Oczyszczanie oligonukleotydów: odsalanie, elektroforeza czy HPLC?

Transkrypt

1 Oczyszczanie oligonukleotydów: odsalanie, elektroforeza czy HPLC? Gdy zamawiamy oligonukleotydy, stajemy przed wyborem metody ich oczyszczenia. Do wyboru zwykle są opcje odsalania i HPLC, chociaż niektóre firmy oferują także mniej wydajną od HPLC chromatografię odwróconej fazy lub sprawdzenie wydajności syntezy poprzez elektroforezę PAGE. Najtańsze jest odsalanie, czy jednak jest ono wystarczające? Którą opcję wobec tego wybrać? Oligonukleotydy są syntezowane automatycznie przez syntetyzery sterowane komputerowo. Nić DNA jest w nich produkowana w kierunku 3 5, każda zasada dołączana jest poprzez serię następujących po sobie reakcji chemicznych. Musimy wiedzieć, że jak to w chemii bywa, żadna synteza nie jest w 100% wydajna. Dlatego otrzymany oligonukleotyd o zadanej długości to tylko jeden z produktów końcowych- synteza powoduje też powstanie niedokończonych, krótszych oligo. Zwykle na każdym etapie przyłączania nukleotydu do rosnącego łańcucha ok. 1% reakcji przebiega nieprawidłowo. W związku z tym produkt syntezy 30-merowego oligonukleotydu w efekcie stanowi mieszaninę poprawnie zsyntezowanych łańcuchów (54%-74%), a resztę stanowią produkty uboczne reakcji : 29-merowe, 28-merowe itd. Im dłuższy łańcuch, tym mniejsza zawartość prawidłowego produktu syntezy. Produkty uboczne reakcji mogą współzawodniczyć z pełnymi oligonukleotydami o matrycę reakcji, obniżając wydajność amplifikacji lub skutkując niespecyficzną amplifikacją. Dlatego właśnie czasami niezbędne jest dobre oczyszczenie

2 oligonukleotydu, jeżeli korzystamy np. z czułych metod allelospecyficznych, albo jeżeli potrzebne nam są sondy molekularne, lub długie oligo (>40pz). Istnieje pięć głównych metody oczyszczania: odsalanie, chromatografia odwróconej fazy ( Cartdridge ), wysokoprężna chromatografia cieczowa (HPLC), oczyszczanie żelowe na akrylamidzie (PAGE), oraz filtracja żelowa * Podczas odsalania roztwór oligonukleotydu jest przepuszczany przez prostą kolumnę chromatograficzną, z której odpłukiwane są sole, natomiast produkty uboczne syntezy nie są usuwane. Odsalanie jest standardowym wyborem dla starterów tradycyjnych PCR, oraz dla większości starterów do reakcji qpcr. * Metoda chromatografii odwróconej fazy w kardridżu wymywa oprócz soli także część produktów niespecyficznych, pozwalając na otrzymanie frakcji ok % żądanego oligonukleotydu. Ustępuje skuteczności HPLC, zapewnia też niższy odzysk oligonukleotydu więc jest dobra tylko dla małych skal syntezy. Metoda nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt). * Wspomniana już wyżej technika HPLC to najwydajniejsza metoda oczyszczania (ale też najdroższa). Pozwala ona na oczyszczenie nawet dużych ilości oligonukleotydów w najwyższej skali syntezy, o dużej czystości (90-97%). Metoda tak jak poprzednia, nie ma zastosowania dla bardzo długich oligo (>50nt). * Rozdział żelowy PAGE jest jedynym skutecznym sposobem oczyszczania długich oligonukleotydów, którym nie podoła HPLC. Pozwala otrzymać bardzo czyste (do 99% czystości) oligonukleotydy, jednakże ma poważną wadę: niski odzysk z żelu znacząco zmniejsza ilość końcową czystego oligo. Tak oczyszcza się aptamery i krótkie konstrukty syntetyczne. * Sączenie żelowe jest metodą z wyboru dla konstruktów zawierających fofotioniany (tzw. s-oligo) w badaniach nad antysensem. Ma także zastosowanie dla wszelkich oligonukleotydów podawanych do hodowli komórkowych, ponieważ zapewnia najlepsze odpłukanie śladowych zanieczyszczeń chemicznych. Filtracja żelowa pozwala podobnie jak PAGE na oczyszczenie dużych fragmentów DNA. Jest wykorzystywana np. podczas oczyszczania sond do techniki FISH, doskonale wymywając niezwiązany z sondą barwnik. Marzena Wojtaszewska

3 Chromatografia czy sączenie żelowe? wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań Źródło: Life Technologies SigmaAldrich Testujemy tanie polimerazy Specjalnie dla Was postanowiliśmy w naszym laboratorium przetestować tanie polimerazy, których cena wynosi około 50 groszy za 1U. Ku naszemu zaskoczeniu tanie polimerazy sprawdzają się bardzo dobrze w rutynowych oznaczeniach wykonywanych metodą PCR. Postanowiliśmy przetestować jakość nowego enzymu zawartego w polimerazach DNA pochodzącego z gatunku Pyrococcus furiosus, w odróżnieniu od najczęściej stosowanych enzymów, izolowanych z bakterii Thermus aquaticus. W celu porównania wydajności reakcji PCR, użyto dwóch rodzajów zestawów enzymów służących do przeprowadzania reakcji PCR: Paq5000 DNA Polymerase (Agilent Technologies) oraz PfuPlus! DNA Polymerase (EURx).

4 Jako matrycy użyto 3 próbek DNA izolowanego z krwi obwodowej. Powstałe produkty PCR w dalszej kolejności miały zostać poddane sekwencjonowaniu. Reakcje PCR prowadzono w końcowej objętości mieszaniny reakcyjnej 50ul (w tym 2ul DNA) zgodnie z rekomendacjami producentów, ponadto skład mieszaniny PCR-mix oraz profil termiczny reakcji prowadzono również ściśle wg zaleceń producentów. Stosowano ten sam zestaw starterów o stężeniu końcowym 0,5uM a w celu optymalizacji PCR, reakcje prowadzono w gradiencie temperatur (50 C, 55 C oraz 60 C) w tym samym termocyklerze (Biometra). Po zakończonej reakcji, próbki rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym. W wyniku przeprowadzonych analiz stwierdzono, że produkty PCR (rycina) odpowiadające szukanemu fragmentowi są zasadniczo tej samej intensywności po zastosowaniu polimerazy firmy Agilent Technologies oraz EURx. We wszystkich 3 amplifikowanych próbkach pojawił się produkt PCR w temperaturach 50 C, 55 C i 60 C; w przypadku polimerazy Paq5000 DNA temperatura 50 C okazała się najbardziej optymalna, natomiast w przypadku PfuPlus!, zależności od próbki, temperatura 50 C lub 55 C wydaje się być optymalna wymaga to dopracowania warunków reakcji lub przeanalizowania większej liczby próbek. W pierwszej próbce amplifikowanej przy pomocy polimerazy PfuPlus! pojawiły się również ciężkie niespecyficzne produkty ich eliminacja jest możliwa po dopracowaniu warunków reakcji.

5 Fotografia przedstawia wynik elektroforezy agarozowej próbek amplifikowanych przy pomocy 2 różnych rodzajów polimeraz. Możliwe różnice widoczne na rycinie wynikają z jakości zdjęcia żelu agarozowego. Magdalena Zawada, dr n med. diagnosta laboratoryjny, specjalista w zakresie genetyki Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Trudne matryce Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Prezentujemy ostatnią część cyklu, w którym tematem przewodnim będą tzw. trudne matryce Czym jest trudnotopliwa matryca i jak można wspomóc polimerazę podczas amplifikacji takiej sekwencji? Trudno o jednoznaczną definicję trudnej matrycy. Z reguły jednak problemy w amplifikacji biorą się z dużej zawartości motywów repetytywnych w sekwencji, a zwłaszcza traktów bogatych w pary GC.

6 Jak rozpoznać taką złośliwą matrycę? Można posiłkować się dostępnymi w sieci narzędziami, obliczającymi lokalną zawartość par GC w danym amplikonie. Szczególnie przydatne są programy, które potrafią wyrysować nam wykres topliwości. Znalazłam 4 działające programy tego typu. Pierwszy to stare, DOS owe narzędzie Melt94, które można pobrać tutaj. Program na zadanej matrycy wykonuje analizę topnienia in silico, a wynik zwraca w formie serii liczb. Żeby otrzymać przejrzysty wynik, trzeba niestety samodzielnie przekopiować ciąg liczb do arkusza kalkulacyjnego, ale taki wykres może nam się później przydać, np. do publikacji na posterze lub w pracy dyplomowej, dlatego właśnie z niego korzystam i gorąco polecam. Ryc. 1. Okno wynikowe programu Melt94. Na osi rzędnych naniesiono kolejne aminokwasy, na osi odciętych- zakres temperatur. Kolejne algorytmy są dostępne w formie online. Są to: GC Profile Gene analysis

7 Loopentropy Są to proste programy, szacujące %GC, które podobnie jak Melt94 rysują wykres topnienia amplikonu. Co z takiego programu możemy wyczytać? Przede wszystkim informację, czy w matrycy znajdują się obszary o wysokiej (>80%) zawartości par GC. Jeśli tak, sprawdźmy czy nasze primery nie cumują właśnie w obrębie takiej wyspy CG. Jeśli tak, to od razu powinniśmy uznać taką matrycę za kłopotliwą i pogodzić się z tym, że może zajść konieczność uciązliwej optymalizacji w celu otrzymania produktu PCR. Uwaga ogólna: czasami zdarza się, że sam PCR nie stanowi problemu, ale np. klonowanie lub sekwencjonowanie takiego produktu jest awykonalne bez zmian w metodyce (przekonałam się o tym na własnej skórze!). Gdy jesteśmy gotowi do rozpoczęcia optymalizacji, postępujemy tak jak w II części naszego cyklu: próbujemy dobrać odpowiednią temperaturę topnienia i stężenie magnezu w gradiencie. Jeżeli jesteśmy w stanie otrzymać w miarę wyraźny specyficzny produkt, w zasadzie nie musimy obawiać się o dalszą optymalizację. Jeżeli natomiast efektem amplifikacji jest smear, albo obecne jest wiele różnych produktów niespecyficznych, lub co gorsza nie jesteśmy w stanie otrzymać w ogóle produktów amplifikacji, to możemy mieć problem. Co dalej? Najprostszymi zabiegami, wspomagającymi słabą amplifikację są: wydłużenie denaturacji wstępnej, podwyższenie temperatury annealingu lub zastosowanie zabiegów z III części cyklu, głównie touchdown PCR-u. Gdy te środki zawiodą, musimy posiłkować się specjalnymi KIT-ami do trudnych matryc (wiele takich zestawów jest dostępne na polskim rynku) albo wypróbowanymi dodatkami, poprawiającymi efekty PCR (gotowe KIT-y także zawierają te same substancje!). Poniżej przedstawiam najpopularniejsze odczynniki tego typu. DMSO dimetylosulfotlenek ma wiele zastosowań, przede wszystkim krioprotekcyjnych, ale także niwelujących oddziaływania międzycząsteczkowe. Ta druga właściwość sprawia, że podczas ochładzania rozplecionych nici DNA na etapie annealingu nie dochodzi do pełnego formowania się struktur II-rzędowych w DNA. W związku z tym polimeraza ma dostęp do luźniej uorganizowanych fragmentów zawierających trakty GC, które byłyby niedostępne i ciasno zwinięte gdyby DMSO w mieszaninie reakcyjnej nie było. Stężenie końcowe DMSO w

8 MIX ie powinno wynosić nie więcej niż 10%, z reguły stosuje się go od 2 do 5%. Betaina jest osmolem organicznym o charakterze jonu obojnaczego. Sądzi się, że jej rola w PCR jest podobna jak DMSO- zmniejsza formowanie się struktur IIrzędowych. Ponadto stabilizuje kompleks polimeraza-dna. Najczęściej dostarczana jest ona w stężeniu 5M, a używana jako 1-3M. Wiele firm sprzedaje betainę jako cudowny środek własnego pomysłu pod różnymi nazwami handlowymi, np. Q-solution (QIAGEN), Advantage-GC (CLONETECH). DTT ditiotreitol to antyoksydant, zwiększający stabilność polimerazy podczas reakcji PCR dzięki swoim własnościom redukującym. Obecnie częściej niż do PCR wykorzystywany w reakcjach RT-PCR. Albumina- środek blokujący wiele białek, który nie wiąże się z polimerazami. Przydatna szczególnie w reakcjach PCR, zachodzących w obecności zanieczyszczeń białkowych (np. bezpośredni PCR na lizacie, PCR na materiale antycznym). Wspomaga też utrzymanie nici DNA w formie zdenaturowanej, co może tłumaczyć jej zastosowanie przy trudnotopliwych matrycach. Formamid-używany jako środek denaturujący DNA, w niskich stężeniach obniża ilość struktur drugorzędowych. Niestety zastosowany w zbyt wysokim stężeniu powoduje unieczynnienie polimerazy, więc musi być stosowany w jak najmniejszych ilościach. Zaleca się końcowe stężenie 1-2,5% tego reagentu. Detergenty niejonowe substancje takie jak Triton, NP40 czy Tween działają stabilizująco na polimerazę i częściowo na matrycę. Mogą działać dodatnio także w reakcjach zanieczyszczonych odczynnikami organicznymi (np. po kiepskiej izolacji kwasów nukleinowych). Glikol etylenowy, 1,2-propanodiol Chińczycy ogłosili światu, że glikol i propanodiol działają podobnie do betainy, ale z dużo wyższą skutecznością. Warto spróbować, jeżeli nie mamy nic do stracenia!

9 Chromatografia czy sączenie żelowe? wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań Uwagi końcowe Niestety jedynym sposobem na przekonanie się, czy któryś z dodatków dla trudnych matryc będzie skuteczny w konkretnym przypadku, jest wypróbowanie go (i to w szeregu stężeń i konstelacji z innymi). Kiedyś odkryłam, że jeden z amplikonów nie chce poddać się reakcji PCR ani w obecności samego DMSO, ani samej betainy, natomiast wybornie działa zastosowanie obu tych substancji jednocześnie. Potraktujmy optymalizację PCR jako przygodę, doświadczenie które wzbogaci nasz warsztat i pozwoli na wyrobienie pewnych rutynowych nawyków podczas pracy z kolejnymi matrycami. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne Poradnik: Optymalizacja reakcji

10 PCR algorytm postępowania Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR. Schemat optymalizacji A. Zawsze po zamówieniu nowych starterów PCR zaczynamy od nastawienia próbnej reakcji od jej wyniku będzie zależało dalsze postępowanie. Musimy znać temperaturę annealingu starterów (albo obliczoną teoretycznie, albo używaną przez inne grupy badawcze, jeżeli nasze startery są zamówione na podstawie już publikacji). Jeżeli korzystaliśmy wcześniej z danego zestawu do PCR, mamy już jakiś działający program amplifikacji i ustalone proporcje reagentów -wykorzystajmy je teraz. Jeżeli jesteśmy nieobeznani z zestawem, przeczytajmy ulotkę i na jej podstawie obliczmy ilości odczynników. Zwykle musimy w końcowej objętości mieć: * bufor 1x stężony * dntp 200μM * MgCl2 1-2,5mM * startery po 200nM * polimerazę ok. 0,5-1U * matrycę: DNA w ilości ng lub cdna uzyskane z ok ng RNA * wodę DEPC, którą uzupełniamy objętość reakcji. (nie podajemy tutaj konkretnych objętości, ponieważ zależnie od zastosowanego zestawu PCR będą one różne, w instrukcji do zestawu jest jednak zwykle

11 wyszczególniony przepis w mikrolitrach) B. Jeżeli nie mamy ustalonego programu PCR, zastosujmy najprostszy, obejmujący : *5 minut denaturacji w 94 stopniach (jeżeli polimeraza nie jest typu HotStart) lub 10 minut w 95 stopniach (dla enzymu HotStart) *30 cykli: (30 sekund denaturacji+ 30 sekund annealingu w temperaturze zależnej od pary starterów + 30 sekund elongacji) *2 minuty elongacji końcowej. C. Po skończonej reakcji pobieramy 5ul, dodajemy obciążnik do elektroforezy i rozdzielamy na żelu agarozowym. Nie zapomnijmy rozdzielić produktu wobec markera mas, by móc zorientować się, czy otrzymany prążek jest tym, czego oczekiwaliśmy. W zależności od tego, czy otrzymamy prążek na żelu, postępujmy dalej zgodnie z poniższym algorytmem By uniknąć frustracji i niepotrzebnego kręcenia się w kółko podczas wprowadzania nowej metodyki opartej na reakcji PCR powinniśmy mieć jasny plan działania i przestrzegać kilku prostych zasad. 1. Stosujmy się do reguły małych kroków. Dążymy w pierwszej kolejności do otrzymania jakiegokolwiek śladu produktu, następnie powoli dopracowujmy

12 reakcję korzystając po kolei ze wszelkich dostępnych metod i odczynników. Czasami od razu uda nam się trafić w idealne warunki, a czasem trzeba będzie dochodzić do nich dłużej. 2. Zapisujmy wszystkie żele, nawet te najbrzydsze. Sporządzajmy notatki dotyczące warunków reakcji i kolejnych rund optymalizacji. Moim zdaniem najlepsza metoda na takie notatki to zapisywanie bezpośrednio na elektronicznym zdjęciu żelu warunków, w jakich reakcja została wykonana. Czyli: kiedy ją wykonano, na jakim sprzęcie, na jakim zestawie do PCR (jeśli mamy kilka). Zapiszmy program PCR lub chociażby temperaturę annealingu oraz koniecznie stężenie magnezu. Jeżeli używaliśmy dodatków (np. DMSO) także nie zapomnijmy tego napisać. 3. Zanim zabierzemy się do nastawiania PCR zweryfikujmy stężenia naszych reagentów, ich termin ważności oraz (TO BARDZO ISTOTNE!) sprawdźmy sekwencje naszych starterów. Jeżeli pomyliliśmy się podczas zamawiania, zweryfikowanie tego drobnego szczegółu oszczędzi nam tygodni frustracji. 4. Jeśli jakaś metoda nie chodzi mimo wszystkich naszych działań, nie wypruwajmy sobie żył. Spróbujmy zmienić startery albo zestaw do PCR. Alternatywą jest poproszenie współpracownika o pomoc. Bywa że to pomaga D. Bogatsi o tę wiedzę możemy zacząć optymalizację. Spójrzcie na powyższy prosty schemat blokowy, którym możecie się posłużyć przy wprowadzaniu większości nowych reakcji. Podstawowym narzędziem pracy podczas optymalizacji jest gradient termiczny i gradient magnezu. Pozwalają one na wykonanie dokładnie tej samej reakcji w szeregu różnych temperatur i stężeń magnezu. Wykonanie gradientu temperatury jest możliwe na nowszych termocyklerach. Potrafią one nagrzać blok grzewczy tak, by w kolejnych rzędach dołków temperatura stopniowo wzrastała. Żeby uzyskać jednolite warunki PCR w każdej próbówce, musimy przygotować wspólną mieszaninę reakcyjną zawierającą wszystkie składniki, a potem rozporcjować ją na pojedyncze próbówki. Polecam wykonać na początku dość szeroki gradient, np. co 2 stopnie celcjusza zaczynając od temperatury dużo niższej od temperatury obliczonej jako optymalna (np. 0d ok. 50 stopni celcjusza przy optymalnej ok. 60), kończąc na

13 temperaturze wyższej niż obliczona optymalna (np. 62 w naszym przykładzie). Jeżeli taki gradient da odpowiedź, w której temperaturze produkt jest najlepiej widoczny, możemy wykonać drugi PCR gradientowy w węższym zakresie temperatur, np. co ok. 1 stopień celcjusza wokół wcześniej wytypowanej przez nas optymalnej temperatury. E. Zwykle po pierwszej lub drugiej reakcji PCR otrzymujemy jakiś ślad pożądanego produktu, nawet jeśli jest on słaby i nawet jeśli są obecne produkty niespecyficzne. Po dokonaniu wyboru optymalnej temperatury, wykonujemy gradient magnezu. Przygotowujemy kilka próbówek PCR z różnymi stężeniami magnezu. Może to być trudne dla początkującego, proponuję więc poradzić się osoby bardziej doświadczonej, jeżeli mamy z tym problem. W próbówce nr 1 przygotujmy stężenie, które po dodaniu do MIXu da nam 0,5mM, w próbówce 2: 1mM, w próbówce 3 : 1,5mM itd. aż do 3,5mM ((instrukcja znajduje się u dou strony). Wykonujemy wspólny mix reakcyjny podobnie jak przy gradiencie temperatury, ale bez dodatku magnezu. Pipetujemy mieszaninę do osobnych próbówek, a potem dodajemy odpowiednio stężony magnez, osobno do każdej z próbówek. F. Po wykonaniu reakcji w gradiencie magnezu i rozdziale agarozowym produktów w 3/4 przypadków udaje nam się uzyskać w miarę czysty i dobrze widoczny produkt. W pozostałych przypadkach musimy wrócić do gradientu temperatury z już wybranym optymalnym stężeniem magnezu (o ile uda nam się takie wybrać). Jeżeli nie liczymy się z kosztami, możemy wykonać jednocześnie gradient 2D na płytce 96-dołkowej (w wymiarze szerszym gradient termiczny, w węższymmagnezu). Przeprowadzenie kolejne obu gradientów jest tańsze, ale bardziej czasochłonne niż wykonanie podwójnego gradientu. Jeżeli nie otrzymaliśmy w ogóle żadnego produktu, wykonajmy na użytych do optymalizacji odczynnikach inną reakcję PCR, o której wiemy że działa. Jeśli okaże się że równieżnie otrzymamy produktu, musimy zmienić zestaw do PCR, w przeciwnym razie dalej zmagamy się z optymalizacją na tych samych odczynnikach- możemy dodać więcej starterów lub więcej dntp. O tym jak modyfikować te parametry i jak połaczyć kilka reakcji PCR w multiplex, przeczytacie w części III naszego opracowania.

14 Jeżeli nie otrzymujemy produktu, możemy także dodać któregoś z dodatków do trudnych matryc (DMSO, betaina, DTT, albumina). O tym jak z nich korzystać- dowiemy się w części IV niniejszego cyklu artykułów. Życzymy samych udanych optymalizacji! *Krótka instrukcja wykonania gradientu (przykład dla reakcji o całkowitej objętości 25μl): Dodatek 3,5μl MgCl2 o standardowym stężeniu 25mM na 25μl całkowitej objętości reakcji daje nam finalne stężenie po sporządzeniu MIXu 3,5mM MgCl2. Żeby przygotować stężenia odpowiednio mniejsze w tej samej objętości 3,5μl, wystarczy odmierzyć odpowiednio mniej magnezu i uzupełnić wodą do 3,5μl. Tak więc żeby otrzymać: * 0,5mM końcowej reakcji dodajmy 0,5 μl MgCl2 + 3μl H20 * 1mM : 1μl MgCl2 + 2,5μl H20, * 1,5mM: 1,5μl MgCl2 + 2μl H20 *2mM: 2μl MgCl2 + 1,5μl H20 *2,5mM: 2,5μl MgCl2 + 1μl H20 *3mM: 3μl MgCl2 + 0,5μl H20 Osobno mix reakcyjny na 7 próbówek przygotowujemy bez magnezu o objętości 3,5μl, który mamy sporządzony zgodnie z powyższą instrukcją w 7 osobnych próbówkach. Mix dobrze mieszamy i dozujemy po 21,5μl do gotowych stężeń magnezu. Można oczywiście sporządzić większą objętość magnezu na więcej reakcji gradientowych (np. mnożąc objętości z powyższego przepisu x10) i odmierzać po 3,5μl gdy najdzie nas taka potrzeba. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne

15 CE IVD bez tajemnic Czym jest, na czym bazuje i po co w ogóle to wprowadzono? Niniejszy artykuł dotyczy dyrektywy 98/79/EC i jej konsekwencji laboratoryjnych oraz prawno-ekonomicznych. Idea polityki jakości jest już dość leciwa, wymyślono ją dla celów wielkoskalowego przemysłu, bo takiego przemysłu nie stać na brak jakości. Czym w ogóle jest jakość? Jakość definiowana po konsumencku to przecież nie to samo, co jakość zawarta w procedurach i normach. Tak definiowana jakość oznacza wysoką powtarzalność parametrów produktów danego typu wykonanych w zgodzie z normą, a także bezpieczeństwo wytwórcy w procesie produkcyjnym i bezpieczeństwo odbiorcy podczas użytkowania. Taka definicja jakości wcale nie daje gwarancji, że produkt na przykład będzie stworzony z wysokiej jakości bawełny. Dlatego sceptycznie podchodzimy do znaczków CE na opakowaniach, które jednak są potrzebne, bo gwarantują bezpieczeństwo użytkowania i humanitarne warunki pracy wytwórców. Jednak skupmy się na diagnostyce in vitro: co ją odróżnia od reszty rynku konsumenckiego? Mamy wytwórcę, mamy użytkownika diagnostę. Mamy jednak kogoś jeszcze. Pacjenta, który jest faktycznym beneficjentem i odbiorcą testu diagnostycznego, mimo że dzieje się to poza jego świadomością tego faktu. Po to właśnie, by chronić także chorego, którego przecież nie stać na pomyłki producenta testu (płaciłby swoim zdrowiem!) powstała dyrektywa UE o medycznych przyrządach* do diagnostyki in vitro (98/79/EC). Dlatego certyfikat jakości CE nie wystarcza jako gwarancja odpowiedniej jakości w diagnostyce medycznej.

16 98/79/EC Cóż to za dokument i czego dotyczy? Jest to zestaw bardzo ogólnikowych norm, jakie muszą spełniać odczynniki i urządzenia używane w laboratoriach diagnostycznych. Jako medyczne przyrządy* diagnostyczne rozumie się wg dyrektywy nie tylko urządzenia, ale także systemy przechowywania próbek, odczynniki diagnostyczne oraz software do analizy danych. Wszelka aparatura i chemia, która ma styczność z próbką na którymkolwiek etapie analizy jest zatem traktowana jako medyczny przyrząd diagnostyczny i podlega tym wytycznym. Dyrektywa IVD mówi między innymi, że do diagnostyki in vitromoże by stosowany sprzęt/odczynnik który spełnia kryteria dla normy CE (działającej w oparciu o dokument EN ISO 9001) i dodatkowe kryteria, zawarte w aneksach (I- X). Ponadto pewne odrębne kryteria, inne niż dla odczynników używanych w laboratoriach, muszą spełnić urządzenia do samokontroli u pacjentów glukometry, paski testowe itp. Z punktu widzenia laboratoriów najważniejszy jest załącznik 2. Zawarta jest w nim klasyfikacja badań o podwyższonym poziomie wymaganych norm jakości ze względu na istotność tych badań w kontekście zdrowia i życia pacjenta i personelu. W aneksie A mamy badania serologiczne grup krwi: systemu ABO, Rh (C, c, D, E, e) Kell, oraz badania wirusologiczne HIV, HTLV oraz badania wirusów wątrobowych. W aneksie B figurują grupy krwi Duffy i Kidd, przeciwciała przeciwkrwinkowe, typowanie tkankowe HLA (serologia), detekcja toksoplazmozy i różyczki, wirusa cytomegalii i chlamydiozy (mikrobiologia, wirusologia), testy na fenyloketonurię, oznaczenie trisomii 21 (genetyczne zaburzenia wrodzone), oznaczenia markeru nowotworowego PSA oraz glukozy we krwi. Oznacza to, że oprócz obowiązkowych wymagań z aneksu I i wymogu posiadania certyfikatu CE dla tych oznaczeń wymagane jest spełnienie kryteriów załączników IV-VIII, potwierdzone certyfikatami zgodności z drugą normą, DIN EN ISO i (najlepiej) oświadczeniem producenta że produkt może by stosowany w diagnostyce in vitro. Dla diagnostów ważne jest, co rozumie się przez stosowanie się do wytycznych dla oznaczeń z aneksów A i B: testy używane w diagnostyce MUSZĄ być certyfikowane CE IVD

17 wszystkie urządzenia służące do wykonania oznaczeń, a wiec zarówno systemy do pobierania próbek, jak i pipety, plastiki laboratoryjne i inne urządzenia muszą spełniać takowe wymagania. O tym wiele laboratoriów zapomina. Zapomina się także o tym, że zestaw może być certyfikowany np. tylko dla krwi, bo firmie nie chciało się certyfikować zestawu dla innych typów materiału (to są koszty a firmy lubią je ciąć!), a my oznaczamy tym zestawem parametry np. w PMR. To błąd który nie powinien mieć miejsca. Za to powinno się karać i to surowo (a w Polsce jest z tym różnie). Dlaczego nie wszystkie laboratoria stosują się do wytycznych aneksów A i B? Bo jakość kosztuje. Zestawy z IVD są droższe, a konkurencyjność wymaga obniżania cen. Często kadra jest też nieprzeszkolona i żyje w błogiej niewiedzy. Niestety nieznajomość prawa nie jest usprawiedliwieniem. A dlaczego producenci znanych, rewelacyjnych marek sprzętu i odczynników na przykład do biologii molekularnej często uwzględniają adnotacje for research use only, mimo że ich odczynnikom można ufać bardziej niż KITom z IVD mało znanych firm? Ma to 2 przyczyny. Po pierwsze certyfikat podraża odczynnik, a adresatami odczynników do badań molekularnych są głównie jednostki naukowe, którym IVD nie jest absolutnie do niczego potrzebne. Po drugie zaś, firmy nie chcą brać na siebie odpowiedzialności prawnej. Wolą swoje enzymy sprzedać podwykonawcy, który produkuje KITy i sam stara się o certyfikację, sam też ponosi odpowiedzialność prawną w razie zaistnienia niezgodności. Tak więc np. bardzo znane polimerazy i odwrotne transkryptazy nie posiadają certyfikacji IVD, ale wchodzą w skład zestawów z IVD. Czyż to nie ironiczne? Tak jednak działa prawo, do którego, chcąc nie chcąc, powinniśmy się stosować. Oczywiście brak certyfikatu IVD przy wykazanym przez producenta fakcie, że produkt spełnia normę CE i kryteria załącznika I (obligatoryjne) wystarcza, by taki sprzęt znalazł się w laboratorium, w którym nie wykonuje się analiz z aneksu II. A więc przyrządy z oznaczeniem zgodności np. z EN ISO mogą być automatycznie traktowane jako mogące uczestniczyć w procesie diagnostycznym. Oczywiście jeśli podlegają przeglądom technicznym i są sprawne. * Uwaga: Używam określenia przyrząd, by nie mylił się on z terminem urządzenie używanym w polskich dokumentach-córkach. Kojarzy się on bowiem jednoznacznie z aparaturą mechaniczną, a nie chciałam wprowadzać zamętu

18 podczas objaśnień. Piśmiennictwo: Directive 98/79/EC of the European Parliament and of the Council of 27 October 1998 on in vitro diagnostic medical devices. Poradnik: Optymalizacja reakcji PCR. Manipulowanie stężeniami i programem termocyklera Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Dziś zwiększamy tempo, starając się już nie tylko otrzymać produkt, ale dopracować amplifikację do perfekcji poprzez różne zabiegi chemiczne i fizyczne. Manipulowanie stężeniami i programem termocyklera W poprzednich częściach pisaliśmy o podstawach. O tym, jak otrzymać produkt. Jednakże kinetyka reakcji jest często równie ważna jak sam efekt w postaci obecności prążka na żelu. Co jeszcze możemy zrobić, by poprawić wydajność amplifikacji? A. Zmieniamy stężenia starterów jeżeli na żelu po PCR widzimy na wysokości

19 poniżej 25-5o pz prążek, świadczy to o zbyt dużej ilości starterów dodanych do PCR lub o słabej amplifikacji i tworzeniu par primer-dimer (czyli startery się kleją same do siebie i amplifikują się zamiast matrycy!). Pary primer-dimer możemy wyrugować podwyższając temperaturę annealingu, zaś słabą amplifikację powinniśmy poprawić albo przez zmianę stężeń MgCl2, albo inne modyfikacje omówione w częściach I-II. Jeżeli nie widzimy w ogóle starterów na żelu, możemy zaryzykować podwyższenie ich stężenia, uważając by nie przesadzić. Może to pomóc zwiększyć plon amplifikacji lub nie, warto jednak spróbować (byle nie doprowadzić do przeładowania starterami, widocznego na żelu). Co jeszcze możemy zrobić ze starterami? Może się okazać że różnią się one długością lub temperaturą annealingu,wtedy możemy zrównoważyć te różnice, zwiększając stężenie tego z nich, który jest krótszy i ma niższą temperaturę topnienia. Jest to stosowane najczęściej w reakcjach multiplex, w których poszczególne pary starterów wchodzą ze sobą w interakcje i często może być potrzebna taka ingerencja. B. Zwiększamy ilość dntp raczej rzadko stosowany zabieg, może pomóc poprzez zmianę siły jonowej roztworu. Nie należy dodawać więcej niż 2-krotnie większej dawki dntp niż zalecana przez producenta. bo to już w niczym nie może pomóc. C. Zatężanie buforu reakcyjnego metoda wykorzystywana czasami dla amplifikacji w multiplexie. Wiele polimeraz toleruje zwiększenie stężenia buforu reakcyjnego od 1,1x do nawet 2x. Wyższa siła jonowa rzekomo pomaga w amplifikacji na krótkich primerach i w reakcjach multiplex. Przy użyciu mojego zestawu do PCR nie widziałam różnic w amplifikacji wielu różnych matryc po zatężeniu buforu, ale wg autorów licznych publikacji (m.in. tej z Biotechniques) to może zadziałać. D. Ilość matrycy zwykle rozsądną minimalną ilością DNA dodawaną do reakcji PCR jest 10ng. Poniżej tej ilości da się wciąż otrzymać wyraźny produkt, jednak podczas wstępnego dopracowywania warunków lepiej mieć pewność, że zbyt mała ilość matrycy nie zakłóca przebiegu reakcji. Oczywiście matryca powinna być wolna od zanieczyszczeń organicznych i soli, najlepiej sprawdzona uprzednio w innej reakcji PCR i/lub oceniona spektrofotometrycznie pod kątem czystości i

20 stężenia. Chromatografia czy sączenie żelowe? wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań Co do cdna nie ma tak precyzyjnych wytycznych, amplifikacja zależy w bardzo dużym stopniu od rodzaju amplifikowanej matrycy RNA- czy jest to gen wysokokopijny, czy też niskokopijny? Czy amplifikujemy koniec 3 czy też 5 transkryptu? Czy odwrotna transkrypcja była wykonana na oligo-dt, na heksamerach,czy też na starterze specyficznym? Jakiego zestawu użyliśmy do RT? Czasami brak produktu RT-PCR może świadczyć nie o braku amplifikacji, ale o bardzo niskiej ekspresji amplifikowanego genu w danej próbce, albo też o degradacji/zanieczyszczeniu matrycy. Jeśli chodzi o ilość cdna poddawaną amplifikacji, to starajmy się korzystać (w przeliczeniu na RNA użyte do reakcji RT) z co najmniej 50ng RNA (dla przykładu może to być 1µl cdna, jeżeli do 20µl reakcji RT dodane było 1000ng RNA, bo 1000/20=50). Jeżeli nie jesteśmy pewni, czy w naszej próbce znajduje się mało czy dużo kopii amplifikowanego cdna, możemy w niektórych przypadkach bardziej znanych organizmów posiłkować się profilami ekspresji genów, dostępnymi np.w bazie GEO lub TiGER. Warto pamiętać jeszcze o jednym szczególe: wiele genów posiada kilka izoform tego samego genu ( alternatywny splicing!). Dlatego przed wyrzuceniem starterów podejrzanych o niespecyficzna amplifikację sprawdźcie, czy dodatkowe produkty to nie warianty splicingowe! E. Program amplifikacji: czas i temperatura (szczególnie annealingu) mają znaczenie dla wydajności amplifikacji. Niestety tak jak w przypadku składników mieszaniny reakcyjnej, dla każdej matrycy idealne warunki amplifikacji trzeba wyznaczyć empirycznie. Generalnie programy PCR dzielimy na 2- i 3-etapowe. Dwuetapowe używane są zwykle w reakcjach qrt-pcr, ale nic nie stoi na przeszkodzie, by stosować je także w konwencjonalnym PCR. Wówczas naprzemiennie stosuje się temperaturę annealingu (zwykle ok. 60 stopni) i

21 denaturację (94-95 stopni). Programy trójstopniowe pomiędzy annealingiem a denaturacją zawierają etap elongacji w optimum termicznym enzymu, ok. 72 stopni. Warto wspomnieć także o drugim kluczowym dla reakcji PCR elemencie: o denaturacji wstępnej, która w przypadku enzymów rekombinowanych typu HotStart jest niezbędna dla aktywacji polimerazy. Ten etap może być zasadniczo pominięty dla enzymów nierekombinowanych (stosuje się zwykle tylko krótką, np. 2-minutową denaturację w 94 stopniach). Dla enzymów HotStart programujemy cykler na dłuższą denaturację wstępną zgodnie z instrukcją producenta, zwykle na 5-15 minut w temperaturze 95 stopni. Oczywiście manipulowanie temperaturą nie wyczerpuje możliwości modyfikowania przebiegu reakcji. Możemy np. próbować wydłużać czas annaelingu i/lub elongacji. Bardzo skrajnym przykładem takiego postępowania jest tzw. rapid PCR. Ten wariant PCR polega na zerosekundowych (sic!), naprzemiennych etapach denaturacji (95-98 stopni) i annealingu (50-65 stopni) w namnażaniu krótkich (<100pz) amplikonów. W rezultacie cała reakcja PCR może trwać zaledwie kwadrans i dawać całkiem ładny profil amplifikacji! (drobna uwaga: większość zwykłych termocyklerów nie ma możliwości technicznych, by oscylować pomiędzy temperaturą 50 stopni i 98 stopni w odpowiednich interwałach czasowych, więc takie reakcje prowadzi się w termocyklerach do qrt-pcr) Kolejną ciekawą modyfikacją programu reakcji jest stosowanie tzw. touchdown PCR. Jest to ciekawa propozycja szczególnie dla osób, które chcą optymalizować multiplex PCR. Stosujemy go jeżeli: -mamy w mieszaninie reakcyjnej 2 pary starterów, z których jedna amplifikuje się preferencyjnie w wyższej temperaturze, a druga w niższej, -gdy dana para starterów tworzy pary primer-dimer -gdy w reakcji tworzą się oprócz produktu głównego także produkty niespecyficzne Tradycyjnie w tych przypadkach możemy wybierać w kwestii temperatury

22 amplifikacji: albo amplifikujemy z gorszą wydajnością w wyższej temperaturze, albo godzimy się na niespecyficzną amplifikację/powstawanie dimerów starterów/nierówną amplifikację w multiplexie w niższej temperaturze. Wyjściem pośrednim, niejako kompromisem jest sztuczka z opadającym PCR. Idea jest prosta: z każdym cyklem temperatura annealingu obniża się o zadeklarowaną ilość stopni celcjusza. Wobec tego w początkowych cyklach amplifikacja jest gorsza (bo temperatura wyższa niż optimum), ale faworyzowany jest wyłącznie specyficzny produkt. W kolejnych cyklach warunki amplifikacji są coraz łagodniejsze, dążą do optimum, ale ilość specyficznego produktu wygenerowanego w pierwszych cyklach w wyższej temperaturze jest na tyle duża, że ma on przewagę amplifikacji nad wszelkimi śmieciami, które mogłyby z nim konkurować, o ile nie zostałby zastosowany touchdown. Tym samym pomagamy żądanemu amplikonowi wybić się w tłumie niespecyficznych produktów reakcji. Jeszcze inną, interesującą modyfikacją programu PCR jest pomostowanie annealingu i elongacji (tzw. ramp-pcr ). Polega to w dużym skrócie na powolnym podwyższaniu temperatury annealingu do temperatury elongacji. Wówczas nie deklarujemy czasu trwania etapu annealingu, za to wyznaczamy jak stromy ma być pomost, np.możemy zastosować ramp od 56 stopni do 72 stopni ze wzrostem temperatury co 1 sekundę o 0,1 stopnia albo o wiele szybszy, jeżeli będziemy zwiększać temperaturę o 0,5 stopień. Parametr ramp wpisywany jest zwykle do programu termocyklera jako %. Co nam daje pomostowanie w PCR? Przede wszystkim może poprawić amplifikację specyficznego produktu, szczególnie dla primerów o bardzo różnej temperaturze annealingu. Są także matryce, które cechują się sekwencją repetytywną. Na takich sekwencjach polimeraza lubi się jąkać, mieć czkawkę lub ślizgać się (takie nazwy potoczne funkcjonują w różnych laboratoriach), tworząc niespecyficzne produkty o kilka par zasad mniejsze lub większe niż produkt główny. Jest to bolączką np. genotypowania polimorfizmu STR w kryminalistyce. Pomostowanie pomaga pozbyć się tych zająknięć (ang. stuttter ), co jest kluczowe dla analiz sądowych. Poniżej przedstawiamy przykład takiego właśnie zająknięcia.

23 Rycina 1: Zjawisko stutter powoduje tworzenie się małych ilości produktów niespecyficznych o obniżonej lub (rzadko) podwyższonej długości w stosunku do właściwego amplikonu. W tym przypadku jest to zanieczyszczenie o niewielkim znaczeniu, niedopracowana reakcja PCR może jednak spowodować stutter obciążający nawet o ponad 20% produkt amplifikacji! Źródło ryciny. Tym oto sposobem dobrnęliśmy do końca części trzeciej. W ostatnim odcinku zaprezentujemy chemiczne dodatki, które pomogą stopić trudne matryce, bogate w pary GC, podsumujemy też cały cykl artykułów. Dziś nie pozostaje mi już nic innego, jak życzyć Wam dalszych udanych optymalizacji. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne

24 Optymalizacja reakcji PCR. Część I: podstawy Jak przeprowadzić optymalizację reakcji PCR? Co zmienić w metodyce, by pozbyć się produktów niespecyficznych? Jak poprawić plon reakcji? Od czego zacząć? Czego unikać? Proponujemy algorytm postępowania, który pozwoli na szybką i bezbolesną poprawę wyników waszych reakcji PCR. Chromatografia czy sączenie żelowe? wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań 1. Podstawy -przede wszystkim należy zapoznać się z podstawowymi składnikami MIXu reakcyjnego. * Bufor : zawiera zoptymalizowany dla danej polimerazy skład jonowy, warunkujący odpowiednią konformację enzymu podczas reakcji, wspomaga inkorporację zasad, sprawia że DNA łatwiej uzyskuje liniową strukturę i nie tworzy skomplikowanych struktur drugorzędowych. Bufor jest dostarczany jako tzw. stock, stężony 2x, 5x lub 10x. W związku z tym musimy pamiętać o otrzymaniu odpowiedniego stężenia końcowego tego odczynnika. Obecnie większość buforów zawiera KCl lub Na2SO4 rozpuszczone w zbuforowanym roztworze opartym o TRIS. Niektóre bufory zawierają już pewną ilość jonów Mg2+, koniecznych jako kofaktor reakcji, inne są ich pozbawione i na to trzeba wziąć poprawkę podczas dostosowywania metodyki literaturowej do swoich potrzeb. Innym udogodnieniem jest obciążanie buforu do PCR odpowiednimi neutralnymi barwnikami do elektroforezy, dzięki którym można od razu po PCRze nakrapiać produkt na żele agarozowe. Niektórzy producenci produkują KITy dedykowane do konkretnych zastosowań, wówczas skład buforu jest

25 modyfikowany np. w celu łatwiejszego topienia matryc bogatych w GC (więcej na ten temat w rozdziale 4: Dodatki do trudnych matryc) * MgCl2: jony magnezu są kofaktorem polimerazy, ich rola jest nie do przecenienia. Im wyższe stężenie Mg2+ tym silniejsze oddziaływanie matrycaenzym, tym wydajniejsze wiązanie starterów i tym niższa optymalna temperatura reakcji. Podwyższenie ilości MgCl2 zwykle dodatnio wpływa na reakcje multiplex i allelospecyficzny PCR. Może jednak spowodować powstawanie niespecyficznych produktów reakcji. Niestety każda matryca cechuje się innymi wymaganiami magnezowymi i należy znaleźć empirycznie idealne stężenie dla naszego KITu i naszego amplikonu. *dntp: trifosforany deoksyrybonukleozydów to paliwo i jednocześnie substrat reakcji amplifikacji. Obecnie najczęściej dostarczane są w KIT cie jako mieszanina datp, dgtp, dctp i dgtp. Wysokoenergetyczne trojfosforany są dość labilne w temperaturze pokojowej, dlatego dobrze jest dbać o to, by nie były poddawane częstym cyklom rozmrażanie-zamrażanie, oraz by były trzymane na lodzie podczas składania reakcji PCR. * startery (primery): czynnik decydujący o tym, co amplifikujemy. Sekwencja starterów, odpowiednio zaprojektowanych dla danego amplikonu, jest komplementarna (w pełni albo przynajmniej w obrębie kilku(nastu) pierwszych nukleotydów od końca 3 ) do naszej matrycy i w odpowiedniej temperaturze annealingu umożliwia hybrydyzację i prymowanie reakcji dla polimerazy. Jest to kluczowe, ponieważ enzym nie przyłączy się do fragmentu jednoniciowego i nie zacznie amplifikacji bez oligonukleotydu, który niejako jest dla niego kotwicą na matrycy. Najczęściej korzystamy ze starterów w równych stężeniach, jednakże w przypadku primerów o różnych długościach, różnej zawartości par GC czy też różnej autokomplementarności można stosunek ich stężeń zmieniać, by otrzymać optymalną amplifikację. * polimeraza DNA: najważniejszy enzym w biologii molekularnej! Enzym jest izolowany z termofilnych bakterii i rekombinowany dla zwiększenia termostabilności, efektywności i wierności amplifikacji. Obecnie rodzajów polimeraz w handlu jest kilkaset (jeśli nie więcej!). Niektóre posiadają specjalne własności: brak aktywności 3 ->5 nukleolitycznej, aktywność korekcyjną proof reading, czy też odporność na wysokie temperatury topnienia (98-99 stopni). Dla podstawowej amplifikacji wystarczy jednak zwykły, poczciwy Taq.

26 * woda ultraczysta do mieszaniny reakcyjnej do PCR nie możemy dodawać wody z kranu. Musi to być woda odwrotnie osmozowana, pozbawiona jonów soli w znaczący sposób mogą wpływać na niepowodzenie reakcji. Poza czystością chemiczną, woda musi być wolna od mikroorganizmów i zanieczyszczeń enzymatycznych, które powodują degradację matrycy (np. ciepłostabilnyvh DNAz bakteryjnych) * matryca zwykle jest to oczyszczone DNA lub cdna, jednakże dostępne rynku zestawy umożliwiają także korzystanie bezpośrednio z lizatu komórkowego jako matrycy. Wydajność reakcji PCR zależy bardzo silnie od jakości zastosowanego kwasu nukleinowego, jego stężenia oraz obecności zanieczyszczeń takich jak rozpuszczalniki organiczne lub sole. W kolejnej części cyklu odpowiemy na pytanie, od czego zacząć podczas wprowadzania nowej metodyki i jak modyfikacja stężeń wymienionych reagentów może wpłynąć (pozytywnie lub negatywnie) na końcowy wynik reakcji. Piśmiennictwo: Doświadczenia własne Masz problem z izolacją DNA? Sięgnij po Sherlocka! W czasie swojej pracy naukowej i diagnostycznej testowałam wiele zestawów do izolacji DNA. Spisują się one zazwyczaj dobrze, problem

27 zaczyna się przy bardzo małej ilości tkanki lub komórek. W przypadku trudnej izolacji, z niewielkiej ilości materiału biologicznego, polecam niezawodny zestaw do izolacji DNA ze śladów biologicznych: Sherlock AX produkowany przez polskiego producenta A&A Biotechnology z Gdyni. Choć dedykowany jako zestaw dla medycyny sądowej, w rzeczywistości jest to niezwykle uniwersalny zestaw do izolacji DNA ze śladów biologicznych z membraną jonowymienną. Zgodnie z zaleceniami producenta wielkość próbki do izolacji to 0,3 ml krwi obwodowej, lub 20 mg tkanki. Taką ilość determinuje pojemność złoża, która wynosi 20 µg DNA. Zestaw Sherlock AX można nabyć w wersjach na 25 i 100 izolacji. Izolowane przy jego pomocy DNA bardzo dobrze sprawdza się przy pracy z technikami takimi jak: PCR, sekwencjonowanie, czy klonowanie. Zestaw jest bardzo praktyczny w użyciu. Choć manualnie, izoluje się z jego pomocą szybko i przyjemnie. A co najważniejsze zestaw jest niezawodny, wyratował mnie z niejednej opresji, kiedy izolacja DNA wydawala sie po prostu niemożliwa. Izolacja przy pomocy Sherlocka AX eliminuje też efekt usunięcia DNA po precypitacji, wraz z nadsączem. Dzięki niebieskiemu wzmacniaczowi precypitacji, użytkownik ma pełną kontrolę nad peletem DNA; pelet po zwirowaniu wybarwia się na granatowo i nie ma niebezpieczeństwa wciągnięcia go przez przypadek do końcówki. Wymagany sprzęt laboratoryjny do izolacji to wirówka, zestaw pipet, blok grzewczy lub cieplarka, wortex. Protokół producenta oraz informacje o zestawie Sherlock AX można znaleźć tutaj Chromatografia czy sączenie żelowe?

28 wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań Gravity flow krok naprzód w dziedzinie izolacji DNA Grawitację odczuwamy na co dzień. Jest ona zjawiskiem tak oczywistym i powszechnym, że nie zastanawiamy się nawet nad jej istnieniem. Naukowcy z firmy A&A Biotechnology postanowili skorzystać z siły grawitacji aby znacznie uprościć i przyspieszyć proces izolacji DNA. Jak to działa? Tradycyjne metody wykorzystujące różnego rodzaju złoża do izolacji kwasów nukleinowych wymagają specjalnych urządzeń takich jak: wirówki, pompy próżniowe lub generatory pola magnetycznego. Urządzenia te są niezbędne do wytworzenia sił napędzających kolejne etapy izolacji. Metoda przepływu grawitacyjnego (Gravity flow) opracowana przez A&A Biotechnology korzysta jedynie z naturalnej siły grawitacji i zjawisk kapilarnych. Dzięki specjalnie opracowanej membranie jonowymiennej i probówce odbierającej możliwy jest swobodny przepływ roztworów i elucja wyizolowanego DNA.

29 Metoda Gravity flow. Specjalnie opracowana membrana i probówka lub płytka odbierająca pozwala na swobodny przepływ roztworów pod wpływem siły grawitacji. Tak zaprojektowany układ pozwala zredukować do minimum wszelkie czynności manualne oraz potrzebę stosowania dodatkowych urządzeń. Dzięki temu metoda jest wyjątkowo prosta, szybka i płynna. Dodawanie i przepływ kolejnych roztworów w metodzie Gravity flow przebiega płynnie, bez potrzeby wirowania i wymiany probówek odbierających. Porównanie izolacji DNA metodą wirówkową oraz Gravity flow

30 Ilość czynności manualnych potrzebnych do przeprowadzenia izolacji metodą grawitacyjną w porównaniu do metody wirówkowej jest znacznie mniejsza. Gravity flow na żywo Manualna izolacja DNA metodą Gravity flow. Izolacja DNA metodą Gravity flow z wykorzystaniem Stacji Pipetującej

31 epmotion. Cztery powody, dla których warto izolować DNA metodą Gravity flow. 1. Wyjątkowa prostota, szybkość i płynność procedury Po przeprowadzeniu lizy do izolacji potrzebny jest jedynie statyw i pipeta. Aż do momentu elucji reszta czynności polega jedynie na dodawaniu kolejnych roztworów. Jest to najprostsze i bardzo wygodne dla każdego rozwiązanie, niezwykle pomocne do celów dydaktycznych oraz dla oso b zabezpieczaja cych pro bki poza laboratorium np.pro bki s rodowiskowe. Wszystkie kroki izolacji, aż do samej elucji odbywają się z wykorzystaniem jednej probówki odbierającej. To znacznie zmniejsza ilość czynności manualnych i tym samym okazji do popełnienia pomyłki lub kontaminacji próbek. Mniejsza ilość probówek to także mniejsza ilość plastikowych odpadów. 2. Elastyczność Metoda Gravity flow uniezależnia nas od planowania i oczekiwania na zajęte urządzenia laboratoryjne. Kolejne etapy izolacji nie wymagają nadzoru, a w razie potrzeby można robić pomiędzy nimi przerwy. 3. Większa wydajność W porównaniu do innych metod izolacji, metoda Gravity flow pozwala na uzyskanie do 50 % więcej czystego DNA z tej samej ilości materiału. 4. Łatwość automatyzacji Z uwagi na wyjątkowo nieskomplikowaną procedurę i małą ilość kroków, metoda Gravity flow jest idealna do zastosowania w wielu, nawet najprostszych modelach urządzeń typu liquid handler, na przykład w formacie płytek 96. Właściwy czas, żeby się przekonać Firma A&A Biotechnology do końca roku ustala 40 % rabat na wszystkie swoje zestawy do izolacji DNA metodą grawitacyjną. Ponadto oferujemy

32 darmowe zestawy demonstracyjne oraz nagrody za wypróbowanie tej innowacyjnej metody i podzielenie się z nami swoją opinią. Więcej na Zapraszamy! Viscolase firmy A&A Biotechnology Firma A&A Biotechnology jest producentem blisko 200 produktów obejmujących zestawy do izolacji kwasów nukleinowych (DNA, RNA) z różnorodnych źródeł materiału biologicznego,odczynniki do reakcji PCR, Real-Time PCR, Hot-Start PCR, rekombinowane białka i enzymy lityczne. Nowością na rynku jest Viscolasa, która pozwala uniknąć problemu gęstych i lepkich preparatyk białkowych. Viscolasa jest rekombinowaną nukleazą o szerokim spektrum aktywności. Produkowana jest w unikalnym systemie drożdżowym. Enzym posiada aktywność endonuleazy degradującej wszystkie formy DNA i RNA do polinukleotydów o długości od 2 do 5 zasad i jest aktywny w szerokim zakresie buforowym. Do swojej aktywności wymaga jonów magnezu. Zastosowanie: 1. Zmniejszenie lepkości lizatów komórkowych (bakteryjnych, drożdżowych, ssaczych, itp.); 2. Przygotowanie próbek do rozdziału białek w elektroforezie 2D; 3. Usuwanie DNA i RNA z preparatów białek rekombinowanych.

33 Viscolase jest dostępna w opakowaniach po U, U w stężeniu 250 U/μl. Definicja jednostki: 1 U Viscolase jest zdefiniowana jako ilość enzymu powodująca zmianę absorpcji roztworu DNA A260 o 1,0 jednostkę w czasie 30 min, co odpowiada całkowitemu strawieniu 37 μg DNA. Na stronach sklepu internetowego A&A Biotechnology dostępne są opakowania po U i U w stężeniu 250 U/μl. Nukleaza Viscolase o stężeniu 250 U/µl jest dostarczona w buforze zawierającym: 50% glicerol, 20 MM Tris-HCl ph 8.0, 20 mm NaCl oraz 2 mm MgCl. W preparacie nie stwierdzono aktywności proteolitycznej. Enzym może być stosowany w połączeniu z powszechnie używanymi lizozymami. Chromatografia czy sączenie żelowe? wybór metody oczyszczania zależy od wielkości oligonukleotydu i zastosowań *** Więcej informacji o Viscolasie oraz innych produktach znaleźć można na stronie internetowej firmy A&A Biotechnology.