(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/050125
|
|
- Katarzyna Piotrowska
- 7 lat temu
- Przeglądów:
Transkrypt
1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12N 15/86 ( ) C12N 15/861 ( ) A61K 48/00 ( ) A61P 37/00 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego (30) Pierwszeństwo: , WO, PCT/NL02/00280 (73) Uprawniony z patentu: CRUCELL HOLLAND B.V., Leiden, NL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 17/05 (72) Twórca(y) wynalazku: RONALD VOGELS, Linschoten, NL ABRAHAM BOUT, Moerkapelle, NL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/13 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska
2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rekombinowany wektor adenowirusowy oraz sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego. Dziedzina wynalazku Wynalazek dotyczy nośników do dostarczania kwasu nukleinowego i ich zastosowania, dokładniej wynalazek dotyczy rekombinowanych wektorów adenowirusowych i ich zastosowania. Tło wynalazku Do chwili obecnej zidentyfikowano 51 serotypów ludzkich adenowirusów, które podzielono na 6 podgrup (A, B, C, D, E i F) opierając się na ich zdolnościach hemaglutynacji i homologii sekwencji (Francki i wsp., 1991). Cykl infekcji adenowirusa dzieli się na fazę wczesną i późną. W fazie wczesnej, wirus zostaje pozbawiony kapsydu i genom jest transportowany do jądra, po czym aktywne transkrypcyjnie stają się wczesne regiony genu (E1, E2, E3 i E4). Region E1 zawiera dwa regiony transkrypcji: E1A i E1B. E1A koduje białka uczestniczące w modyfikacji cyklu komórki gospodarza i aktywowaniu innych regionów transkrypcyjnych wirusa (przegląd dokonany przez Russell, 2000). Region E1B koduje dwa główne białka: E1B-19K i E1B-55K, które zapobiegają indukcji apoptozy będącej wynikiem aktywności białek E1A (Rao i wsp., 1992; Yew i Berg, 1992; Shenk, 1996). Ponadto, białko E1B-55K jest wymagane w późnej fazie dla wybiórczego transportu wirusowego mrna i hamowania ekspresji białka gospodarza (Pilder i wsp., 1986). E2 jest również podzielony na dwie poddomeny E2A i E2B, które razem kodują trzy białka (białko wiążące DNA, wirusową polimerazę i białko preterminalne), które uczestniczą w replikacji wirusowego genomu (Van der Vliet, 1995). E3 nie jest niezbędny dla replikacji in vitro lecz koduje szereg białek, które hamują mechanizm obronny gospodarza przeciw infekcji wirusowej (Horwitz, 2001). E4 niesie przynajmniej 6 otwartych ramek odczytu (orf) kodujących białka uczestniczące w szeregu różnych funkcji związanych ze składaniem i transportem wirusowego mrna, transportem mrna komórki gospodarza, wirusową i komórkową transkrypcją i transformacją (przeglądu dokonał Leppard, 1997). Późne białka niezbędne dla utworzenia wirusowych kapsydów i pakowania wirusowego genomu są wszystkie wytworzone w oparciu o główną, późną jednostkę transkrypcyjną (MLTU), która staje się w pełni aktywna po zajściu replikacji. Złożone procesy różnicowego składania i poliadenylacji dają więcej niż 15 rodzajów mrna o wspólnej trzyczęściowej sekwencji lidera. Białka E1B-55K, E4-orf3 i E4-orf6 odgrywają kluczową rolę w regulacji obróbki i transportu z jądra komórkowego późnego, wirusowego mrna. W tym celu E1B-55K oddziałuje z E4-orf6 tworząc funkcjonalny kompleks, który pobudza transport wirusowego mrna do cytoplazmy, gdzie kompleks uczestniczy również w hamowaniu transportu komórkowego mrna z jądra komórkowego do cytoplazmy (przeglądu dokonał Leppard, 1997 i 1998). Wytwarzanie wektorów z delecją E1 opartych na podgrupie C serotypach Ad5 lub Ad2 jest osiągnięte w liniach komórkowych komplementujących E1 takich jak 293 (Graham i wsp., 1970), 911 (Fallaux i wsp., 1996) i PER.C6 (Fallaux i wsp., 1998, Depozyt nr ECACC ). Jak ujawniono w WO/55132 i WO 01/05945 wektory i linie komórkowe mogą być tak dopasowane by zapobiec zachodzeniu replikacji kompetentnych adenowirusów przez rekombinację homologiczną pomiędzy sekwencjami adenowirusa w linii komórkowej i wektorem. Dla wydajnego wytwarzania replikacyjnie niekompetentnych adenowirusów pochodzących z grupy C, dogodnie stosuje się linię komórkową PER.C6. Przy pomocy tej linii komórkowej dopasować można wektory adenowirusowe, a co za tym idzie, umożliwia to wytwarzanie wektorów adenowirusowych z grupy C przy braku replikacyjnie kompetentnych adenowirusów (Fallaux i wsp., 1998; patent US nr 6,033,908). Natomiast, wektory z grupy C mogą nie zawsze być idealnymi nośnikami dla bezpośrednich zastosowań in vivo, ponieważ wydajność infekcji jest poważnie ograniczona przez obecność wysokiego miana aktywności neutralizującej u większości ludzi i braku dostatecznej ilości receptora komórkowego (Coxsackie - receptor adenowirusa, CAR) na specyficznych pierwotnych komórkach docelowych (np. komórkach śródbłonka, komórkach mięśnia gładkiego, komórkach maziówkowych, monocytach i komórkach dendrytycznych). Podanie większych ilości wirusów w celu zwiększenia transdukcji może prowadzić do zwiększonej toksyczności i nie przewidywalnych objawów klinicznych związanych ze zmiennością mian neutralizujących u leczonych podmiotów. Ograniczeń tych można uniknąć przez użycie innych serotypów adenowirusów. Przykładowo, receptor wiążący część włókna wirusów z podgrupy B (w szczególności serotyp 16), gdy ulegał ekspresji z wektora opartego na Ad5, pośredniczył w znacząco zwiększonej infekcji ludzkich komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich (WO 00/31285) oraz ludzkich komórek maziówkowych (WO 00/52186). Włókno innego adenowirusa z podgrupy B, Ad35 jest najbardziej
3 PL B1 3 skuteczne w wywoływaniu zakażenia ludzkich monocytów i komórek dendrytycznych (WO 00/03029). Ponadto, Ad35 został zidentyfikowany jako wirus, dla którego ogromna większość ludzkiej populacji nie posiada aktywności neutralizującej (WO 00/70071). W dziedzinie istnieje ogólnie odczuwana potrzeba opracowania technologii wykorzystującej więcej serotypów. Szczególnym problemem jest brak użytecznych linii komórek pakujących dla tych innych serotypów. Linie komórek pakujących dla wektorów Ad5 typowo zawierają białka kodowane przez E1 pochodzące od adnowirusa o serotypie 5. Przykłady takich typowych", pakujących linii komórkowych to 293, 911 i PER.C6. Próby wytworzenia wektorów pochodzących od innych serotypów na tych standardowych liniach komórek pakujących okazały się mało pomyślne, jeśli nie nieudane. Wyjątkowo obserwuje się pewne wytwarzanie w zależności od szczególnego użytego serotypu. Natomiast wydajność rekombinowanych wektorów adenowirusowych pochodzących z innych podgrup adenowirusa niż podgrupa C wytwarzanych na transformowanych liniach komórkowych i unieśmiertelnionych przez E1 z Ad5, jest mała. W publikacji Abrahamsena i wsp. (1997) zaobserwowano poprawione oczyszczanie z łysinki wektorów adenowirusowych o serotypie 7 z delecją E1A (podgrupa B) w komórkach 293 zawierających E4-orf6 pochodzący z adenowirusa o serotypie 5, w porównaniu z komórkami 293 pozbawionymi sekwencji E4-orf6 z Ad5. Jednakże, pojawiły się problemy ze stabilnością wektora, bowiem zaobserwowano nieoczekiwane rekombinacje w roztworach wyjściowych oczyszczonych z łysinek. Dodatkowy problem był związany z zanieczyszczeniem wirusami - adenowirusami typu dzikiego, podczas produkcji. Ponadto, dla wielkoskalowej produkcji adenowirusów nie jest użyteczne współtransfekowanie E4-orf6 dla uzyskania mian, które są dostatecznie wysokie do zastosowania. Jedną opcją hodowania takich adenowirusów jest dostarczenie komórek z genem E4-orf6 stabilnie wbudowanym do genomu linii komórkowej komplementującej/pakującej. Takie komórki opisano w dziedzinie (np. WO 96/22378). Niekorzystną stroną tego systemu jest fakt, że powinny zostać wytworzone nowe, stabilne linie komórkowe i szereg rund selekcji powinno być przeprowadzonych zanim wytworzone zostaną stabilne i odpowiednie komórki. Proces ten jest pracochłonny i czasochłonny. Ogólnie, można stwierdzić, że wytwarzanie i namnażanie adenowirusów o serotypach innych niż serotyp 5 (podgrupa C), takich jak wirusy z podgrupy B, okazało się być trudne na liniach komórkowych komplementujących Ad5. Jak ujawnili zgłaszający w zgłoszeniu w WO 00/70071 rekombinowane wirusy oparte na wirusach podgrupy B Ad35 mogą być wytwarzane przez kotransfekcję konstruktu ekspresyjnego zawierającego sekwencje wczesnego regionu-1 Ad35 (Ad35-E1). Ponadto, wirusy oparte na Ad35, które mają usunięte jedynie sekwencje E1A, a nie E1B okazały się wydajnie replikować w komórkach PER.C6, co sugeruje że białka E1A z Ad5 są w stanie komplementować funkcje Ad35-E1A (jeszcze nie opublikowane Międzynarodowe Zgłoszenie PCT/NL01/00824, Zgłaszającego). Ponadto, doświadczenia pokazują, że brak Ad35-E1B prowadzi do słabego namnażania na komórkach komplementujących Ad5. WO 00/70071 ujawnia również linie komórkowe do wytwarzania wektorów adenowirusowych z grupy nie C z delecją E1 przez dalsze modyfikowanie linii komórkowych, które są zdolne do komplementowania adenowirusów o serotypie 5. WO 00/70071 sugeruje ponadto, że powinny zostać ustalone nowe linie komórkowe niosące sekwencje Ad35-E1 do komplementowania rekombinowanych wektorów adenowirusowych o serotypie 35 pozbawionych regionu E1 (patrz również międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT/NL01/00824, Zgłaszającego). Natomiast, jak również dyskutowano powyżej, jeśli wskazane jest zastosowanie specyficznego serotypu dla specyficznej potrzeby, trzeba ustalić nową linię komórkową dla każdego specyficznego serotypu lub zmodyfikować dostępne linie komórkowe, które mogą komplementować adenowirusa o serotypie 5 dla komplementowania serotypu będącego przedmiotem zainteresowania. Oczywistym jest, że dogodne byłoby stosowanie ustalonych linii komórkowych, które są dostępne w dziedzinie i nie modyfikowanie ich oraz stosowanie ich do wytwarzania wszystkich innych serotypów nie Ad5, stosując ustalone i wydajne sposoby znane w dziedzinie. Podsumując, do niniejszego wynalazku nie były dostępne w dziedzinie plastyczne i odpowiednie platformy produkcyjne" umożliwiające wytwarzanie użytecznych ilości adenowirusów o serotypach innych niż serotypy z grupy C. Krótki opis Figur. Fig. 1 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu ρδμτ.orf6.hygro (Depozyt nr ECACC P ). Dla jasności duże D oznacza delta (Δ). Fig. 2 jest schematycznym przedstawieniem plazmidu pad35.δμτ.orf6. Dla jasności duże D oznacza delta (Δ). Fig. 3 jest schematycznym przedstawieniem puc.35-5e4. Fig. 4 przedstawia etapy klonowania dla uzyskania puc.35-5e4.
4 4 PL B1 Fig. 5 jest schematycznym przedstawieniem pbr.ad35.prn. Fig. 6 jest schematycznym przedstawieniem pbr.ad35.pre4 (Depozyt nr ECACC P ). Fig. 7 jest schematycznym przedstawieniem pwe.ad35.pix-ritr.5e4. Fig. 8 jest schematycznym przedstawieniem pcrscriptamp.nfi.ncoir. Fig. 9 jest schematycznym przedstawieniem pcrscriptamp.ncoifnr2. Fig. 10 jest schematycznym przedstawieniem pcrnf1-nr2. Fig. 11 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowej E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 5 (NR ID. SEKW.:21; górna sekwencja) z sekwencją aminokwasową białka E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 5 sklonowanego w szkielecie Ad35 (NR ID. SEKW.:21; środkowa sekwencja; NB. identyczna z E4-orf6 z Ad5, górna sekwencja) jakie otrzymano przez określenie kolejności nukleotydów i sekwencji aminokwasowej białka E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 35 (NR ID. SEKW.:22; dolna sekwencja) pokazujące, że cały fragment kodujący białko E4-orf6 w szkielecie Adenowirusa o serotypie 35 został zastąpiony przez fragment kodujący białko E4-orf6 z Adenowirusa o serotypie 5. Fig. 12 przedstawia przyrównanie sekwencji aminokwasowych białka E4-orf6/7 z Adenowirusa o serotypie 5 (NR ID. SEKW.:23; górna sekwencja) z sekwencją aminokwasową E4-orf6/7 białka fuzyjnego kodowanego częściowo przez adenowirusa o serotypie 5, fragment E4-orf6/7 zastępujący odpowiadającą mu część fragmentu E4-orf6/7 adenowirusa o serotypie 35 w szkielecie Adenowirusa o serotypie 35 (NR ID. SEKW.:24; środkowa sekwencja) i sekwencja aminokwasowa białka E4-orf6/7 z Adenowirusa o serotypie 35 (NR ID. SEKW.:25, dolna sekwencja); pokazuje, że sekwencja orf6/7 jest częściowo chimerowa z fuzją w przybliżeniu w reszcie lizyny (K) w pozycji 138. Dla jasności, oznaczenie orf6+7 powinno być czytane jako otwarta ramka odczytu orf6/7, która jest oddzielną ramką odczytu w regionie E4 adenowirusów pomiędzy orf6 i orf7, co jest oznaczeniem dobrze znanym specjalistom w dziedzinie. Fig. 13 jest schematycznym przedstawieniem pbrad35.pr.5orf6 (Depozyt nr ECACC P ). Fig. 14 jest schematycznym przedstawieniem pwe.ad35.pix-ritr.5orf6. Fig. 15 jest schematycznym przedstawieniem pbr.ad35.prn E3. Dla jasności D oznacza delta (Δ). Fig. 16 jest schematycznym przedstawieniem pbr.ad35.δε3.pr5e4. Dla jasności D oznacza delta (Δ). Fig. 17 jest schematycznym przedstawieniem pbr.ad35.δε3.pr5orf6. Dla jasności D oznacza delta (Δ). Fig. 18 przedstawia system do wytwarzania rekombinowanych cząsteczek adenowirusa w komórkach takich jak PER.C6 przez podwójną rekombinację homologiczną. Fig. 19 przedstawia pwe.ad35.pix-ecorv. Krótki opis wynalazku. Przedmiotem niniejszego wynalazku jest rekombinowany wektor adenowirusowy, charakteryzujący się tym, że zawiera strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 z adenowirusa o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp. W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp i wspomniany drugi serotyp korzystnie są z różnych podgrup adenowirusa. W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp korzystnie jest z podgrupy innej niż podgrupa C a wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C. W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp korzystnie jest z podgrupy B a wspomniany drugi serotyp jest z podgrupy C. Korzystnie wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi w wektorze według wynalazku z adenowirusa o serotypie 5. W wektorze według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp korzystnie jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50. Korzystnie rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku zawiera ponadto sekwencję kodującą nie-adenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd. Korzystnie wspomniane nie-adenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd w wektorze według wynalazku są wybrane z grupy składającej się z polipeptydu indukującego śmierć komórki, determinanty antygenowej organizmu patogennego, antygenu specyficznego dla guza, białka wirusa, hormonu i cytokiny.
5 PL B1 5 Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i nie-strukturalne elementy adenowirusa nie z podgrupy C o pierwszym serotypie, polegający na tym, że: a. dostarcza się komórkę komplementującą niosącą sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o serotypie 5 (Ad5) w postaci ulegającej ekspresji, z niezbędnymi elementami adenowirusa pozwalającymi na składanie wspomnianego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie nie z podgrupy C i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 Ad5; b. hoduje się wspomnianą komórkę komplementującą w pożywce w warunkach pozwalających na wytwarzanie i składanie wektora adenowirusowego; i c. zbiera się tak wytworzony, rekombinowany wektor adenowirusowy z pożywki i/lub komórki komplementującej, gdzie sekwencja kodująca białko E4-orf6 Ad5 występuje w tak wytworzonym rekombinowanym wektorze adenowirusowym. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem adenowirusa z podgrupy B. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniany pierwszy serotyp wybiera się z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K jest wbudowana do genomu wspomnianej komórki komplementującej. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka pochodzi z pierwotnej, diploidalnej komórki człowieka lub jej komórki progenitorowej. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka komplementująca pochodzi z pierwotnej ludzkiej komórki blastycznej statkówki, pierwotnej ludzkiej komórki zarodkowej nerki, pierwotnej ludzkiej komórki nerwowej lub pierwotnego ludzkiego amniocytu. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka komplementująca posiada wbudowany do swojego genomu kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A Ad5. Korzystnie w sposobie według wynalazku wspomniana komórka komplementująca jest komórką PER.C6 lub jej pochodną. Niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowanych wektorów adenowirusowych zawierających strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą białko E4-orf6, która to wspomniana sekwencja jest wybrana z grupy składającej się z sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o drugim serotypie innym niż serotyp pierwszy. Opisano tu także sekwencję kodującą E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o pierwszym wspomnianym serotypie otrzymaną przez delecję, mutację, insercję i/lub substytucję w jednym lub większej liczbie kodonów oraz sekwencję kodującą E4-orf6 zawierającą fuzję pomiędzy częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z drugiego serotypu innego niż wspomniany pierwszy serotyp i częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z trzeciego serotypu, przy czym wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub różny od wspomnianego pierwszego serotypu. Opisano tu ponadto sposoby wytwarzania takich rekombinowanych wektorów adenowirusowych zawierających elementy strukturalne i niestrukturalne adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany sposób obejmuje etapy: a) dostarczania komplementującej komórki niosącej sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o drugim serotypie w postaci umożliwiającej ekspresję, z niezbędnymi elementami adenowirusa takimi jak pozwalające na składanie wspomnianego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej niektóre elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie innym niż wspomniany drugi serotyp i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6, lub jego funkcjonalną część, jego pochodną i/lub analog, który jest zgodny ze wspomnianym białkiem mogącym ulegać ekspresji we wspomnianej, komplementującej komórce; b) hodowania wspomnianych komplementujących komórek w pożywce w warunkach pozwalających na wytworzenie i złożenie wektora adenowirusowego; i c) zbierania tak wytworzonego, rekombinowanego wektora adenowirusowego z pożywki i/lub komórki komplementującej, przy czym w tak wytworzonym, rekombinowanym wektorze adenowirusowym obecna jest sekwencja kodująca zgodna z białkiem E4-orf6.
6 6 PL B1 Ponadto opisano tu kompozycje farmaceutyczne zawierające wektory adenowirusowe według wynalazku i leczenie osobników przy pomocy wektorów adenowirusowych dostarczonych przez niniejszy wynalazek. Opisano tu również zestaw części obejmujący linie komórkowe i wektory adenowirusowe dostarczone przez wynalazek do realizacji sposobu dostarczonego przez wynalazek. Szczegółowy opis. Niniejszy wynalazek ujawnia sposoby i środki, które rozwiązują pewne trudności związane ze zmniejszoną komplementacją wektorów adenowirusowych z nie-grupy C w komórkach pakujących/komplementujących Ad5. Choć w liniach komórkowych komplementujących Ad5 zachodzi funkcjonalna ekspresja E1B-55K z Ad5, stwierdzono, że wytwarzane mogą być jedynie bardzo niskie miana wektorów adenowirusowych, w przypadku gdy szkielet adenowirusowy pochodził z adenowirusa nie-grupy C; to stwierdzenie oznacza specyficzność serotypową w oddziaływaniu E1B-55K z innym (wirusowym) białkiem. Ujawniono tu, że ta zależność serotypowa może być przełamana przez dostarczenie białka E4-orf6 zgodnego z białkiem E1B-55K dostarczonym przez komplementującą linię komórkową. Jak tu ujawniono, E1B-55K i E4-orf6 tworzą kompleks uczestniczący w hamowaniu transportu komórkowego mrna z jądra komórkowego do cytoplazmy, gdzie kompleks uczestniczy również w pobudzeniu transportu wirusowego mrna z jądra do cytoplazmy. Twórcy niniejszego wynalazku zaobserwowali również, że odpowiednie komplementowanie wektorów wirusowych w komórkach pakujących wymaga obecności produktów genów E1B-55K i E4-orf6, które są zgodne. Komórki pakujące są również określone jako komórki komplementujące jeśli komórki zawierają określone sekwencje kodujące białka komplementujące funkcje nie dostarczane przez wektor, który powinien być zapakowany. Zgodne" w użytym tu znaczeniu oznaczają, że kompleks pomiędzy dostępnym produktem genu E1B-55K jest zdolny do tworzenia funkcjonalnego kompleksu z dostępnym produktem genu E4- orf6 w tym sensie, że kompleks białka podtrzymuje replikację wirusa, namnażanie i/lub pakowanie do poziomu, który jest porównywalny do sytuacji wirusa typu dzikiego, lub który jest porównywalny do sytuacji stwierdzonej gdy wytworzony jest rekombinowany wektor adenowirusowy o serotypie 5 w linii komórkowej komplementującej Ad5 takiej jak 293 lub PER.C6. Replikacja wektora w komórkach pakujących jest wydajna, jeśli podczas etapu produkcji, gdy powstaje wirus, komórka zawiera przynajmniej zgodne białka E1B-55K i E4-orf6. Dogodnie sekwencje E1B-55K i E4-orf6 są z adenowirusa z tej samej podgrupy adenowirusa (takiej jak A, B, C, D, E lub F). Dogodniej sekwencje E1B-55 i E4-orf6 są z tego samego serotypu. Ponieważ w dziedzinie dostępne są ustalone linie komórkowe, które są zdolne wspierać wzrost adenowirusa z podgrupy C, takie jak serotyp 5, jest nawet bardziej zalecane by geny E1B-55K i E4-orf6 pochodziły z adenowirusa o serotypie 5. Dla specjalisty w dziedzinie będzie zrozumiałe, że zgodność może być określona w testach lub oznaczeniach komplementacji takich jak znane specjalistom w dziedzinie wytwarzania wektorów adenowirusowych. Specjaliści w dziedzinie zrozumieją również, że niniejszy wynalazek może również być stosowany do wytwarzania jakiegokolwiek serotypu adenowirusa w jakiejkolwiek komplementującej linii komórkowej pod warunkiem, że białka E1B-55K i E4-orf6 są zgodne. Ponadto, zaobserwowano, że produkt genu E4-orf6 pasujący" do E1B w linii komórek komplementujących, może być dostarczany przez wektor adenowirusowy przez zastąpienie E4-orf6 w wybranym wektorze adenowirusowym, przez sekwencję kodującą E4-orf6, która jest zgodna z genem E1B obecnym w pakującej linii komórkowej. Co zaskakujące, stwierdzono, że modyfikacja ta nie ma szkodliwego wpływu na stabilność, replikację, pakowanie, składanie i wytwarzanie wektora. W specyficznym aspekcie wynalazku można skutecznie wytwarzać adenowirusy o serotypach innych niż te z podgrupy C w liniach komórkowych normalnie stosowanych do wytwarzania adenowirusa o serotypie 5 lub innych serotypów z podgrupy C, takich jak serotyp 1, 2 i 6. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów wytwarzania adenowirusów nie-grupy C bez konieczności oddzielnego dostarczenia komórek komplementujących (pakujących) z E4-orf6, ponieważ sekwencja E4-orf6, która jest zgodna z komplementującą sekwencją E1B-55K, jest włączona w szkielet adenowirusowy. Niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowany wektor adenowirusowy zawierający elementy strukturalne i niestrukturalne adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniany wektor zawiera ponadto sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp. Wspomniana sekwencja może być wybrana z grupy składającej się z: a) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o drugim serotypie innym niż wspomniany pierwszy serotyp; lub b) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie zawierającym delecję, mutację, insercję i/lub substytucję w jednym lub większej liczbie kodonów; i c) sekwencję kodującą E4-orf6 zawierającej fuzję pomiędzy częścią sekwencji ko-
7 PL B1 7 dującej E4-orf6 pochodzącej z drugiego serotypu innego niż wspomniany pierwszy serotyp i część sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z trzeciego serotypu, który to wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub różny niż wspomniany pierwszy serotyp. W jednym z wykonań niniejszy wynalazek dostarcza rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku, w którym wspomniany pierwszy serotyp i wspomniany drugi serotyp są z różnych podgrup adenowirusa. W korzystnym wykonaniu dostarczony jest rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku, w którym wspomniany pierwszy serotyp jest z podgrupy innej niż podgrupa C a wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C. Korzystniejszy jest rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku, w którym to wspomniany pierwszy serotyp jest z podgrupy B a wspomniany drugi serotyp jest z podgrupy C. Jeszcze, gdy wspomniana sekwencja kodująca E4- -orf6 pochodzi z adenowirusa o serotypie 5. Specjaliści w dziedzinie dostrzegli, że u ludzi krążą różne poziomy neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciw różnym serotypom. Stwierdzono, że określone serotypy adenowirusa natrafiają na wysokie miana takich przeciwciał neutralizujących i wiele osobników w różnych populacjach posiada przeciwciała neutralizujące takie serotypy. Stwierdzono również, że określone serotypy były tylko neutralizowane w mniejszości próbek (WO 00/70071). Najwyraźniej, określone serotypy z podgrupy B były neutralizowane jedynie w małej grupie próbek. Co za tym idzie, w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, dostarczone są rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, w których wspomniany pierwszy serotyp jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50. Wysoce zalecane są rekombinowane wektory adenowirusowe, w których wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem 11 lub 35, podczas gdy te spotkane neutralizujące go przeciwciała występują jedynie w bardzo małym procencie badanych próbek. Wektory według wynalazku mogą być stosowane w różnych sytuacjach takich jak terapia genowa, genomika funkcjonalna, szczepienie przeciwko guzowi i/lub szczepienie przeciwwirusowe. Dla tego celu niezbędne jest aby wektor adenowirusowy funkcjonował jako nośnik dostarczający gen, w którym gen nie-natywny jest włączany do genomu adenowirusa. Cząsteczka adenowirusa może następnie być specyficznie adresowana do komórek docelowych będących przedmiotem zainteresowania; adenowirus wiąże się ze specyficznymi komórkami albo przez wiązanie kapsyd-receptor albo innymi sposobami i dostarcza transgen. Adresowanie adenowirusów może być dokonane na wiele różnych sposobów. Specjaliści w dziedzinie adresowania wektora adenowirusowego będą znali wszystkie, różne możliwości, które stosuje się do dostarczania wektorów adenowirusowych do komórek będących przedmiotem zainteresowania. Takie możliwości obejmują, ale bez ograniczenia, zmianę kapsydu (modyfikacji włókna, heksonu i/lub pentonu, takich jak delecje, zamiany pomiędzy włóknami o różnych serotypach i insercje peptydów i/lub innych wiążących cząsteczek), przy czym wytwarzane są włókna chimerowe, które rozpoznają receptor na komórce będącej przedmiotem zainteresowania lub w których wykorzystane jest wiązanie oparte na pentonie. Innymi możliwościami jest związanie adresujących cząsteczek z białkami kapsydu, w których przykładowo wiążące peptydy, znane i silnie wiążące białka lub przeciwciała lub ich części, wiąże się z białkami kapsydu dla osiągnięcia specyficznego adresowania. Takie wektory mogą wszystkie być wyprodukowane przy pomocy sposobów dostarczonych przez niniejszy wynalazek i środków tu opisanych. Co za tym idzie, niniejszy wynalazek ujawnia również rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, zawierające ponadto sekwencję kodującą nieadenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd. Takie sekwencje mogą występować w różnych miejscach w szkielecie adenowirusowym, lecz dogodnie są umiejscowione w regionie E1, którego brak w rekombinowanych wektorach adenowirusowych według wynalazku. Region E1 jest komplementowany przez elementy (komplementacyjne) obecne w komplementujących komorach. Orientacja promotora, transgenu i innych sekwencji regulatorowych może być skierowana ku lewemu, jak również ku prawemu odwróconemu, końcowemu powtórzeniu. Niniejszy wynalazek może również być stosowany do wytwarzania wektorów wirusowych opartych na adenowirusie i/lub innych wirusach, takich jak wirus towarzyszący adenowirusowi (ang. Adeno-Associated Virus, AAV), w którym kombinacja taka jak wirus chimerowy Ad-AAV może wbudować się do genomu komórki gospodarza. W dziedzinie znanych jest wiele sposobów wytwarzania integrujących adenowirusów. Ogólnie, wynalazek jest również użyteczny do wytwarzania postaci adenowirusa, które (specyficznie lub niespecyficznie) mogą integrować. Jak wspomniano, szereg nieadenowirusowych transgenów może być klonowanych do rekombinowanych wektorów adenowirusowych. Korzystnie w sposobie według wynalazku. Obejmują one nie tylko sekwencje regulatorowe kwasu nukleinowego, takie jak wzmacniacze, promotory (np. silne pro-
8 8 PL B1 motory nieadenowirusowe takie jak promotor cytomegalowirusa, promotor SV40 i promotor RSV) i sygnały poliadenylacji, lecz również heterologiczne geny dla celów leczniczych. Dlatego, w jednym aspekcie wynalazku dostarczone są rekombinowane wektory adenowirusowe według wynalazku, w których wspomniane nieadenowirusowe białko, polipeptyd lub peptyd są wybrane z grupy składającej się z: polipeptydu indukującego śmierć komórki, determinanty antygenowej z organizmu patogennego, antygenu specyficznego dla guza, białka wirusowego, hormonu i cytokiny. Przykładami patogennych organizmów są, ale bez ograniczenia, bakterie, wirusy i grzyby. Nieograniczającymi przykładami czynników nieadenowirusowych, białek, polipeptydów i peptydów są czynniki transkrypcyjne, białka sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, fosfatazy, kinazy, czynniki hamujące apoptozę, antagoniści receptora, rozpuszczalne postaci receptorów związanych z błoną, inhibitory RNA, antysensowne RNA, czynniki wabiące, rybozymy i dokładniej, kinaza tymidynowa, erytropoetyna, białka pobudzające nową erytropoezę (NESP), IL3, cenos, gamma-interferon i gp10. W rekombinowanych wektorach adenowirusowych dostarczonych przez sposoby i środki według wynalazku do szczepienia klonowane mogą być białka wirusowe niepochodzące z adenowirusa. Takie białka wirusowe obejmują, ale bez ograniczenia, gag, pol, env, nef, itd. dla szczepionek HIV, białka E6 i E7 dla szczepionek przeciwko ludzkiemu wirusowi brodawczaka, białka circumsporozoitu pierwotniaka Plasmodium dla szczepionek przeciw malarii, składniki rotawirusa dla szczepionek przeciwko rotawirusowi, białka ebola dla szczepionek przeciwko ebola, produkty genu F i G z syncytialnego wirusa układu oddechowego (RSV) dla szczepionek przeciw RSV, HA i NA dla szczepionek przeciw grypie, itd. Rekombinowane adenowirusy według wynalazku zawierają elementy strukturalne i niestrukturalne. Przykładami elementów strukturalnych są geny kodujące białka kapsydu takie jak włókno, hekson i penton, jak również same produkty genu. Przykładami elementów niestrukturalnych są wczesne geny, które ulegają ekspresji po zakażeniu komórki i wraz z postępem cyklu infekcji są tłumione. Innymi przykładami elementów niestrukturalnych są geny kodujące białka aktywne podczas replikacji takie jak pol i ptp. Powinno być zrozumiałe, że rekombinowane wektory adnowirusowe mogą zawierać elementy strukturalne i niestrukturalne pochodzące z różnych serotypów. Przykładami takich wektorów są np. cząsteczki adenowirusowe posiadające chimerowe włókna (patrz zgłoszenie patentowe zgłaszającego WO/03029). Techniki biologii molekularnej stworzyły możliwość konstrukcji nieskończonej liczby kombinacji sekwencji kwasu nukleinowego. Jest jasne, dla specjalisty w dziedzinie biologii molekularnej, że tworzenie kombinacji różnych sekwencji może być przeprowadzone przy użyciu różnych technik molekularnych takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), jak również bezpośredniego subklonowania. Wiele sekwencji użytych w niniejszym wynalazku, jak również sekwencje i konstrukty chimerowe znane w dziedzinie pochodzą z różnych serotypów adenowirusa. Pochodzą" w użytym tu znaczeniu oznacza, że takie kombinacje sekwencji mogą być otrzymane przez bezpośrednie klonowanie sekwencji typu dzikiego otrzymanych z wirusów typu dzikiego, natomiast mogą być one również przykładowo otrzymane przez PCR z użyciem jako matrycy różnych fragmentów DNA. Oznacza to również, że takie sekwencje mogą być w postaci typu dzikiego jak również w postaci zmienionej. Inną możliwością uzyskania takich samych wyników jest łączenie syntetycznego DNA. Powinno być zrozumiałe, że pochodzący" nie oznacza wyłącznie bezpośredniego klonowania DNA dzikiego typu. Specjalista w dziedzinie zna również możliwości biologii molekularnej do uzyskania form zmutowanych określonego kawałka kwasu nukleinowego. Mutacje te mogą wpływać na różne właściwości funkcjonalne, lecz również mogą być milczące w ten sposób, że określone mutacje nie zmieniają właściwości funkcjonalnych szczególnego fragmentu DNA i kodowanego przez niego białka. Co za tym idzie terminy część funkcjonalna, pochodna i/lub jej analog" powinny być rozumiane jako równoważniki kwasu nukleinowego, z którym są spokrewnione. Specjalista w dziedzinie doceni fakt, że określone delecje, zamiany, mutacje (punktowe) insercje, itd. mogą nadal dawać kwas nukleinowy posiadający podobną funkcję co oryginalny kwas nukleinowy. Co za tym idzie, powinno być zrozumiałe, że takie zmiany, które znacząco nie zmieniają funkcjonalności białek takich jak produkt genu E4- -orf6 i E1B-55K są w zakresie niniejszego wynalazku. Pewne zmiany w kwasie nukleinowym, takie jak delecja, mutacja insercja i/lub substytucja w jednym lub większej liczbie kodonów mogą znacząco zmienić strukturę i/lub funkcjonalność kodowanego przez gen produktu. Zatem, opisano tu również sekwencje kodujące E4-orf6 pochodzące z adenowirusa o tym samym serotypie co szkielet niosący geny, na przykład elementy strukturalne i niestrukturalne, lecz w których sekwencja kodująca E4-orf6 została zmutowana tak, że stała się zgodna z białkami E1 (takimi jak produkt genu E1B-55K) obecny w komórce komplementującej, w której wytworzony będzie wektor adenowirusowy. Kodon może być całkowicie zmieniony aby za-
9 PL B1 9 mienić kodowany aminokwas, lecz może być również zmutowany częściowo aby zmienić kodowany aminokwas. Delecje kwasu nukleinowego mogą doprowadzić do utraty jednego lub większej liczby kodowanych aminokwasów; lecz może to również doprowadzić do zmiany ramki odczytu. Niniejszy wynalazek dotyczy również sekwencji E4-orf6 obecnej w kwasie nukleinowym adenowirusa, który zawiera różne części pochodzące z różnych serotypów, w których domena czyniąca białko funkcjonalnym w zgodnym układzie może być użyta z jednego serotypu, podczas gdy pozostała sekwencja E4-orf6 lub jej część pochodzi z innego (nie) spokrewnionego serotypu (przykładowo z tej samej podgrupy, z różnych podgrup lub z różnych gatunków lub ich kombinacji). Co za tym idzie, w niniejszym wynalazku możliwe jest zastosowanie fuzji białkowych E4-orf6, które są zgodne. Takie fuzje białkowe mogą być produktem szeregu fragmentów kwasu nukleinowego. Specjaliście w dziedzinie będzie znany fakt, że poza wszystkimi ludzkimi adenowirusami nauka zidentyfikowała liczne adenowirusy niepochodzące od człowieka. Oczywiście również adenowirusy niepochodzące od człowieka mogą być zastosowane dla uzyskania takich samych wyników jak ujawnione w niniejszym wynalazku. Będzie jasne dla specjalisty w dziedzinie, że zgodność pomiędzy E1B- -55K i E4-orf6 może nie być ograniczona do ludzkich adenowirusów, lecz zgodne mogą być również elementy z adenowirusów specyficznych dla innych gatunków. Tak więc, również kolejnym aspektem wynalazku jest, że niepochodzące od człowieka adenowirusy mogą być wytwarzane w wysokich mianach na znanych liniach komórki pakującej dostępnych nauce tak długo, jak długo zgodne są produkty genów E1B-55K i E4-orf6. Nieograniczającymi przykładami niepochodzących od człowieka adenowirusów, które mogą być wytworzone przy pomocy sposobów według wynalazku i środków tu opisanych są adenowirusy psie, bydlęce, owcze, żabie, świńskie, końskie, małpie i ptasie. Serotypy jakich tu użyto mieszczą się w obrębie ograniczonym gatunkowo. Jeśli przykładowo produkt genu E4-orf6 pochodzącego z małpiego adenowirusa jest zgodny z E1B-55K dostarczonym przez komórkę pakującą to kombinacja ta mieści się w zakresie niniejszego wynalazku. Również, gdy zastosowane są fuzje pomiędzy różnymi serotypami lub pomiędzy sekwencjami E4-orf6 pochodzącymi przykładowo z ludzkiego i ptasiego adenowirusa, który jest zgodny z genem E1B komórki pakującej, to taka szczególna kombinacja jest również w zakresie niniejszego wynalazku. Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i niestrukturalne elementy adenowirusa nie-podgrupy C o pierwszym serotypie, obejmującego etapy: a) dostarczenia komórki komplementującej niosącej sekwencję kodującą E1B-55K pochodzącą z adenowirusa o serotypie 5 (Ad5) w postaci umożliwiającej ekspresję, z niezbędnymi elementami adenowirusa tak, aby możliwe było składanie wspomnianego zrkombinowanego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne elementy strukturalne i niestrukturalne z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie nie-podgrupy C i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4- -orf6 Ad5, b) hodowania wspomnianej komórki komplementującej w pożywce w warunkach, w których ma miejsce produkcja i składanie wektora adenowirusowego; i c) zbierania tak wytworzonego rekombinowanego wektora adenowirusowego z pożywki i/lub komórki komplementującej, w której sekwencja kodująca białko E4-orf6 Ad5 występuje w tak wytworzonym, rekombinowanym wektorze adenowirusowym. Opisano tu również sposób, w którym wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 jest wybrana z grupy obejmującej: i) sekwencję kodującą E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o wspomnianym drugim serotypie; ii) sekwencję kodującę E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o trzecim serotypie innym niż wspomniany serotyp pierwszy i drugi; iii) sekwencję kodującą E4-orf6 pochodzącą z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie zawierającą delecję, mutacje insercję i/lub substytucję w jednym lub większej liczbie kodonów; i iv) sekwencję kodującą E4-orf6 zawierającą fuzję pomiędzy sekwencją kodującą E4-orf6 pochodzącą z trzeciego serotypu i część sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym drugim serotypie, przy czym wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub inny niż wspomniany pierwszy serotyp. W opisanej tu realizacji wspomniany pierwszy i wspomniany drugi serotyp są z różnych podgrup. W bardziej zalecanej postaci wspomniany drugi serotyp jest adenowirusem o serotypie 5. W innym, szczególnym aspekcie wynalazku, wspomniany pierwszy serotyp jest serotypem adenowirusa z podgrupy B. Korzystnie, wspomniany pierwszy serotyp jest wybrany z grupy składającej się z serotypów adenowirusa 11, 14, 16, 21, 34, 35 i 50. W dziedzinie znanych jest szereg komórek pakujących, używanych do komplementowania rekombinowanych wektorów adenowirusowych i produkcji, składania i pakowania cząsteczek adnowirusa. Nieograniczającymi przykładami takich linii komórkowych są komórki HEK-293, 911 i PER.C6.
10 10 PL B1 Zalecane jest zastosowanie linii komórkowych, które już potwierdzono jako dające zawiesiny adenowirusa o wysokim mianie. Takie linie komórkowe wytwarzają w stabilny sposób białka E1, dlatego korzystnym aspektem wynalazku jest zastosowanie linii komórkowych i sposobów, w których wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K jest wbudowana do genomu wspomnianej komórki komplementującej. Korzystne są takie komórki komplementujące pochodzące z pierwotnej diploidalnej komórki człowieka lub jej komórki progenitorowej. Jeszcze korzystniej, wspomniana komórka komplementująca pochodzi z pierwotnej ludzkiej komórki blastycznej siatkówki, pierwotnej ludzkiej komórki zarodkowej nerki, pierwotnej ludzkiej komórki nerwowej lub pierwotnego ludzkiego amniocytu. Bardzo korzystne jest użycie komórki komplementującej w sposobie według wynalazku, w którym wspomniana komórka komplementująca jest komórką PER.C6 lub jej pochodną. Komórki PER.C6 są dobrze znane w dziedzinie, ponieważ nie dają zdolnych do replikacji adenowirusów, gdy użyty jest adenowirusowy DNA nieposiadający części wspólnej z kwasem nukleinowym dostarczonym przez komórkę. Wiele wektorów adenowirusowych używanych przez naukowców utraciło region E1, dlatego w jednym aspekcie wynalazku, wspomniana komórka komplementująca posiada wbudowany do jej genomu kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A z Ad5 adenowirusa. Dogodnie, wspomniany kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno adenowirusowe białko E1A pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy innej niż podgrupa B. Dogodniej, wspomniany kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno białko E1A z adenowirusa pochodzi z adenowirusa o serotypie z podgrupy C. Zalecane są postaci, w których wspomniany kwas nukleinowy kodujący przynajmniej jedno adenowirusowe białko E1A pochodzi z adenowirusa o serotypie 5. Opisano tu również sposób, w którym wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą z adenowirusów o różnych serotypach i w którym wspomniane różne serotypy adenowirusa są przedstawicielami tej samej podgrupy adenowirusa. Dogodnie, wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą od adenowirusów o różnych serotypach i przy czym wspomniane różne serotypy adenowirusów są przedstawicielami podgrupy C. Dogodniej wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą z tego samego serotypu adenowirusa. Zalecane są sposoby, w których wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 i wspomniana sekwencja kodująca E1B-55K pochodzą z adenowirusa o serotypie 5. Opisano tu również kompozycję farmaceutyczną zawierającą rekombinowany wektor adenowirusowy według wynalazku lub którą można otrzymać sposobem dostarczonym przez wynalazek. Kompozycja farmaceutyczna zawiera ponadto, nośnik dopuszczalny farmaceutycznie, powszechnie stosowany przez specjalistów w dziedzinie przygotowywania farmaceutyków. Ponadto opisano tu również sposób leczenia ludzkiego ciała obejmujący podawanie do ciała człowieka rekombinowanego wektora adenowirusowego według wynalazku lub kompozycji farmaceutycznej tu opisanej. Opisano tu również sposoby wytwarzania wektorów adenowirusowych przy pomocy odpowiednich komórek komplementujących/pakujących i wektora adenowirusowego będącego przedmiotem zainteresowania. Do wydajnego procesu produkcji użyteczne jest zastosowanie odpowiednich komórek z odpowiednim wektorem adenowirusowym. W związku z tym opisano tu również zestaw części obejmujący: komórkę komplementującą do wytwarzania rekombinowanego wektora adenowirusowego zawierającego strukturalne i niestrukturalne elementy adenowirusa o pierwszym serotypie, przy czym wspomniana komórka niesie sekwencję kodującą E1B-55K lub jej funkcjonalną część, pochodną i/lub analog, pochodzące z adenowirusa o drugim serotypie w postaci ulegającej ekspresji; i b) na jednym lub więcej ulegających replikacji wektorowych kwasach nukleinowych wszystkie niezbędne elementy adenowirusa tak, aby umożliwić składanie wspomnianego rekombinowanego wektora adenowirusowego przez wspomnianą komórkę komplementującą, przy czym wspomniane elementy zawierają przynajmniej pewne strukturalne i niestrukturalne elementy z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie innym niż wspomniany drugi serotyp i sekwencję kodującą funkcjonalne białko E4-orf6 lub jego funkcjonalną część, pochodną i/lub analog, który jest zgodny ze wspomnianym ulegającym ekspresji białkiem E1B- -55K we wspomnianej komplementującej komórce. Zalecane są zestawy części, w których wspomniana sekwencja kodująca E4-orf6 jest wybrana z grupy składającej się z: a) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym drugim serotypie; b) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adnowirusa o trzecim serotypie innym niż wspomniany pierwszy i drugi serotyp; c) sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adenowirusa o wspomnianym pierwszym serotypie zawierającej delecję, mutację, insercję i/lub substytucję jednego lub większej liczby kodonów i d) sekwencji kodującej E4-orf6 zawierającej fuzję pomiędzy częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z trzeciego serotypu i częścią sekwencji kodującej E4-orf6 pochodzącej z adnowirusa o wspomnianym drugim
11 PL B1 11 serotypie, przy czym wspomniany trzeci serotyp może być identyczny z lub inny niż wspomniany pierwszy serotyp. Wynalazek jest szczególnie użyteczny do replikacji chimerowych adenowirusów z delecją E1, które niemal w całości pochodzą od serotypu innego niż adenowirus 5. Takim wektorom trzeba jedynie dostarczyć kwas nukleinowy kodujący E4-orf6 z adenowirusa 5. Po jego dostarczeniu wektor może wydajnie replikować się w normalnych liniach komórkowych komplementujących i pakujących adenowirusowych 5 E1. Stabilność wektorów jest poprawiona i wektory mogą być komplementowane zarówno dla delecji E1A, jak i E1B. Przez dostarczenie takim wektorom kwasu nukleinowego, kodującego adenowirusowe E4-orf6 jest możliwe poprawienie wydajności oczyszczania z łysinki i uzyskanie dobrej wydajności przy braku dodatkowych problemów z zanieczyszczeniami typem dzikim, gdy hodowla jest prowadzona na komórkach 293 lub 911. W PER.C6 oczywiście zanieczyszczeniu adenowirusem typu dzikiego można również zapobiec innymi sposobami. Dodatkową zaletą rekombinowanego wektora według wynalazku jest to, że nie ma potrzeby wytwarzania specjalnych linii komórek adenowirusa E4-orf6 z kwasu nukleinowego wbudowanego do genomu. Choć takie linie komórkowe istnieją, nie są one łatwo utrzymywane w niezmienionej postaci. Jest to po części związane z faktem, że przy większej liczbie obcych genów wbudowanych do genomu linii komórkowej trudno jest utrzymać stabilność obcych sekwencji (lub ich ekspresję). W niniejszym wynalazku stwierdzono, że przynajmniej niektóre problemy związane z niską wydajnością wektorów opartych na nieadenowirusowym serotypie 5 i stabilnością wektorów adenowirusowych o serotypach z podgrupy B, takich jak serotyp adenowirusa 7, 11 i 35 w liniach komórkowych pakujących adenowirus o serotypie 5 można ominąć przy pomocy rekombinowanego wektora adenowirusowego według wynalazku. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie wirusów Ad35 z delecją E1 wytwarzających E4-Orf6 z Ad5 w linii komórkowej komplementującej Ad5 Sekwencjonowanie genomu adenowirusa o serotypie 35 jak również konstruowanie systemu wektora opartego na plazmidzie i wytworzenie rekombinowanych wirusów opartych na Ad35 opisano szczegółowo w WO 00/ Klonowanie sekwencji kodującej Ad5-E4-orf6 w padapt35ip1 (nr depozytu ECACC P , dla szczegółów klonowania tego plazmidu patrz WO 00/70071) przeprowadzono jak następuje. Plazmid strawiono NheI i AvrII i zdefosforylowano fosfatazą z jelita cielęcia (New England Biolabs). Strawiony DNA wyizolowano z żelu przy pomocy zestawu GeneClean. Plazmid ρδμτ.orf6.hygro (Fig. 1, nr depozytu ECACC P ) strawiono NheI i następnie częściowo strawiono XbaI. Po rozdzieleniu uzyskanych pasm w żelu, fragment 1350 pz odpowiadający promotorowi ΔΜΤ połączonemu z sekwencją E4-orf6 oczyszczono z żelu. Następnie oba wyizolowane fragmenty połączono przy pomocy ligazy i wprowadzono przez transformację do elektrokompetentnych komórek DH10B (Invitrogen/Life Technologies), po czym wyselekcjonowano, w celu wytworzenia DNA na dużą skalę, kolonię ze wstawką w prawidłowej orientacji względem sygnału poliadenylacji SV40. Dało to konstrukt pad35. MT.Orf6 (Fig. 2) zawierający sekwencję kodującą E4-orf6 z Ad5, połączoną funkcjonalnie ze zmutowanym promotorem metalotioneiny (ΔΜΤ). Promotor ΔΜΤ został opisany przez Hagmayer i wsp. (1996). Sekwencja E4.orf6 z Ad5 odpowiada nukleotydom do w sekwencji Ad5 (Genbank nr dostępu M73260). Dla sprawdzenia czy ekspresja białek E4-orf6 z Ad5 umożliwi wytwarzanie wektorów Ad35 z pełną delecją E1 w komórkach komplementujących Ad5, pad35.δμτ.orf6 kotransformowano ze szkieletowym konstruktem Ad35 pwe.ad35.pix-ritr do komórek PER.C6. W tym celu pad35.δμτ.orf6 strawiono PI-Psp-1, a pwe.ad35.pix-ritr strawiono NotI aby uwolnić wstawki adenowirusowe ze szkieletu. 2 μg strawionego pad35.δμτ.orf6 i 6 µg strawionego pwe.ad35.pix-ritr transfekowano przy pomocy LipofectAmine. Mieszaninę transfekcyjną dodano do komórek PER.C6, które wysiano dzień wcześniej przy gęstości 3,5x10 6 komórek na kolbę T25. Następnego dnia pożywkę zmieniono na pożywkę do hodowli PER.C6 (DMEM z 10% FBS i 10 mm MgCl 2 ) i komórki dalej inkubowano w 37 C/10% CO 2. Transfekcje kontrolne przeprowadzano przy pomocy padapt35.luc kotransfekując z pwe.ad35.pix-ritr i samym pwe.ad35.pix-ritr. Dwa dni po transfekcji komórki przeszczepiano z kolb T25 do T80 i inkubowano jak opisano. Ponownie, 3 dni później hodowle stransfekowane pad35.δμτ.orf6 wraz ze szkieletem Ad35 ujawniły efekt cytopatogenny (CPE) wykazujący replikację wirusa i zebrano je (łącznie komórki i pożywkę) po dalszej, trwającej dwa dni inkubacji. Zawiesinę komórek poddano dwu rundom cykli zamrażanie/rozmrażanie i otrzymany materiał (nieoczyszczony lizat) trzymano w -20 C aż do dalszego użycia. Inne kolbynie wykazywały CPE i były
WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE. Ewa Waszkowska ekspert UPRP
WYNALAZKI BIOTECHNOLOGICZNE W POLSCE Ewa Waszkowska ekspert UPRP Źródła informacji w biotechnologii projekt SLING Warszawa, 9-10.12.2010 PLAN WYSTĄPIENIA Umocowania prawne Wynalazki biotechnologiczne Statystyka
Bardziej szczegółowoKlonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP
Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane
Bardziej szczegółowoWybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna
Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu np. w porównaniu z analizą trankryptomu:
Bardziej szczegółowoProteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych
Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać
Bardziej szczegółowoDr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany
1 2 3 Drożdże są najprostszymi Eukariontami 4 Eucaryota Procaryota 5 6 Informacja genetyczna dla każdej komórki drożdży jest identyczna A zatem każda komórka koduje w DNA wszystkie swoje substancje 7 Przy
Bardziej szczegółowoKLONOWANIE DNA REKOMBINACJA DNA WEKTORY
KLONOWANIE DNA Klonowanie DNA jest techniką powielania fragmentów DNA DNA można powielać w komórkach (replikacja in vivo) W probówce (PCR) Do przeniesienia fragmentu DNA do komórek gospodarza potrzebny
Bardziej szczegółowoWybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna
Wybrane techniki badania białek -proteomika funkcjonalna Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich (lub prawie wszystkich) białek komórkowych Zalety analizy proteomu w porównaniu z analizą trankryptomu:
Bardziej szczegółowoInżynieria genetyczna- 6 ECTS. Inżynieria genetyczna. Podstawowe pojęcia Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka
Inżynieria genetyczna- 6 ECTS Część I Badanie ekspresji genów Podstawy klonowania i różnicowania transformantów Kolokwium (14pkt) Część II Klonowanie ekspresyjne Od genu do białka Kolokwium (26pkt) EGZAMIN
Bardziej szczegółowoNowoczesne systemy ekspresji genów
Nowoczesne systemy ekspresji genów Ekspresja genów w organizmach żywych GEN - pojęcia podstawowe promotor sekwencja kodująca RNA terminator gen Gen - odcinek DNA zawierający zakodowaną informację wystarczającą
Bardziej szczegółowoROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) / z dnia r.
KOMISJA EUROPEJSKA Bruksela, dnia 29.5.2018 C(2018) 3193 final ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) / z dnia 29.5.2018 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 847/2000 w odniesieniu do definicji pojęcia podobnego
Bardziej szczegółowoZawartość. Wstęp 1. Historia wirusologii. 2. Klasyfikacja wirusów
Zawartość 139585 Wstęp 1. Historia wirusologii 2. Klasyfikacja wirusów 3. Struktura cząstek wirusowych 3.1. Metody określania struktury cząstek wirusowych 3.2. Budowa cząstek wirusowych o strukturze helikalnej
Bardziej szczegółowoInwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii
Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych dr Małgorzata Kozłowska Ekspert w UPRP dr Ewa Waszkowska
Bardziej szczegółowoAgenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa
dr Bartosz Walter Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna Co może byd wynalazkiem Wynalazek biotechnologiczny Ochrona patentowa Procedura zgłoszenia patentowego Gdzie, kiedy i jak warto patentowad
Bardziej szczegółowopaździernika 2013: Elementarz biologii molekularnej. Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II
10 października 2013: Elementarz biologii molekularnej www.bioalgorithms.info Wykład nr 2 BIOINFORMATYKA rok II Komórka: strukturalna i funkcjonalne jednostka organizmu żywego Jądro komórkowe: chroniona
Bardziej szczegółowoTERAPIA GENOWA. dr Marta Żebrowska
TERAPIA GENOWA dr Marta Żebrowska Pracownia Diagnostyki Molekularnej i Farmakogenomiki, Zakładu Biochemii Farmaceutycznej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Źródło zdjęcia: httpblog.ebdna.plindex.phpjednoznajwiekszychzagrozenludzkosciwciazniepokonane
Bardziej szczegółowoTATA box. Enhancery. CGCG ekson intron ekson intron ekson CZĘŚĆ KODUJĄCA GENU TERMINATOR. Elementy regulatorowe
Promotory genu Promotor bliski leży w odległości do 40 pz od miejsca startu transkrypcji, zawiera kasetę TATA. Kaseta TATA to silnie konserwowana sekwencja TATAAAA, występująca w większości promotorów
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ 1. Gen to odcinek DNA odpowiedzialny
Bardziej szczegółowoPatentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii
chroń swoje pomysły 3 Kongres Świata Przemysłu Farmaceutycznego Poznań, 16-17 czerwca 2011 Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii dr Izabela Milczarek Czym jest biotechnologia? Biotechnologia,
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 5 Droga od genu do
Bardziej szczegółowoPytania Egzamin magisterski
Pytania Egzamin magisterski Międzyuczelniany Wydział Biotechnologii UG i GUMed 1. Krótko omów jakie informacje powinny być zawarte w typowych rozdziałach publikacji naukowej: Wstęp, Materiały i Metody,
Bardziej szczegółowoInformacje dotyczące pracy kontrolnej
Informacje dotyczące pracy kontrolnej Słuchacze, którzy z przyczyn usprawiedliwionych nie przystąpili do pracy kontrolnej lub otrzymali z niej ocenę negatywną zobowiązani są do dnia 06 grudnia 2015 r.
Bardziej szczegółowoInwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii
Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych aspekty praktyczne dr Małgorzata Kozłowska Ekspert
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 4 Jak działają geny?
Bardziej szczegółowoGeny i działania na nich
Metody bioinformatyki Geny i działania na nich prof. dr hab. Jan Mulawka Trzy królestwa w biologii Prokaryota organizmy, których komórki nie zawierają jądra, np. bakterie Eukaryota - organizmy, których
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2152872. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 21.05.2008 08748815.
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 212872 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 21.0.08 0874881.1 (97)
Bardziej szczegółowoInżynieria Genetyczna ćw. 3
Materiały do ćwiczeń z przedmiotu Genetyka z inżynierią genetyczną D - blok Inżynieria Genetyczna ćw. 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, rok akad. 2018/2019
Bardziej szczegółowoWykład 14 Biosynteza białek
BIOCHEMIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr III Wykład 14 Biosynteza białek WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH
Bardziej szczegółowoGdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle. czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych
Gdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych Wirusy zwiększające ryzyko rozwoju nowotworów HBV EBV HCV HTLV HPV HHV-8 Zmniejszenie liczby zgonów spowodowanych
Bardziej szczegółowoEkspresja białek w komórkach ssaczych
Ekspresja białek w komórkach ssaczych Ekspresja białek w komórkach ssaczych Używane powszechnie w laboratoriach ssacze linie komórkowe są zmodyfikowane w celu pełnienia roli gospodarza ekspresji białek
Bardziej szczegółowoTRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów
Eksparesja genów TRANSKRYPCJA - I etap ekspresji genów Przepisywanie informacji genetycznej z makrocząsteczki DNA na mniejsze i bardziej funkcjonalne cząsteczki pre-mrna Polimeraza RNA ETAP I Inicjacja
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2764103 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.12.2013 13824232.6 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/63 (2006.01)
Bardziej szczegółowo(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/FR00/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 210590 (21) Numer zgłoszenia: 354099 (22) Data zgłoszenia: 05.10.2000 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Bardziej szczegółowoBadanie funkcji genu
Badanie funkcji genu Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2.
Bardziej szczegółowoMożliwości współczesnej inżynierii genetycznej w obszarze biotechnologii
Możliwości współczesnej inżynierii genetycznej w obszarze biotechnologii 1. Technologia rekombinowanego DNA jest podstawą uzyskiwania genetycznie zmodyfikowanych organizmów 2. Medycyna i ochrona zdrowia
Bardziej szczegółowoPL 217144 B1. Sposób amplifikacji DNA w łańcuchowej reakcji polimerazy za pomocą starterów specyficznych dla genu receptora 2-adrenergicznego
PL 217144 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 217144 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391926 (22) Data zgłoszenia: 23.07.2010 (51) Int.Cl.
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2135881 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.06.2006 09010789.7
Bardziej szczegółowoDNA musi współdziałać z białkami!
DNA musi współdziałać z białkami! Specyficzność oddziaływań między DNA a białkami wiążącymi DNA zależy od: zmian konformacyjnych wzdłuż cząsteczki DNA zróżnicowania struktury DNA wynikającego z sekwencji
Bardziej szczegółowoDopasowanie sekwencji (sequence alignment)
Co to jest alignment? Dopasowanie sekwencji (sequence alignment) Alignment jest sposobem dopasowania struktur pierwszorzędowych DNA, RNA lub białek do zidentyfikowanych regionów w celu określenia podobieństwa;
Bardziej szczegółowoMutacje jako źródło różnorodności wewnątrzgatunkowej
Mutacje jako źródło różnorodności wewnątrzgatunkowej Zajęcia terenowe: Zajęcia w klasie: Poziom nauczania oraz odniesienie do podstawy programowej: Liceum IV etap edukacyjny zakres rozszerzony: Różnorodność
Bardziej szczegółowoSPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO
Załącznik nr 2 SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO CZĘŚĆ I - STRESZCZENIE DOKUMENTACJI I A IB I B 1 I
Bardziej szczegółowoZasady oceniania rozwiązań zadań 48 Olimpiada Biologiczna Etap centralny
Zasady oceniania rozwiązań zadań 48 Olimpiada Biologiczna Etap centralny Zadanie 1 1 pkt. za prawidłowe podanie typów dla obydwu zwierząt oznaczonych literami A oraz B. A. ramienionogi, B. mięczaki A.
Bardziej szczegółowoWYKŁAD: Klasyczny przepływ informacji ( Dogmat) Klasyczny przepływ informacji. Ekspresja genów realizacja informacji zawartej w genach
WYKŁAD: Ekspresja genów realizacja informacji zawartej w genach Prof. hab. n. med. Małgorzata Milkiewicz Zakład Biologii Medycznej Klasyczny przepływ informacji ( Dogmat) Białka Retrowirusy Białka Klasyczny
Bardziej szczegółowoDominika Stelmach Gr. 10B2
Dominika Stelmach Gr. 10B2 Czym jest DNA? Wielkocząsteczkowy organiczny związek chemiczny z grupy kwasów nukleinowych Zawiera kwas deoksyrybonukleoinowy U organizmów eukariotycznych zlokalizowany w jądrze
Bardziej szczegółowoWarszawa, dnia 3 sierpnia 2016 r. Poz. 1173
Warszawa, dnia 3 sierpnia 2016 r. Poz. 1173 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 18 lipca 2016 r. w sprawie określenia wzorów wniosków oraz zgłoszeń związanych z zamkniętym użyciem mikroorganizmów
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowoThe Role of Maf1 Protein in trna Processing and Stabilization / Rola białka Maf1 w dojrzewaniu i kontroli stabilności trna
Streszczenie rozprawy doktorskiej pt. The Role of Maf1 Protein in trna Processing and Stabilization / Rola białka Maf1 w dojrzewaniu i kontroli stabilności trna mgr Tomasz Turowski, promotor prof. dr hab.
Bardziej szczegółowoFOCUS Plus - Silniejsza ryba radzi sobie lepiej w trudnych warunkach
FOCUS Plus - Silniejsza ryba radzi sobie lepiej w trudnych warunkach FOCUS Plus to dodatek dostępny dla standardowych pasz tuczowych BioMaru, dostosowany specjalnie do potrzeb ryb narażonych na trudne
Bardziej szczegółowoBadanie funkcji genu
Badanie funkcji genu Funkcję genu można zbadać różnymi sposobami Przypadkowa analizy funkcji genu MUTACJA FENOTYP GEN Strategia ukierunkowanej analizy funkcji genu GEN 1. wprowadzenie mutacji w genie 2.
Bardziej szczegółowoAnalizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych???
Analizy DNA in silico - czyli czego można szukać i co można znaleźć w sekwencjach nukleotydowych??? Alfabet kwasów nukleinowych jest stosunkowo ubogi!!! Dla sekwencji DNA (RNA) stosuje się zasadniczo*
Bardziej szczegółowoCo to jest transkryptom? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2
ALEKSANDRA ŚWIERCZ Co to jest transkryptom? A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH 2 Ekspresja genów http://genome.wellcome.ac.uk/doc_wtd020757.html A. Świercz ANALIZA DANYCH WYSOKOPRZEPUSTOWYCH
Bardziej szczegółowo(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 205575 (21) Numer zgłoszenia: 366842 (22) Data zgłoszenia: 24.04.2002 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Bardziej szczegółowoInżynieria genetyczna
Inżynieria genetyczna i technologia rekombinowanego DNA Dr n. biol. Urszula Wasik Zakład Biologii Medycznej Inżynieria genetyczna świadoma, celowa, kontrolowana ingerencja w materiał genetyczny organizmów
Bardziej szczegółowoS YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma c j e ogólne
Załącznik Nr 3 do Uchwały Senatu PUM 14/2012 S YL AB US MODUŁ U ( PRZEDMIOTU) I nforma c j e ogólne Kod modułu Rodzaj modułu Wydział PUM Kierunek studiów Specjalność Poziom studiów Nazwa modułu INŻYNIERIA
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Budowa rybosomu Translacja
Bardziej szczegółowoSPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO
Załącznik nr 2 SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO CZĘŚĆ I STRESZCZENIE DOKUMENTACJI I A Wniosek o dopuszczenie
Bardziej szczegółowoBiologia molekularna z genetyką
Biologia molekularna z genetyką P. Golik i M. Koper Konwersatorium 3: Analiza genetyczna eukariontów Saccharomyces cerevisiae Makrokierunek: Bioinformatyka i Biologia Systemów; 2016 Opracowano na podstawie
Bardziej szczegółowoKlonowanie i transgeneza. dr n.med. Katarzyna Wicher
Klonowanie i transgeneza dr n.med. Katarzyna Wicher Klonowanie proces tworzenia idealnej kopii z oryginału oznacza powstawanie lub otrzymywanie genetycznie identycznych: cząsteczek DNA komórek organizmów
Bardziej szczegółowo(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 08.03.2000, PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204373 (21) Numer zgłoszenia: 351486 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 08.03.2000 (86) Data i numer zgłoszenia
Bardziej szczegółowoWprowadzenie. DNA i białka. W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej.
Wprowadzenie DNA i białka W uproszczeniu: program działania żywego organizmu zapisany jest w nici DNA i wykonuje się na maszynie białkowej. Białka: łańcuchy złożone z aminokwasów (kilkadziesiąt kilkadziesiąt
Bardziej szczegółowoBiologia molekularna wirusów. Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego.
Biologia molekularna wirusów Materiały dydaktyczne współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. Co to jest wirus? Cząsteczka złożona z kwasu nukleinowego (DNA
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowoTHE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE
THE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE Anna Czarnecka Źródło: Intercellular signaling from the endoplasmatic reticulum to the nucleus: the unfolded protein response in yeast and mammals Ch. Patil & P. Walter The
Bardziej szczegółowoGeny, a funkcjonowanie organizmu
Geny, a funkcjonowanie organizmu Wprowadzenie do genów letalnych Geny kodują Białka Kwasy rybonukleinowe 1 Geny Występują zwykle w 2 kopiach Kopia pochodząca od matki Kopia pochodząca od ojca Ekspresji
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 16821 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 11..04 04768811.4 (97)
Bardziej szczegółowowykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki
Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Ekspresja genów jest regulowana
Bardziej szczegółowo(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197408 (21) Numer zgłoszenia: 346772 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 21.09.1999 (86) Data i numer zgłoszenia
Bardziej szczegółowoMetody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA
Metody odczytu kolejności nukleotydów - sekwencjonowania DNA 1. Metoda chemicznej degradacji DNA (metoda Maxama i Gilberta 1977) 2. Metoda terminacji syntezy łańcucha DNA - klasyczna metoda Sangera (Sanger
Bardziej szczegółowoHybrydyzacja kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych Jaka jest lokalizacja genu na chromosomie? Jakie jest jego sąsiedztwo? Hybrydyzacja - powstawanie stabilnych struktur dwuniciowych z cząsteczek jednoniciowych o komplementarnych
Bardziej szczegółowoSCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU
SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU Czy priony zawsze są szkodliwe? SPIS TREŚCI: Wprowadzenie. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. Karty pracy. 1.
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowoDrożdżowe systemy ekspresyjne
Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli
Bardziej szczegółowoSpis treści. Przedmowa... XI. Wprowadzenie i biologiczne bazy danych. 1 Wprowadzenie... 3. 2 Wprowadzenie do biologicznych baz danych...
Przedmowa... XI Część pierwsza Wprowadzenie i biologiczne bazy danych 1 Wprowadzenie... 3 Czym jest bioinformatyka?... 5 Cele... 5 Zakres zainteresowań... 6 Zastosowania... 7 Ograniczenia... 8 Przyszłe
Bardziej szczegółowoWNIOSEK O WYDANIE ZGODY NA ZAMKNIĘTE UŻYCIE GMO
WNIOSEK O WYDANIE ZGODY NA ZAMKNIĘTE UŻYCIE GMO 1. Informacje o użytkowniku GMO i osobach odpowiedzialnych za realizację planowanego zamkniętego użycia GMO 1.1 (*) Nazwa i siedziba użytkownika lub imię,
Bardziej szczegółowoPODSTAWY IMMUNOLOGII Komórki i cząsteczki biorące udział w odporności nabytej (cz.i): wprowadzenie (komórki, receptory, rozwój odporności nabytej)
PODSTAWY IMMUNOLOGII Komórki i cząsteczki biorące udział w odporności nabytej (cz.i): wprowadzenie (komórki, receptory, rozwój odporności nabytej) Nadzieja Drela ndrela@biol.uw.edu.pl Konspekt do wykładu
Bardziej szczegółowoDiagnostyka wirusologiczna w praktyce klinicznej
Diagnostyka wirusologiczna w praktyce klinicznej Ponad 60% zakażeń w praktyce klinicznej jest wywołana przez wirusy. Rodzaj i jakość materiału diagnostycznego (transport!) oraz interpretacja wyników badań
Bardziej szczegółowo2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy
Metody analizy DNA 1. Budowa DNA. 2. Enzymy pozwalające na manipulację DNA a. Polimerazy DNA b. Nukleazy c. Ligazy 3. Klonowanie in vivo a. w bakteriach, wektory plazmidowe b. w fagach, kosmidy c. w drożdżach,
Bardziej szczegółowo(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.12.1999,PCT/EP99/09864 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202483 (21) Numer zgłoszenia: 349335 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 13.12.1999 (86) Data i numer zgłoszenia
Bardziej szczegółowoTematyka zajęć z biologii
Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania
Bardziej szczegółowoDane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska
Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 197092 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 22.11.06 06824279.1 (13) (1) T3 Int.Cl. A61K 3/36 (06.01) A61P
Bardziej szczegółowoĆwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:
Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================
Bardziej szczegółowoMaking the impossible possible: the metamorphosis of Polish Biology Olympiad
Making the impossible possible: the metamorphosis of Polish Biology Olympiad Takao Ishikawa Faculty of Biology, University of Warsaw, Poland Performance of Polish students at IBO Gold Silver Bronze Merit
Bardziej szczegółowoSylabus Biologia molekularna
Sylabus Biologia molekularna 1. Metryczka Nazwa Wydziału Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Program kształcenia Farmacja, jednolite studia magisterskie, forma studiów: stacjonarne
Bardziej szczegółowoBiotechnologia i inżynieria genetyczna
Wersja A Test podsumowujący rozdział II i inżynieria genetyczna..................................... Imię i nazwisko.............................. Data Klasa oniższy test składa się z 16 zadań. rzy każdym
Bardziej szczegółowo(12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) O PIS PATENTOWY (19) PL (11) 159844 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 273721 ( 2) Data zgłoszenia: 14.07.1988 (51) IntCl.5: C12N 15/51
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowoPL B1. Sposób i układ do modyfikacji widma sygnału ultraszerokopasmowego radia impulsowego. POLITECHNIKA GDAŃSKA, Gdańsk, PL
PL 219313 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 219313 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 391153 (51) Int.Cl. H04B 7/00 (2006.01) H04B 7/005 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1674111 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.07.2005 05760156.9
Bardziej szczegółowoBezpośrednia embriogeneza somatyczna
Bezpośrednia embriogeneza somatyczna Zarodki somatyczne formują się bezpośrednio tylko z tych komórek roślinnych, które są kompetentne już w momencie izolowania z rośliny macierzystej, czyli z proembriogenicznie
Bardziej szczegółowoIndukowane pluripotencjalne komórki macierzyste
Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste Nagroda Nogla w dziedzinie medycyny i fizjologii z roku 2012 dla Brytyjczyka John B.Gurdon oraz Japooczyka Shinya Yamanaka Wykonały: Katarzyna Białek Katarzyna
Bardziej szczegółowoPowodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów:
Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru szeregu parametrów: dobór warunków samej reakcji PCR (temperatury, czas trwania cykli, ilości cykli itp.) dobór odpowiednich starterów do reakcji amplifikacji
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1767642 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 19.11.2004 04797352.4
Bardziej szczegółowoPodstawy mikrobiologii. Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej
Podstawy mikrobiologii Wykład 3 Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej Budowa wirusów Wirusy nie mają budowy komórkowej, zatem pod względem biologicznym nie są organizmami Ŝywymi! Są to twory nukleinowo
Bardziej szczegółowo(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21081 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201738 (21) Numer zgłoszenia: 355963 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 14.09.1999 (86) Data i numer zgłoszenia
Bardziej szczegółowoLEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE
LEKI CHEMICZNE A LEKI BIOLOGICZNE PRODUKT LECZNICZY - DEFINICJA Art. 2 pkt.32 Ustawy - Prawo farmaceutyczne Substancja lub mieszanina substancji, przedstawiana jako posiadająca właściwości: zapobiegania
Bardziej szczegółowoKonspekt do zajęć z przedmiotu Genetyka dla kierunku Położnictwo dr Anna Skorczyk-Werner Katedra i Zakład Genetyki Medycznej
Seminarium 1 część 1 Konspekt do zajęć z przedmiotu Genetyka dla kierunku Położnictwo dr Anna Skorczyk-Werner Katedra i Zakład Genetyki Medycznej Genom człowieka Genomem nazywamy całkowitą ilość DNA jaka
Bardziej szczegółowo(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2074843. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 27.09.2007 07818485.
RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 74843 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 27.09.07 0781848.0 (13) (1) T3 Int.Cl. H04W 4/12 (09.01) Urząd
Bardziej szczegółowoWektory DNA - klonowanie molekularne
Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany
Bardziej szczegółowo