Nie wiadomo, kiedy człowiek po raz pierwszy sięgnął po środki odurzające. Zapewne wtedy, gdy uświadomił sobie ograniczenia i kruchość swej

Transkrypt

1 Izabela Jasicka-Misiak Piotr Młynarz Paweł Kafarski Identyfikacja grzybów halucynogennych ze wskazaniem najpowszechniej stosowanych metod oznaczania substancji halucynogennych z grzybów we krwi Opole i Wrocław,

2 1. WSTĘP ie wiadomo, kiedy człowiek po raz pierwszy sięgnął po środki odurzające. Zapewne wtedy, gdy uświadomił sobie ograniczenia i kruchość swej egzystencji, poczuł ból i odkrył, że niektóre rośliny potrafią go łagodzić. Archeolodzy odnaleźli ślady makówek i nasiona konopi w grobach z epoki neolitu. W trzecim tysiącleciu p.n.e., na Dalekim Wschodzie ludzie żuli już betel przygotowywany z orzechów palmy arekowej (Areca catechu), a w Mezopotamii wytwarzali alkohol. W V wieku p.n.e. erodot pisał o Scytach odurzających się haszyszem. Ryty naskalne w grobowcu na bretońskiej wysepce Gawinis sprzed lat wywołują takie wrażenie, że wielu badaczy podejrzewa ich twórców o działanie pod wpływem substancji halucynogennych. Skomplikowane, powtarzające się wielokrotnie wzory geometryczne nie mają bowiem żadnego odpowiednika w naturze [RUDGLEY, 2000]. aukowcom nie udało znaleźć się żadnej cywilizacji pierwotnej, która obywałaby się bez środków odurzających. Ludzie wszędzie znajdowali substancje zmieniające świadomość, niezależnie od tego, gdzie przyszło im żyć, w amazońskiej dżungli, syberyjskiej tajdze, na stepie czy pustyni. Botanicy opisali ponad 200 roślin o właściwościach halucynogennych, do dziś odkryto w nich kilka tysięcy związków chemicznych. ajwiększą grupę stanowią alkaloidy, czyli zasady zawierające atom azotu. Łączy je zdolność wpływania na funkcjonowanie układu nerwowego człowieka. Efekty mogą być różne - od uspokajania i znieczulenia, przez pobudzanie, po wywoływanie halucynacji. Alkaloidy w czystej postaci są toksyczne, przyjęte w dużych dawkach powodują zatrucia, także śmiertelne. Dlatego od czasów prehistorycznych zażywanie zawierających je preparatów starano się kontrolować. Po środki odurzające dawniej nie sięgano dla przyjemności, lecz w ściśle określonych celach i czasie - dla nawiązania kontaktu z bogami i duchami, wprowadzenia się w trans podczas rytualnych obrzędów, wzmocnienia sił i odwagi przed wyruszeniem na łowy lub wojnę. Młodzież uzyskiwała prawo korzystania z używek dopiero po inicjacji Dawniej o tym, co dozwolone, decydowała religia i tradycja, dziś - przepisy prawa. Środki dopuszczone do obrotu określa się zazwyczaj jako używki, zakazane - jako narkotyki. Podstawą podziału jest ich szkodliwość, moc i właściwości uzależniające. W wypadku roślin nieprzetworzonych nie jest to kryterium precyzyjne, o czym świadczy odmienne traktowanie tytoniu i marihuany. Wątpliwości nie wzbudzają wyizolowane i zsyntetyzowane środki psychotropowe. Przepisy regulujące dostęp do używek i narkotyków wydają się stałe, ale w rzeczywistości ulegają zmianom. W XIX wieku w europejskich miastach działały palarnie opium i kluby miłośników haszyszu. W XX wieku do dobrego tonu należało palenie tytoniu, dziś napiętnowane. Freud uważał kokainę za cudowny lek, a zawierające ją napoje reklamowano tak, jak dziś kawę czy herbatę. W olandii można palić papierosy z marihuaną, 2

3 co w sąsiedniej Francji grozi już konsekwencjami prawnymi. Dla Indian z Andów zakaz żucia liści koki jest równie absurdalny, jak dla Europejczyków alkoholowa prohibicja. Muzułmanie zdelegalizowali obie te używki, ale nie mają nic przeciwko raczeniu się wywołującym podobne efekty ghatem [RUDGLEY, 2000]. Od kilku lat obserwuje się stały wzrost liczby ujawnianych przestępstw ściganych na podstawie ustawy o przeciwdziałaniu narkomanii, w tym przemytu i nielegalnego wytwarzania narkotyków. agłaśniane przez media przykłady skutecznych działań odpowiedzialnych służb i stosunkowo wysokie kary nakładane na producentów środków odurzania czy kurierów narkotykowych, nie powstrzymują kolejnych sprawców. a terenie spokojnych dotąd województw (w tym województw dolnośląskie i opolskie) dynamicznie wzrasta przestępczość narkotykowa, a proceder ten, z uwagi na ogromne zyski, podejmuje niemal każda grupa przestępcza, dążąc następnie do stworzenia własnych źródeł zaopatrzenia (kanału przemytu lub produkcji). Z danych statystycznych wynika, że na terenie całego kraju w dalszym ciągu utrzymuje się wzrost podaży narkotyków i popytu na te środki, szczególnie wśród młodych ludzi. arkotyki dostępne są już praktycznie nie tylko w dużych miastach, ale także w mniejszych miejscowościach, a co najgorsze również na terenie szkół. W ciągu jedenastu lat prawie pięciokrotnie powiększyła się grupa uczniów, którzy próbowali nielegalnych substancji odurzających. Po okresie stabilizacji, odnotowanej w latach , dwa kolejne badania ujawniły skokowy wzrost liczby uczniów eksperymentujących z narkotykami. Pochodne konopi indyjskich i ruteckich (marihuana i haszysz) to zdecydowanie najbardziej powszechnie stosowany nielegalny narkotyk (w Polsce używa go stale 6,3% młodzieży w ogóle, a w Czechach aż 22,1%). astępnym narkotykiem najczęściej konsumowanym jest amfetamina i jej pochodne, w tym głównie Ecstasy (MDA, MDMA, MDEA, PMA, PMMA). Zaznacza się spadek zainteresowania LSD, który rekompensowany jest popytem na grzyby halucynogenne (np. łysiczka lancetowata) oraz inne halucynogeny pochodzenia roślinnego. Choć rozpowszechnienie stosowania magicznych grzybków jest stosunkowo niewielkie, są one najczęściej stosowanym środkiem halucynogennym w 12 Państwach Członkowskich UE (w Polsce ok. 20% oburzeń - według badań sieci Znaczenie i użytkowanie grzybów trujących w tym halucynogennych na terenie Polski i krajów ościennych ). Z ponad odmian grzybów znanych przez człowieka około 80 posiada właściwości psychoaktywne. Dolny Śląsk, a szczególnie rejon Karkonoszy, to jeden z głównych regionów gdzie grzyby te są zbierane. Można dokonać też ich zakupu (wraz ze szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi hodowli) przez internet. Zjawisko narkotyzowania się grzybami halucynogennymi ma w Polsce coraz szerszy zasięg. Istnieje zatem potrzeba zdefiniowania tego typu grzybów ze wskazaniem najczęściej używanych, opracowanie przewodnika dla potrzeb policji, identyfikacja głównych składników odpowiedzialnych za efekty narkotyczne, opracowanie metod standardowego oznaczania poziomu tych substancji 3

4 w materiale biologicznym, w osoczu i moczu (w tym i metod immunologicznych - tzw. testów paskowych). Pod względem prawnym aktualnie obowiązująca ustawa z dnia 29 lipca 2005 r. O przeciwdziałaniu narkomanii nie precyzuje dokładnie, które gatunki grzybów zaliczone są do kategorii grzybów halucynogennych. Mówi ona jedynie, iż grzyby halucynogenne, są to grzyby zawierające substancje psychotropowe. Taki stan prawny pozostawia wiele miejsca do subiektywnej interpretacji zapisów tej ustawy. Przykładem takiej interpretacji może być przypadek muchomora czerwonego, który posiada dobrze poznane właściwości halucynogenne. Substancje czynne tego grzyba kwas ibotenowy i muscymol, nie zostały umieszczone w wykazie środków psychotropowych we wspomnianej ustawie. Brak jest jednoznacznych informacji, które precyzują sposoby określania zawartości substancji halucynogennych w grzybach oraz informacji, które gatunki należy bezsprzecznie zaliczyć do kategorii halucynogennych. 2. GRZYBY ALUCYOGEE Grzyby halucynogenne ( magiczne grzyby, grzybki-halucynki ), to grupa grzybów, które zawierają substancje psychoaktywne powodujące doznania narkotyczne. Grzyby te należą do grupy trzeciego typu toksyczności określanego neurologicznym oraz ze względu na działanie na człowieka sklasyfikowane są do szóstej grupy toksyczności (halucynogenne). Zazwyczaj spożywane są one w celach narkotycznych bądź w wyniku pomyłki grzybiarza. Obecnie znanych jest ok. 80 gatunków grzybów posiadających właściwości halucynogenne. Grzyby halucynogenne należą głównie do rodzaju Psilocybe, natomiast sporadycznie do rodzajów Gymnopilus i Panaeolus [UGET I SAVILLE, 2004]. a świecie występuje około 140 gatunków łysiczek, z których około 80 zalicza się do halucynogennych. Grzyby te rosną niemalże na wszystkich kontynentach, najwięcej jednak gatunków halucynogennych zidentyfikowanych zostało w Meksyku [GUZMA, 1983]. W Europie rośnie kilkanaście gatunków Psilocybe, jednakże działanie halucynogenne wykazuje tylko kilka gatunków tych grzybów. ajczęściej wymienia się: Psilocybe semilanceata (Fr.) Quel., Psilocybe bohemica, Psilocybe montana, Psilocybe cyanescens Wakef. Łysiczki rosną na ziemi, nawozie, odchodach roślinożerców, resztkach obumarłych roślin. Spotyka się je w trawie, najczęściej w otwartym terenie, rzadziej rosną w lesie [JAOSZKA, 2005; KAFARSKI, 2006]. 4

5 Łysiczka lancetowata (Psilocybe semilanceata) gatunek grzyba należący do pierścieniakowatych. Ze względu na wygląd i właściwości halucynogenne nazywany również czapeczką wolności (Liberty Cap). Dość rzadko występujący w Polsce. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: pierścieniakowate Rodzaj: łysiczka Gatunek: Łysiczka lancetowata Kapelusz higrofaniczny, 0,5-1,5 cm średnicy, zmienny w kształcie, stożkowaty lub dzwonkowaty, ze szpiczastym guzkiem w środku, ale również bez guzka tylko z nieznacznym uwypukleniem, gładki. W czasie wilgotnej pogody nieco lepki i brązowy, suchy jest brudnoochrowy, żółtawy lub żółtawo-brązowy, czasami z odcieniem oliwkowozielonym. U starszych owocników brzeg trochę pomarszczony. Blaszki dość rzadkie, szerokie, przerośnięte, początkowo ochrowe, szybko stają się purpurowo-brązowe do prawie czarnych. Trzon wysmukły, elastyczny, cylindryczny, do 10 cm długi i do 2 mm gruby (przeważnie 1 mm), zabarwiony kremowo, bladożółtawo lub żółtobrązowo, w podstawie może mieć odcień niebieskawy, a czasami jest u dołu biało oprószony. Miąższ cienki, białawy, bez wyraźnego smaku. Zapach nieznaczny, grzybowy, nieco stęchły. Wysyp zarodników ciemnobrązowy z purpurowym odcieniem. Zarodniki elipsoidalne, grubościenne, gładkie, z wyraźną porą rostkową; x µm, nieco spłaszczone. Występuje głównie na terenach o dużej ilości opadów, w górach. Owocniki wyrastają od lata do jesieni, pojedynczo lub w grupach po kilka, w trawie i mchach, w miejscach podmokłych, na ścieżkach. Większość źródeł podaje, że występuje w miejscach bogatych w składniki odżywcze. Zawiera psylocybinę [TTP:// 5

6 Łysiczka czeska (Psilocybe bohemica) podobnie jak łysiczka lancetowata grzyb ten należy do pierścieniakowatych. Bardzo rzadko występujący w Polsce. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: pierścieniakowate Rodzaj: łysiczka Gatunek: Łysiczka czeska Kapelusz higrofaniczny, wilgotny płowo do rdzawobrązowego, suchy jasnoochrowy, z wiekiem i w miejscach uszkodzonych przebarwia się ciemno sino-zielonkawo; mm średnicy, początkowo tępostożkowaty, potem wypukły do rozpostartego; brzeg podgięty, z wiekiem prosty lub odgięty, wilgotny słabo prążkowany; powierzchnia gładka, nie lepka; skórka nieściągalna. Blaszki początkowo jasnobrązowe, z czasem przyjmują barwę kremową. Wysyp zarodników brązowy z purpurowym odcieniem. Zarodniki elipsoidalne, nieco spłaszczone, grubościenne, z wyraźną porą rostkową; µm. Trzon wysmukły, elastyczny, cylindryczny, do 12 cm długi i do 4 mm gruby. Zapach nieznaczny, grzybowy. Owocniki wyrastają pojedynczo lub w grupach. a silnie rozłożonym drewnie drzew liściastych i iglastych, gałązkach, kompoście, resztkach roślinnych, w ogrodach, parkach, na poboczach dróg, w miejscach żyznych, ruderalnych [TTP:// Łysiczka górska (Psilocybe montana) jak większość łasiczek występuje dość rzadko. Owocniki wyrastają przez cały rok, poza zimą, w grupach, rzadziej pojedynczo, na ubogich terenach porośniętych mchem i trawą z mchami. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: pierścieniakowate Rodzaj: łysiczka Gatunek: Łysiczka czarnobrązowa 6

7 Kapelusz higrofaniczny, wilgotny ciemnobrązowy do ciemnoczerwonobrązowego, suchy jasny beżowoochrowy do beżowego; 5-15(20) mm średnicy; półkulisty z wiekiem wypukły, bez garbka lub nieznacznym garbkiem. Brzeg kapelusza ostry, gdy wilgotny to prążkowany, mogą być widoczne białe włókienka osłonki. Blaszki początkowo szare, szybko brązowe z purpurowym odcieniem. Trzon barwy kapelusza, u szczytu nieco jaśniejszy; 15-25(50) x 0.5-1(2) mm, równogruby, powierzchnia oprószona na szczycie, poza tym włókienkowata. Cechy wyróżniające, to nie lepki kapelusz, dojrzałe blaszki posiadają purpurowy odcień [TTP:// Muchomor czerwony (Amanita muscaria), to rozpowszechniony w Polsce grzyb kapeluszowy z rodziny drobnołuszczakowatych. Jest to grzyb o słabych właściwościach trujących. Ze względu na swój charakterystyczny wygląd, do zatruć nim dochodzi dość rzadko. ajczęściej, są to zatrucia w przypadku nieodpowiedniego spreparowania grzyba w celach odurzających. Wedle statystyk śmiertelność przy zatruciu tym grzybem waha się w granicach 2-5%. ajbardziej trujące są świeże osobniki ze względu na zwiększoną zawartość w swoim składzie kwasu ibotenowego. Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: drobnołuszczakowate Rodzaj: muchomor Gatunek: Muchomor czerwony Kapelusz grzyba jest żywo czerwony do żółtopomarańczowego, jego średnica wynosi od 50 do 150 (200) mm; początkowo półkulisty, potem wypukły, w końcu rozpostarty. Powierzchnia kapelusza pokryta jest dość regularnie rozmieszczonymi, białymi, luźno przylegającymi łatkami będącymi resztkami osłony, łatki te mogą być spłukiwane przez deszcze. Skórka błyszcząca, ściągalna, w czasie wilgotnej pogody lepka. Brzeg kapelusza długo gładki, u starych okazów prążkowany. Blaszki białe do kremowych; dość gęste, brzuchate, wolne. Trzon biały lub żółtawy; (200) x mm; cylindryczny; podstawa bulwiasta, kulista od jajowatej, z pochwą zredukowaną do kilku pierścieni kłaczkowato-wałeczkowatych brodawek, powyżej pokryta nielicznymi kosmkami. Pierścień 7

8 wyraźny, biały lub białożółtawy, zwieszony, nieprążkowany; brzeg pierścienia biały lub żółtawo ząbkowany. Miąższ biały, pod skórką kapelusza żółty (żółtopomarańczowy); niezmienny, kruchy. Smak grzyba jest łagodny oraz bez zapachu [TTP:// W celach halucynogennych często wykorzystywany jest także dość pospolity w Polsce muchomor plamisty (Amanita pantherina). Królestwo: grzyby Typ: grzyby podstawkowe Klasa: podstawczaki Podklasa: podstawczaki pieczarkopodobne Rząd: pieczarkowce Rodzina: drobnołuszczakowate Rodzaj: muchomor Gatunek: Muchomor plamisty Oprócz wymienionych wyżej gatunków występujących w Polsce zawierających substancje psychoaktywne, istnieje także wiele gatunków grzybów podejrzewanych o zawartość w swym składzie substancji halucynogennych. Grzyby te są mniej poznane pod względem zawartości substancji toksycznych i halucynogennych, a niektóre z nich rzadziej występują w naszej strefie klimatycznej. Gatunki podejrzewane o zawartość substancji halucynogennych to między innymi: - Pierścieniaki: pierścieniak wieńczony (Stropharia coronilla), - Czernidłaki: czernidłak narkotyczny (Corpinus narcoticus), czernidłak pospolity (Corpinus atramentarius), - Kołpaczki: kołpaczek motylkowaty (Panaeolus sphinctrinus), kołpaczek motylkowaty (Panaeolus papilonaceus) - iektóre gatunki z rodzaju Inocybe (strzępiaki), Conocybe (stożkogłówka), Pluteus (drobnołuszczak), Gymnopilus (łysak). Do chwili obecnej przeprowadzono badania składu chemicznego niewielu spośród wyżej wymienionych gatunków grzybów. Z dotychczas przeprowadzonych analiz wynika, że w grzybie Inocybe aeruginascens obecna jest psylocybina w ilości 0,3% suchej masy oraz baeocestyna w ilości 0,2% suchej masy. Dodatkowo odnotowano kilkanaście zatruć spowodowanych tym grzybem. Kolejnym gatunkiem zbadanym pod kątem obecności 8

9 substancji halucynogennych był grzyb z rodziny łysaków - Gymnopilus purpuratus. Zarówno psylocyna jak i baeocystyna znajdowały się w tym gatunku w ilości ok. 0,3% [GARTZ, 1992]. Jak wynika z literatury, zawartość procentowa substancji halucynogennych w grzybach jest zmienna i zależy od gatunku, stadium rozwojowego, warunków klimatycznych oraz dostępności rozpuszczalnego azotu i fosforu w glebie (Tabela 1). Tabela 1. Przykładowe gatunki grzybów halucynogennych oraz zawartość psylocyny, psylocybiny oraz baeocystyny w przeliczeniu na suchą masę grzyba. % % % Gatunek Psylocybiny Psylocyny Baeocystyny Źródło P. azurenscens 1,78 0,38 0,35 [STAMETS I GARTZ, 1995] P. bohemica 1,34 0,11 0,02 [GARTZ I MUELLER, 1990]; [GARTZ, 1994] P. semilanceata 0,98 0,02 0,36 [GARTZ, 1994] P. baeocystis 0,85 0,59 0,1 [REPKE, 1977; BEUG I BIGWOOD, 1982] P. cyanescens 0,85 0,36 0,03 [STIJVE I KUYPER, 1985; REPKE I I., 1977] P. tampanensis 0,68 0, [GARTZ, 1994] P. cubensis 0,63 0,60 0,25 [GARTZ, 1994] P. weilii 0,61 0,27 0, P. hoogshagenii 0,60 0, [EIM I OFMA,1958; TTP:// P. stuntzii 0,36 0,12 0,02 [BEUG I BIGWOOD, 1982; REPKE, 1977] P. cyanofibrillosa 0,21 0, [STAMETS I GARTZ, 1995] P. liniformans 0, ,005 [STIJVE I KUYPER, 1985] Wydawać by się mogło, iż z racji sezonowego występowania grzybów, dostęp do świeżego materiału ogranicza się wyłącznie do późnego lata i jesieni. Istnieje jednak możliwość prowadzenia hodowli grzybów posiadających właściwości halucynogenne w warunkach domowych. ielegalne sklepy internetowe oferują sprzedaż zarodników takich grzybów, zarówno gatunków występujących w naszej strefie klimatycznej, jak i gatunków 9

10 spoza naszej strefy (na przykład Psilocybe cubensis). Zarodniki, a także fragmenty owocników stanowią materiał wyjściowy do prowadzenia hodowli w warunkach domowych. Wraz z materiałem do hodowli grzybiarze żądni mocnych wrażeń otrzymują dokładne wskazówki dotyczące warunków hodowli, których dotrzymanie gwarantuje wyhodowanie owocników w ciągu czterech do ośmiu miesięcy [JAOSZKA I I., 2005]. Poniżej pokazano zdjęcia z instrukcji dla hodowców takich grzybów łysiczki kubańskiej, których zarodniki oferuje w internecie firma PF (1202 E. Pike #783, Seattle Wa , USA), oraz ofertę z witryny Buy magic mushrooms. Warto zaznaczyć, że znalezienie tych ofert zajęło autorom raportu 5 minut. Psilocybe Colombian #1 This one has a nice history in Colombia. Picked from the cowfields of the little village Villa de Leiva. Found to be very potent, giving a beautiful journey. From the same grower as the ormal Mexican. Fresh Colombian Magic Mushrooms available in 750g packs. ot recommended for use under 18. If pregnant, nursing or taking a prescription drug, consult your health care professional. Do not exceed recommended dose. Consumption may impair ability to drive or operate heavy equipment. ot recommended for consumption with alcoholic beverages. Opisano również metodę, w której wykorzystanie zarodników prowadzi do otrzymania dikariotycznej grzybni. Grzybnię tę można wykorzystać do dalszego jej namnażania lub do porcjowania i sprzedawania jako gotowego do spożycia materiału [JAOSZKA I I., 2005]. Takie produkty, ze względu na swą bezpostaciową formę, są niemożliwe do identyfikacji za pomocą tradycyjnych metod makro- i mikroskopowych [ADAMCZYK, 2006]. Dostęp do grzybków halucynogennych jest zatrważająco łatwy, nie dziwi zatem ich rosnąca wciąż popularność. ależy jednak wziąć pod uwagę fakt, iż w naszej strefie klimatycznej oprócz osławionej przez zbieraczy łasiczki lancetowatej, na łąkach rośnie kilkadziesiąt podobnych gatunków grzybów, praktycznie nierozróżnialnych dla laików. 10

11 Gatunki te stanowią poważne zagrożenie życia dla amatorów odurzania, którzy przez niewiedzę konsumują silnie trujące grzyby, jak na przykład stożogłówki (Conocybe), czy hełmówki (Galerina). 3. MORFOLOGICZA IDETYFIKACJI GRZYBÓW Oznaczanie grzybów do celów konsumpcyjnych jest zadaniem stosunkowo łatwym. Dla oznaczenia gatunku grzyba konieczne jest sprawdzenie cech, które odróżniają ten gatunek od innych podobnych. Są to tak zwane cechy diagnostyczne. Jedną z takich cech jest barwa zarodników, dzięki której można nieuzbrojonym okiem określić gatunek grzyba. Wysyp zarodników otrzymuje się układając dojrzały kapelusz hymenoforem do dołu na kartce białego papieru. Po kilku godzinach należy usunąć kapelusz, na kartce pozostają wówczas zarodniki o kolorze właściwym dla danego gatunku. Barwa wysypu zarodników jest cechą bardzo pomocną przy oznaczaniu grzybów, pozwala ona na szybkie przyporządkowanie znaleziska do rodziny w danej grupie grzybów. Warto podkreślić, że w przypadku grzybów blaszkowych zrobienie wysypu zarodników jest łatwe i szybkie i jest bardzo pomocne. W praktyce grzybiarza, umiejętność robienia wysypu zarodników jest także bardzo przydatna. Określenie barwy wysypu zarodników umożliwia na przykład pewne odróżnienie pieczarek (czekoladowobrązowy wysyp) od muchomorów (biały wysyp), opieniek (biały wysyp) od "fałszywych opieniek" (brązowy wysyp), itd. Wysyp zarodników bywa także potocznie nazywany "odciskiem kapelusza". W przypadku grzybów Psilocybe wysyp zarodników jest purpurowo-brązowy. Często można zauważyć, iż kapelusze sąsiadujących ze sobą łysiczek są oprószone smugami ciemnego pyłu. Inną cechą, która ułatwia identyfikację gatunków grzybów Psilocybe jest niebieskie zabarwienie trzonka u nasady kapelusza. Po ścięciu lub uszkodzeniu trzonka barwa ta zmienia się na czerwoną w ciągu min. Zjawisko to, nie jest cechą charakterystyczną gatunków grzybów zawierających psylocybinę, ale może świadczyć o tym, iż grzyb nie należy do gatunku trującego [SCWARZ I SMIT, 1988] Wysypu zarodników można dokonać dysponując świeżymi owocnikami, jednakże najczęściej do identyfikacji i analizy otrzymywane są grzyby w postaci zasuszonej. Ze względu na trudności z makroskopowym określeniem gatunku grzyba w celu jego identyfikacji stosuje się często metody mikroskopowe. 11

12 Psilocybe semilanceata (Łysiczka lancetowta) Psilocybe cubensis (Łysiczka kubańska) Amanita muscaria (Muchomor czerwony) Aby przywrócić turgor tkanek często stosuje się roztwór 2,5% wodorotlenku potasu. Po potraktowaniu wodorotlenkiem tkanki grzyba powracają w pewnym stopniu do swojego pierwotnego stanu i możliwa staje się identyfikacja gatunku przy pomocy mikroskopu tradycyjnego bądź elektronowego. W przypadku analizy z użyciem mikroskopu tradycyjnego bierze się pod uwagę kształt oraz cechy charakterystyczne zarodników, cystyd oraz basyd umiejscowionych na grzybni. Dodatkowo, analiza za pomocą mikroskopu elektronowego może ułatwić identyfikację grubszych i bezbarwnych tkanek. W przypadku zastosowania skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) otrzymuje się także zdjęcia trójwymiarowe [TSUJIKAWA, I I., 2003]. 12

13 4. EFEKTY SPOŻYWAIA GRZYBÓW Magiczne grzybki, jak wynika z wielu doniesień [MUSSOFF I I. 2000; PASSIE I I., 2002], konsumowane są zazwyczaj w postaci surowej, taka forma wywołuje, bowiem, najsilniejsze doznania już po minut od spożycia. Opisywane są również przykłady spożywania grzybków zmieszanych w napojach lub potrawach. Zbiory grzybków przechowywane są najczęściej w postaci suszonej bądź mrożonej, często są trzymane w miodzie, co w znacznym stopniu pozwala zachować ich wysoką aktywność [BOGUSZ I I., 1998; MUSSOFF I I., 2000]. Doniesienia dotyczące formy oraz ilości spożywanych grzybków są bardzo zróżnicowane. Jednakże za ilość pozwalającą odczuć działanie przyjmuje się sztuk świeżych lub suszonych grzybków. Badania kliniczne pozwoliły na oszacowanie, iż konsumpcja mg grzybków wpływała na różnorodne zachowanie psychiczne niektórych pacjentów. otowano między innymi zaburzenia toku myślenia, zaburzenia emocjonalne oraz zaburzenia spostrzegania rzeczywistości [VOLLEWEIDER I I., 1997]. W literaturze naukowej oraz w doniesieniach internatów spotyka się opisy różnorodnych doznań po spożyciu grzybków. Spośród wielu efektów najczęściej jednak opisywane są: - halucynacje, zmiany percepcyjne i zmiany sposobu postrzegania świata definiowane jako fałszywe spostrzeżenia zmysłowe, patologiczne postrzeganie przedmiotów, które nie znajdują się w polu widzenia jednostki lub w ogóle nie istnieją; halucynacjom towarzyszy silne przekonanie o realności odbieranych bodźców, - uczucie błogostanu czyli przyjemne odprężenie, wrażenie odpływania, przyjemne barwne wizje, ogólne pozytywne spostrzeganie stanu rzeczy, uczucie opuszczenia ciała, brak koordynacji ruchowej [KELLER I I., 1999]; - stany psychotyczne w tym paranoidalne urojenia oraz obsesje, nagłe i gwałtowne zmiany osobowości oraz toku postępowania, może wystąpić tzw. bad trip [JAOSZKA I I., 2005] - nadmierne pobudzenie psychosomatyczne, huśtawka nastrojów, - różnorakiego rodzaju zaburzenia ze strony układu pokarmowego w tym wymioty, biegunki oraz bóle brzucha. Badania dotyczące konsumpcji Psilocybe dowodzą, że nie istnieje możliwość fizycznego uzależnienia od tych grzybów, pomimo zwiększającej się tolerancji przy ich długotrwałym zażywaniu. Ich częste spożywanie stwarza możliwość uzależnienia psychicznego. Element oszołomienia, związany z ich spożywaniem, nie jest obojętny dla młodego organizmu. 13

14 Grzyby te powodują pobudzenie psychoruchowe, halucynacje, uczucie niepokoju. Przy niewłaściwym stosowaniu może dojść nawet do ostrej psychozy. Człowiek w takim stanie traci świadomość i może być bardzo niebezpieczny dla siebie i innych. Osoby często zażywające substancje halucynogenne wykazują podwyższony poziom agresji [ 5. SUBSTACJE AKTYWE WYSTĘPUJĄCE W GRZYBAC Głównymi substancjami o właściwościach halucynogennych występującymi w grzybach są psylocybina (4-fosfonyloksy-,-dimetylotryptamina) i towarzyszący jej drugi alkaloid psylocyna (4-hydroksy-,-dimetylotryptamina). Oprócz tych związków, w grzybach stwierdzono również obecność baeocystyny (4-fosforyloksy--metylotryptaminy) będącej pochodną psylocybiny, a różniąca się od niej jedynie brakiem podstawnika metylowego przy azocie w łańcuchu bocznym, oraz norbaeocestyny (4- fosforyloksytryptaminy) występującej zazwyczaj w ilościach śladowych. O C 3 C 3 O P O O O C 3 C 3 Psylocyna Psylocybina O O P O O C 3 O O P O O Baeocystyna orbaeocystyna 14

15 Psylocybina jest jednym z nielicznych związków naturalnych, które zawierają w swej strukturze atom fosforu. Substancja ta dobrze wchłania się poprzez tkanki jamy ustnej i ulega w organizmie defosforylacji. W wyniku tego procesu degradacji powstaje najprawdopodobniej jej metabolit psylocyna, która jest odpowiedzialna za ogół właściwości halucynogennych grzybów. Przyjęcie inhibitorów monoaminooksygenazy przed zażyciem psylocybiny groźnie wzmacnia jej działanie. Farmakologicznie działanie psylocybiny jest charakterystyczne dla substancji halucynogennych i przypomina efekty wywoływane przez LSD, jednakże około 100 razy słabsze. Przyjęta doustnie, działa około 5-6 godzin. Pierwsze efekty jej działania zauważalne są po około minutach od jej zażycia. Psylocybina pojawia się we krwi w oznaczalnych stężeniach w minut po podaniu doustnym 0,2 mg/kg masy ciała [KAFARSKI, 2006]. Z przeprowadzonych badań wynika, że ilość psylocybiny niezbędna do wywołania silnych halucynacji to około mg [ASLER I I., 2002]. Jest to jednak ilość szacunkowa, gdyż na efekty działania psylocybiny składa się wiele czynników, jak na przykład indywidualne cechy związane z metabolizmem osoby zażywającej oraz pokarm przyjęty przed spożyciem grzybów. Zarówno psylocybina, jak i psylocyna zostały sklasyfikowane jako substancje o dużym potencjale nadużywania. Substancje te znajdują się w wykazie środków odurzających w grupie I-P stanowiącym załącznik do ustawy O przeciwdziałaniu narkomanii. O O O O 2 O O 2 Kwas ibotenowy Muscymol Oprócz wyżej wymienionych psylocyny i psylocybiny w wielu grzybach o właściwościach halucynogennych występują także kwas ibotenowy oraz muscymol (5- (aminometylo)-3-izoksazolol), pochodne izoksazoli [ALLE I I., 2002]. Związki te występują w znacznych ilościach w muchomorach (Amanita muscaria, Amanita phalloides, Amanita pantherina), i to właśnie one odpowiedzialne są za ich właściwości odurzające. W 100 g suchej masy grzyba Amanita muscaria zawartych jest 180 mg wymienionych substancji, z których jedynie 25 mg, to kwas ibotenowy. W organizmie kwas ten metabolizowany jest właśnie do muscymolu, który wykazuje mniejszą toksyczność i wydalany jest z moczem w 15

16 postaci niezmienionej. Dawka niezbędna do wywołania doznań narkotycznych to mg dla kwasu ibotenowego oraz mg dla muscymolu [ALPER, 2004]. Aktualny pogląd głosi, że kwas ibotenowy nie przekracza bariery krew-mózg w formie zmienionej i jest częściowo metabolizowany do muscymolu i muskazonu, a częściowo wydalany w niezmienionej formie. Z badań prowadzonych nad zwierzętami przy użyciu kwasu ibotenowego wynika, że jest potężną neurotoksyną (po wstrzyknięciu domózgowym). Jest strukturalnie podobny do glutaminy i aktywuje receptory MDA, ale to prawdopodobnie nie włącza się to w ogół działania psychoaktywnego Amanita muscaria. Ma on działanie 5-8 razy słabsze niż muscymol (efektywna dawka to mg). Muscymol odpowiada za większą część działania psychoaktywnego muchomorów. Główne działanie tego związku polega na blokowaniu receptora GABA-A. Związek ten używany jest w badaniach nad GABA jako jego najskuteczniejszy broker [LI I OBERLIES, 2005]. Dowiedziono, że muscymol działa na kilka obszarów mózgu - korę mózgową, hipokamp i móżdżek. Związek ten wpływa także na poziom neuroprzekaźników: zwiększa ilość serotoniny i acetylocholiny w mózgu, a obniża ilość noradrenaliny. Działanie muscymolu znacznie różni się od działania pochodnych fenyloetyloaminy i indolu, co jest widoczne na wykresach badań EEG. ie są to jednak naukowo potwierdzone badania, gdyż muscymol nie jest metabolizowany przez organizm ludzki. Oznacza to, z czysto teoretycznego punktu widzenia, że nie ma on prawa oddziaływać w jakikolwiek sposób na ciało i umysł. Muscymol wydalany jest z organizmu w niezmienionej formie. Dawkowanie doustne substancji waha się w granicach mg. W ustawie o przeciwdziałaniu narkomanii kwas ibotenowy oraz muscymol nie znajdują się w wykazie środków psychotropowych. Kolejnym związkiem, który występuje w muchomorach w niewielkich ilościach jest muskazon. Wykazuje on psychoaktywość i bardzo możliwe, że odpowiada za część ogólnego działania muchomorów czerwonych. W niewielkich ilościach (0,002% - 0,003% suchej masy grzyba), w Amanita muscaria występuję muskaryna. Alkaloid ten, charakterystyczny dla innych gatunków grzybów (min.: strzępiaka ceglastego Inocybe patouillardii) oddziaływuje na poziom acetylocholiny w mózgu i działa na receptory muskarynowe. Zawartość muskaryny w muchomorach jest dosyć niska, jednak może być ona odpowiedzialna za cholinergiczne działanie muchomorów. Choć dowiedziono naukowo aktywność muskaryny, to jej wchłanianie przez ścianę jelita jest bardzo powolne i prawie nie przedostaje się ona przez barierę krew-mózg (możliwe jest to w zasadzie tylko przy równoczesnym podaniu lecytyny). Ponadto efekt działania muskaryny znacznie różni się od działania Amanita 16

17 muscaria. Zatem muskaryna nie ma większego wpływu na charakter odurzenia muchomorem czerwonym. 6. BADAIA FARMAKOKIETYCZE Rosnąca liczba publikacji naukowych wskazuje na coraz to większe zainteresowanie zarówno środowisk medycznych jak i chemicznych tematem oddziaływania psylocybiny na organizm ludzki. Badania przeprowadzane na wolontariuszach oraz zwierzętach laboratoryjnych, przy użyciu 14 C-znakowanej psylocybiny wykazały, iż metabolitami tej substancji są 4-hydroksy-,-dimetylotryptamina, aldehyd 4-hydroksy-indolo-3-octowy, kwas 4-hydroksy-indolo-3- octowy oraz 4-hydroksytryptofanol. Produkty te powstają w procesie deaminacji oraz oksydacji psylocybiny [ASLER I I., 1997; ASLER I I., 2002]. Dodatkowo postulowane jest tworzenie się w szlaku metabolizmu psylocybiny, psylocyno-o-glukuronidu (typowego produktu detoksykacji) na zasadzie analogii tworzenia się 5-hydroksytryptamin-Oglukuronidu w szlaku metabolizmu serotoniny. Jednakże, przeprowadzone do tej pory badania nie pozwalają na jednoznaczną identyfikację tego metabolitu [PASSIE I I., 2002]. Psylocyna pojawia się w surowicy po około 30 minutach. W tym czasie, w wątrobie zachodzi główny szlak przemiany metabolicznej tej substancji. Psylocybina ulega gwałtownej defosforylacji, przy pomocy fosfatazy alkalicznej, do psylocyny, która jest główną substancją odpowiedzialną za właściwości halucynogenne grzybków. Ponadto stwierdzono również, że czas półtrwania psylocybiny oraz długość jej działania jest zmienna i zależy od sposobu jej podania. I tak, dożylne podanie psylocyny skraca czas do 74,1 ± 19,1 min. w porównaniu do czasu półtrwania psylocyny podanej doustnie 163 ± 64 min. Z kolei czas działania tej substancji po dożylnej aplikacji skraca się nawet do minut [ASLER I I., 1997]. 17

18 O P O O O C 3 C 3 O C 3 C 3 Psylocybina Psylocyna O O 4-hydroksyindoloacetaldehyd O O O O O kwas 4-hydroksyindolo-3-octowy 4-hydroksyindoloetanol Postulowany szlak metabolizmu psylocybiny w organizmie ludzkim [ASLER I I., 1997, ASLER I I., 2002]. Budowa zarówno psylocybiny, jak i psylocyny wykazuje podobieństwo strukturalne do neuroprzekaźnika serotoniny. Psylocyna jest substancją mniej hydrofilową niż jej prekursor, w związku z czym łatwiej przenika barierę krew-mózg. Psylocyna wykazuje właściwości antagonistyczne względem receptorów serotoniny oraz mimetyczne względem samej serotoniny. Dowiedziono, iż za działanie halucynogenne, zarówno związków będących analogami strukturalnymi fenyloetyloaminy (amfetamina, meskalina) jak i indoloaminy (psylocyna) odpowiedzialne jest ich powinowactwo do receptorów serotoninowych typu 5- T 2, a w szczególności 5-T 2A i 5T 2C [AGAJAIA I MAREK, 1999]. Dzięki tym właściwościom psylocybina zwiększa poziom serotoniny w mózgu oraz powoduje pobudzenie czynności sensoromotorycznych i percepcyjnych. Dlatego też charakterystyczne objawy zażywania grzybków halucynogennych, to niepokój oraz różnego rodzaju halucynacje. 18

19 O C 3 C 3 O 2 Psylocyna Serotonina 7. MOŻLIWOŚCI IDETYFIKACJI I OZACZAIA SUBSTACJI ALUCYOGEYC Z racji potencjalnego zagrożenia związanego ze zbieractwem, hodowlą, dystrybucją i zażywaniem grzybków halucynogennych i realizacji założeń Ustawy o zapobieganiu narkomanii, istnieje zwiększone zapotrzebowanie w zakresie określenia poziomu środków psychoaktywnych w płynach ustrojowych. Metody analizy jakościowej i ilościowej, przeznaczone do rutynowych oznaczeń wykorzystywanych przez właściwe instytucje, powinny być wystarczająco szybkie i wiarygodne. Zatem w tej części opracowania omówione zostaną aktualnie używane metody izolacji, oraz analizy jakościowej i ilościowej substancji psychoaktywnych występujących w grzybach polskich. Izolacja psylocyny i psylocybiny z materiału biologicznego Proces izolacji psylocybiny i psylocyny z materiału grzybowego jest prosty i dość szybki. ajczęściej izolacji tych alkaloidów dokonuje się na drodze ekstrakcji do rozpuszczalnika. Standardowo stosowane rozpuszczalniki to chloroform, metanol bądź woda [KYSILKA I WURST 1990, WURST I I., 1992]. Izolacji substancji halucynogennych, jednym z wybranych rozpuszczalników, wykonuje się używając ultrasonifikatora celem zniszczenia komórek grzyba, a tym samym zwiększenia stopnia ekstrakcji substancji halucynogennych z grzyba. Po oddzieleniu supernatantu od zawiesiny odparowuje się rozpuszczalnik, najlepiej w środowisku niereaktywnego gazu. Tak otrzymany ekstrakt poddaje się dalszym badaniom [MUSSOFF I I., 2000]. Inną metodą izolacji halucynogennych alkaloidów jest ekstrakcja materiału grzybowego rozcieńczonym wodnym roztworem kwasu octowego. W kolejnym etapie wyodrębniania otrzymany ekstrakt zakwasza się do p=4 lodowatym kwasem octowym. Rozwór pozostawia się do odstania na okres jednej godziny, a następnie podgrzewa 19

20 do temperatury 70º C. Po tym czasie ekstrakt chłodzi się, filtruje, otrzymany filtrat doprowadza się do p=8 przy użyciu stężonego wodorotlenku amonu. W ten sposób otrzymany roztwór poddaje się ekstrakcji eterem dietylowym. Otrzymany ekstrakt eterowy suszy się nad siarczanem sodu, filtruje i odparowuje w środowisku niereaktywnym [CASALE, 1985]. W obu przypadkach otrzymuje się ekstrakty o wystarczającej czystości do przeprowadzenia dalszych badań. Wynikiem ekstrakcji metanolem jest mieszanina psylocyny oraz psylocybiny. Z kolei poprzez ekstrakcję, kolejno wodnym roztworem kwasu octowego i eterem dietylowym otrzymuje się ekstrakt zawierający niemal wyłącznie psylocynę. W zastosowanych warunkach, obecna w roztworze psylocybina ulega defosforylacji [CASALE, 1985]. ajprostszą i najczęściej wykorzystywaną techniką rozdziału i identyfikacji pochodnych indolowych zawartych w grzybach jest chromatografia cienkowarstwowa (TLC) [BEUG I BIGWOOD, 1981; GARTZ, 1987; GROSS, 2002; SEMERDZIEVA I I., 1986; WURST I I., 1992]. Rozdziału przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej dokonuje się na płytkach pokrytych krzemionką. ajlepsze efekty rozdziału otrzymano przy użyciu eluentów: n-butanol, kwas octowy, woda (12:3:5 v/v/v), 1,5% rozwór amoniaku w metanolu, n-butanol, kwas octowy, woda (2:1:1 v/v/v) oraz amoniak, woda, n-propanol (12:188:500 v/v/v). Stosując pierwszy z opisanych eluentów otrzymano najlepszy rozdział i nie obserwowano rozmycia plamek na płytce [BEUG I BIGWOOD, 1981]. W celu wizualizacji rozdzielonych substancji standardowo używa się odczynnika Ehrliha służącego do wykrywania amin. Ponadto psylocyna jak i psylocybina są dobrze widoczne na płytce w niskim paśmie promieniowania UV. Metody immunochemiczne ajbardziej przydatnymi metodami analizy jakościowej i ilościowej substancji o właściwościach narkotycznych, są te, które nie wymagają dodatkowych technik izolacji z materiału biologicznego (krew, mocz). Tego typu metody oparte są przede wszystkim o badania immunochemiczne. Możliwość wytwarzania przeciwciał dowolnych leków w organizmie żywym spowodowała istotny postęp w badaniach ilości i jakości środków psychoaktywnych. Standardowy proces otrzymywania trwałych połączeń chemicznych badana substancja-białko, opiera się na wykorzystaniu reaktywnych grup, które z tą substancją tworzą czynny związek immunologiczny - wysokocząsteczkowy hapten (immunogenic conjugate). Stworzenie tego typu haptenu może stymulować wytworzenie wysoce specyficznych przeciwciał monoklonalnych, które mogą być wykorzystane w analizie 20

21 jakościowej oraz ilościowej wybranych substancji psychoaktywnych. W literaturze istnieje niewiele informacji dotyczących zastosowania tej metody do identyfikacji substancji halucynogennych. Jedyna informacja dotyczy prób syntezy koniugatów białkowych psylocyny [ALBERS I I., 2002]. Metody analizy instrumentalnej Do najbardziej przydatnych i efektywnych metod zarówno ilościowej, jak i jakościowej analizy substancji psychoaktywnych należy obecnie wysokosprawna chromatografia cieczowa (PLC). Zastosowanie tej metody do celów identyfikacyjnych wzrosło szczególnie po wprowadzeniu techniki detekcji typu diode-array. Ten typ detekcji pozwala uzyskać obok sygnału piku danego związku na chromatografie jego widmo UV ( nm) w układzie trójwymiarowym, potwierdzające jego jednorodność. Ta właściwość detektora diode-array znacznie podnosi możliwości identyfikacji związków [BOGUSZ I WU, 1991; FERARA I I., 1992; LOGA I I., 1990]. Wykorzystanie PLC z możliwością użycia innych detektorów: UV [KYSILKA I I., 1985; TSUJIKAWA I I., 2003], fluorescencyjnym [SAITO I I. 2004; SAITO I I., 2005], chemiluminescencyjnym [AASTOS I I., 2005; AASTOS I I., 2006], elektrochemicznym [CRISTIASE I RASMUSSE, 1983], woltametrycznym [KYSILKA I I., 1985] i masowym [BOGUSZ I I., 1998; SAITO I I. 2004], pozwala na uzyskanie wysokiego stopnia odzysku substancji halucynogennych, wysoką selektywność pomiaru oraz niewielki nakład czasu niezbędny do wykonania pomiarów. Metoda ta została z powodzeniem użyta do badania obecności i stężenia psylocyny w próbkach krwi [LIDEBLATT I I., 1998], poziomu psylocyny i psylocybiny w suszu grzybowym [TOMPSO, 1980], oraz poziomu kwasu ibotenowego w sporach i kapeluszach muchomora czerwonego [STROEMER I I., 2004]. Kolejną metodą identyfikacji oraz analizy ilościowej związków o aktywności halucynogennej jest metoda chromatografii gazowej i spektrofotometrii masowej (GC-MS) z równoczesną możliwością korzystania z biblioteki widm masowych np. systemu P 5997 OC MS/MD Chemistation. Wśród możliwych technik analitycznych w tym układzie, zastosowanie znalazła techniki SIR (selected ion recording) oraz SIM (selected ion monitoring) stosowane dla niższych stężeń związków halucynogennych [STICT I KÄFERSTEI, 2000]. Techniki te pozwalają na monitorowanie zmian intensywności wybranych specyficznych fragmentów cząsteczki tworzących widmo masowe. Dane uzyskane dla materiału badawczego, mogą znaleźć potwierdzenie w komputerowym układzie porównawczym z odpowiednim wzorcem wybranym z banku widm. Metoda GC-MS 21

22 znajduje również zastosowanie w analizie ilościowej. Rutynowo, z uwagi na oznaczalność, stosuje się technikę SIM z równoczesnym użyciem wzorca wewnętrznego, którym jest pochodna deuterowana oznaczanego związku. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do identyfikacji psylocyny, zarówno w materiale grzybowym, jak również w próbkach krwi i moczu [KELLER I I., 1999; STICT I KÄFERSTEI, 2000, SARWAR I MCDOALD, 2003; KIKURA- AAJIRI, 2005]. W rutynowych badaniach toksykologicznych zastosowanie znajdują również programy systematycznej analizy ksenobiotyków, wśród których wymienić można system Remedi S (Bio-Rad). Program Remedi S oparty jest na zasadach wysokosprawnej chromatografii cieczowej (PLC) i detekcji UV. System ten, który umożliwia szybką analizę około 500 leków i ich metabolitów w układzie wielopunktowego pomiaru UV (multiwavelenght ultrafiolet detection), znalazł również zastosowanie analizie substancji psychotropowych zawartych w grzybach halucynogennych. Metodą tą zidentyfikowano psylocynę w moczu [STICT I KÄFERSTEI, 2000]. ajnowszym rozwiązaniem analitycznym jest zastosowanie chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią masową (LC-MS). Osiągane progi detekcji dla oznaczeń wielu związków w tym układzie są niższe aniżeli uzyskane w systemie GC-MS i najczęściej występują w zakresie od 10 ng/ml. Z zastosowaniem techniki chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z jonizacją przez rozpylanie w polu elektrycznym (LC/MS- ESI), opracowano szybką identyfikację wielu substancji o właściwościach narkotycznych, takich jak amfetamina, LSD oraz psylocybina. Czas analizy każdego ze związków jest był dłuższy niż 5 minut, a zastosowanie łagodnej metody jonizacji ESI miało duże znaczenia dla analizy, substancji termolabilnych [PILAIE I I., 2003]. Z kolei stosując technikę chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas z chemiczną jonizacją pod ciśnieniem atmosferycznym (LC/MS-APCI) wykryto i oznaczono psylocynę w zredukowanych do niewielkich objętości próbkach krwi [LECOWICZ, 2004]. Metodą służącą najczęściej do rozdziału związków o niewielkich masach cząsteczkowych jest strefowa elektroforeza kapilarna (CZE). Znalazła ona również zastosowanie w identyfikacji i określeniu zawartości substancji o właściwościach halucynogennych w grzybach. Pomiary psylocybiny zostały przeprowadzone w systemie P/ACE 5000 i pozwoliły na dokładne określenie zawartości psylocybiny oraz baeocestyny w próbkach grzybów. [PEDERSE-BJERGAARD I I., 1997]. 22

23 Inne metody W ostatnich kilkudziesięciu latach nastąpił znaczny rozwój technik analitycznych opartych o zastosowanie metod biologii molekularnej. Metody te są coraz powszechniej wykorzystywane w wielu dziedzinach nauki, w tym również do identyfikacji grzybów halucynogennych. Umożliwiają one identyfikację poszczególnych gatunków grzybów halucynogennych [KIMBERLY I SAVILLE, 2004; UGET I SAVILLE, 2004; LI I OBERLIES, 2005] bez konieczności mikroskopowej analizy zarodników, czy też makroskopowego rozpoznania materiału w postaci zasuszonej. Jedną z takich metod jest PCR, która zrewolucjonizowała współczesną biologię molekularną umożliwiając wyprodukowanie milionów kopii fragmentów DA w zaledwie kilka godzin. Metoda ta jest doskonałym narzędziem do wykrywania ekstremalnie niskiego stężenia szukanego metabolitu z wysoką specyficznością. iezwykła wybiórczość i wydajność amplifikacji metody PCR jest uzupełnieniem procedur analitycznych, które omówiono powyżej. Połączenie tych metod umożliwia badanie pojedynczego genu lub krótkiego segmentu w jego obrębie, nawet jeśli cały dostępny do analiz DA pochodzi z zaledwie jednej komórki. Metodę PCR wykorzystuje się obecnie powszechnie do wykrywania infekcji wirusowych, również obecności wirusa IV-1 we krwi pacjentów chorych na AIDS (lub podejrzewanych o chorobę); do badania samoczynnie powstających nowotworów ludzkich, aby określić ewentualne zmiany w sekwencji genów kontrolujących wzrost i podział komórek, oraz przed przeszczepami, do określania typu genów, od których zależy układ zgodności tkankowej. PCR okazuje się również potężnym narzędziem do jednoznacznej identyfikacji grzybów z rodzaju Psilocybe [ADAMCZYK, 2006]. Przeprowadzenie testów przy użyciu tej metody może zostać wykorzystane do odróżniania bezpostaciowych grzybni, ujawniania łysiczki w mieszaninach suszu różnych gatunków grzybów. 8. MOŻLIWOŚCI IDETYFIKACJI I OZACZAIA SUBSTACJI ALUCYOGEYC W LABORATORIAC DOLEGO ŚLĄSKA Badania strukturalne substancji halucynogennych za pomocą metody MR: Zakład Chemii Bioorganicznej Kierownik: Prof. Paweł Kafarski Tel.:

24 Politechnika Wrocławska Wybrzeże Wysińskiego Wrocław Rozdział i identyfikacja chemicznych substancji halucynogennych metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej PLC: Zakład Chemii Bioorganicznej Kierownik: Prof. Paweł Kafarski Politechnika Wrocławska Wybrzeże Wysińskiego Wrocław Rozdział i identyfikacja chemicznych substancji halucynogennych metodą chromatografii gazowej, PLC i elektroforezy kapilarnej: Zakład Chemii Ekologicznej Kierownik: dr hab. Piotr Wieczorek tel.: w. 2545; 2550 Uniwersytet Opolski ul Oleska Opole Badania materiału biologicznego za pomocą PCR: Zakład Technik Molekularnych Kierownik: Dr hab. Tadeusz Dobosz Tel.: Akademia Medyczna we Wrocławiu ul. M. Curie-Skłodowskiej Wrocław Opracowanie metody immunologicznej oznaczania substancji halucynogennych: Zakład Immunologii Chorób Zakaźnych Kierownik: Prof. dr hab. Andrzej Gamian Tel.: Polska Akademia auk Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej ul. Rudolfa Weigla Wrocław 9. LITERATURA Adamczyk A., Identyfikacja grzybów gatunku Psilocybe semilanceata przy pomocy techniki PCR, Praca magisterska, Wydział Chemiczny, Politechnika Wrocławska, Wrocław, Aghajanian G. K., Marek G. J., 1999, Serotonin and hallucinogens, 24

25 europsychopharmacology, 21, Albers Ch., Lehr M., Beike J. Köhler., Brinkmann B., 2002, Synthesis of a psilocyn hapten and a protein-hapten conjugate, J. Pharm. Pharmacol. 54, Anastos., Barnett. W., Lewis S. W., Gathergood., Scammells P. J.,. Sims D., 2005, Determination of psilocin and psilocybin using flow injection analysis with acidic potassium permanganate and tris(2,2 / -bipyridyl) ruthenium(ii) chemiluminescence detection respectively, Talanta, 67, Anastos., Lewis S. W., Barnett. W., SimsD.., 2006, The determination of psilocin and psilocybin in hallucinogenic mushrooms by PLC utilizing a dual reagent acidic potassium permanganate and tris(2,20-bipyridyl)ruthenium(ii) chemiluminescence detection system, J. Forensic Sci. 51, Beug M., Bigwood J., 1981, Quantitative analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe baeocystis by igh-performance Liquid Chromatography and Thin-Layer Chromatography, J. Chromatogr., 207, Bogusz M., Wu M., 1991, Standarized PLC-DAD systems based on retention for systematic toxicological screening, J. Anal. Toxicol. 15, Bogusz M. J., Maier R. D., Schafer A. T., Erkens M., 1998, oney with Psilocybe mushrooms: a revival of a very old preparation on the drug market, Int. J. Legal. Med., 111, Casale J. F., 1985, An aqueous-organic extraction method for the isolation and identification of Psilocin from hallucinogenic mushrooms, J. Forensic Sci., 30, Christiansen A., Rasmussen K.., 1983, Screening of hallucinogenic mushrooms with high performance liquid chromatography and multiple detection, J. Chromatogr. 270, Ferara S. D., Tedeschi L., Frison G., Castanga F., 1992, Solid phase extraction and PLC-UV Gartz J., 1987, confirmation of drug of abuse in urine, J. Anal. Toxicol. 16, Gartz J., 1992, ew aspect of the occurrence, chemistry and cultivation of European hallucinogenic mushrooms, Storia e Scienze aturali, 8. Gartz J., 1994, Extraction and analysis of indole derivatives from fungal biomass, J. Basic. Microbiol. 34, Gartz J., Mueller G. K., 1990, Analysis and cultivation of fruit bodies and mycelia of Psilocybe bohemica, Biochem. Physiol. Pflanzen, 184,

26 Gross S., 2002, Psychotropic drugs in developmental mushrooms: a case study review. J. Forensic Sci. 47, Guzman, G., The genus Psilocybe, 1983, Beih. ova edwigia 74. J. Cramer, Vaduz. allen. E., Adams G.C., Eicer A., 2002, Amatoxins and phallotoxins in indigenous and introduced South African Amanita species, South African J. Botany 68, alpern J.., 2004, allucinogens and dissociative agents naturally growing in United States, Pharmacol. Ther., 102, asler F., Bourquin D., Brenneisen R., Bar T., Vollenweider F. X., 1997, Determination of psilocin and 4-hydroxyindole-3-acetic acid in plasma by PLC-ECD and pharmacokinetic profiles of oral and intravenous psilocybin in man, Pharm. Acta elv., 72, asler F., Bourquin D., Brenneisen R., Vollenweider F. X., 2002, Renal excretion profiles of psilocin following oral administration of psilocybin: a controlled study in man, J. Pharm. Biomed. Anal., 30, eim R., ofmann A., 1958, Isolement de la Psilocybine à partir du Stropharia cubensis Earle et d'autres espèces de champignons hallucinogènes mexicains appartenant au genre Psilocybe, Compt. rend. Acad. sc., 247, Janoszka J., Rymkiewicz A., Dobosz T., 2005, alucynogenne grzyby Łysiczki (Psilocybe). Część I. Charakterystyka, skutki zażycia, rozpoznawanie, Arch. Med. Sąd. Krym. 55, Kafarski P., 2006, Rodzaje i zawartość związków halucynogennych w źródłach biologicznych z terenu Polski oraz możliwości ich identyfikacji we krwi, Referat na seminarium naukowym Biotechnologia w Strategii Rozwoju Województwa Dolnośląskiego, Wrocław. Keller T., Schneider A., Regenscheit P., Dirnhofer R., Riicker T., Jaspers J., Kisser W., 1999, Analysis of psilocybin and psilocin in Psilocybe subcubensis GUZMA by ion mobility spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry, Forensic Sci. Int., 99, Kikura-anajiri R., ayashi M., Saisho K., Goda Y., 2005, Simultaneus determination of nineteen hallucinogenic tryptamines/β-calbolines and phenethylamines using gas 26