzielenie w rodzinie ryzyka genetycznego wiarygodnej porady genetycznej. Jest to szczególnie istotne w przypadku identyfikacji chromosomu markerowego w diagnostyce prenatalnej. Dla celów poradnictwa genetycznego ważne jest wówczas, oprócz szczegółowej charakterystyki cytogenetyczno-molekularnej chromosomu markerowego, potwierdzenie lub wykluczenie jego obecności u obojga rodziców oraz znajomość jego skutków klinicznych. Zastosowanie techniki MLPA w diagnostyce cytogenetycznej Metoda MLPA (z ang. Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) umożliwia szybką diagnostykę submikroskopowych aberracji chromosomowych ograniczoną jedynie liczbą zastosowanych sond w jednym badaniu. W MLPA zhybrydyzowane do DNA sondy oligonukleotydowe są następnie łączone przez ligazę i powielane w reakcji PCR z odpowiednimi starterami. Liczba produktów takiej reakcji jest proporcjonalna do liczby kopii badanej sekwencji DNA. Niewątpliwą zaletą MLPA jest względna prostota wykonania, niska cena oraz mała ilość DNA potrzebna do badania. Potencjalne zastosowanie techniki MLPA może być bardzo szerokie. Umożliwia ona diagnostykę zespołów mikrodelecyjnych (w tym mikrodelecji / mikroduplikacji w regionach subtelomerowych) oraz, ostatnio, szybką diagnostykę aneuploidii chromosomowych. Najszersze wykorzystanie znalazła ta metoda w diagnostyce submikroskopowych aberracji subtelomerowych stanowiąc alternatywę dla bardziej czaso- i pracochłonnej techniki FISH. Aplikacja techniki MLPA w grupie chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi, cechami dysmorfii oraz prawidłowym wynikiem badania kariotypu umożliwia ustalenie rozpoznania dodatkowo u 2-6% pacjentów przy jednoczesnej wysokiej czułości i specyficzności metody [8]. Udowodniono także skuteczność techniki MLPA w diagnostyce znanych zespołów mikrodelecyjnych, takich jak zespół delecji 1p36, zespół Williamsa, DiGeorge a, Sotosa lub Millera-Diekera poprzez porównanie metody z badaniem FISH i wykazanie pełnej zgodności obu technik [15]. Istotną modyfikacją techniki MLPA jest tzw. MS-MLPA (z ang. Methylation-Specific) umożliwiające analizę stanu metylacji m.in. w regionie krytycznym zespołów Pradera-Williego i Angelmana [16]. Należy zaznaczyć, że technika MLPA umożliwia badanie w kierunku wielu zespołów genetycznie uwarunkowanych w ramach jednego testu diagnostycznego. Gotowe zestawy sond dostępne są na rynku w cenie konkurencyjnej w porównaniu z FISH. Technika porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) i jej modyfikacje Podstawowe ograniczenie technik FISH oraz w mniejszym stopniu MLPA dotyczy konieczności sformułowania rozpoznania klinicznego konkretnego zespołu genetycznie uwarunkowanego jeszcze przed wdrożeniem procesu diagnostycznego. Tymczasem, zwłaszcza u noworodków lub niemowląt, jest to bardzo trudne ze względu na często mało charakterystyczny obraz kliniczny, niespecyficzne cechy fenotypowe, wspólne dla różnych zespołów genetycznych. Nie bez znaczenia jest ewolucja obrazu klinicznego, co powoduje, że niektóre objawy stają się łatwiejsze do oceny dopiero w późniejszym wieku dziecka [17]. Przełomem w diagnostyce chorób genetycznych, w tym także wad rozwojowych, okazało się zastosowanie techniki porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH). Technika CGH polega na hybrydyzacji dwóch genomowych DNA, badanego i referencyjnego, wyznakowanych fluorescencyjnie i zmieszanych w proporcji 1:1, do prawidłowych chromosomów metafazowych [18]. Inaczej niż w badaniu FISH, badanie metodą CGH umożliwia identyfikację zmian w genomie bez uprzedniej wiedzy (podejrzenia) o ich istnieniu. Porównawcza hybrydyzacja genomowa umożliwia bowiem ocenę wszystkich chromosomów w jednym badaniu. Pod tym względem przypomina ona analizę kariotypu. Podstawowymi zaletami techniki CGH są jednak czas badania, który nie przekracza zwykle kilku dni, oraz, w przypadku najnowszej jej modyfikacji tzw. CGH do mikromacierzy, możliwość identyfikacji niewidocznych w standardowym badaniu cytogenetycznym aberracji submikroskopowych z niespotykaną jak dotąd rozdzielczością sięgającą kilkuset, a w niektórych przypadkach, kilku-kilkunastu par zasad. W cytogenetyce klinicznej, technika CGH znalazła zastosowanie początkowo jako HR-CGH (z ang. High-Resolution CGH). Umożliwiło to badanie genomu z dokładnością do 3 milionów par zasad, co przyczyniło się do identyfikacji submikroskopowych rearanżacji chromosomowych u około 10% chorych z prawidłowym kariotypem oraz obecnością wad wrodzonych i cech niepełnosprawności intelektualnej o nieustalonej etiologii [19]. Dalsze zwiększenie potencjału diagnostycznego osiągnięto poprzez wykorzystanie klonów bakteryjnych zamiast chromosomów metafazowych (tzw. mikromacierze BAC). Umożliwiło to analizę całego genomu w jednym badaniu z rozdzielczością zależną od liczby zastosowanych klonów i odległości między nimi w genomie. Prawdziwie rewolucyjne zmiany przyniosło jednak dopiero zsekwencjonowanie genomu człowieka, a zwłaszcza poznanie zjawiska zmienności liczby kopii sekwencji DNA (z ang. CNV, Copy-Number Variation). Zmienność liczby kopii określonych fragmentów DNA powstaje wskutek różnych rearanżacji DNA, np. delecji lub duplikacji, przy czym niektóre fragmenty DNA (tzw. LCR, z ang. Low- Copy Repeats) są bardziej niż inne podatne na występowanie tego typu rearanżacji chromosomowych [7]. Ocenia się, że CNV w większym stopniu niż zmiany pojedynczych nukleotydów może odgrywać rolę w patogenezie chorób [20]. Odkrycie tzw. wariantów patogennych CNV umożli-

6 Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych 113 wiło skonstruowanie odpowiednich sond oligonukleotydowych i identyfikację wielu niestwierdzanych dotychczas nieprawidłowości, które mogą być odpowiedzialne za patologię kliniczną. Do sond utrwalonych na specjalnych szkiełkach, zwanych mikromacierzami, kompetycyjnie hybrydyzują dwie różne sekwencje genomowego DNA (jedna pochodząca od pacjenta i druga kontrolna), które znakowane są odpowiednimi barwnikami fluorescencyjnymi. Stanowi to podstawę techniki CGH do mikromacierzy (arraycgh, acgh). Badania przeprowadzane z zastosowaniem metody acgh umożliwiają jednoczesną identyfikację aneuploidii, duplikacji, delecji oraz amplifikacji każdego z reprezentowanych na mikromacierzy loci genowych, z rozdzielczością limitowaną wyłącznie liczbą oraz wielkością sond użytych do konstrukcji mikromacierzy. Technika acgh jest wykorzystywana głównie w diagnostyce klinicznej chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi i dysmorfią. W ostatnio opublikowanej metaanalizie 19 badań wykonanych techniką acgh u około 14 tysięcy chorych z niepełnosprawnością intelektualną, wadami rozwojowymi i prawidłowym wynikiem badania cytogenetycznego zidentyfikowano patogenne CNV u 10% chorych. Należy podkreślić, że wraz ze wzrastającą rozdzielczością stosowanej macierzy zwiększał się odsetek chorych, u których stwierdzano obecność aberracji (do 14% ogółu badanych) [21]. Technikę acgh wykorzystuje się od niedawna także w Polsce, m.in. w Zakładzie Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka. Dotychczasowe wyniki badań wykonanych u 116 chorych z niepełnosprawnością intelektualną i cechami dysmorfii umożliwiły wyjaśnienie przyczyny zaburzenia u 11 pacjentów (11,8%) [19]. O ogromnym potencjale diagnostycznym CGH do mikromacierzy świadczą m.in. wyniki badań z zastosowaniem techniki acgh z sondami subtelomerowymi. Zgodnie z nimi, w grupie ponad 5 tysięcy chorych, zidentyfikowano przyczynę zaburzeń rozwoju u około 3% chorych z prawidłowym kariotypem oraz u około 43% chorych z nieprawidłowym wynikiem badania cytogenetycznego [22]. Metodę CGH do mikromacierzy z powodzeniem wykorzystuje się w celach diagnostycznych u dzieci urodzonych z mnogimi wadami rozwojowymi [23, 21]. Ze względu na fakt krótszej przeżywalności noworodków z wielowodziem, przypuszcza się, że w tej grupie pacjentów rearanżacje genomowe identyfikowane technikami submikroskopowymi występują istotnie częściej niż u dzieci lub osób dorosłych. Jednocześnie, z uwagi na niedostateczną możliwość pełnej oceny potencjału poznawczego noworodka, często jedynym objawem przemawiającym za występowaniem zaburzenia rozwojowego jest obecność wady/wad wrodzonych. W największej opublikowanej jak dotąd z wykorzystaniem techniki acgh pracy badawczej w takiej grupie chorych, spośród 179 noworodków z rozpoznaniem wielowadzia z/bez innych problemów medycznych, patogenne rearanżacje chromosomowe wykryto u 18% chorych [17]. U noworodków z wielowadziem z towarzyszącymi cechami dysmorfii w budowie odsetek ten wynosił aż 27%. W badanych rodzinach stwierdzono zarówno znane zespoły mikrodelecyjne (m.in. mikrodelecję regionu krytycznego zespołu DiGeorge a), jak i nowe, dotychczas nieopisywane w piśmiennictwie, rearanżacje o nieznanych skutkach fenotypowych [24]. Wśród nich były także aberracje występujące w formie mozaikowej, które nie zostały zidentyfikowane przy zastosowaniu konwencjonalnych metod oceny kariotypu [25]. Z badań Lu i wsp. wynika, że wykorzystanie mikromacierzy nowszej generacji przekładało się na lepszą wartość diagnostyczną. Technika acgh o wysokiej rozdzielczości staje się atrakcyjnym narzędziem badawczym w diagnostyce przyczyn specyficznych, izolowanych wad rozwojowych, np. wady serca lub wady rozszczepowej wargi i podniebienia bez towarzyszącej dysmorfii i/lub cech opóźnienia rozwoju. Chociaż, zważywszy na prawdopodobny wieloczynnikowy model uwarunkowania tych defektów, badania cytogenetyczne wykonywane są w tych przypadkach niezwykle rzadko, to jednak zastosowanie tej techniki może ujawnić obecność bardzo niewielkich rearanżacji obejmujących nierzadko pojedyncze geny, prowadząc do braku lub zaburzenia ich funkcji [26]. W największej jak dotąd pracy badawczej z zastosowaniem acgh, Erdogan i wsp. w grupie 105 dzieci z izolowaną wadą serca zidentyfikowali 18 zmian patogennych [27]. Przyczyniło się to do lepszego poznania etiopatogenezy wady i pośrednio umożliwiło wytypowanie nowych genów kandydujących, których defekty przyczyniają się do jej powstania. Na zakończenie, należy podkreślić, że, podobnie jak każda technika diagnostyczna, porównawcza hybrydyzacja genomowa posiada istotne ograniczenia. Podstawową wadą CGH jest niemożność identyfikacji w badaniu translokacji zrównoważonych lub inwersji, czyli takich aberracji chromosomowych, które nie wiążą się z utratą lub nadmiarem dodatkowego materiału genetycznego. Lekarz interpretujący wynik badania diagnostycznego z użyciem CGH musi także mieć świadomość, że zidentyfikowana zmiana może być zmianą niepatogenną w odniesieniu do obecnych u pacjenta objawów. Dotyczy to zwłaszcza sytuacji, gdy zmiana jest mała (poniżej 1 miliona par zasad), ta sama aberracja identyfikowana jest u niewykazującego objawów klinicznych członka rodziny lub jest zmianą łagodną stwierdzaną w populacji osób zdrowych (polimorfizm). Faktycznie, interpretacja każdego nieprawidłowego wyniku badania metodą CGH stanowi w obecnych czasach wyzwanie zarówno dla wykonującego badanie cytogenetyka, jak i dla lekarza klinicysty. Algorytm postępowania diagnostycznego w przypadku stwierdzenia dużej wady rozwojowej lub zespołu mnogich wad wrodzonych (ryc. 1) Proponowany poniżej sposób postępowania diagnostycznego dotyczy chorych w różnym wieku, jednak naj-

7 114 K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak Ryc. 1. Algorytm postępowania diagnostycznego w przypadku stwierdzenia izolowanej wady rozwojowej oraz mnogich wad wrodzonych u noworodka lub dziecka częściej noworodków/niemowląt, u których stwierdza się dużą wadę rozwojową. Zasadniczym czynnikiem prognostycznym w takich przypadkach jest, poza małą masą ciała przy urodzeniu, współwystępowanie innych wad rozwojowych. Zarówno w wielowadziu, jak i w wadach izolowanych, kluczowym elementem badania chorego dziecka jest, poza wywiadem i analizą rodowodu, ocena rozwoju psychoruchowego oraz współistniejących cech dysmorficznych. Wynik tej oceny stanowi podstawę do wstępnego zakwalifikowania chorego do dalszych badań diagnostycznych mających na celu identyfikację określonej aberracji chromosomowej (badanie kariotypu lub techniką FISH) lub zespołu monogenowego. U wielu chorych z opóźnieniem rozwoju psychoruchowego i/lub cechami dysmorfii nie udaje się jednak sformułować rozpoznania znanej, uwarunkowanej genetycznie choroby. Nieocenioną wartość diagnostyczną mają wówczas nowoczesne techniki cytogenetyki klinicznej, zwłaszcza CGH do mikromacierzy. Proces diagnostyczny powinien być zakończony udzieleniem rodzinie chorego dziecka w pełni wiarygodnej porady genetycznej. Warto jednak podkreślić, że równie ważna, co zastosowanie szerokiego wachlarza badań diagnostycznych, jest rzetelna i długookresowa obserwacja kliniczna w warunkach poradni genetycznej lub gabinetu lekarza pediatry. Podsumowanie W obecnej dekadzie obserwujemy niezwykle dynamiczny postęp w zakresie rozwoju nowych metod identyfikacji aberracji chromosomowych jako przyczyny wad

8 Zastosowanie nowoczesnych technik cytogenetyki molekularnej w diagnostyce wrodzonych wad rozwojowych 115 wrodzonych oraz opóźnienia rozwoju psychoruchowego. Powoduje to, iż coraz częściej rozpoznawane są aberracje u chorych, u których sformułowanie rozpoznania konkretnej choroby genetycznie uwarunkowanej było dotychczas niemożliwe. Przełomem w cytogenetyce klinicznej stało się zwłaszcza wprowadzenie porównawczej hybrydyzacji genomowej do mikromacierzy do diagnostyki przyczyn niepełnosprawności intelektualnej ze współistniejącymi wadami rozwojowymi. W aspekcie praktycznym przekłada się to na istotnie lepszą opiekę nad chorymi, w tym zaplanowanie odpowiedniego postępowania terapeutycznego, oraz poradnictwo genetyczne. Coraz szersza wiedza o skutkach klinicznych określonej aberracji chromosomowej umożliwia także prognozowanie przebiegu choroby, co ma istotne znaczenie dla rodziny chorej osoby ale również, poprzez fakt lepszego ukierunkowania opieki, znacznie ogranicza jej koszty. Poza znaczeniem nowej techniki w diagnostyce przyczyn wystąpienia wielowadzia, metoda acgh umożliwia dokonanie próby korelacji fenotypowogenotypowej, a zatem identyfikację lub poszerzenie istniejącej wiedzy o nowych zespołach mikrodelecyjnych/ mikroduplikacyjnych oraz o roli określonych genów dla prawidłowego rozwoju człowieka. Naturalny postęp w dziedzinie nowoczesnych technik cytogenetyczno-molekularnych, wyrażony coraz większą liczbą stosowanych sond molekularnych, a zatem coraz gęstszym pokryciem genomu, budzi nadzieje na przyszłość. Warto jednak na koniec przypomnieć, że zarówno w przeszłości, jak i obecnie, nie dysponujemy jednym uniwersalnym badaniem diagnostycznym umożliwiającym rozpoznanie wszystkich zespołów genetycznie uwarunkowanych, w tym zespołów z towarzyszącymi wrodzonymi wadami rozwojowymi uwarunkowanych obecnością mutacji genowych. W ocenie wskazań do badań genetycznych należy więc najczęściej nadal polegać na wiedzy i doświadczeniu lekarzy różnych specjalności, w tym pediatrów, neonatologów i genetyków klinicznych, pełniących opiekę nad osobami chorymi i ich rodzinami. Podziękowanie Autorzy dziękują prof. Ewie Bocian za cenne uwagi w trakcie przygotowywania pracy. Piśmiennictwo [1] Latos-Bieleńska A. (1998) Polski Rejestr Wrodzonych Wad Rozwojowych. Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań. [2] Korniszewski L. (2005) Typy wad wrodzonych. W: Dziecko z zespołem wad wrodzonych, red. Korniszewski L. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa. [3] Zespół Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych. (2008) Wstęp. [w:] Wrodzone wady rozwojowe w Polsce w latach Dane z Polskiego Rejestru Wrodzonych Wad Rozwojowych, red. Latos-Bieleńska A., Materna-Kiryluk A. Ośrodek Wydawnictw Naukowych, Poznań. [4] Kalter H., Warkany J. (1983) Congenital malformations (second of two parts). N. Engl. J. Med. 308: [5] HCUP Statistical Brief #24 (2004) Hospitalizations for Birth Defects. ( statbriefs/ sb24.jsp) [6] Thompson J.S., McInness R.R., Willard H.F. (1991) Genetics in medicine. WB Saunders Company, London. [7] Nowakowska B., Bocian E. (2004) Cytogenetyka molekularna techniki badawcze i ich zastosowanie w diagnostyce klinicznej. Med. W. Rozw. tom VIII, część 1: [8] Ahn J.W., Ogilvie C.M., Welch A. et al. (2007) Detection of subtelomere imbalance using MLPA: validation, development of an analysis protocol, and application in a diagnostic centre. BMC Med. Genet. 8: 9. [9] Shinawi M., Cheung S.W. (2008) The array CGH and its clinical applications. Drug Discov. Today 13: [10] Warburton D. (1991) De novo balanced chromosome rearrangements and extra marker chromosomes identified at prenatal diagnosis: clinical significance and distribution of breakpoints. Am. J. Hum. Genet. 49: [11] De Vries B.B.A., Winter R., Schinzel A., van Rawenswaaij- Arts C. (2003) Telomeres: a diagnosis at the end of the chromosomes. J. Med. Genet. 40: [12] De Vries B.B.A., White S.M., Knight S.J. et al. (2001) Clinical studies on submicroscopic subtelomeric rearrangements: a checklist. J. Med. Genet. 38: [13] Weremowicz S., Sandstrom D.J., Morton C.C. et al. (2001) Fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid detection of aneuploidy: experience in 911 prenatal cases. Prenat. Diagn. 21: [14] Caine A., Maltby A.E., Patkin C.A. et al. (2005) Prenatal detection of Down syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, and 21 by FISH or PCR without a full karyotype: a cytogenetic risk assessment. Lancet 366: [15] Cho E.H., Park B.Y., Cho J.H., Kang Y.S. (2009) Comparing two diagnostic laboratory tests for several microdeletion causing mental retardation syndromes: multiplex ligation-dependent probe amplification vs. fluorescent in situ hybridization. Korean J. Lab. Med. 29: [16] Nygren A.O.H., Ameziane N., Duarte H.M.B. et al. (2005) Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number chan ges of up to 40 sequences. Nucleic Acids Res. 33: e128. [17] Lu X.Y., Phung M.T., Shaw C.A. et al. (2008) Genomic imbalance in neonates with birth defects: high detection rates by using chromosomal microarray analysis. Pediatrics 122: [18] Kallioniemi A., Kallioniemi O.-P., Sudar D. et al. (1992) Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 258: [19] Nowakowska B., Stankiewicz P., Obersztyn E. et al. (2008) Application of metaphase HR-CGH and targeted chromosomal microarray analyses to genomic characterisation of 116 patients with mental retardation and dysmorphic features. Am. J. Med. Genet. (A) 146: [20] Menten B., Maas N., Thienpont B. et al. (2006) Emerging patterns of cryptic chromosomal imbalances in patients with idiopathic mental retardation and multiple congenital anomalies: a new series of 140 patients and review of the literature. J. Med. Genet. 43: [21] Sagoo G., Butterworth A., Sanderson S. et al. (2009) Array CGH in patients with learning disability (mental retardation) and congenital anomalies: updated systematic review and meta-analysis of 19 studies and 13,926 subjects. Genet. Med. 11: [22] Shao L., Shaw C.A., Lu X.Y., Sahoo T. et al. (2008) Identification of chromosome abnormalities in subtelomeric regions by microarray analysis: a study of 5,380 cases, Am. J. Med. Genet. (A) 146:

9 116 K. Szczałuba, E. Obersztyn, T. Mazurczak [23] Ming J., Geiger E., James A. et al. (2006) Rapid detection of submicroscopic chromosomal rearrangements in children with multiple congenital anomalies using high density oligonucleotide arrays. Hum. Mutat. 27: [24] Slavotinek A. (2008) Novel microdeletion syndromes detected by chromosome microarrays. Hum. Genet. 124: [25] Cheung S., Shaw C., Scott D. et al. (2007) Microarray-based CGH detects chromosomal mosaicism not revealed by conventional cytogenetics. Am. J. Med. Genet. (A) 143: [26] Vissers L., Veltman J., van Kessel A., Brunner H.G. (2005) Identification of disease genes by whole genome CGH arrays. Hum. Mol. Genet. 14: R215-R223. [27] Erdogan F, Larsen L, Zhang L et al. (2008) High frequency of submicroscopic aberrations detected by tiling path array comparative genome hybridisation in patients with isolated congenital heart disease. J. Med. Genet. 45: [28] Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Birth Defects. March 11, 2009 J Krzysztof Szczałuba Zakład Genetyki Medycznej, Instytut Matki i Dziecka w Warszawie Warszawa, ul. Kasprzaka 17A krzysztof.szczaluba@imid.med.pl Application of novel molecular cytogenetics techniques in the diagnostics of congenital birth defects Genetic factors, including chromosomal aberrations, significantly contribute to pathogenesis of birth defects. Until recently their recognition was possible merely by the use of routine cytogenetic techniques such as chromosome banding. In the light of well documented novel diagnostic techniques, such as fluorescent in situ hybridization (FISH), MLPA or the latest method of array comparative genomic hybridization (acgh), it is reasonable to assume that submicroscopic chromosomal rearrangements in the form of microdeletions and microduplications play a significant role in ethiopathogenesis of congenital birth defects. In the majority of sick children, including neonates, the causes of their birth defects, not reflecting phenotypically a known genetic syndrome, remain obscure. Many such abnormalities, especially if multiple, would be lethal, leading to early deaths, not infrequently before the diagnostic process has ever begun. In this work, current knowledge about application of novel molecular cytogenetics techniques in the identification of causes of congenital birth defects has been presented. A diagnostic algorithm in the case of recognition of a major birth defect or multiple defects in the neonate has been suggested. Key words: congenital birth defect, chromosomal aberration, FISH, MLPA, CGH