Kriogeniczne przechowywanie zasobów genowych w Leśnym Banku Genów Kostrzyca

Transkrypt

1 Kriogeniczne przechowywanie zasobów genowych w Leśnym Banku Genów Kostrzyca Cryopreservation of genetic resources in The Kostrzyca Forest Gene Bank (Poland) Paweł Chmielarz, Marcin Michalak, Małgorzata Pałucka, Paulina Hrydziuszko, Urszula Wasileńczyk, Agata Szymkowska Instytut Dendrologii PAN w Kórniku Leśny Bank Genów Kostrzyca, czerwca 2015 r.

2 Początek lat 90-tych zajmie się pan kriokonserwacją Prof. B. Suszka Od lewej: T. Tylkowski, B. Bujarska-Borkowska, P. Chmielarz, E. Drzewiecka, D. Nowak, S. Pieniężny, T. Woźniak, A. Firgut

3 Grant z Dyrekcji Generalnej LP Profesora Suszki umożliwił rozpoczęcie badań 1992 r. Badania nad kriokonserwacją w Kórniku (Research on cryopreservation in Kórnik) Badania w Fort Collins (Research in NCGRP, Fort Collins, CO) Wspólne Badania ID PAN i LBG Kostrzyca , (Joint research ID and LBG Kostrzyca), Pracownia Kriokonserwacji

4 Liczba publikacji dotyczących kriokonserwacji (Number of publications on cryopreservation (ISI Web of Knowledge) - Kriokonserwacja - (cryopreservation) - Krio roślin - (cryo plants) Panis B. 2008

5 >90% gatunków >90% of species Nasiona (wg Robertsa 1973) Charakterystyka nasion orthodox i recalcitrant (Orthodox versus recalcitrant seeds (Roberts, 1973) orthodox recalcitrant 8000 poznanych gatunków 8000 known species opadają suche (wilg %) are shed when dry (seeds moisture content 12-20%) obniżają metabolizm slowed down metabolism tolerują odwodnienie desiccation tolerant tolerują przechowywanie tolerate long-term storage kiełkują po dostarczeniu wody germinate after imbibition opadają wilgotne (wilg %) are shed when moist (seeds moisture content 22-60%) aktywne metabolicznie active metabolism wrażliwe na odwodnienia sensitive to desiccation nie tolerują przechowywania do not tolerate long-term storage kiełkują bez dostarczenia wody z zewnątrz germinate without any external supply of water

6 Nasiona recalcitrant (Avicennia marina) zainfekowane przez Fusarium moniliforme (Recalcitrant seeds infected by fungi during storage) Epifluorescencja dystalnej części końców hypokotylu osi zarodkowej Blue colour hyphae of Fusarium located inside of hypocotyl ANGUELOVA MERHAR V S et al. Ann Bot 2003;92: by Oxford University Press

7 Podział nasion na kategorie Nasiona intermediate (Classification of seeds) grab pospolity (Carpinus betulus) buk zwyczajny (Fagus sylvatica) dąb szypułkowy (Quercus robur) (Avicenia marina) orthodox suborthodox recalcitrant (temperate) recalcitrant (tropical)

8 Od nasion gatunków odpornych na odwodnienie do bardzo wrażliwych (From dehydration-tolerant to very sensitive seeds) Wzrastająca wrażliwość nasion na podsuszenie Increasing desiccation sensitivity to dehydration (continuum) ORTHODOX RECALCITRANT low high Berjak P., Pammenter N., 1999

9 Kriogeniczne przechowywanie zasobów genowych gatunków produkujących nasiona z kategorii recalcitrant (Cryopreservation of genetic resources of species producing recalcitrant seeds)

10 Etapy w procedurze kriokonserwacji (Steps in a cryopreservation protocol) Wycięcie (excision) kroprotekcja (cryoprotection) częściowe podsuszenie (drying) -196 C tajanie i rehydratacja (thawing and rehydration) sterylizacja (sterilization) odtworzenie rośliny (recovery)

11 Nasiona dębu szypułkowego Quercus robur kat. recalcitrant Kriogeniczne przechowywanie osi zarodkowych dębu szypułkowego (Quercus robur) (Cryogenic storage of Q. robur embryonic axes) wrażliwość nasion na temperaturę LN wrażliwość nasion na desykację osie zarodkowe siewki dębu z osi z. po LN hodowla in vitro

12 Kriokonserwacja embriogennego kalusa dębu szypułkowego (Quercus robur L.) (Cryoconservation of Q. robur embryogenic callus) a c b d

13 Najwyższa bezpieczna wilgotność nasion orthodox i suborthodox zamrażanych w LN (High Moisture Freezing limit, HMFL) -LN 1. PODSUSZANIE (Drying) Śm 2 Śm1 100 W 100 W STRATYFIKACJA I KIEŁKOWANIE (Stratification and the germination tests) +LN silica gel C 5. TEST WSCHODZENIA (Seedling emergence Test) 3. TAJANIE (Thawing at 40 C)

14 Modele stratyfikacji, Suszka 2000, 2002; Tylkowski 1991 (Types of stratification) C 20 C 2-4 tyg. 20 C 3 C 20 C 2 tyg. 2 tyg. 3 C 16 tyg. 3 C np.: klon zwyczajny, jawor, buk zwyczajny, jabłoń płonka 14 tyg. grab pospolity, jarząb pospolity 14 tyg. czereśnia ptasia C 8-16 tyg. 3 C 16 tyg. jesion wyniosły, róża dzika, sosna limba, głogi, lipy 5. 15/20 C 24~24 godz. 24 tyg. 3 C 12 tyg. cis pospolity 20/30 C 6. 24~24 godz. 18 tyg. 3 C dereń jadalny, Tylkowski tyg.

15 Cisowa Góra zdolność kiełkowania (germination) A B C cis pospolity Taxus baccata D E F Nasiona dojrzałe (ciemne) C Usunięto nasiona niedojrzałe (zielone) 1,6-16,9% 22,9-31,1% Stratyfikację nasion przeprowadzono w podłożu w temperaturze cyklicznie zmiennej 15~20 C (24+24h) przez 6,5 miesiąca, następnie w 3 C przez okres 4,5 miesiąca, Suszka 1985.

16 Cisowa Góra wschody (seedling emergence) cis pospolity Taxus baccata 3,1-16,9% 22,9-26,9% (Moisture content, %)

17 Wierzchlas zdolność zdolność kiełkowania kiełkowania (germination) cis pospolity Taxus baccata 1,9-17,0% 23-31,1% (Moisture content, %)

18 Wierzchlas Wierzchlas wschody - wschody (seedling emergence) cis pospolity Taxus baccata (Moisture content, %)

19 Bezpieczny zakres wilgotności nasion z kategorii orthodox zamrażanych w ciekłym azocie (BZW) (Safe ranges of moisture content of cryogenically stored orthodox seeds - BZW) Gatunek BZW, % Publikacja: 1. Abies alba (3,3-11,8) Chmielarz P W: Barzdajn W. i Raj A. (red.), s Alnus glutinosa (2,7-19,2) Chmielarz P CryoLetters 31: Alnus incana (3,7-22,6) 4. Betula pendula (2,0-23,2) Chmielarz P., Acta Physiol. Plant. 32: Betula pubescens (2,7-24,6) 6. Carpinus betulus (3,2-16,5) Chmielarz P Seed Sci. Technol. 38: Fagus sylvatica (8,5-13,2) Chmielarz P., ISBN , Poznań: Fraxinus excelsior (7,2-19.5) Chmielarz P Tree Physiol. 29: Larix decidua ( ) 10. Malus sylvestris ( ) 11. Prunus avium (9,0-16,9) Chmielarz P Ann. For. Sci. 66: 405p1-405p Pseudotsuga menziesii (2,2-19,0) 13. Pyrus communis (6,7-20,5) 14. Salix alba (9,5-18,1) 18. Taxus baccata (3,1-16,9) i (22,9-26,9) 19. Tilia cordata (5,2-20,1) Chmielarz P Dendrobiology Vol. 47, Supplement: Ulmus glabra (3,3-17,7) Chmielarz P Acta Biol. Hungar. 61: Ulmus minor (3,8-20,4) 22. Ulmus laevis (3,3-17,3)

20 Wrażliwość nasion buka na podsuszenie i temperaturę LN (Sensitivity of Fagus sylvatica seeds to desiccation and cryogenic storage, 12 Polish provenances (safe ranges of MC) Pochodzenie Provenance - miejsce zbioru nasion buka zwyczajnego - miejsce zbioru nasion buka zwyczajnego - miejsce zbioru nasion buka zwyczajnego Wilg. kryt. (critical moisture cont.) % Podsuszanie nasion Seed drying NBW, The lowest safe moisture cont. % -196 C Freezing of seeds in LN BZW (Safe range of mc) % Baligród Bardo Śląskie Brzeziny Choczewo Damnica Karnieszewice Krotoszyn Łopuchówko Połczyn Rudy Raciborskie Szczecinek Złotów Średnia (mean) Chmielarz P Bogucki Wydawnictwo Naukowe, ISBN , Poznań, 143 s.

21 Fort Collins, CO

22 Desykacja osi zarodkowych Quercus shumardii, Q. velutina i Q. kelloggii (Drying of embryonic axes) 0,016 g 0,008 g 0,025 g

23 Jak ochronić komórki przed uszkodzeniami? (How to protect cells against damages during cryopreservation, -196 C?) Wilgotność zbyt wysoka MOISTURE CONTENT TOO HIGH Krystalizacja (crystallization) Optymalna wilgotność Optimal moisture content Wilgotność zbyt niska MOISTURE CONTENT TOO LOW Deplazmoliza (deplasmolysis) Temperaturę krystalizacji lodu (DSC - różnicowa kalorymetria skaningowa) Wrażliwość tkanki na desykację (wilgotność krytyczna określona in vitro) Określić optymalną prędkość podsuszania i schładzania tkanki Skuteczność krioprotektantów (PVS2, sacharoza, gliceryna) Temperature of ice crystallization (DSC - differential scanning calorimetry) Desiccation sensitivity (critical tissue moisture content) Optimum desiccation and cooling rate Cryoprotectants (PVS2, sucrose, glicerol)

24 Ciepło zamarzania (heat of freezing) DSC Ukryte ciepło łączenia (heat of fusion) Stan nieuporządkowania cząsteczek H 2 O Stan uporządkowania cząsteczek LÓD (ICE)

25 Energia /sucha masa (mw/mg sm) Krystalizacja lodu w osiach zarodkowych o różnej wilgotności, DSC 2 1,5 Q. kelloggii (Egzoterms - ice crystalization DSC) 2 Wilgotność osi 37% 1,5 Q. macrocarpa Wilgotność osi 34% 1 0, ,5 1 0, ,5 1 0,5 Q. shumardii Q. velutina , ,5 1 0, ,5 1 0,5 Q. robur Q. virginiana Temperatura ( o C) %

26 Określenie poziomu niezamrażalnej wody (DSC) Non-freezable water in embryonic axes ΔH/dw y = mx + b? Wilgotność (moisture content of axes with non-freezable water)

27 Wilgotność osi (%) Moisture content, % Niezamrażalna woda i wilgotność krytyczna w osiach zarodkowych 6 gatunków dębów (Non-freezable water and critical water content in oak embryonic axes) niezamrażalna woda wilgotność krytyczna osi Non - freezable water Critical water content 25 0 KELL SHU VEL MAC ROB VIR Gatunki z rodzaju Quercus Quercus species

28 NCGRP, Fort Collins, CO National Center for Genetic Resources Preservation, Fort Collins, CO

29 Zewnętrzny zbiornik na ciekły azot, Fort Collins (External tank for liquid nitrogen) Pojemność (capacity) 40 tys. L

30 Badania w ramach grantu z DGLP W listopadzie 2005 roku, zaczęła Funkcjonować w LBG Kostrzyca Pracownia Kriokonserwacji (In November Cryopreservation Laboratory was created)

31 W 2006 r. zbiór żołędzi i wstępne przechowanie w -3 C Preliminary storage of acorns at -3 C (for further research cryopreservation of plumules) 3 mm (axis) oś zarodkowa - 0,016 g (acorn) żołądź 9,1 g Zebrano 175 kg żołędzi, z 50 indywidualnych drzew doborowych, wyłączonych drzewostanów nasiennych lub drzewostanów zachowawczych.

32 Powstało laboratorium (Laboratorium was created)

33 Pierwsza dostawa ciekłego azotu (First delivery of liquid nitrogen to the Kostrzyca FGB)

34 oraz fitotron (and phytotron)

35 Izolacja plumul dębu szypułkowego z osi zarodkowych (Isolation of plumules from embryonic axes) 1 mm 3 mm żołędzie osie zarodkowe (embryonic axes) Plumule (plumules)

36 Pierwsze 6 miesięcy KRIO w LBG (First 6 months of research on cryogenic storage in LBG) Skonstruowano: system podsuszania osi zarodkowych oraz plumul w gazowym azocie system szybkiego mrożenia w 210 o C

37 Kriokonserwacja plumul dębu szypułkowego (Quercus robur) (Protocol for cryogenic storage of Q. robur plumules) 1 mm 1 cm żołędzie plumule izolowane z nasion zamrażanie w LN regeneracja roślin in vitro ukorzeniona sadzonka Chmielarz P., Michalak M., Pałucka M., Wasileńczyk U Plant Cell Reports 30:

38 Wyniki wspólnych badań opublikowano w Plant Cell Reports (Results of our joint research were published in PCR)

39 Wzrost plumul dębu szypułkowego po rozmrożeniu z ciekłego azotu Wzrost plumul w kulturach in vitro po rozmrożeniu z LN (Plumules recovered in vitro after cryogenic storage)

40 Pierwsze probówki z plumulami dębu umieszczono w LN (First plumules are stored in liquid nitrogen) P. Chmielarz, P. Hrydziuszko, M. Michalak, M. Pałucka, A. Szymkowska, U. Wasileńczyk

41 Mikrosadzonki wyhodowane w kulturach in vitro z plumul Q. robur, przemrożonych w LN (Plantlets derived from plumules using in vitro culture )

42 Instrukcja kriogenicznego przechowywania dla LBG (Instruction of cryogenic storage) Leśny Bank Genów Kostrzyca Ramowa Instrukcja Gromadzenia i Przechowywania Zasobów Genowych PRZECHOWYWANIE W TEMPERATURACH KRIOGENICZNYCH 2012

43 Pracownia Kriokonserwacji (Cryopreservation Laboratory in LBG Kostrzyca)

44 Zbiorniki do kriogenicznego przechowywania (Cryo-tanks in LBG Kostrzyca)

45 Prunus avium (Cryogenic storage of orthodox seeds)

46 Kriogeniczne przechowywanie gatunków drzewiastych (Cryogenic storage of forest tree species) Zestawienie kriogenicznych zasobów genowych z drzew i krzewów - LBG Kostrzyca czerwiec 2015 r. lp. Nazwa polska Nazwa łacińska Rodzaj materiału tworzącego zasób genowy Ilość zasobów genowych [szt.] Temperatura przechowania [ C] 1 Czereśnia ptasia Prunus avium nasiona Buk zwyczajny Fagus sylvatica nasiona Brzoza brodawkowata Betula pendula nasiona Wiąz górski Ulmus glabra nasiona Wiąz szypułkowy Ulmus laevis nasiona Dąb szypułkowy Quercus robur plumule Dąb bezszypułkowy Quercus petraea plumule Jodła pospolita Abies alba nasiona Grab pospolity Carpinus betulus nasiona Olsza czarna Alnus glutinosa nasiona Lipa drobnolistna Tilia cordata nasiona Jesion wyniosły Fraxinus excelsior skrzydlaki Jesion wyniosły Fraxinus excelsior pąki spoczynkowe Sosna drzewokosa Pinus x rhaetica Brügger nasiona Wierzba lapońska Salix lapponum nasiona RAZEM 580

47 Przechowywane są również nasiona gatunków zielnych (Cryogenic storage of herbaceous species as well)

48 Kriogeniczne przechowywanie gatunków zielnych (Cryogenic storage of herbaceous species) Zestawienie kriogenicznych zasobów genowych z roślin zielnych- LBG Kostrzyca czerwiec 2015 r. lp. Nazwa polska Nazwa łacińska Rodzaj materiału tworzącego zasób genowy Ilość zasobów genowych [szt.] Temperatura przechowania [ C] 1 Biedrzeniec mniejszy skalny Pimpinella saxifraga ssp. rupestris. nasiona Brzoza niska Betula humilis Schrank nasiona Czosnek siatkowaty Allium victorialis L. nasiona Czosnek syberyjski Allium sibiricum L. nasiona Dzwonek karkonoski Campanula bohemica Hruby in Polivka, Domin et Podp nasiona Dzwonek piłkowany Campanula serrata (Kit.) Hendrych nasiona Gęsiówka alpejska Arabis alpina L. nasiona Gnidosz hacqueta Pedicularis hacquetii Graf nasiona Goryczka krzyżowa Gentiana cruciata L. nasiona Goryczuszka czeska Gentianella bohemica Skalický nasiona Goryczuszka polna Gentianella campestris (L.) Börner nasiona Jaskier skalny Ranunculus oreophilus M. Bieb. nasiona Okrzyn jeleni Laserpitium archangelica Wulfen nasiona Ostróżka wyniosła Delphinium elatum L. nasiona Ponikło wielołodygowe Eleocharis multicaulis (Sm.) nasiona Przetacznik alpejski Veronica alpina nasiona Przytulia sudecka Galium sudeticum Tausch nasiona Rogownica alpejska Cerastium alpinum L. nasiona Różeniec górski Rhodiola rosea L. nasiona Rzeżucha gorzka opiza Cardamine amara subsp. opizii (C.Presl & J.Presl ) Celak. nasiona Rzeżucha rezedolistna Cardamine resedifolia L. nasiona Sasanka słowacka Pulsatilla slavica G. Reuss nasiona Sasanka wiosenna Pulsatilla vernalis (L.) Mill. nasiona Skalnica darniowa bazaltowa Saxifraga moschata subsp. basaltica nasiona Skalnica mchowata Saxifraga bryoides L. nasiona Skalnica śnieżna Saxifraga nivalis L. nasiona Starodub łąkowy Angelica palustris (Besser) Hoffm. nasiona Szarota drobna Gnaphalium supinum L. nasiona Świetlik maleńki Euphrasia minima nasiona Tłustosz pospolity Pinguicula vulgaris L. nasiona Turzyca patagońska Carex magellanica Lam. nasiona Warzucha tatrzańska Cochlearia tatrae Borbás nasiona Duplikaty z CZRB PAN w Powsinie nasiona Duplikaty z FlorNatur ROBIA- Rada Ogrodów Botanicznych i Arboretów w Polsce nasiona RAZEM 163

49 Projekty realizowane z udziałem Pracowni Kriokonserwacji (Other projects of cryogenic storage conducted in Kostrzyca FGB) PROJEKTY BADAWCZO-WDROŻENIOWE REALIZOWANE W PRACOWNI KRIOKONSERWACJI lp. Nazwa projektu Akronim Okres realizacji Zachowanie zasobów genowych zagrożonych i ginących gatunków metodami kriogenicznymi w banku genów Zachowanie zasobów genowych drzew i krzewów leśnych metodami kriogenicznymi Ochrona ex situ zagrożonych i chronionych roślin dziko rosnących w zachodniej części Polski Ocena stanu populacji oraz ochrona ex situ wybranych dziko rosnących gatunków roślin rzadkich i zagrożonych na terenie Polski. (Bneficjent: Rada Ogrodów Botanicznych i Arboretów w Polsce (Leśny Bank Genów Kostrzyca uczestniczy w realizacji projektu jako Konsorcjant) Zachowanie różnorodności biologicznej, poprzez ochronę ex situ, jesionu wyniosłego, wiązu górskiego, wiązu pospolitego oraz wiązu szypułkowego na terenie Dolnego Śląska na obszarach Natura 2000 Zachowanie różnorodności biologicznej siedlisk obszarów NATURA 2000, poprzez ochronę ex situ jesionu wyniosłego, wiązu górskiego, wiązu pospolitego oraz wiązu szypułkowego na terenie Polski w trakcie realizacji FlorNaturLBG FlorNaturROBIA FraxUmLBG

50 Pracownia Kriokonserwacji, LBG Kostrzyca Workshop 2012

51 dr Kazimierz Toka Dyrektor Leśnego Banku Genów Kostrzyca (First director of the Kostrzyca Forest Gene Bank) ( )

52 Naczelnik Wojciech Fonder (Head of Faculty of Forestry, General Directorate of State Forests in Warsaw) ( )

53 Professor Patricia Berjak, South Africa

54 Dziękuję za uwagę