XVIII Zjazd Naukowy ZBIÓR STRESZCZEŃ

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 203 Volume 49 Number 3 x-x Praca oryginalna Original Article XVIII Zjazd Naukowy Polskiego Towarzystwa Diagnostyki Laboratoryjnej ZBIÓR STRESZCZEŃ Warszawa, 5 8 września 203 r. Uwaga: Redakcja czasopisma dokonała wyłącznie ujednolicenia formy prezentowanych materiałów, nie bierze odpowiedzialności za ich treść merytoryczną 283

2 284 WYKŁADY

3 WYKŁADY WYKŁADY PLENARNE Rola badań molekularnych w personalizacji terapii chorób nowotworowych. Marek Mirowski Przez wiele lat poszukiwania leków były związane z przypadkowym odkrywaniem substancji biologicznie aktywnych. Dopiero poznanie genomu człowieka w ramach projektu Human Genome Project pozwoliło na rozwój koncepcji medycyny i terapii personalizowanej, która opiera się na dopasowaniu leku do pacjenta, a nie do danej choroby. Terapia na miarę stała się możliwa dzięki wykorzystaniu szeregu wysoko zaawansowanych metod diagnostycznych, ponieważ to właśnie one umożliwiają precyzyjne zdefiniowanie różnic genetycznych pomiędzy chorującymi na tę samą chorobę oraz identyfikację możliwych tarcz działania leków. Dzięki zdobyczom biologii molekularnej nowoczesna medycyna personalizowana posługuje się nowymi narzędziami diagnostycznymi pozwalającymi na precyzyjne oznaczenia zmian związanych z procesem nowotworzenia na poziomie DNA (genomika) i RNA (transkryptomika). Należą do nich technika polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) i szereg jej modyfikacji RT-PCR, PCR-RFLP, qrt-pcr, mikromacierze cdna i oligonukleotydowe oraz metody sekwencjonowania. Należy jednak pamiętać, że w personalizacji terapii istotne są również badania metabolomiczne czy proteomiczne. Badania prowadzone w oparciu o ww. techniki stwarzają możliwości wyboru nowych biomarkerów charakterystycznych dla poszczególnych nowotworów i w konsekwencji na planowanie struktury nowych leków i indywidualizację terapii. Klasycznym przykładem biomarkera może być receptor naskórkowego czynnika wzrostu typu 2 (HER2). Białko HER2 stało się czynnikiem predykcyjnym odpowiedzi na terapię celowaną trastuzumabem u chorych z rakiem piersi. Istotną rolę w onkogenezie wielu nowotworów m.in. płuca, jelita grubego, trzustki odgrywa gen K-RAS. Kodowane przez ten gen białko K-RAS stanowi istotny element szlaku sygnałowego inicjowanego przez receptor EGFR. Jak wykazano pacjenci z prawidłowym genem kodującym białko K-RAS dużo lepiej odpowiadają na leczenie anty-egfr niż pacjenci z genem zmutowanym. Z kolei mutacje w obrębie genu kodującego receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu korelują z odpowiedzią na leczenie pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą inhibitorów kinazy tyrozynowej. Mutacje w obrębie genu BRAF występują u około 50% chorych na czerniaka skóry. Inhibitor białka będącego produktem tego zmutowanego genu może wkrótce stać się przełomem w leczeniu tego źle rokującego nowotworu. Badania molekularne są również wykorzystywane do oceny szybkości metabolizmu leków. Na tej podstawie dobiera się optymalną dawkę dla chorego, przewiduje ich skuteczność, toksyczność oraz lekooporność. Zmienność ta wiąże się z występowaniem różnych wariantów genetycznych w ludzkim genomie. Zjawisko to określane jest polimorfizmem genetycznym. Znanych jest kilka rodzajów polimorfizmu, wśród nich najważniejsze to: SNP (polimorfizm pojedynczych nukleotydów), D/I (polimorfizm delacja/insercja) oraz VNTR (polimorfizm zmiennej liczby tandemowych powtórzeń). Dla niektórych, stosowanych w onkologii leków np. azatiopuryny i merkaptopuryny głównie metabolizowanych przez metylotransferazę tiopuryny (TPMT), irynotekanu przekształcanego w czynny metabolit SN-38, który jest następnie inaktywowany poprzez sprzęganie z kwasem glukuronowym z udziałem glukuronylotranferazy-udp (UGTA) farmakogentyczna informacja jest zawarta w ulotkach o leku. Znaczenie diagnostyki molekularnej w medycynie personalizowanej podkreśla wprowadzenie nowego terminu jakim jest teranostyka lub teradiagnostyka, który łączy terminy terapia i diagnostyka a medycyna personalizowana staje się wyzwaniem medycyny w XXI wieku. Rola badań diagnostycznych w przeszczepieniach szpiku Wiesław Wiktor Jędrzejczak Badania diagnostyczne wykonywane podczas zabiegu przeszczepiania komórek krwiotwórczych można podzielić na badania dotyczące choroby, która jest wskazaniem do wykonania danego zabiegu oraz na badania związane z samym zabiegiem. Te ostatnie można z kolei podzielić na badania standardowe wykonywane podczas wszystkich poważniejszych zabiegów i dotyczące monitorowania istotnych funkcji życiowych oraz powikłań oraz na badania swoiste dla przeszczepiania komórek krwiotwórczych. Badania dotyczące choroby, która była wskazaniem do wykonania zabiegu zależą od rodzaju tej choroby i zwykle polegają na ocenie jej natężenia i znalezienia wykładników, które będą mogły następnie być wykorzystywane do oceny wyników leczenia. Badania dotyczące monitorowania istotnych funkcji życiowych obejmują testy hematologiczne, biochemiczne, mikrobiologiczne oraz badania obrazowe. Badania swoiste dla zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych obejmują w pierwszej kolejności dobór dawcy, następnie ocenę zdolności krwiotwórczej przeszczepu, a ostatecznie ocenę chimeryzmu poprzeszczepowego, czyli ocenę wytwarzania przez przeszczep komórek pochodzących od dawcy w organizmie biorcy. Dobór dawcy to przede wszystkim badania HLA wysokiej rozdzielczości, badanie grup krwi (nie ma znaczenia dla wyniku zabiegu, ale określa sposób jego wykonania) oraz w przypadku przeszczepiania krwi pępowinowej crossmatch. Ocena zdolności krwiotwórczej przeszczepu to ocena liczby komórek jednojądrowych w przeszczepie oraz liczba komórek CD34 dodatnich (i/lub CD33 dodatnich) wśród których znajdują się krwiotwórcze komórki macierzyste. Wreszcie ocenę chimeryzmu poprzeszczepowego wykonuje się różnymi metodami. Jeśli dawca i biorca różnili się antygenami grupowymi krwi to do tego celu może być wykorzystana zmiana tych antygenów po przeszczepieniu. Jeśli dawca i biorca różnili się płcią to do tego celu może być wykorzystane pojawianie się lub zanikanie chromosomu Y. Oprócz tego, obecnie powszechnie wykorzystywane są markery mikrosatelitarne określane metodami biologii molekularnej. Badania te mogą być wykonywane w odniesieniu do pełnego szpiku lub krwi obwodowej lub mogą oddzielnie dotyczyć izolowanych populacji komórkowych, a więc np. limfocytów T. Podsumowując, zabiegi przeszczepiania szpiku wymagają na każdym etapie dużej liczby badań monitorujących funkcję przeszczepu, chorobę podstawową i powikłania, a jeśli są wykonywane zgodnie z protokołem zapewniają wysoką skuteczność leczniczą tych zabiegów. Glikacja znaczenie kliniczne i diagnostyczne Krystyna Sztefko Nieenzymatyczne potranslacyjne modyfikacje zmieniające struktu-ralne i biologiczne własności białek w organizmach żywych są jedną z przyczyn procesu starzenia organizmu i różnych, często długotrwałych, schorzeń. Nieodwracalne modyfikacje białek wynikają z reakcji przyłączania się różnych niskocząsteczkowych metabolitów do wolnych, reaktywnych grup aminowych białek z następową rearanżacją chemiczną cząsteczek białka. W takiej sytuacji naruszona zostaje równowaga pomiędzy syntezą de nowo białek a procesem degradacji zmodyfikowanych białek, co powoduje nagromadzanie się tych ostatnich zarówno wewnątrz- jak i poza komórką. Procesy te pojawiają się progresywnie z wiekiem, ale schorzenia takie jak cukrzyca, choroby nerek, retinopatia, osteoporoza, choroby neurodegeneracyjne, nadciśnienie i miaż-dżyca proces ten przyspieszają. Najbardziej znaną nieenzymatyczną modyfikacją białek, lipidów i kwasów nukleinowych jest glikacja. Reakcja glikacji, pierwszy etap reakcji Maillarda in vivo, to kondensacja grupy karbonylowej z wolną grupą aminową białek w wyniku czego powstaje zasada Schiffa, która ulega spontanicznej rearanżacji do produktu Amadoriego. Ten ostatni produkt jest z kolei degradowany do różnych produktów pośrednich. W ostatecznej fazie powstają końcowe produkty glikacji (AGEs). Procesowi glikacji ulegają wszystkie białka, przy czym najbardziej znaną reakcją jest glikacja hemoglobiny. Proces ten jest niezależny od wieku w zdrowej populacji. Molekularne starzenie się białek powoduje: ) nagromadzenie się białek opornych na proteolizę, 2) agregację białek, co zmienia fizykochemiczne i mechaniczne własności tkanek, 3) utratę funkcji biologicznej starego białka co powoduje nieprawidlowe oddziaływanie białko-białko czy komórka-białko oraz 4) tworzenie się nowych immunogennych epitopów, 5) nieprawidłowy efekt biologiczny na skutek uruchamiania nieprawidłowego przekazu informacji po połączeniu uszkodzonych białek z receptorami komórkowymi. Badania nad produktami glikacji to bardzo obiecująca dziedzina nauki. Jednakże z analitycznego punktu widzenia jest to niesłychanie trudny problem bowiem ogromna liczba struktur chemicznych o różnym czasie biologicznego półtrwania i różnej stabilności jest główną przyczyną braku selektywnych i wysoko czułych metod. Do tej pory do oznaczania białek glikowanych, produktów pośrednich, reaktywnych metabolitów lub swoistych zmodyfikowanych białek a także końcowych produktów glikacji wykorzystywane były metody kolorymetryczne, fluorescencyjne, immunochemiczne, chromatografii gazowej czy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrem masowym. Najbardziej istotny z klinicz- 285

4 WYKŁADY nego punktu widzenie byłby pomiar końcowych produktów glikacji a nie ich pośrednich produktów. Istotnym utrudnieniem dla analityka jest egzogenne pochodzenie wielu produktów glikacji a ich stężenie stanowi wypadkową wielu równoległych i konkurencyjnych reakcji chemicznych. Należy mieć nadzieję, że zastosowanie proteomiki to oznaczania AGEs z pewnością będzie milowym krokiem w zrozumieniu procesu nieenzymatycznej glikacji i pozwoli na wprowadzanie nowych terapii znanych chorób. WYKŁADY NA SESJACH NAUKOWYCH I. NOWE TECHNOLOGIE I PRZYKŁADY ICH ZASTOSOWANIA Mikromacierze, nanotechnologia, lab on a chip. Urszula Demkow Mikromacierze (microarray) to miniaturowe układy hybrydyzacyjne składające się z różnego typu sond rozpoznających fragmenty genów, transkryptów lub białek. Poziom ekspresji badanych genów, transkryptów lub obecność protein ocenia się mierząc natężenie emitowanej punktowo fluorescencji. Pomiaru dokonuje się za pomocą odpowiedniego analizatora. Mikromacierze mogą one służyć zarówno do analizy strukturalnej jak i czynnościowej genomu, transkryptomu lub proteomu. Mikromacierze znajdują coraz szersze zastosowanie w wielu dziedzinach biologii i medycyny, w tym w rutynowej diagnostyce. Zaletą techniki mikromacierzy w diagnostyce jest znaczne przyspieszenie procesu analitycznego, synchronizacja wielu oznaczeń w jednym czasie oraz niewielka ilość niezbędnego do analizy materiału. Mikromacierze są przydatnym narzędziem do badań genomu. Stwarzają możliwości poznania sekwencji materiału genetycznego, mapowania genomu oraz określenie zależności wewnątrz genomu. Mikromacierze mają potencjalnie bardzo szerokie znaczenie w onkologii. Wzorce ekspresji genów umożliwiają bardziej precyzyjną stratyfikację chorych. Analiza proteomu komórki może mieć również duże znaczenia diagnostyczne i poznawcze. Mikromacierze mogą służyć jako metoda badawcza ułatwiająca identyfikację istotnego punktu uchwytu dla leku hamującego wzrost guza. Badania można prowadzić in vitro na wyizolowanych od chorego komórkach nowotworowych. Farmakogenomika nowotworów pozwala na odkrycie nowych leków przeciwnowotworowych oraz molekularnych celów dla nich na podstawie poznania mechanizmu onkogenezy. Technika mikromacierzy stała się jednym z ważniejszych narzędzi farmakogenomiki. Nanotechnologia zajmuje się obiektami o rozmiarach w granicach od do 00 nanometrów. Rozwój nanotechnologii możliwy był dzięki rozwojowi skaningowej mikroskopii tunelowej, pozwalającej oglądać obiekty wielkości atomów. Obiekt zbudowany z tych samych atomów w skali makroskopowej ma zupełnie inne, obserwowane w naszym codziennym życiu właściwości. Przy rozdrobnieniu do wielkości cząstek rzędu nanometrów pojawiają się nowe cechy fizyczne. Wynikają one z dużego stosunku powierzchni cząstek w stosunku do zajmowanej przez nie objętości. Nanodiagnostyka polega na zastosowaniu urządzeń pracujących w nanoskali. Pozwalają one na znaczne zwiększenie czułości metody i przyspieszenie procesu analitycznego. Przykładem miniaturyzacji urządzeń pomiarowych może być laboratorium na szkiełku (lab on a chip). Wykorzystując taką technologię kilkadziesiąt tysięcy reakcji biochemicznych dziennie można przeprowadzić za pomocą układu mikroprzepływowego wielkości karty kredytowej. Reakcje zachodzą we wnętrzach drobnych kropel, przesuwających się wzdłuż odpowiednio zaprojektowanych kanalików. Objętości kropel są kontrolowane za pomocą komputera. Przy małych objętościach przepływ jest laminarny co ułatwia kontrolowanie przebiegu reakcji. Układy wytwarzające kropelki są proste i tanie, substancje w mikrokanalikach doskonale się mieszają, a ich przepływ zazwyczaj jest wymuszany różnicą ciśnień. Pomimo ogromnych sukcesów nowych technologii znaczący postęp techniczny nie idzie jeszcze w parze z zastosowaniami klinicznymi. Stopień skomplikowania analiz, złożoność i koszt aparatury oraz trudności związane ze złożoną analizą biostatystyczną stanowią wciąż ogromne wyzwanie. Możliwości aplikacyjne LC-MRM/MS do rutynowego oznaczenia stężenia białek i peptydów w osoczu, moczu oraz tkance Dominik Domański W ciągu ostatnich dwudziestu lat biochemia białek została zrewolucjonizowana dzięki rozwojowi nowych technologii spektrometrii mas tworząc dziedzinę zwaną proteomiką. Badania proteomów różnych organizmów za pomocą spektrometrii mas pozwoliły na identyfikację i pomiar stężenia tysięcy białek, badanie ich posttranslacyjnych modyfikacji oraz analizę ich struktury. Globalne analizy proteomiczne doprowadziły do identyfikacji potencjalnych biomarkerów wielu chorób, w tym markerów chorób nowotworowych, chociaż większość z nich czeka na walidacje za pomocą bardziej specyficznych metod. Przed kilku laty w proteomice powstał nowy sposób analizowania prób, zwany analizą ukierunkowaną- Multiple Reaction Monitoring (MRM). Zastosowanie tej analizy spowodowało znaczny wzrost liczby prowadzonych badań proteomicznych m.in. dotyczących walidacji biomarkerów, dzięki możliwości dokładnego pomiaru ilościowego konkretnych białek w bardzo zróżnicowanym materiale biologicznym organizmów (począwszy od roślin po płyny ustrojowe człowieka). Do zalet metody MRM należy krótki czas analizy (poniżej jednej godziny) oraz jej wysoka wydajność. Co więcej, dzięki możliwości użycia syntetycznych peptydów wyznakowanych ciężkimi aminokwasami i nowoczesnych spektrometrów mas, analiza MRM pozwala na pomiar białek ze specyficznością, precyzją, powtarzalnością oraz czułością nieosiągalną dla innych metod analitycznych w biochemii. Aplikacje tej innowacyjnej, ilościowej techniki proteomicznej zostaną przedstawione w oparciu o przykłady oznaczeń stężenia białek i peptydów w osoczu, moczu oraz tkance w badaniach naukowych z potencjalnymi możliwościami zastosowań w rutynowych laboratoriach diagnostycznych w przyszłości. Ilościowe oznaczenia za pomocą LC-MS/MS w materiale klinicznym panelu leków immunosupresyjnych Leszek Pączek Streszczenia nie dostarczono Możliwości zastosowania HPLC i LC-MS/MS w rutynowym oznaczaniu metabolitów witaminy D oraz paneli hormonów sterydowych Zbigniew Bartoszewicz W rutynowej diagnostyce medycznej stężenia metabolitów witaminy D oraz hormonów sterydowych są najczęściej oznaczane za pomocą testów immunochemicznych. Używane w testach przeciwciała wykazują różne powinowactwo w stosunku do poszczególnych izoform mierzonego analitu oraz mogą reagować krzyżowo z innymi związkami znajdującymi się w badanym materiale biologicznym, co wpływa na wiarygodność otrzymywanych wyników. Z pośród wielu metabolitów witaminy D najczęściej oznaczane jest stężenie jej 25-hydroksylowanej formy (25OHD, kalcidiol), która najlepiej odzwierciedla status witaminy D w organizmie. W surowicy dominującą jest izoforma 25OHD 3 (cholekalcidiol), jakkolwiek w zależności od rodzaju stosowanej diety, trybu życia i rodzaju suplementacji izoforma 25OHD 3 (ergokalcidiol) może stanowić znaczny udział. Dodatkowo u niemowląt występuje forma epimeryczna C-3a-hydroxy epimer -25OHD. Przeciwciała w testach immunochemicznych w różnym stopniu rozpoznają 25OHD 3, 25OHD 2 i C-3 epimer, reagują krzyżowo z formami laktonowymi oraz innymi metabolitami np. z 24,25-dihydroksy witaminą D. Z tego powodu wyniki pomiaru stężenia 25OHD wykonane testami immunochemicznymi różnych producentów mogą znacznie od siebie odbiegać co obserwuje się w międzynarodowym programie kontroli jakości (Vitamin D External Quality Assessment Scheme -DEQAS). W konsekwencji znaczące dysproporcje w wynikach stężeń 25(OH)D mogą mieć wpływ na podejmowanie odmiennych decyzji dotyczących leczenia danego pacjenta. Powyższych problemów można uniknąć stosując do pomiarów stężeń wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężona z tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS). Obecnie stosowane kolumny chromatograficzne pozwalają na rozdział 25OHD 3, 25OHD 2 i C-3 epimeru, a po ich zjonizowaniu w trybie monitorowania wybranych reakcji MRM - Multi Reaction Monitoring w spektrometrii mas poddaniu analizie powstałych z jonów macierzystych charakterystycznych dla danego analitu jonów fragmentacyjnych (potomnych). Wyniki pomiaru stężenia 25OHD metodą LC-MS/MS w programie DEQAS wykazują wyższą wiarygodność w porównaniu z metodami immunochemicznymi. Dodatkowo w badanej próbce można określić udział poszczególnych izoform 25OHD 3, 25OHD 2 oraz C-3 epimeru. Diagnostyka wielu ważnych chorób układu endokrynnego bazuje na oznaczeniach stężeń 286

5 WYKŁADY wybranych hormonów steroidowych testami immunochemicznymi i jest obarczona błędami wynikającymi z interakcji przeciwciał używanych w testach z lekami (np. spirolaktonem) oraz metabolitami hormonów steroidowych o zbliżonej strukturze chemicznej. Niektóre testy immunochemiczne np. do oceny stężenia dihydrotestosteronu oraz 2-deoksykortyzolu - najbardziej specyficznego metabolitu dla rozpoznania wrodzonego przerostu nadnerczy (WPN) są trudno dostępne. Zastąpienie testów immunochemicznych metodą LC-MS/MS pozwala na usprawnienie diagnostyki poprzez oznaczanie w jednej analizie stężeń niezbędnych paneli hormonów sterydowych oraz porównanie ich stosunków ilościowych. Wprowadzenie metody LC-MS/MS do rutynowej diagnostyki medycznej na świecie stało się faktem ponieważ dysponuje ona możliwościami niedostępnymi dla obecnie stosowanych metod, pozwalając przy okazji uniknąć błędów z nimi związanych. Polska w tym zakresie znacznie pozostaje w tyle za USA i zachodnią częścią Unii Europejskiej. II. BADANIA W MIEJSCU OPIEKI NAD PACJENTEM Badania w miejscu opieki nad pacjentem koncepcja, zalecenia, regulacje Bogdan Solnica Rozwój metod intensywnej opieki medycznej (oddech wspomagany i zastępczy, wspomaganie krążenia, rewaskularyzacja niedokrwionego myocardium i in.) oraz rosnąca liczba innych procedur klinicznych stwarzają potrzebę radykalnego skrócenia czasu oczekiwania na wyniki badań laboratoryjnych (TAT, turn-around time), a często wyników w czasie rzeczywistym. Wykonywanie badań w laboratorium, z fazą przedanalityczną, analityczną i poanalityczną, często nie może zapewnić wymaganego TAT. Najbardziej efektywnym sposobem skrócenia TAT i otrzymywania wyników badań w czasie rzeczywistym jest wykonywanie ich w miejscu opieki nad pacjentem (POCT, point-of-care testing). Koncepcja POCT rozwijana jest od końca lat 980. i obecnie ten sposób wykonywania badań jest nieodwracalnym trendem w diagnostyce laboratoryjnej. Konsekwencją przeniesienia wykonywania badań do miejsc opieki nad pacjentem było stworzenie nowej kategorii aparatury laboratoryjnej obecnie ten segment rynku IVD rozwija się najszybciej. Istotnymi aspektami POCT są kwalifikacje personelu wykonującego te badania oraz system jakości. Wskazania do wykonywania badań w trybie POCT oraz zalecana ich organizacja zostały opisane w zaleceniach praktyki medycyny laboratoryjnej, jak np. w wydawnictwie amerykańskiej NACB z Evidence-based Practice for Point-of-Care Testing. Są one również przedmiotem zapisów normy PN-EN ISO z Badania w miejscu opieki nad pacjentem. Wymagania dotyczące jakości i kompetencji. Warto podkreślić, że zarówno zalecenia NACB jak i polska norma przewidują aktywny udział i odpowiedzialność centralnego laboratorium placówki służby zdrowia w zakresie organizacji i wyposażenia stanowisk POCT oraz szkolenia i kontroli jakości. Czynniki determinujące jakość badań POCT Jan Kanty Kulpa Badania laboratoryjne stały się, niezbędnym elementem medycyny klinicznej, obserwuje się dynamiczny wzrost zapotrzebowania na wyniki badań laboratoryjnych, na poszerzenie zakresu badanych parametrów. Diagnostyka laboratoryjna jest jedną z dziedzin medycyny o wyjątkowo rozbudowanym systemie kontroli jakości wykonywanych badań. Międzynarodowe normy (ISO 7025 jak i ISO 589) wyraźnie precyzują wzorce, których spełnienie zwiększa prawdopodobieństwo wiarygodnych wyników, a akty legislacyjne nakładają na medyczne laboratoria diagnostyczne obowiązek ich wdrażania. Konsekwencją rozwoju metod intensywnej opieki medycznej, którego od szeregu lat jesteśmy świadkami jest znaczący tak pod względem liczby jak i asortymentu wykonywanych badań rozwój działu badań diagnostycznych wykonywanych przy łóżku chorego (point of care testing POCT), których podstawową zaletą jest minimalizacja czasu oczekiwania na wynik. Stwarza to określone wymagania odnośnie technik i aparatury pomiarowej stosowanych przy wykonywania tego typu badań. Przy pełnym zrozumieniu dla znaczenia wyników POCT w intensywnej opiece medycznej, należy być świadomym zagrożeń, jakie ten tryb wykonywania badań stwarza dla ich wiarygodności. Minimalizacja prawie do zera - czasu trwania fazy przedanalitycznej bynajmniej nie zapewnia eliminacji, przynajmniej niektórych czynników, które mogą być przyczyna błędnego wyniku badania. W fazie pomiarowej, pomimo jej znacznej automatyzacji i ograniczenia czynności, istotny problem stanowią ograniczenia profesjonalnych umiejętności wykonawców badań, brak systemów kontrolnych jak i autoryzacji wyników badań, problemy z elektroniczną dokumentacja wyników badań. W fazie poanalitycznej brak istotnych informacji dotyczących pacjenta może stwarzać trudności dla prawidłowej interpretacji wyników badań. Świadomość tych wszystkich ograniczeń leży u podstaw określenia roli i wymagań, jakie stawiane są przed medycznym laboratorium diagnostycznemu w zakresie pomocy i opieki nad badaniami wykonywanymi w trybie POCT, obejmującymi zarówno udział w wyborze aparatury pomiarowej, szkoleniu kadr, jak i przygotowaniu instrukcji wykonawczych, systematycznej kontroli wykonawstwa badań oraz procedur konserwacyjnych. Należy mieć pełną świadomość, ze tylko wówczas wynik badania w trybie POCT jest bezpieczny i wnoszący istotne informacje dla podejmowania decyzji w trakcie intensywnej opieki medycznej, jeżeli jest wiarygodny. Laboratoryjne parametry krytyczne w stanach zagrożenia życia, ich przydatność w szpitalnym oddziale ratunkowym i oddziale intensywnej terapii. Wojciech Gaszyński W stanach zagrożenia życia pacjentów leczonych w Szpitalnym Oddziale Ratunkowym (SOR) i w Oddziale Intensywnej Terapii (OIT) poza badaniem przedmiotowym poszkodowanego, kluczową rolę w szybkiej diagnostyce a tym samym w stabilizacji stanu chorego odgrywają badania laboratoryjne wykonywane przyłóżkowo w SOR i OIT. Badania te określane jako laboratoryjne parametry krytyczne powinne być wykonane w pierwszej kolejności po badaniu podmiotowym (jeżeli wywiad jest możliwy) i badaniu przedmiotowym (ocena fizykalna) w stanach krytycznych u chorego przed dalszą szczegółową diagnostyką, bowiem w oparciu o wyniki tych badań wdrażane są określone procedury ratunkowe diagnostyczno-lecznicze. Do laboratoryjnych parametrów krytycznych wykonywanych przyłóżkowo w SOR w zależności od stanu pacjenta zaliczamy:. U wszystkich pacjentów nieprzytomnych, konieczne jest natychmiastowe oznaczenie stężenia glukozy we krwi; 2. U wszystkich chorych bladych, z przyśpieszonym tętnem, niskim lub nieoznaczalnym ciśnieniem tętniczym krwi konieczne jest natychmiastowe oznaczenie stężenia hemoglobiny i wartości hematokrytu; 3. U wszystkich chorych z zaburzeniami rytmu serca, konieczne jest natychmiastowe oznaczenie stężenia jonów potasu we krwi; 4. U wszystkich chorych z bólami w klatce piersiowej, konieczne jest wykonanie natychmiastowe oznaczenia enzymów sercowych; 5. U wszystkich chorych z zaburzeniami oddechowymi, konieczne jest wykonanie natychmiastowe gazometrii krwi z uwzględnieniem methemoglobiny i stężenia CO; 6. Do laboratoryjnych parametrów krytycznych wykonywanych przyłóżkowo w OIT poza wymienionymi wyżej wykonywanymi w SOR w zależności od stanu pacjenta zaliczamy: 7. U wszystkich chorych z zaburzeniami oddechowymi wentylowanymi mechaniczni, konieczne jest wykonywanie przyłóżkowe gazometrii krwi z uwzględnieniem równowagi kwasowo zasadowej i wodnoelektrolitowej; 8. U wszystkich chorych z ciągłą terapią nerkozastępczą z użyciem cytrynianów, konieczne jest oznaczanie przyłóżkowe wapnia zjonizowanego; 9. U wszystkich chorych z punktacją APACHE II > 5 pkt., konieczne jest wykonywanie przyłóżkowe stężenia glukozy we krwi. 0. U wszystkich chorych z objawami krwawienia, powinno się wykonywać przyłóżkowo badania tromboelastograficzne;. Uzasadnieniem dla wykonywania badań laboratoryjnych przyłóżkowych są stany zagrożenia życia i konieczność podjęcia natychmiastowej terapii. Decyduje czas otrzymania wyniku badania a tym samym podjęcia decyzji terapeutycznej. Rola diagnosty w organizacji badań POCT Alicja Utracka Centralne Laboratorium Kliniczne Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku, w odpowiedzi na potrzeby klinicystów 287

6 WYKŁADY w zakresie otrzymywania niektórych wyników badań laboratoryjnych w czasie rzeczywistym, stworzyło sieć punktów do oznaczeń parametrów krytycznych. W całym szpitalu stworzono jednolity system. System ten jako koncepcja POCT (Badania w miejscu opieki nad pacjentem) jest nadal rozwijany. Do takiego rozwiązania w dużej mierze przyczyniło się rozproszenie klinik na terenie całego szpitala i oddalenie ich od laboratorium centralnego co uniemożliwiało wcześniej szybkie wykonywanie analiz. W 2005 roku we współpracy klinicystów z diagnostami laboratoryjnymi, po rozpoznaniu rynku z zakresu aparatury diagnostycznej rozpoczęto wdrażanie projektu. Zainstalowano wówczas w klinikach 5 analizatorów (na dzień dzisiejszy 2 analizatorów POCT). Od początku główną rolę we wdrożeniu systemu (przygotowanie specyfikacji przetargowej, określenie zakresu wykonywanych badań na analizatorach, ich instalacje na oddziałach, kalibracje, system kontroli, konserwacje, serwis techniczny, zabezpieczenie w odczynniki, szkolenia personelu, nadzór nad systemem informatycznym) pełnili diagności laboratoryjni. Wdrożono system zarządzania jakością i Standardowe Procedury Badawcze (SOP) spójne dla klinik i laboratorium. Za nadzór nad badaniami odpowiadają diagności Centralnego Laboratorium Klinicznego. Stworzono stanowisko Asystenta Opiekuna Analiz Krytycznych odpowiedzialnego za ten obszar. Jego głównym zadaniem jest zabezpieczenie prawidłowego działania wszystkich analizatorów, wydawanie wiarygodnych wyników. Odpowiada on za ciągłe, nieustanne szkolenia i podnoszenia kwalifikacji personelu wykonującego badania na oddziałach ( lekarze, pielęgniarki, ratownicy medyczni). Wszystkie analizatory zostały połączone w jeden system informatyczny nadzorujący ich pracę. Diagnosta laboratoryjny za jego pomocą może monitorować prawidłowość pracy poszczególnych aparatów. W systemie tym widoczne są aktualne statusy analizatorów. Możliwa jest zdalna interwencja diagnosty w poszczególne analizatory. System umożliwia kontakt z osobą obsługującą aparat POCT za pomocą komunikatora na ekranie analizatora. Program nadzoru nad analizatorami komunikuje się dwukierunkowo z systemem laboratoryjnym. Przesyła dane pacjentów i ich wyniki do Laboratoryjnego Systemu Informatycznego, który jest połączony w sieci ze szpitalnym systemem informatycznym. Rozwój POCT jest nieunikniony i jest nowym obszarem do działania dla diagnostów laboratoryjnych. Wdrażanie w szpitalu systemu POCT jest przykładem na to jak nowoczesne laboratorium medyczne powinno szybko identyfikować i reagować na potrzeby odbiorców wyników badań laboratoryjnych. Takie działania są jednocześnie wspomagane regulacjami prawnymi tj. Rozporządzeniem Ministra z dnia 5 marca 2007 r. w sprawie szpitalnego oddziału ratunkowego jak też normą ISO Badania w miejscu opieki nad pacjentem. Wymagania dotyczące jakości i kompetencji III. ASPEKTY ANALITYCZNE I KLINICZNE ZABURZEŃ FUNKCJI NEREK Markery nerkowe jako wskaźniki ryzyka pozanerkowego Zbigniew Gaciong Przewlekła choroba nerek stanowi niezależny od poznanych, tradycyjnych czynników ryzyka wskaźnik zwiększonego ryzyka choroby wieńcowej, jak również powikłań u osób z już istniejącą chorobą układu krążenia. Zarówno zmniejszenie wielkości przesączania kłębuszkowego, jak i obecność białkomoczu wskazują na wzrost zagrożenia zdarzeniami sercowo-naczyniowymi, a zależność pomiędzy ryzykiem a wymienionymi parametrami ma charakter ilościowy i ciągły. Wzrost zagrożenia powikłaniami ze strony układu krążenia tłumaczy się częstym występowanie tradycyjnych czynników ryzyka, takich jak nadciśnienie tętnicze, palenie tytoniu, cukrzyca, hiperlipidemia i podeszły wiek, u pacjentów z przewlekłą chorobą nerek. Ponadto, w zaawansowanych stadiach niewydolności nerek, dodatkowo mogą niekorzystnie oddziaływać zaburzenia typowe dla mocznicy obecność toksyn mocznicowych, niedokrwistość, zaburzenia gospodarki wapniowo-fosforanowej, kwasica i in. Nie można również wykluczyć, że objawy uszkodzenia nerek wynikają ze zmian naczyniowych, które występują także w innych narządach, stąd białkomocz czy spadek GFR mogą być wskaźnikiem a nie czynnikiem ryzyka. Dane z dużych badań epidemiologicznych dowodzą, że wzrost ryzyka ma miejsce już w początkowych okresie przewlekłej choroby nerek, nawet gdy wartości stężenia kreatyniny pozostają w zakresie wartości referencyjnych dla zdrowej populacji. Podobnie, wzrost wydalania albumin, nawet niewielki - nie spełniający kryteriów mikroalbuminurii, zwiastuje zwiększone zagrożenie. Dlatego od kilku lat powszechnie zaleca się ocenę czynności nerek w oparciu o wyliczany wskaźnik przesączania kłębuszkowego (egfr). Spośród popularnych wzorów (MDRD, Cocrofta-Gaulta, Schwartza) najbardziej dokładny wydaje się zaproponowany niedawno kalkulator CKD-EPI. Należy pamiętać, że powyższe kalkulatory egfr zostały opracowane w oparciu o dane pochodzące od określonych grup pacjentów, co ogranicza ich przydatność w szeregu populacjach, jak osoby starsze, dzieci, ciężarne. Bardziej dokładną ocenę czynności nerek i tym samym lepsze określenie ryzyka sercowo-naczyniowego zapewnia pomiar stężenia cystatyny C. Stężenie tego białka, które jest naturalnym inhibitorem proteaz, nie zależy od masy mięśniowej i wcześniej niż kreatynina, reaguje na zmiany wielkości przesączania kłębuszkowego. Poszukuje się lepszych nerkowych markerów ryzyka i pewne obserwacje wskazują, że niektóre krążące w surowicy białka (np. beta2-mikroglobulina) mogą okazać się przydatne do tego celu. Objawy łagodnej choroby nerek w większym stopniu wskazują na zagrożenie powikłaniami sercowo-naczyniowymi aniżeli ryzyko rozwoju schyłkowej niewydolności nerek. Epidemia chorób układu krążenia nakazuje ocenę czynności nerek (egfr) i pomiar białkomoczu u każdego pacjenta, natomiast ciągle poszukuje się lepszych bardziej czułych i swoistych markerów. Czy są troponiny nerkowe? Jolanta Małyszko Dotychczasowe definicje ostrego uszkodzenia nerek (acute kidney injury-aki) opierają się o wzrost stężenia kreatyniny w surowicy, a nie o spadek GFR. Z badań wiadomo, że wzrost kreatyniny pojawia się późno i ulec musi uszkodzeniu co najmniej połowa nefronów, aby znalazło to odbicie we wzroście stężenia kreatyniny. Dlatego też poszukuje się wczesnych markerów uszkodzenia nerek w celu identyfikacji tych pacjentów. Dotyczy to nie tylko uszkodzenia wywołanego kontrastem, ale też uszkodzenia nerek po leczeniu cytostatykami, po transplantacji nerek oraz dużych zabiegach, w tym kardiochirurgicznych. Problem dotyczy więc dużej grupy pacjentów, u których istnieje prawdopodobieństwo wystąpienia ostrego uszkodzenia nerek. O potrzebie czułego i specyficznego biomakera (ów) AKI świadczy przykład ostrych zespołów wieńcowych. W przeciwieństwie do ONN/AKI, gdzie nadal od końca lat 50-tych XX wieku praktycznie nic się nie zmieniło i nadal podstawą rozpoznania jest oznaczanie stężeń kreatyniny, a śmiertelność nadal jest wysoka W przypadku zaś ostrych zespołów wieńcowych rzecz ma się zupełnie. Co kilka lat pojawiały się nowe markery (LDH, CK, CK-MB, Mioglobina, Troponina T, Troponina I) co pozwoliło na poprawę diagnostyki OZW. Przejawiło się to zarazem znacznym zmniejszeniem śmiertelności u tych chorych. Ocena stężenia troponiny uwalnianej z uszkodzonych miocytów umożliwia szybkie rozpoznanie OZW, pozwala na interwencję terapeutyczną w odpowiednim czasie i w konsekwencji dramatyczny spadek śmiertelności. Wczesne rozpoznanie AKI jest pomocne w prowadzeniu dotychczasowego leczenia (unikanie leków nefrotoksycznych, adekwatne prowadzenie bilansu płynów) oraz w rozwoju nowych form leczenia. Istnieje również bezpośrednia korelacja pomiędzy czasem trwania niewydolności nerek a śmiertelnością. Wczesne rozpoznanie umożliwi czasowe wprowadzenie metod leczenia uszkodzenia nerek i zapobiegania progresji- jednakże jak wynika z badań doświadczalnych i u ludzi okno możliwości terapeutycznych jest wąskie. Należy także rozważyć ocenę stężenia biomarkerów jako wtórnych punktów końcowych, kryteriów włączenia do badań oraz bezpieczeństwo stosowania leków tj ocenę potencjalnej neurotoksyczności. Obecnie trwają intensywne prace nad znalezieniem biomarkera lub kilku biomarkerów wczesnego uszkodzenia nerek. Biomarkery AKI obecnie oceniane: NGAL (osocze/surowica i mocz), KIM- (mocz), L-FABP (mocz), IL-8 (mocz), cystatyna C (osocze/surowica, mocz), albumina (mocz), NAG (mocz), GST α i π (mocz), GGT (mocz), beta-2-mikroglobulina (mocz), midkine (osocze/surowica), hepcydyna (osocze/surowica, mocz), renalaza (surowica, osocze). Z tych wielu badanych biomarkerów obecnie największym obiektem zainteresowania jest NGAL. Wyniki uzyskane w wielu badaniach klinicznych wykazują iż NGAL jest dobrym, obiecującym markerem wczesnego uszkodzenia nerek. Niestety nie pozbawiony jest też wad. Ograniczeniem jest jego występowanie poza nerką. Jego bardzo niskie stężenie wykryto w kilku innych narządach, tchawicy, płucach, żołądku i jelicie grubym. Wzrost stężenia NGAL w surowicy odnotowano np. w ostrej 288

7 WYKŁADY infekcji bakteryjnej. Na temat pełnej przydatności NGAL powiedzą nam przeprowadzane obecnie duże badania kliniczne, wtedy uzyskamy odpowiedź czy może on być troponiną w nefrologii. Rola badań laboratoryjnych w dializoterapii Jerzy Przedlacki Wyniki badań laboratoryjnych są istotne przy podejmowaniu decyzji o rozpoczęciu leczenia dializami i przy ocenie skuteczności i bezpieczeństwa dializoterapii. Służą ocenie wielu ważnych życiowo parametrów, w tym gospodarki żelazowej (problem niedokrwistości), wapniowofosforanowej, ocenie stanu zapalnego i niedożywienia. Nie jest możliwe bezpieczne prowadzenie Ośrodka Dializ bez ścisłej współpracy z lokalnym laboratorium. Kwalifikacja do leczenia dializami: Jest ona oparta jest na ocenie stanu klinicznego pacjenta i wynikach niektórych badań laboratoryjnych. Wartość egfr (z wykorzystaniem stężenia kreatyniny w surowicy) poniżej 0-5 ml/min/,73m 2 jest najczęściej uznawana za wskazanie do rozpoczęcia leczenia dializami chorych z przewlekłą chorobą nerek. Innymi uwzględnianymi badaniami są: stężenie potasu (>6,5 mmol/l) i mocznika (>250 mg/dl) w surowicy oraz kwasica metaboliczna (HCO3 <3 mmol/l). Istotna jest również ocena stanu odżywienia oparta na wyniku stężeniu albumin we krwi, cholesterolu, transferryny, rzadziej somatomedyny C i prealbumin. W ostrym uszkodzeniu nerek graniczne wartości egfr kwalifikujące do rozpoczęcia dializoterapii są najczęściej wyższe (<20-25 ml/min/,73 m 2 ), a mocznika niższe (> mg/dl). Kontrolne badania laboratoryjne w trakcie dializoterapii: Badania laboratoryjne są, obok stanu klinicznego, podstawowym sposobem oceny skuteczności i bezpieczeństwa leczenia dializami. Zakres badań u pacjentów leczonych dializą otrzewnową i hemodializą jest praktycznie taki sam. Krew u pacjentów hemodializowanych jest najczęściej pobierana przed hemodializą, a u pacjentów dializowanych otrzewnowo w godzinach rannych. Pacjenci leczeni dializami wymagają znacznie częstszych kontrolnych badań laboratoryjnych niż w ogólnej populacji. Poszczególne Ośrodki Dializ wprowadziły różne modyfikacje w zakresie wykonywanych badań, szczególnie dotyczące odstępów pomiędzy nimi. W badaniach comiesięcznych przed hemodializą dializą wykonywane jest oznaczenie morfologii krwi, stężenia w surowicy: mocznika kreatyniny, sodu, potasu, wapnia, fosforanów, CRP. Po dializie oznaczane jest stężenie mocznika, kreatyniny, sodu i potasu. W badaniach wykonywanych co 3 miesiące, poza wymienionymi wcześniej, oznaczane jest w surowicy stężenie: kwasu moczowego, glukozy, cholesterolu i jego frakcji HDL i LDL, triglicerydów, parathormonu (intact-pth), żelaza, TIBC, ferrytyny, białka całkowitego, albumin, HbAc. Oznaczana jest też aktywność w surowicy transaminaz alaninowej i asparaginowej, gammaglutamylotranspeptydazy, fosfatazy zasadowej. Pacjenci dializowani otrzewnowo mają częściej niż hemodializowani oznaczane stężenie albumin. Dodatkowe badania zależą od indywidualnych wskazań. Interpretacja wyników badań laboratoryjnych w dializoterapii: Większość wyników badań laboratoryjnych jest interpretowana tak jak w ogólnej populacji. Istnieją jednak odstępstwa od tych zasad, które nakazują przyjąć inne wartości optymalne. Zgodnie z zaleceniami towarzystw nefrologicznych optymalne stężenie intact-pth w surowicy mieści się w zakresie 2-9 krotnej górnej granicy normy dla danego testu, przy stabilnych wartościach kontrolnych badań. Wartości stężenia intact-pth powyżej lub poniżej optymalnego stężenia są wykładnikiem m.in. zwiększonego ryzyka klinicznie jawnej osteodystrofii nerkowej. Optymalne stężenie hemoglobiny jest niższe niż w ogólnej populacji i wynosi 0-,5 g/dl. Wyższe wartości hemoglobiny wiążą się ze zwiększonym ryzykiem złej kontroli ciśnienia tętniczego oraz powikłaniami zakrzepowymi. Przydatność badań laboratoryjnych w dializoterapii: Wyniki badań laboratoryjnych pozwalają modyfikować leczenie dializami i leczenie farmakologiczne. Są istotne przy podejmowaniu decyzji o rozpoczęciu leczenia dializami i przy ocenie skuteczności i bezpieczeństwa dializoterapii. Służą ocenie wielu ważnych życiowo parametrów, w tym gospodarki żelazowej (problem niedokrwistości), wapniowo-fosforanowej, ocenie stanu zapalnego i niedożywienia. Nie jest możliwe bezpieczne prowadzenie Ośrodka Dializ bez ścisłej współpracy z lokalnym laboratorium. Problemy analityczne oznaczeń kreatyniny Dagna Bobilewicz Kreatynina jest jednym z najczęściej wykonywanych badań laboratoryjnych, a pierwsze próby oznaczeń klasyczną metodą Jaffe pojawiły się na początku XX wieku. Obecnie metodą referencyjną oznaczania stężenia kreatyniny jest metoda spektrometrii masowej z rozcieńczeniami izotopowymi (Isotope Dilution Mass Spectrometry IDMS). Metoda ta nie nadaje się do stosowania rutynowego natomiast zgodnie z ustaleniami miedzynarodowymi obowiązkiem producentów zestawów jest standaryzacja wszystkich innych wersji odczynnikowych właśnie wobec IDMS. Przez wiele lat do oznaczeń rutynowych wykorzystywano reakcję w której powstaje pomarańczowo czerwony barwnik pomiędzy kreatyniną a kwasem pikrynowym w środowisku alkalicznym /reakcja Jaffe/. Ilość wytworzonego barwnika jest proporcjonalna do stężenia kreatyniny w badanej próbce. Pomiaru wytworzonej barwy dokonuje się przy długości fal około nm. Reakcja Jaffe nie jest swoista wyłącznie dla kreatyniny. Aceton, ketokwasy i białka tworzą dodatkowy kompleks z kwasem pikrynowym zawyżając wynik oznaczenia. Fałszywie zawyżone wyniki uzyskuje się także w próbkach z wysokim stężeniem glukozy, kwasu askorbinowego, kwasu moczowego oraz cefalosporyny. Z kolei w próbkach ze znaczną bilirubinemią /próbki żółtaczkowe/ uzyskuje się wyniki fałszywie zaniżone. Znajomość zachodzących nieprawidłowości doprowadziła do powstania szeregu modyfikacji metody. Dużym powodzeniem cieszy się obecnie wersja kinetyczna w której dokonuje się kilkakrotnych pomiarów przyrostu absorbancji w krótkich odcinkach czasu. Prowadzi to do eliminacji wielu czynników interferujących, których kinetyka reakcji jest odmienna od kinetyki reakcji z kreatyniną. Odmienną grupę stanowią tzw. metody z kompensacją w których także częściowo udało się wyeliminować wpływ substancji interferujących, określanych jako Jaffe dodatnie. Nową grupę metod stanowią metody enzymatyczne. Wykorzystywane w nich enzymy: kreatyninaza, kreatynaza i oksydaza sarkozynowa przekształcają kreatyninę w glicynę, formaldehyd i nadtlenek wodoru. Powstały H 2 O 2 jest rozkładany przez peroksydazę chrzanową z wytworzeniem aktywnej postaci tlenu. Pod jego wpływem dochodzi do utlenienia tzw. chromogenów i przekształcenia postaci bezbarwnych w barwne co daje możliwość pomiaru spektrofotometrycznego. Powszechnie znany hamujący wpływ piramidonu i uzyskiwane w jego obecności wyniki fałszywie zaniżone. Wymienione wyżej enzymy zostały wykorzystane także w metodzie określanej jako amperometryczna w której pomiar dokonywany jest przy pomocy specjalnej elektrody. W metodach z użyciem enzymów udało się wyeliminować wpływ większości substancji interferujących w oznaczenia z użyciem metody Jaffe. Oznaczenie stężenia kreatyniny dostępne jest w menu wszystkich analizatorów biochemicznych, a w niektórych, dostępne są obydwie metody. Rutynowo stężenie kreatyniny oznaczane jest w surowicy krwi i w moczu. Jako materiał do badania dopuszcza się także osocze. Wprowadzenie metody amperometrycznej dało możliwość wykonywania oznaczeń także we krwi pełnej, heparynizowanej. Jest ona dostępna w analizatorach parametrów krytycznych najnowszej generacji. Zastosowanie pomiaru amperometrycznego i specjalnej, półprzepuszczalnej membrany dla kreatyniny, pozwoliło dodatkowo na eliminację wpływu kwasu askorbinowego, bilirubiny, cyklosporyny, glukozy i hemoglobiny. W metodzie tej czas konieczny na uzyskanie wyniku skrócony jest do 2 minuty, bez konieczności wstępnego przygotowywania próbki. We wszystkich ulotkach dołączanych do zestawów odczynnikowych są wyszczególnione czynniki interferujące tym nie mniej w codziennej praktyce spotyka się niewytłumaczalne w jednoznaczny sposób różnice między metodami, co dotyczy najczęściej chorych w stanie ciężkim, otrzymujących jednoczasowo wiele preparatów drogą dożylną. Cystatyna C jako użyteczny marker? Marzena Iwanowska Cystatyna C jest uznawana jako marker przewlekłej choroby nerek, pozwalający na ocenę zmian jeszcze w okresie niezaawansowanych stadiów ich niewydolności, w przypadkach, kiedy stężenia kreatyniny lub egfr MDRD nie są istotne diagnostycznie. Mając na uwadze fakt, że możliwości wprowadzenia oznaczeń cystatyny do badań rutynowych były ograniczone tak ze względu na metodykę jak i cenę ciągle nie ma wystarczających danych, umożliwiających wprowadzenie cystatyny do ogólnie zaakceptowanych procedur diagnostycznych. W piśmiennictwie 289

8 WYKŁADY dyskutowane są propozycje wykorzystania stężeń cystatyny i kreatyniny do wyliczeń egfr. Z doświadczeń własnych nie wynika jednoznacznie przewaga oznaczeń cystatyny nad innymi parametrami u chorych z nadciśnieniem tętniczym, jak również w grupie osób z granicznymi wartościami egfr MDRD (50 59ml/min) IV. HIPOWITAMINOZA D NOWE WYZWANIA DLA MEDYCYNY LABORATORYJNEJ Vitamin D Status and Osteoporosis: Critical Decision Limits Howard A. Morris Current data demonstrate that vitamin D deficiency contributes to the aetiology of two metabolic bone diseases, osteomalacia and osteoporosis. Osteomalacia, or rickets in children, is the index disease of vitamin D deficiency and arises from a delay in mineralization. It can be resolved by normalising plasma calcium and phosphate homeostasis even if the vitamin D status remains depleted. The well characterised endocrine pathway of vitamin D metabolism and its activities are solely responsible for vitamin D regulating plasma calcium and phosphate homeostasis and therefore for protecting against osteomalacia. Clinical data indicate that plasma calcium homeostasis is markedly disrupted only when serum 25-hydroxyvitamin D levels fall below 20 nmol/l with decreased serum,25-dihydroxyvitamin D and intestinal calcium absorption with marked hypocalcaemia and secondary hyperparathyroidism. In contrast large bodies of clinical data support the concept that an adequate vitamin D status protects bone health by improving bone mineral density and reducing the risk of fracture. Adequate serum,25-dihydroxyvitamin D levels do not reduce the risk of osteoporotic fractures. The risk of hip fracture is markedly increased at levels of serum 25-hydroxyvitamin D below 50 nmol/l. Meta-analyses of randomised control trials strongly indicate that vitamin D in combination with calcium supplements reduce the risk of fractures in the institutionalised elderly. Metaregression analyses of such data suggest that serum 25-hydroxyvitamin D levels above 75 nmol/l are required to achieve significant fracture reduction. Clinical bone histology studies support this value of serum 25-hydroxyvitamin D as necessary to optimise bone cell activities. A plausible mechanism for various activities of vitamin D arising from the various serum 25-hydroxyvitamin D levels is provide from studies on human bone cells in culture and animal models. 25-hydroxyvitamin D can be metabolised to,25-dihydroxyvitamin D by each of the major bone cells to activate VDR and modulate gene expression to reduce osteoblast proliferation and stimulate osteoblast and osteoclast maturation. These effects are associated with increased mineralization and decreased mineral resorption. Dietary calcium interacts with vitamin D metabolism at both the renal and bone tissue levels to direct either a catabolic action on bone through the endocrine system or an anabolic action through a bone tissue autocrine or paracrine system. Wyzwania i trudności wynikające z suplementacji populacji polskiej w witaminę D. Roman Lorenc α,25-dihydroksywitamina D [,25(OH)2D] - aktywna forma witaminy D - należy do superrodziny hormonów regulujących ekspresję genów. Jej synteza ograniczana jest przez dostępność substratu - 25(OH)D. Dlatego właściwe stężenie 25(OH)D jest kluczowym elementem odpowiedniego zaopatrzenia organizmu w witaminę D dla manifestacji jej szerokiego spektrum działania. Stężenie 25(OH)D w surowicy w zakresie ng/ml jest rekomendowane jako właściwe oraz bezpieczne, co dokumentują dane z badań dotyczących a) wysokiej ekspozycji na słońce, b) kinetyki -alfa-hydrolazy (CYP27B), gdzie Km = 40 ng. Stężenia 25(OH)D poniżej 30 ng/ml wiążą się ze wzrostem częstości występowania różnych schorzeń, dlatego wartość ta uznana została za graniczną dla określenia niedoboru witaminy D. Górna granica właściwego zaopatrzenia organizmu w witaminę D została ustalona na poziomie 50 ng/ml 25(OH)D, chociaż przypadki toksyczności obserwowano niezwykle rzadko poniżej 200 ng/ml. Standardem oznaczania 25(OH)D w surowicy zgodnie z zasadami GLP (ang. Good Laboratory Practice) są metody automatyczne oceniające równocześnie stężenie 25(OH)D2 i 25(OH)D3 charakteryzujące się CV < 8% kontrolowane w systemie DEQAS (ang. The International External Quality Assessment Scheme for Vitamin D Metabolites). Wielkość odpowiedzi na zastosowaną suplementację witaminą D zależy od wyjściowego stężenia 25(OH)D oraz składu ciała (masa ciała, BMI). U pacjentów zagrożonych niedoborem witaminy D proponuje się stosowanie terapii spersonalizowanej. Suplementacja poprzez syntezę skórną musi być zawsze brana pod uwagę, jako bezpieczne i naturalne źródło witaminy D. Niedostateczna synteza skórna wymaga uzupełnienia suplementami w dawkach IU/dzień (górna bezpieczna dawka 4000 IU/dzień). Stężenie 25(OH)D w surowicy w zakresie ng/ml wskazuje na adekwatne zaopatrzenie organizmu w witaminę D, zapewniające dostępność substratu do odpowiedniej produkcji,25(oh)2d dla jej endokrynnego i parakrynnego działania. Standaryzacja oznaczeń witaminy D Elżbieta Karczmarewicz W ramach programu Vitamin D Standardization Program (VDSP) wprowadzono standaryzację oznaczeń 25(OH)D w surowicy, która spełnia kryteria dla oznaczeń endokrynologicznych. Ocena zaopatrzenia organizmu w witaminę D winna opierać się na metodach oznaczających równocześnie 25(OH)D3 oraz 25(OH)D2. Jako procedurę referencyjną zatwierdzono metodę LC-MS/MS mającą zdolność dyskryminacji metabolitu 3-epi-25(OH)D ( ) a jako materiały referencyjne SRM 972 Vitamin D in Human Serum oraz SRM Hydroxyvitamin D2 and D3 Calibration Solutions wytwarzane przez The National Institute of Standards and Technology (NIST) oraz The National Institutes of Health (NIH) Office of Dietary Supplements (ODS). Zalecenia dotyczące maksymalnego dopuszczalnego współczynnika zmienności (CV) dla oznaczeń rutynowych, referencyjnych i wzorcowych wynoszą odpowiednio 0%, 5% i 0,6%. Kontrola zewnętrzna w systemie DEQAS (Vitamin D External Quality Assessment Scheme) jest warunkiem koniecznym do ustalenia kryteriów porównywalności różnych metod. W systemie tym od ocena wiarygodności oznaczeń 25(OH)D w próbkach rutynowych ma być oceniana względem procedury referencyjnej VDSP oraz jak dotychczas względem wskaźnika odchylenia standardowego (SD) wszystkich oznaczeń ( ALTM -All-Laboratory Trimmed Mean ). Przyjęcie wspólnych kryteriów interpretacji wyników jest głównym celem prac mających na celu harmonizację oznaczeń. Zalecenia polskie, opracowane przez ekspertów w oparciu o zasady medycyny opartej na dowodach, wskazują stężenie 25(OH)D w surowicy ng/ml jako optymalne dla zdrowia człowieka.. Porównanie automatycznych metod oznaczania 25(OH)D w naszych doświadczeniach laboratorium szpitala pediatrycznego, uczestniczącego w międzynarodowym systemie kontroli jakości DEQAS,wykazało że badane metody automatyczne zastosowane w analizatorach LIAISON i ELECSYS spełniają kryteria dokładności oznaczeń przyjętych w systemie DEQAS, wykazują niski błąd oznaczeń (< 8%) i są rekomendowane do badań pediatrycznych. Oznaczenia 25(OH)D Total na analizatorach LIAISON oraz ELECSYS wykazywały również dużą zgodność wyników z metodami uznawanymi za złoty standard, HPLC i LC/MS. V. UWARUNKOWANIA JAKOSCI BADAŃ LABORATORYJNYCH Wymogi fazy przedanalitycznej, analitycznej i poanalitycznej w medycznych laboratoriach diagnostycznych w świetle standardów jakości i wymagań normy PN-EN ISO 589: 2008 Mirosława Pietruczuk, W prezentowanej pracy przedstawiono laboratoryjną opiekę nad pacjentem, w odniesieniu do wymagań resortowych i wymagań normy PN-EN ISO 589: Pokazano szczególną rolę współpracy lekarz laboratorium, pielęgniarka laboratorium, personel pomocniczy laboratorium, uwzględniając możliwości i ograniczenia tej współpracy. W polskiej diagnostyce laboratoryjnej obowiązują uregulowania prawne, które w większości powstawały równolegle do utworzonej w 200 roku korporacji diagnostów laboratoryjnych. Ich konsekwencją jest między innymi określenie standardów jakości, które musi spełniać medyczne laboratorium diagnostyczne oraz personel w nim pracujący. Akty prawne wprowadziły także odpowiednią nomenklaturę dotyczącą laboratoriów wykonujących badania diagnostyczne, jako medyczne laboratoria diagnostyczne, nazwę wykonywanego w nich zawodu, diagnosta laboratoryjny (wymóg wyższego kierunkowego wykształcenia) oraz nazwę wykonywanych w nich czynności, jako czynności diagnostyki laboratoryj- 290

9 WYKŁADY nej. Ustawa o diagnostyce laboratoryjnej określa również kompetencje diagnosty laboratoryjnego, w tym kierownika laboratorium, specjalisty w dziedzinie adekwatnej do profilu laboratorium medycznego. Ustawa o diagnostyce laboratoryjnej, wskazuje również fizyczne miejsce wykonywania czynności diagnostyki laboratoryjnej jako medyczne laboratorium diagnostyczne, co również jednoznacznie precyzuje że, diagnosta laboratoryjne sprawuje laboratoryjną opiekę medyczną nad pacjentem w medycznym laboratorium diagnostycznym. Obowiązujące akty prawne, określają wymagania fazy przedanalitycznej, analitycznej i poanalitycznej w medycznych laboratoriach diagnostycznych. Standardy jakości w medycznych laboratoriach diagnostycznych wymuszają istnienie systemów zarządzania jakością, w związku z tym coraz częściej laboratoria decydują się na wdrożenie normy PN-EN ISO 589:2008 (Polska Norma PN-EN ISO 589:2008, Laboratoria medyczne, Szczególne wymagania dotyczące jakości i kompetencji), normy dedykowanej do medycznych laboratoriów diagnostycznych. Wpływ fazy przedanalitycznej na wiarygodność wyników badań Hanna Zborowska Podstawą uzyskania rzetelnego wyniku oznaczenia oprócz zastosowania właściwej, dobrze wystandaryzowanej metody badawczej jest także odpowiednia jakość próbki. Płyny ustrojowe jako materiał do badań, są szczególnie narażone na wpływ wielu czynników, których zaistnienie może w sposób istotny zmienić wartość uzyskanego wyniku i wpływać na jego interpretację. Mino dobrze określonych wymagań w zakresie przygotowania pacjenta do badania mających na celu wyeliminowanie wpływu pory dnia, posiłku, wysiłku fizycznego, itp. należy pamiętać, że ich wykonanie zależy wyłącznie od pacjenta, szczególnie jeśli jest to pacjent ambulatoryjny. Od pacjenta zależy także jakość próbek moczu czy kału, które w większości pobierane są przez niego samego. Oczywiście standardowe wymagania mogą być zrealizowane wyłącznie w odniesieniu do badań planowych. W każdym innym przypadku wpływ powyższych czynników należy uwzględnić przy interpretacji wyniku. Często nie uświadamianą przyczyną niespójności wyników z sytuacją kliniczną jest stosowanie, często w sposób niekontrolowany /zdarzają się wielokrotne przekroczenia zapotrzebowania/, suplementów diety. Mogą one zmieniać stężenie w zakresie składników zawartych w suplemencie - żelazo, magnez, kwas foliowy ale także wpływają np. na stężenie hormonów i czynniki układu krzepnięcia. Farmakoterapia, oprócz pożądanego efektu leczniczego jest przyczyną niezamierzonego działania uszkadzającego na narządy /wątroba, nerki, szpik kostny/ ale też modyfikuje przebieg wielu reakcji chemicznych w czasie oznaczenia. Powszechnie znany jest hamujący wpływ witaminy C na przebieg reakcji oksydazowej oznaczenia glukozy. Niewątpliwie trudnym problemem są zmiany natury próbki spowodowane sytuacją kliniczną pacjenta: hiperbilirubinemia, hiperlipemia, hipo- i hiperproteinemia czy obecność przeciwciał heterofilnych i autoprzeciwciał. Te ostatnie często są źródłem nieprawdziwych wyników oznaczeń immunologicznych. Nie mniejsze źródło odstępstw w jakości próbki stanowią błędy popełniane na etapie pobierania krwi do badania. Najczęściej są to działania mechaniczne /zbyt długi ucisk stazy, oklepywanie miejsca pobrania, zbyt intensywna aspiracja, użycie za cienkiej igły/ prowadzące do rozpadu krwinek. Czerwone zabarwienie surowicy lub osocza jest potwierdzeniem tego zjawiska i takie próbki powinny być dyskwalifikowane. W próbkach shemolizowanych uzyskuje się fałszywie zawyżone wyniki oznaczeń potasu, AST, LDH, żelaza wynikające z uwolnienia się tych składników z wnętrza krwinek ale także błędne wyniki oznaczeń związane z interferencją ze strony hemoglobiny. Należy pamiętać, że hemoliza nie jest widoczna w próbkach krwi pełnej i w przypadku jakichkolwiek wątpliwości należy upewnić się czy fakt ten nie ma miejsca odwirowując próbkę krwi pełnej Lu pozostawiając ją do opadnięcia krwinek. Inne błędy zdarzające się na etapie pobierania próbek krwi to: niezachowanie proporcji pomiędzy objętością krwi i antykoagulantu /możliwa dyskwalifikacja próbki/ i użycie niewłaściwego antykoagulantu. W tym drugim przypadku wykrycie błędu jest prawie nie możliwe. Szczególną sytuacją jest wykrzepienie próbek z antykoagulantami wskutek ich niewłaściwego wymieszania. Powstający skrzep może być widoczny gołym okiem i próbka powinna być zdyskwalifikowana, ale wytworzenie mikro skrzepów może być trudne w ocenie makroskopowej i w efekcie być źródłem błędnych wyników oznaczeń parametrów układu krzepnięcia. Z kolei nie wykrzepienie próbek surowicy powoduje zmiany w naturze analizowanego materiału i w efekcie uzyskanie odmiennych wyników oznaczenia niektórych parametrów /np. białka/. W warunkach szpitalnych częstym błędem jest pobieranie próbek przez wenflom, bez uprzedniego usunięcia pierwsze porcji krwi. Takie postępowanie jest częstym źródłem rozcieńczenia próbki i uzyskiwania fałszywie zaniżonych wyników wszystkich oznaczanych parametrów lub też domieszki składnika jeśli oznaczany składnik zawarty jest w płynie infuzyjnym /glukoza, elektrolity. Pobranie próbki na badanie układu krzepnięcia po uprzednim przepłukaniu wenflomu heparyną będzie źródłem błędnych oznaczeń parametrów układu krzepnięcia. Wielość problemów fazy przedlaboratoryjnej stanowi istotny problem i zawsze powinny one być uważnie rozważone przy interpretacji wyników. Quality Control in View of ISO 589 and Beyond Oswald Sonntag Quality control programs in the medical laboratory have a long history. Today the focus is mainly driven by either patient safety initiatives or/and the ISO 589 document. In the presentation we will learn more about some details of the quality control challenges in the routine laboratory work. From the beginning of the calibration process, internal and external quality control process, use of independent control material, reference method values and how to use and set goals for achieving reliable patient results. Further aspects of extended quality control procedures need to be considered in order to improve the quality of the medical laboratory. We will discuss the use of uncertainty values, concept of traceability, commutability of calibrators and control materials, quality indicators for pre-, post-, and analytical phase, and how to set goals for the quality. Calculation of the sigma level and the state of the art of laboratory performance will be covered. Finally we will understand the way of troubleshooting in daily laboratory performance issues by use of inter-laboratory comparisons. It is estimated that % of clinical decisions are based upon information derived from laboratory test results. A good quality control program is essential to provide reliable laboratory results for patients to protect them for misdiagnosis and mistreatment. Such programs will help to safe money to avoid unnecessary additional testing and examinations of the patient. It has an influence in the long run of the hospitalisation and also the reputation of the hospital. Zmiany stężenia białka w surowicy krwi jako czynnik interferujący. Ewelina Kmin Hiperproteinemia jako czynnik interferujący wydaje się szczególnie trudna do wykrycia ponieważ nie można jej ocenić wizualnie, a nowoczesne analizatory biochemiczne mimo dużego postępu technologicznego wciąż nie posiadają opcji jej detekcji. Celem przeprowadzonych badań było porównanie wyników stężenia elektrolitów dwoma metodami (ISE Indirect, ISE Direct ) w próbkach surowicy krwi o wysokim stężeniu białka całkowitego (> 9,2 g/dl) oraz ocena wpływu zmian stężenia białka na wyniki elektrolitów oznaczanych obydwoma metodami. Materiał do badań stanowiły świeże próbki surowicy krwi (n = 30) z normoglikemią, wolne od hemolizy, lipemii i hiperbilirubinemii, które dostarczono do laboratorium celem wykonania rutynowych badań biochemicznych. Pomiaru elektrolitów dokonywano powszechnie stosowaną w analizatorach biochemicznych metodą potencjometrii pośredniej przy użyciu elektrod jonoselektywnych - ISE Indirect (analizator Cobas c50, Integra 800, Dimension EXL) oraz potencjometrii bezpośredniej - ISE Direct (analizator Vitros FS5600, ABL 800 Radiometer) Uzyskane wyniki wskazują, że pomiary potencjometryczne przy użyciu ISE Indirect są w znaczący sposób zakłócane i modyfikowane w próbkach krwi o wysokich stężeniach białka a tym samym nie odzwierciedlają stanu rzeczywistego i są powodem rozbieżności wyników pomiędzy obydwoma metodami. Różnice wahają się w granicach 6-0 mmol/l dla sodu oraz 0.8 0,33 mmol/l dla potasu. W niektórych przypadkach różnice między poszczególnymi wartościami stężeń dla jonów sodowych dla obu metod sięgały nawet 2 mmol/l, a dla jonu potasowego 0,37 mmol/l. Wysoką zgodność wyników obserwowano natomiast w próbkach surowicy z normoproteinemia jak również w przypadku obniżonego stężenia białka całkowitego.w codziennej praktyce laboratoryjnej problem 29

10 WYKŁADY dotyczy głównie uzyskiwania fałszywie niskich wartości stężeń jonów sodowych, także znacznie rzadziej zlecanych jonów chlorkowych. W badanych próbkach stwierdzono zależność pomiędzy nasileniem hiperproteinemii a uzyskiwaniem zaniżonych wyników pomiarów. Wniosek: Wraz z patologicznym wzrostem stężenia białka rośnie ryzyko występowania pseudohiponatremii i pseudohipochloremii. Ze względu na fakt, że hiperproteinemia dotyczy ciężko chorych (najczęściej jest wynikiem rozrostu szpiczakowego) fałszywe wyniki mogą mieć istotne konsekwencje kliniczne. VI. OD PEDIATRII DO GERIATRII Krew do badań potrzeby laboratorium a rzeczywistość Przemysław Tomasik Utrata krwi związana z pobieraniem próbek do oznaczeń laboratoryjnych stanowi czasami poważny problem medyczny. Dotyczy to zwłaszcza noworodków i niemowląt, a także dorosłych pacjentów intensywnie monitorowanych w oparciu o wyniki badań laboratoryjnych. Pobieranie krwi do celów diagnostycznych może prowadzić do anemii jatrogennej, a w konsekwencji do pogorszenia stanu klinicznego chorego i przedłużającej się rekonwalescencji. Szczególnie narażoną grupą pacjentów są wcześniaki, ponieważ jednorazowe pobranie kilku mililitrów krwi u jednokilogramowego noworodka, jest porównywalne z pobraniem 450 ml krwi od dorosłego krwiodawcy. W praktyce brak jest uniwersalnych zaleceń dotyczących dopuszczalnych objętości krwi, które można pobrać jednorazowo. U dzieci, według różnych zaleceń, można pobrać od jednego do pięciu procent objętości krwi krążącej, co u przeciętnego, donoszonego, trzykilogramowego noworodka wynosi od 3 do 5 ml krwi. Ograniczenia dotyczą także pobierania krwi w dłuższych przedziałach czasowych, np. w ciągu dwóch miesięcy nie powinno się pobierać więcej niż 8% całkowitej objętości krwi krążącej. U małych dzieci z powodów medycznych często te zalecenia nie są przestrzegane. U dorosłych pacjentów bardzo rzadko zdarza się zagrożenie anemizacją związane bezpośrednio z jednorazowym pobieraniem krwi do badań. Brak takiego zagrożenia nie stanowi jednak usprawiedliwienia dla pobierania nadmiernych objętości krwi, jeżeli procedury analityczne tego nie wymagają. Z własnych badań wynika, że powszechną praktyką, niezależnie od wieku pacjenta, jest pobieranie większych objętości krwi niż wymagają tego laboratoryjne metody diagnostyczne. Można wnioskować, że w kształceniu pielęgniarek i lekarzy pomija się informacje o automatyzacji i miniaturyzacji metod analitycznych. Często brakuje świadomości, że jeden ml krwi jest wystarczający do oznaczenia nawet kilkunastu parametrów biochemicznych. Laboratorium powinno odgrywać wiodącą rolę w opracowywaniu standardów dotyczących objętości krwi potrzebnej do wykonania zleconych oznaczeń. Takie wytyczne powinny być przedmiotem rutynowych szkoleń dla personelu odpowiedzialnego za pobieranie materiału do badań. Niechęć do stosowania mikroprobówek zarówno od ze strony personelu medycznego jak i laboratoryjnego jest zrozumiały, ale wypracowanie odpowiednich procedur związanych z właściwym pobieraniem krwi do badań laboratoryjnych powinno być priorytetem wszystkich odpowiedzialnych za pacjenta. Geriatra, laboratorium i starzejący się pacjent Tomasz Grodzicki Pacjenci w wieku starszym stanowią większość chorych w gabinetach lekarzy POZ oraz około 30% pacjentów hospitalizowanych. Zarówno proces diagnostyczny jak i leczenia są znacznie trudniejsze niż u osób młodszych ze względu obecność zmian związanych ze starzeniem przebiegającym z różnym nasileniem, współistnienie szeregu chorób, stosowanie wielu leków, i często brak współpracy pacjenta z lekarzem. Chociaż badania laboratoryjne stanowią nieodłączną część całego procesu diagnostycznego, w geriatrii interpretacja wyników oznaczeń jest trudna. Podobnie jak w ocenie klinicznej, zmiany w wynikach badań laboratoryjnych wynikają z procesu starzenia, choroby podstawowej, zaburzeń towarzyszących lub mogą być pochodną stosowanych leków. Dla oceny wyników laboratoryjnych istotne są również zmiany polegające na odwodnieniu lub przewodnieniu, wyniszczenie, zanik masy mięśniowej i kostnej, menopauza i andropauza. Przebyte uprzednio choroby i stosowane leczenie mogą dodatkowo wpływać na wyniki aktualnych badań laboratoryjnych. Trudności we właściwej interpretacji wyników mogą być także rezultatem niewłaściwego przygotowania chorego do badania wynikającego z demencji, depresji bądź niesprawności. Od pediatrii do geriatrii zależne od wieku przedziały referencyjne Krystyna Sztefko Wyniki badań laboratoryjnych zależą od wielu modyfikowalnych i niemodyfikowalnych czynników. Jednym z nich jest wiek. Zależna od wieku dojrzałość różnych narządów, układu immunologicznego czy osi hormonalnych, zmiany z powodu andropauzy i menopauzy, zmiany spowodowane brakiem aktywności fizycznej, czynnikami środowiskowymi i zmiany będące konsekwencją chorób mają istotny wpływ na stężenie wielu analitów Największe różnice w stężeniach parametrów biochemicznych obserwuje się porównując między sobą następujące grupy wiekowe: noworodki (wcześniaki i urodzone o czasie), niemowlęta, dzieci przed okresem dojrzewania, dzieci po okresie dojrzewania, dorośli i osoby starsze (populacja geriatryczna). Bardzo szerokie przedziały wartości referencyjne wielu analitów uzyskiwane dla zdrowych noworodków są z jednej strony następstwem okresu życia płodowego, a z drugiej wynikają z niedojrzałości narządów. Interpretując wyniki u noworodka należy brać pod uwagę jego dojrzałość i szybkie zmiany fizjologiczne a także sposób porodu czy stan matki w czasie porodu oraz choroby matki w czasie ciąży. Zmiany adaptacyjne i dojrzewanie narządowe mogą zachodzić w różnym czasie, zatem postnatalny wiek chronologiczny nie zawsze koreluje z rozwojem dziecka. Z tego powodu nie zawsze wartości referencyjne stosowne do wieku będą odpowiednie dla każdego noworodka. Po okresie niemowlęcym, do okresu szybkiego wzrostu i dojrzewania płciowego, obserwuje się niewielkie wahania stężenia wiekszości parametrów. W okresie dojrzewania zmieniają się wartości stężenia hormonów płciowych i parametrów związanych z procesem wzrastania. Po osiągnięciu dojrzałości płciowej parametry laboratoryjne oznaczane u dziecka osiągają wartości, które mogą stanowić osobnicze wartości referencyjne. W następnych latach życia bowiem stężenie parametrów ściśle regulowanych, związanych z utrzymaniem homeostay, takich jak jony sodowe, potasowe czy wapniowe, nie ulega zmianie natomiast poziomy tych parametrów, na które w istotny wpływ ma styl życia czy sposób odżywiania, np. glukozy, triglicerydów czy cholesterolu, ulegają podwyższeniu. Do okresu menopauzy, kiedy to następują istotne zmiany hormonalne, stężenia większości analitów nie ulegają zmianie z wiekiem. W okresie wczesnej a tym bardziej późnej starości obserwuje się zmiany stężeń analitów na skutek niewydolności narządów np. nerek (podwyższenie stężenia kreatyniny i mocznika), zmniejszenie syntetycznej funkcji wątroby (np. spadek stężenia albuminy), zmniejszenie wydolności gruczołów dokrewnych co powoduje spadek stężenia hormonów docelowych (np. FT4) i podwyższenie stężenia hormonów tropowych, np. (TSH). Obniżeniu ulega także stężenie hemoglobiny. Dodatkowo, ze względu na współistnienie wielu schorzeń, wielolekowość, stres i brak aktywności fizycznej trudno jest jednoznacznie określić przedziały referencyjne w populacji geriatrycznej. Odróżnienie zmian w stężeniach parametrów biochemicznych/hematologicznych związanych z wiekiem od zmian patologicznych czy spowodowanych czynnikami środowiskowymi wymaga łączenia wiedzy praktycznej z wiedzą teoretyczną. Często jednak wiedza praktyczna ogranicza się do stwierdzenia tak to przeciętnie wychodzi w danej grupie wiekowej. Wiedza teoretyczna, coraz bardziej szeroka wśród diagnostów laboratoryjnych, nie zawsze jest wykorzystywana. Dla właściwej interpretacji wyników badań laboratoryjnych istotne jest jednak aby oba te źródła wiedzy umiejętnie łączyć. VII. Nowe kierunki w terapii monitorowanej stężeniem leku Terapeutyczne monitorowanie stężeniem leku w leczeniu immunosupresyjnym korzyści i zagrożenia Tomasz Pawiński Terapeutyczne monitorowanie stężeniem leku (TML) jest dyscypliną naukową, która w ostatnim ćwierćwieczu zdobyła uznanie zarówno diagnostów jak i klinicystów w optymalizacji terapii i poprawie jej bezpieczeństwa. Prowadzona jest zazwyczaj w przypadku leków o wąskim przedziale terapeutycznych stężeń, farmakokinetyce nieliniowej, braku 292

11 WYKŁADY bezpośredniej zależności pomiędzy podaną dawką a działaniem leczniczym oraz znaczącym zróżnicowaniu przebiegu farmakokinetyki wewnątrz- i międzyosobniczej. Ponadto z punktu widzenia diagnosty oznaczającego lek w materiale biologicznym konieczne jest aby opracowana, zwalidowana metoda analityczna umożliwiała pomiar stężenia leku w sposób stosunkowo prosty i szybki w rutynowym badaniu. Równocześnie lekarz powinien obserwować zależność pomiędzy ogólnoustrojową zawartością leku w organizmie a efektem terapeutycznym. Ten efekt leczniczy leków o tzw. krytycznym znaczeniu dawki jest również trudny do osiągnięcia podczas stosowania standardowej terapii stąd często stosowane jest zindywidualizowane dobieranie dawki do potrzeb chorego, konwersja leków i terapia skojarzona z zastosowaniem kilku środków leczniczych. Leki immunosupresyjne to grupa terapeutyczna, która od momentu wprowadzenia cyklosporyny w terapii przeciwodrzuceniowej w połowie lat 80-tych XX wieku została objęta terapeutycznym monitorowaniem stężenia w pełnej krwi, osoczu i innych płynach ustrojowych. Aktualnie coraz częściej podkreśla się również znaczenie diagnostyczne monitorowania stężenia w tkance docelowej i jednojądrzastych komórkach krwi obwodowej. Metody analityczne stosowane w TML immunosupresyjnych to najczęściej metody immunochemiczne oparte na szybkich testach z użyciem analizatorów i metody chromatograficzne z różną detekcją. W zależności od zakresu stężeń analizowanych leków stosowane są mniej lub bardziej czułe metody analityczne. Technika chromatografii cieczowej sprzężonej z detekcją masową pozwala na oznaczanie stężeń inhibitorów kalcyneuryny (cyklosporyny i takrolimusa) oraz inhibitorów sygnału proliferacji (sirolimusa i ewerolimusa) w stężeniach nanogramowych. Również wolna frakcja kwasu mykofenolowego o wartościach poniżej 0 ng/ml jest możliwa do oznaczenia z użyciem ww. techniki. Obecnie prowadzone są badania umożliwiające oznaczanie leków immunosupresyjnych w elementach morfotycznych krwi i w samej tkance w stężeniach pikogramowych. Niewątpliwie wyznaczenie bezpiecznych przedziałów terapeutycznych stężeń dla tych leków ograniczających do minimum wystąpienie epizodów ostrego odrzucania przeszczepionych narządów oraz występowania działań niepożądanych w organizmie ludzkim jest celem nadrzędnym TML (Rekomendacja Polskiego Towarzystwa Transplantacyjnego dotycząca schematów leczenia). Korzyści odnoszone poprzez spersonalizowane leczenie mają wymierny efekt w postaci obniżenia kosztów terapii, poprawy jakości życia biorców i znajomości dodatkowych parametrów obrazujących losy leku w ustroju. Należy zwrócić jednocześnie uwagę na zagrożenia pojawiające się podczas interpretacji wyników oznaczonych stężeń. Są nimi z pewnością niskie wartości stężeń i ekspozycji tych leków w organizmie zwłaszcza we wczesnym okresie po transplantacji mogące mieć zmienną przyczynowość. Podawanie i odstawianie bądź konwersja równolegle stosowanych innych leków immunosupresyjnych (inhibitory kalcyneuryny, glikokortykosteroidy) w przypadku terapii mykofenolanem mofetylu, osiągnięcie przez lek stężenia stacjonarnego w badanym materiale biologicznym, polimorfizm genetyczny, indukcja i inhibicja enzymatyczna oraz regularność przyjmowania leków to tylko niektóre z zagrożeń, które mogą utrudniać poprawną interpretacje wyniku i mało doświadczony personel medyczny wprowadzić w błąd o trudnych do oszacowania konsekwencjach. Również inne parametry biochemiczne obserwowane u pacjenta będą miały znaczący wpływ na wartość stężenia. Szacuje się, że np. w przypadku kwasu mykofenolowego ponad 50 % pacjentów w pierwszym tygodniu po przeszczepieniu posiada wartości pola powierzchni pod krzywą poniżej 30 mg h/l, przy czym ta liczba biorców ulega dwukrotnemu obniżeniu już w 3 miesiącu. Przyczyny, które mogą leżeć u podstaw obserwowanych odmiennych wartości stężeń to klirens kreatyniny, poziom albumin we krwi, wartości hemoglobiny i bilirubiny. Dlatego w prawidłowej ocenie oznaczonej wartości stężenia leku immunosupresyjnego w płynach ustrojowych niezmiernie ważny jest pełny obraz wskaźników biochemicznych pacjenta i wiedza na temat profilu genetycznego i schematu leczenia. Oznaczanie leków immunosupresyjnych we krwi nowoczesnymi metodami chromatograficznymi Paweł K. Kunicki Terapeutyczne monitorowanie stężenia leku we krwi odgrywa kluczową rolę dla ustalenia optymalnej dawki wszystkich podstawowych leków immunosupresyjnych u pacjentów po przeszczepieniach narządowych. Leczenie immunosupresyjne polega na równoczesnym stosowaniu kilku leków w określonych schematach, w zależności od przeszczepionego narządu i charakterystyki klinicznej pacjenta. Spośród podstawowych leków immunosupresyjnych, inhibitory kalcyneuryny cyklosporyna (CSA) i takrolimus (TAC) oraz inhibitory mtor ewerolimus (EWE) i syrolimus (SYR) wymagają oznaczania stężenia we krwi pełnej, natomiast kwas mykofenolowy (MPA) powinien być oznaczany w osoczu krwi. Obecnie pomiar stężenia leków immunosupresyjnych opiera się głównie na metodykach immunochemicznych, które są dostosowane do rutynowych oznaczeń w laboratoriach diagnostycznych, zapewniając dużą automatyzację analiz oraz często satysfakcjonujące parametry walidacji. Nieustannie jednak największym problemem jest brak wystarczającej specyficzności metod immunochemicznych powodujący uzyskiwanie zawyżonych wyników, jak również relatywnie wysoka cena samych odczynników. Alternatywą jest stosowanie metod chromatograficznych zapewniających wiarygodne wyniki oznaczeń. Referencyjną techniką analityczną jest chromatografia cieczowa połączona z podwójną detekcją masową (LC- MS/MS). Dotychczas medyczne laboratoria diagnostyczne nie korzystały z techniki LC-MS/MS z uwagi na kosztowną aparaturę oraz wyspecjalizowany personel analityczny. Dodatkowo, pokutuje przekonanie, że metodyka taka jest przeznaczona dla placówek naukowo-badawczych lub przemysłowych, a jest zbyt wyrafinowana do rutynowego stosowania w diagnostyce laboratoryjnej. Obniżająca się cena aparatury w połączeniu z dostępnością komercyjnych zestawów aplikacyjnych przeznaczonych do analizy kilku leków jednocześnie oraz niewielkie zużycie odczynników i krótki czas analizy sprawiają, że technika LC-MS/MS jest coraz szerzej wykorzystywana w nowoczesnej terapii monitorowanej. Historycznie, w Pracowni Farmakologii Klinicznej i Terapii (PFKiT) w oznaczaniu leków immunosupresyjnych stosowane były liczne metody immunochemiczne: FPIA, MEIA, EMIT, ACMIA, PETINIA, QMS. W roku 20 we współpracy z Instytutem Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie rozpoczęliśmy jako pierwsze medyczne laboratorium diagnostyczne w Polsce monitorowanie EWE techniką LC-MS/MS. Ostatnio, w PFKiT do monitorowania leków immunosupresyjnych wdrożona została technika ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) połączonej z tandemową detekcją masową (MS/MS). Do badań wykorzystano system UPLC-MS/MS Acquity Ultra Performance LC (Waters, USA) oraz certyfikowany zestaw analityczny MassTox dedykowany dla leków immunosupresyjnych (Chromsystems, Niemcy). Opracowana oryginalna metoda umożliwiająca jednoczesną analizę CSA, TAC, EWE i SYR w próbkach krwi pełnej została zwalidowana w zakresie dostępnym dla komercyjnych zestawów zawierających wstępnie przygotowane kalibratory, kontrole i standardy wewnętrzne, a uzyskane parametry walidacji (specyficzność, liniowość, powtarzalność kalibracji, precyzja i dokładność wewnątrz- i międzyseryjna decydujące o zakresie metody) spełniły wymagania stawiane metodom bioanalitycznym przez Europejską Agencję Leków (EMA). Dla oznaczania stężenia MPA w PFKiT opracowano autorską metodykę chromatograficzną HPLC-UV, która po kompleksowej walidacji w zakresie stężeń: 0,-40 μg/ml została zastosowana w rutynowej terapii monitorowanej. Opracowana procedura analityczna jest prosta, czas wykonania badania - krótki, a metoda jest specyficzna zapewniając uzyskiwanie wiarygodnych wyników, które w przeciwieństwie do metod immunochemicznych (EMIT, PETINIA ) - nie są zawyżone w wyniku reakcji krzyżowej odczynników z produktami metabolizmu MPA cechującej te metody immunochemiczne. Przedstawione nowoczesne metodyki chromatograficzne są wygodnym i wiarygodnym narzędziem zarówno dla potrzeb rutynowej terapii monitorowanej leków immunosupresyjnych, jak i dla prowadzenia badań farmakokinetycznych. Perspektywy dla terapii monitorowanej w leczeniu depresji Halina Matsumoto Według WHO głównymi powodami inwalidztwa w skali globalnej są : depresja i zaburzenia lękowe. Wg prognoz, w 2020 roku liczba zachorowań na depresję ma przewyższyć zachorowalność na choroby ze strony układu sercowo-naczyniowego. Problemy związane z leczeniem depresji, to: wzrost kosztów społecznych na skutek zaburzeń w funkcjonowaniu pacjentów dramatyczny wzrost liczby przypisywanych leków przeciwdepresyjnych dobry efekt terapeutyczny osiąga się jedynie u 40-70% leczonych ocena skuteczności klinicznej możliwa jest dopiero po 6-8 tygodniach leczenia. 293

12 WYKŁADY W tej sytuacji poszukuje się predykatorów odpowiedzi terapeutycznej na stosowane leki, do których zalicza się zarówno objawy kliniczne lub reakcje neurobiologiczne, które pojawiają się na początku leczenia i mają dużą moc predykcyjną w przewidywaniu odpowiedzi na leczenie indywidualnego pacjenta. Są to tzw. endofenotypy odpowiedzi na leczenie przeciwdepresyjne (ang. response endophenotypes-re). Za markery skuteczności leczenia przeciwdepresyjnego uważa się obecnie szereg wskaźników laboratoryjnych, takich jak: stężenie leku i jego aktywnych metabolitów we krwi (Terapia monitorowana stężeniem leku we krwi (TDM) uzupełnianej badaniami farmakogenetycznymi i/lub farmakogenomicznymi badania farmakoencefalograficzne (farmako-eeg), zwłaszcza ilościowe (QEEG) oznaczanie markerów biochemicznych, takich, jak: BDNF, kortyzol, cytokiny, stężenie biopierwiastków we krwi. Badania polimorficznych wariantów genów kodujących receptory neuroprzekaźników (np. układu serotoninergicznego), takich, jak: 5HTRA, 5HTRA2, transportera serotoniny: 5HTTLPR, enzym syntezy serotoniny: TPH2. Wiele uwagi poświęca się genetycznym markerom osi Podwzgórze-Przysadka- Nadnercza (HPA), zwanej osią stresową. Najczęściej genotypuje się CRH i CRH2, ACE, FKPB5. Przyszłością terapii monitorowanej w leczeniu depresji jest tzw. medycyna spersonalizowana (ang.personalized Medicine), która obiecuje rozwój sztuki dobierania skutecznego i bezpiecznego leczenia dla każdego pacjenta na podstawie informacji istotnych klinicznie oraz danych laboratoryjnych z zakresu TDM, farmakogenetyki, badań neuroobrazowania mózgu oraz wyżej wymienionych biomarkerów. Znaczenie terapeutycznego monitorowania stężeniem leku w leczeniu antyretrowirusowym Beata Gralak Dąbrowska Oznaczanie wartości stężeń leków antyretrowirusowych w materiale biologicznym (osoczu, wewnątrz komórek krwi obwodowej) ma duże znaczenie w praktyce klinicznej podczas prowadzenia terapii antyretrowirusowej. Pozwalabowiem dokonać modyfikacji dawki, w zależności od obserwowanego zróżnicowania we wchłanianiu substancji czynnej, przebiegu metabolizmu uwarunkowanego polimorfizmem genetycznym i występowania interakcji pomiędzy lekami podawanymi w terapii skojarzonej. Monitorowanie stężenia leku jest również pomocne w kontroli zjawiska nieregularnego przyjmowania dawki środka leczniczego (nonadherence) co jest szczególnie ważne podczas leczenia antyretrowirusowego. Określenie właściwego przedziału terapeutycznego stężeń stało się w ostatnim okresie nadrzędnym celem prowadzonej terapii monitorowanej. Obserwowany jest bowiem w określonym zakresie stężeń korzystny efekt leczniczy w postaci obniżonego poziomu wiremii i ograniczenia do minimum działań niepożądanych ze strony metabolizowanego leku. Aby wyniki oznaczanych stężeń leków mogły być wiarygodne niezbędne jest stosowanie w analityce czułych, selektywnych i powtarzalnych, zwalidowanych metod analitycznych. Są nimi najczęściej metody chromatograficzne (HPLC, UPLC, LC/MS/MS) umożliwiające oznaczanie równocześnie kilku leków antyretrowirusowych z kilku grup chemiczno-terapeutycznych podawanych w terapii skojarzonej. Wśród leków tej grupy terapeutycznej najczęściej monitorowane są nukleozydowe inhibitory odwrotnej transkryptazy (NIOT) oraz inhibitory proteazy (IP). NIOT będące pro-lekami wymagają do uzyskania aktywności farmakologicznej wewnątrzkomórkowej fosforylacji do aktywnych trójfosforanów. Stężenie w osoczu pro-leków jest łatwe do oznaczenia, ale słabo koreluje z efektem leczniczym. Z kolei stężenie wewnątrzkomórkowych trójfosforanów posiada wysoki współczynnik korelacji z efektem zahamowania replikacji wirusa HIV, ale z punktu widzenia analitycznego oznaczenie jego stężenia jest trudne i wymaga specjalistycznej aparatury (LC/MS) dostępnej jedynie w wybranych laboratoriach. W przypadku terapeutycznego monitorowania IP poszukuje się w dalszym ciągu parametru farmakokinetycznego, który posiadałby wysoki współczynnik korelacji z długotrwałą odpowiedzią w postaci zahamowania replikacji wirusa HIV. Optymalnym wskaźnikiem może stać się wartość stężenia w określonym punkcie czasowym od podania leku w odniesieniu do efektu leczniczego. Czy jest nim C 0, C max, czy w końcu AUC? Liczne badania wskazują, że wartość C min jest najlepszym wskaźnikiem prognostycznym odpowiedzi wirusologicznej. Z drugiej jednak strony nie zawsze wartości C 0 i AUC dobrze korelują z liczbą komórek CD4 +. Dlatego koniecznym stało się w dalszym ciągu poszukiwanie optymalnego parametru farmakokinetycznego w odniesieniu do zahamowania replikacji wirusa HIV. Konieczne jest zatem opracowanie nowych metod analitycznych służących wiarygodnemu oznaczaniu stężeń leków stosowanych w terapii antyretrowirusowej. VIII. EPIDEMIA CUKRZYCY CZY MEDYCYNA LABORATORYJNA MOŻE POMÓC Wykrywanie cukrzycy ciążowej już rozwiązany problem? Maciej Małecki Streszczenia nie nadesłano Od mikroalbuminurii do leczenia nerkozastępczego diagnostyka nefropatii cukrzycowej. Czy może być lepiej? Dariusz Moczulski Nefropatia cukrzycowa to jedną z najpoważniejszych późnych powikłań cukrzycy, która prowadzi do schyłkowej choroby nerek. Staje się ona na świecie najczęstszą przyczyną przewlekłej choroby nerek wymagającej leczenia nerkozastępczego. Pierwszymi objawami nefropatii cukrzycowej jest zwiększone wydalanie albumin w moczu. W kolejnych etapach dochodzi do upośledzenia czynności wydalniczej nerek. Rozpoznanie nefropatii cukrzycowej stawia się na podstawie pośrednich dowodów, że u chorego na cukrzycę doszło do upośledzenia czynności nerek w przebiegu cukrzycy. Rzadko wykonuje się biopsję nerki w celu postawienia rozpoznania. Zwiększone wydalanie albumin w moczu oraz upośledzenie czynności wydalniczej nerek nie są specyficznymi wskaźnikami dla nefropatii cukrzycowej. Nadal poszukuje się bardziej specyficznych wskaźników nefropatii cukrzycowej. Obecnie nie zaleca się przeprowadzenia dobowej zbiórki moczu w celu zbadania dobowego wydalania albumin w moczu. Zaleca się jedynie badanie wydalania albumin w porannej porcji moczu oraz oznaczenia wskaźnika ACR (albumin to creatinine ratio). U każdego chorego na cukrzycę zaleca się przynajmniej raz w roku oznaczenie stężenia kreatyniny i oszacowanie na tej podstawie wskaźnika przesączania kłębuszkowego (GFR glomerular filtration rate) używając wzoru MDRD. Nadal poszukuje się dokładniejszych wskaźników funkcji wydalniczej nerek, takich ja na przykład cystatyna C. U każdego chorego na cukrzycę przed rozpoznaniem nefropatii cukrzycowej należy przeprowadzić również diagnostykę różnicową w kierunku niecukrzycowej choroby nerek. W ostatnich latach towarzystwa naukowe zalecają zaniechania używania określeń, takich jak mikroalbuminuria czy makroalbuminuria. Zalecają, żeby zamiast tego używać określenia umiarkowanie i znacznie zwiększone wydalanie albumin w moczu. Poza tym nefrologiczne towarzystwa naukowe zalecają, aby termin nefropatia cukrzycowa zastąpić określeniem cukrzycowa choroba nerek. Cukrzyca typu 2 jak wykrywać i monitorować Leszek Czupryniak Streszczenia nie nadesłano Samokontrola glikemii, technologia i jakość czy czas na zmianę wymagań? Bogdan Solnica Samokontrola glikemii jest uznawana za integralną część leczenia cukrzycy, stąd jakość analityczna oznaczeń przy użyciu glukometrów ma duże znaczenie kliniczne. Używane obecnie narzędzia jej oceny oraz regulacje, jak norma DIN EN ISO597 i wymogi Food and Drug Administration w USA dopuszczają błąd glukometru sięgający 20%. Wymogi te krytykowane są jako zbyt liberalne, szczególnie w odniesieniu do dawkowania insuliny na podstawie wyników pomiarów. Producenci glukometrów /pasków testowych ciągle ulepszają ich własności użytkowe i jakość analityczną. Trwają prace nad enzymami oksydoreduktazami utleniającymi glukozę stosowanymi w paskach testowych. Poprzez modyfikację struktury enzymów i koenzymów zwiększa się swoistość substratową całego układu, doskonali się także techniki pomiarowe glukometrów. Pracuje się nad wykorzystaniem w glukometrach fluoroforów, 294

13 WYKŁADY zjawiska transferu energii Förstera (FRET) i pomiarów fluorescencji. W efekcie, dla wielu dostępnych na rynku glukometrów / pasków testowych wykazuje się całkowity błąd oznaczenia <5% i coraz mniejszą podatność na czynniki interferujące. Panuje opinia, że poprawa dokładności oznaczeń jest wystarczającą podstawą do zwiększenia wymogów jej dotyczących. Postuluje się np. zmiany w wymogach FDA, gdzie minimalnym standardem dla stężeń glukozy >75 mg/dl byłby błąd do ±5% wartości referencyjnej, a dla stężeń 75 mg/dl błąd do ±0 mg/dl, ponadto obowiązywałaby gradacja dokładności w zależności od zastosowania glukometru. IX. POSTĘPY W BADANIACH HEMOSTAZY Płytki krwi aspekt naukowy i praktyczny. Milena Dąbrowska, Coraz lepiej poznana biologia płytek krwi wzbudza zainteresowanie zarówno praktyków jak i teoretyków różnych dziedzin nauk medycznych. Obecnie, intensywnie badane są procesy molekularne, kontrolujące tworzenie propłytek z dojrzałych megakariocytów. Również aktywacja płytek, wiązana głównie z hamowaniem krwawienia, ma wpływ na szereg innych zjawisk. Ostatnio, wiele uwagi poświęca się mikrocząstkom płytkowym, które mogą pełnić rolę nośników efektorów błonowych i cytoplazmatycznych. Uwzględniając znaną rolę płytek w progresji miażdżycy i zakrzepicy tętniczej nasila się debata, czy stwierdzenie przetrwałej reaktywności płytek u osób leczonych przeciwpłytkowo może mieć znaczenie kliniczne. Dzięki coraz lepiej poznawanej roli transporterów płytkowych, płytki postrzega się jako mikrokompartment farmakologiczny, w którym hamowanie swoistego transportera może być atrakcyjną opcją terapeutyczną. Intensywnie rozwija się także koncepcja, że płytki krwi są komórkami efektorowymi nie tylko w reakcjach zapalnych, ale także w odporności wrodzonej i nabytej. Odkąd wykazano, że wspierają progresję i przerzutowanie nowotworów oraz odgrywają istotną rolę w neoangiogenezie, płytki krwi stały się potencjalnym celem terapeutycznym w chorobie nowotworowej. Wdrożone szerokie programy badawcze umożliwiają odkrycie nowych genów zaangażowanych w fizjologię płytek w warunkach zdrowia i choroby, a dalszy rozwój wiedzy o funkcjonalnej charakterystyce produktów genowych może zrewolucjonizować nasze spojrzenie na funkcję tych niepozornych elementów morfotycznych. Hemostaza trzeciego wieku - parametry hemostazy u osób w wieku więcej niż dojrzałym Jacek Golański U osób powyżej 60 roku życia, w badaniach hemostazy, rejestrowane jest zwiększone stężenie czynników krzepnięcia, wyższa reaktywność płytek krwi, dysfunkcja śródbłonka, osłabienie mechanizmów antykoagulacyjnych w tym upośledzenie aktywności fibrynolitycznej. Obserwowana jest rosnąca wraz z wiekiem tendencja do przesunięcia równowagi hemostazy w kierunku zwiększającym ryzyko wystąpienia zakrzepicy. Zjawisko to manifestuje się między innymi, wzrostem liczby zachorowań na żylną chorobę zakrzepowo-zatorową u starszych osób. Około 70% przypadków tej choroby dotyczy osób w wieku >60 lat, a zapadalność na ŻChZZ jest ponad 3-krotnie większa wśród osób w wieku 65 lat niż w wieku lat.w badaniach prowadzonych w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku zaobserwowano zwiększające się wraz z wiekiem stężenie fibrynogenu w osoczu. U młodych osób stężenie fibrynogenu (fg) wynosi średnio 2,5 g/l, u osób w wieku lat kształtuje się na poziomie 2,8 g/l podczas gdy w grupie wiekowej lat stężenie to wynosi ponad 3,0 g/l. Zaobserwowano, że każda kolejna dekada życia związana jest ze zwiększeniem stężenia fibrynogenu osoczu u osób w analizowanych grupach wiekowych średniego o 0, g/l. W podobny sposób zwiększa się. wraz z wiekiem badanych osób. stężenie czynnika von Wllebrand a i czynnika VIII.Prokoagulacyjne tendencje hemostazy odzwierciedlane są w badaniach stężenia markerów aktywacji krzepnięcia.średnie stężenia w osoczu fragmentów F+2, kompleksów TAT oraz dimeru D jest od dwóch do pięciu razy wyższe u osób w wieku powyżej 60 lat niż u osób młodszych. Brak równowagi hemostazy pogłębiany jest także na skutek zahamowania fibrynolizy. Postępujący wraz z wiekiem wzrost stężenia głównego inhibitora fibrynolizy PAI- powoduje, że aktywność fibrynolityczna istotnie słabnie. W związku z powyższym, u osób w podeszłym wieku obserwowane jest, między innymi, wydłużenie czasy fibrynolizy w euglobulinach. Podobne, prokoagulacyjne tendencje zaobserwowano u osób starszych w obrębie hemostazy pierwotnej, w pierwszej kolejności opisano w tej grupie wiekowej krótsze czasy krwawienie niż u osób młodych. Stwierdzono także zwiększającą się wraz z wiekiem reaktywność płytek krwi.w badania prowadzone przez Mari i wsp. w trzech grupach wiekowych (od 8 do 50, od 5 do 69 oraz 00 lat) potwierdziły, że stężenie czynnika VIII i dimeru D jest wyższe o osób w wieku powyżej 50 lat niż u osób młodych.z kolei, w badaniach Emmerechts i wsp. porównujących dwie skrajne grupy wiekowe (od i 84 do 88) wykazano istotne różnice w zakresie: stężenia fibrynogenu, czynnika vw, czynnika VIII i APTT.Zestawienie danych dostępnych w piśmiennictwie pozwala na wyciągniecie wniosku, że parametry hemostazy zaczynają się zmieniać w wieku średnim (powyżej 50 lat), a wyraźne różnice pojawiają się u osób w wieku podeszłym (powyżej 80 lat). Nie ma w tej chwili jednoznacznych opinii na temat konieczności wprowadzenia zakresów referencyjnych dla badań hemostazy wykonywanych u starszych osób pojawiają się jednak propozycję zmiany progów odcięcia stosowanych w wykluczaniu zakrzepicy żylnej. Proponuje się zastosowanie tradycyjnego progu wynoszącego 500 μg/l dla osób w wieku poniżej 60 lat oraz 750 μg/l dla osób starszych. Jest prawdopodobne, że w najbliższym czasie pojawią się podobne propozycje dla stężenia fibrynogenu, czynnika vw i czynnika VIII. Trombofilia problemy diagnostyczne (przykłady kliniczne) Magdalena Jeleńska Żylna choroba zakrzepowo-zatorowa (ŻCHZZ) występuje w ogólnej populacji europejskiej z częstością jeden przypadek na 600 osób na rok. U młodych osób (poniżej 45 roku życia) w większości przypadków wynika ona z obecności wrodzonych czynników ryzyka ŻCHZZ, natomiast w późniejszym wieku jest zazwyczaj konsekwencją chorób towarzyszących, unieruchomienia, przebytej operacji. Zostaną omówione przyczyny wrodzonej tromboflilii (zaburzenia hemostazy predysponujące do ŻCHZZ) i zalecenia odnośnie jej diagnostyki. Na przykładach klinicznych będą przedstawione niektóre problemy związane z wykonywaniem badań, w trakcie czynnej zakrzepicy lub leczenia przeciwzakrzepowego. Również na przykładzie klinicznym zostanie omówiona możliwość wystąpienia zakrzepicy z towarzyszącą jej małopłytkowością, w przebiegu leczenia heparyną tzw HIT (heparin- induced trombocytopenia). Monitorowanie leczenia przeciwzakrzepowego dziś i jutro Anna Raszeja-Specht Monitorowanie leczenia przeciwzakrzepowego w laboratorium analitycznym jest niezaprzeczalnym standardem od czasu rozpoczęcia terapii heparynowej. Lekarze wprowadzający obecnie leczenie doustnymi antykoagulantami nowej generacji entuzjastycznie przyjmują fakt, że nie wymagają one bezwzględnie monitorowania w warunkach laboratoryjnych, dzięki temu są zdecydowanie bardziej przyjazne pacjentom niż antagoniści witaminy K. Leczenie heparyną wielkocząsteczkową (UFH) wymaga oznaczania czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT). Heparyny drobnocząsteczkowe (LMWH) należą do leków przeciwkrzepliwych i przeciwzakrzepowych, stosowanych najczęściej w profilaktyce i leczeniu żylnych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych oraz ostrych zespołów wieńcowych, a większość pacjentów, u których wprowadzono terapię LMWH, nie wymaga monitorowania. Metodą z wyboru w monitorowaniu leczenia LMWH u ciężarnych oraz w określonych sytuacjach klinicznych, jest oznaczanie aktywności anty-xa. Leczenie tzw. doustnymi antykoagulantami, pochodnymi warfaryny, antagonistami witaminy K, monitorowane jest poprzez oznaczanie czasu protrombinowego w wersji wystandaryzowanej, wyrażanego jako INR. Obecnie prowadzone są badania leków, które w sposób bezpośredni blokują działanie czynnika Xa lub trombiny i są podawane doustnie. Leczenie nie wymaga monitorowania ani modyfikacji dawki, jednakże klasyczne testy stosowane w diagnostyce zaburzeń hemostazy czasy APTT i PT, ulegają przedłużeniu lub nie zmieniają się w okresie terapii. W monitorowaniu leczenia rywaroksabanem (Xarelto) u pacjentów z grup ryzyka, znajdują zastosowanie takie testy, jak oznaczanie aktywności anty-xa, APTT i PT, drvvt oraz HepTest, przy czym część z nich 295

14 WYKŁADY wymaga modyfikacji. Zarówno rekombinowane hirudyny jak i analogi hirudyny monitorowane są poprzez pomiar APTT. Skuteczność doustnych bezpośrednich inhibitorów trombiny np. dabigatranu, można monitorować poprzez oznaczanie zmodyfikowanego czasu trombinowego oraz czasu ekarynowego. Zastosowanie doustnych inhibitorów czynników Xa i IIa rozpoczęło nową erę w profilaktyce i terapii żylnych oraz niektórych tętniczych zaburzeń zakrzepowo-zatorowych. Dotychczasowe wyniki badań klinicznych zachęcają do dalszego wprowadzania tych leków w różnych grupach chorych. Oczekiwania klinicystów dotyczą uproszczenia wielomiesięcznego leczenia przeciwzakrzepowego i zwiększenia bezpieczeństwa, co jednak jest związane, jak zawsze w pierwszym okresie po wprowadzeniu nowej terapii, ze zwiększonymi kosztami leczenia. Ten problem może być kompensowany ograniczeniem konieczności laboratoryjnego monitorowania skuteczności działania X. Biomarkery w onkologii oczekiwania a rzeczywistość Biomarkery - uniwersalne narzędzie we współczesnej diagnostyce laboratoryjnej Jan Kanty Kulpa Rozwój w okresie ostatnich lat szeroko pojmowanej biologii molekularnej stworzył nowe perspektywy dla diagnostyki laboratoryjnej chorób nowotworowych. Coraz szerszy staje się panel biomarkerów, których ekspresja w materiale komórkowym, ale również stężenia w płynach ustrojowych pozwalają na bardziej precyzyjną charakterystykę zaburzeń szeregu procesów metabolicznych, do jakich dochodzić może w następstwie transformacji nowotworowej, a także w odpowiedzi organizmu gospodarza na obecność nowotworu. Obok klasycznych markerów nowotworowych, do biomarkerów zalicza się wiele czynników wzrostu i ich receptorów, chemokin, enzymów proteolitycznych i ich inhibitorów, przeciwciał, dodatnich i ujemnych reaktantów ostrej fazy. Jakkolwiek użyteczność badań większości z tych biomarkerów dla wykrywania choroby nowotworowej we wczesnych stadiach zaawansowania pozostaje nadal ograniczona, ze względu na niezadowalającą czułość, a zwłaszcza swoistość diagnostyczną, to coraz więcej faktów dokumentuje znaczenie wyników ich badań w diagnostyce różnicowej zmian niezłośliwych i złośliwych, kontroli chorych po leczeniu podstawowym, przewidywaniu podatności lub oporności na radio-, chemio- i immunoterapię, ocenie rokowania chorych. Możliwości precyzyjnego określenia, zespołu cech molekularnych czy genetycznych, charakterystycznych dla danego typu nowotworu ma istotną wartość predykcyjną dla wybór metody leczenia, rodzaj leku, immuno- lub chemioterapeutyka o potencjalnie najwyższej efektywności działania w odniesieniu do tego przypadku klinicznego. Właśnie ta precyzyjna diagnostyka stwarza warunki sprzyjające rozwojowi terapii spersonalizowanej. Systematyczne badania panelu właściwie dobranych biomarkerów w monitorowaniu tego rodzaju leczenia pozwalają na wczesną ocenę reakcji chorych na terapię. Równocześnie badania szeregu innych biomarkerów mogą być pomocne we wczesnym wykrywaniu ewentualnych powikłań, do rozwoju jakich może dochodzić w trakcie terapii. Umiejętność łączenia badań laboratoryjnych z badaniami z użyciem innych technik diagnostycznych stanowi jeden z elementów postępu we współczesnej onkologii. Diagnostyka molekularna chorych na choroby nowotworowe ze szczególnym uwzględnieniem raka płuca. Janusz A. Siedlecki Przyczyną chorób nowotworowych są liczne zmiany w genomie. Zmiany te to zarówno różnego typu mutacje, delecje i insercje, translokacje chromosomalne jak i zmiany epigenetyczne. Konsekwencją zmian zachodzących w wielu różnych genach, których produkty są istotne dla prawidłowego przebiegu procesów wzrostu, proliferacji, różnicowania i śmierci komórki jest stopniowa zmiana fenotypu z prawidłowego na nowotworowy. Celem większości dotychczas stosowanych terapii przeciwnowotworowych jest usunięcie lub co najmniej uśmiercenie komórek nowotworowych. Działanie leków nowej generacji czyli leków nakierowanych na cele molekularne oparte jest o zupełnie inną zasadę. Celem dla tych leków jest zablokowanie (lub przynajmniej czasowe zahamowanie) jednego z czterech podstawowych procesów związanych z żywotnością komórki nowotworowej takich jak: proliferacja, różnicowanie, zdolność do przemieszczania się i śmierć programowana. Procesy te sterowane są za pomocą różnorodnych ścieżek sygnalizacyjnych. Dlatego najogólniej biorąc większość nowoczesnych leków celowanych to związki hamujące zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowe przekaźnictwo sygnału. Z dotychczasowych doświadczeń wynika, że leki celowane są skuteczne jedynie wówczas, gdy podawane są pacjentom, u których biologia nowotworu ukierunkowana jest zgodnie z mechanizmem działania leku. Oznacza to, że należy wstępnie wyselekcjonować grupę pacjentów, która odniesie korzyść ze stosowanej terapii. Taka selekcja jest dodatkowo konieczna ze względu na wysokie koszty tego typu terapii. Omówione zostaną podstawowe metody, którymi posługuje się diagnostyka molekularna oraz klasyczne przykłady wykorzystania tego rodzaju badań do selekcji pacjentów. Dzięki metodom molekularnym możemy ustalić status kluczowych dla przekazywania sygnału genów, ocenić stopień uszkodzenia systemów naprawy DNA a także poznać rolę polimorficznych form genu w odpowiedzi na terapię. Szczególna uwaga poświęcona zostanie metodom selekcjonującym chorych na raka płuca. Jak się wydaje diagnostyka molekularna staje się obecnie jednym z podstawowych narzędzi, które pozwolą na coraz skuteczniejszą walkę z chorobami nowotworowymi. Główny problem na dziś polega na braku odpowiedniej bazy. Dotychczas badania genetyczne były domeną ośrodków uniwersyteckich i instytutów badawczych. Obecnie diagnostyka molekularna musi stać się częścią rutynowego postępowania diagnostycznego. Oznacza to, że muszą powstać podobnie jak to jest w przypadku diagnostyki mikrobiologicznej czy biochemicznej odpowiednio wyspecjalizowane jednostki. Powinny one posiadać odpowiednio wyszkolona doświadczona kadrę i odpowiednio opisane procedury postępowania. Laboratoria takie powinny posiadać akredytacje pod względem jakościowym. Powinny też poddać się procesowi walidacyjnemu. Na dziś brak jest zarówno odpowiednich przepisów prawnych jak i jednostki zdolnej do akredytacji takich laboratoriów. Wpływ palenia tytoniu na zaburzenia podstawowych procesów metabolicznych Ewa Wójcik Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) ocenia, że prawie miliard mężczyzn i 250 mln kobiet na świecie to nałogowi palacze tytoniu, w Polsce stanowią oni 24,6% społeczeństwa. Palenie tytoniu uważa się za jeden z głównych czynników etiologicznych szeregu chorób, w tym szczególnie nowotworów złośliwych. Dym tytoniowy zawiera substancje o działaniu drażniącym, toksycznym, mutagennym, i karcinogennym. Pod wpływem obecnych w nim karcinogenów tj. policyklicznych węglowodorów aromatycznych, amin aromatycznych, czy N-nitrozoamin, w organizmie palacza dochodzić może do uszkodzeń DNA m.in. utleniania zasad, lub powstawania adduktów DNA. Karcinogeny powinny być usuwane w procesie detoksykacji, jednak wzmożona aktywność enzymów aktywacyjnych oraz obniżona sprawność enzymów detoksykacyjnych i naprawczych prowadzi do zmian w strukturze DNA i mutacji. Powtarzające się mutacje w komórkach somatycznych onkogenów i genów supresorowych, oraz te związane z metabolizmem karcinogenów skutkują utratą dozoru nad różnicowaniem i wzrostem komórek, zmianami w ich genomie. Uważa się, że nikotyna m.in. moduluje fenotyp prawidłowych komórek nabłonka przewodu oddechowego, czego następstwem jest osłabienie apoptozy i nasilenie angiogenezy. Ostateczny efekt mutagennego działania składników dymu tytoniowego zależy od predyspozycji genetycznych gospodarza. Szczególnie istotną rolę przypisuje się składnikom dymu tytoniowego w rozwoju raka płuca, jamy ustnej, przełyku, krtani, żołądka, trzustki, czy pęcherza moczowego. W wyniku stresu oksydacyjnego dochodzi m.in. do utleniania białek, nienasyconych kwasów tłuszczowych lub innych lipidów, zostają upośledzone funkcje komórek, może dochodzić do ich śmierci. Składniki dymu tytoniowego aktywują kaskady wewnątrzkomórkowego przekazywania sygnałów w komórkach nabłonkowych, aktywują m.in prozapalne czynniki transkrypcyjne. Sekrecja mediatorów zapalenia takich jak IL-8, IL-6 i TNFα promuje ciągłą rekrutację komórek układu immunologicznego. Modulacja sygnałów wewnątrzkomórkowych i supresja wrodzonej oraz nabytej aktywacji układu immunologicznego u osób palących osłabia odporność na infekcje oraz zakażenia wirusami. Indukowane dymem tytoniowym zmiany wykładników stanu zapalnego w organizmie są wyrazem zaburzeń równowagi pomiędzy mechanizmami pro- i przeciwzapalnymi. Dym tytoniowy u zdrowych osób wpływa nie tylko na wydolność układu 296

15 WYKŁADY oddechowego ale również na poziom wskaźników hematologicznych, biochemicznych i markerów nowotworowych. Duńskie badania prospektywne wskazują, że u 5,7% zdrowych palaczy tytoniu poziom CRP jest wyższy od 3 mg/l. Ta grupa cechuje się zwiększonym ryzykiem zachorowań na nowotwory. Zdrowi palacze tytoniu mają wyższe poziomy TNFα, niekiedy nawet 2-krotnie przekraczające wartości osób zdrowych niepalących tytoniu, ponadto niższe o około 0-20% poziomy immunoglobulin IgA, IgG i IgM. Przewlekły stan zapalny o umiarkowanym nasileniu będący skutkiem palenia tytoniu prowadzi do uszkodzeń środbłonka i zmiany profilu cząsteczek adhezyjnych. U palaczy tytoniu, w porównaniu z osobami niepalącymi obserwuje się wyższy poziom sicam-, E-selektyny, P-selektyny. Nadmierne utlenianie cząsteczek cholesterolu LDL sprzyja hipercholesterolemii. U zdrowych palaczy obserwuje się zwiększoną agregację płytek krwi, zwiększoną aktywność układu sympatycznego oraz częstsze skurcze naczyń wieńcowych. Palacze w porównaniu do osób niepalących mają wyższe skurczowe jak i rozkurczowe ciśnienie krwi, większą częstość skurczu serca, oraz wyższy poziom NT-proBNP. Poziom markera wykazuje zależność od ilości wypalanych papierosów. Palenie tytoniu wpływa także na poziom niektórych markerów nowotworowych. Stężenie CEA u zdrowych osób niepalących tytoniu nie powinno przekroczyć 3 ng/ml, jednak u 8,6% palaczy poziom CEA osiąga wartości pomiędzy 5 a 0 ng/ml, a u 5,% nawet mieszczą się one w przedziale od 0-2,5 ng/ml. Zmiany poziomu innych markerów są różnokierunkowe. O ile u kobiet palących tytoń poziom CA 25 jest niższy w porównaniu z niepalącymi, to poziom HE4 jest wyższy o ok. 29%. W porównaniu do zdrowych osób niepalących tytoniu, u zdrowych palaczy wyższy jest również poziom AFP. U ciężarnych kobiet palących, bez podwyższonego ryzyka urodzenia dziecka z wadą rozwojową, poziom AFP wzrasta o ok. 7-0%, obniża się poziom HCG o ok. 0-20%, i ue3 o ok. 3%, co w konsekwencji może prowadzić do fałszywie dodatnich lub ujemnych wyników testu potrójnego u kobiet ciężarnych. Przeprowadzone u palaczy tytoniu badania wskazują, że w celu właściwej interpretacji wyników oznaczeń różnych wskaźników u chorych należy zawsze dobierać grupy porównawcze, zarówno ze względu na BMI, wiek, płeć jak i obciążenia nałogami. Udział śródbłonka naczyniowego w powstawaniu przerzutów u chorych na raka piersi Anna Thielemann, Zygmunt Kopczyński Powstawanie przerzutów nowotworowych u chorych na raka piersi jest procesem złożonym i wieloetapowym. Uważa się, że zdolność do przerzutowania zależy od stanu czynnościowego śródbłonka naczyniowego, na który ma wpływ wiele mechanizmów komórkowych i pozakomórkowych. Śródbłonek naczyniowy stanowi nie tylko półprzepuszczalną barierę oddzielającą światło naczynia od płynu pozakomórkowego, ale pełni też funkcję gruczołu wydzielania wewnętrznego i zewnętrznego. Stężenia substancji, wydzielanych przez endotelium, mogą być cennym wskaźnikiem jego dysfunkcji inicjującej proces przerzutowania. Celem badań było określenie stężenia wskaźników związanych z funkcjonowaniem endotelium u kobiet chorych na raka piersi: VEGF i jego swoistych białek receptorowych: VEGFR- i VEGFR-2, cząstek adhezyjnych śródbłonka naczyniowego: ICAM- (cząsteczki adhezji międzykomórkowej) i VCAM- (cząstki adhezji komórkowej naczyń), białek układu aktywacji plazminogenu: aktywatora plazminogenu typu urokinazowego (upa) i tkankowego (tpa) w surowicy kobiet chorych na raka piersi oraz receptorów dla urokinazy (upar) i inhibitorów PAI- i PAI-2. Oznaczanie stężeń tych substancji odzwierciedlających stan czynnościowy śródbłonka, może ułatwić wyjaśnienie mechanizmu powstawania przerzutów u chorych na raka gruczołu piersiowego. Stężenia badanych czynników VEGF, svegfr- i svegfr-2, svcam- i sicam- oraz upa i tpa, receptorów upar i inhibitorów PAI- i PAI- 2 oznaczano we krwi kobiet chorych na raka piersi w wieku lat (średnia wieku 56 lat) przed zabiegiem chirurgicznym, leczonych w Katedrze i Klinice Onkologii UM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Grupę kontrolną stanowiły surowice 40 kobiet zdrowych w wieku lat (średnia wieku 47 lat). Stężenie VEGF, svegfr- i svegfr-2, svcam- i sicam- oraz tpa i upar, PAI- oceniano metodą immunoenzymatyczną ELISA w oparciu o testy firmy R&D. Aktywność upa oznaczano metodą ELISA firmy CHEMICON. Badania laboratoryjne wykonano w Katedrze i Zakładzie Diagnostyki Laboratoryjnej UM w Poznaniu. W badaniach otrzymano istotnie wyższe stężenia VEGF, rozpuszczalnych form receptorów svegfr- i svegfr-2, cząsteczek adhezyjnych svcam- i sicam-oraz upa, tpa i upar u kobiet chorych na raka piersi w porównaniu do wartości w grupie kontrolnej. Im wyższy był stopień zaawansowania klinicznego choroby tym wyższy uzyskano poziom cytokiny VEGF, receptorów svegfr- i svegfr-2, cząsteczek svcam- i sicam- oraz tpa i upa. Podobną zależność obserwowano w grupie kobiet chorych na raka piersi z przerzutami do węzłów chłonnych. Dodatnią korelację uzyskano także między średnim stężeniem badanych substancji a wielkością guza pierwotnego. Zmiany ilościowe badanych czynników u kobiet chorych na raka piersi mogą wskazywać na zaburzenie aktywności biologicznej komórek śródbłonka naczyniowego. Dysfunkcja biochemiczna i czynnościowa śródbłonka naczyniowego może z kolei ułatwiać rozwój guza nowotworowego i powstawanie odległych przerzutów. Metaloproteinazy u chorych na nowotwory złośliwe Barbara Mroczko Rozwój nowotworu złośliwego jest procesem wieloetapowym, charakteryzującym się wieloletnim przebiegiem. Jednym z kluczowych etapów rozwoju nowotworu jest proteoliza kolagenu błony podstawnej naczyń włosowatych. Migracja komórek nowotworowych jest związana z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), zbudowanej m.in. z kolagenu, fibronektyny, lamininy czy proteoglikanów tkanki łącznej. Macierz zewnątrzkomórkowa bierze udział w fizjologicznych procesach rozwoju, rozrostu i różnicowania komórek, a także formowania tkanek. Transformacja ECM jest również związana z różnymi procesami patologicznymi, zachodzącymi w organizmie, w tym z proliferacją komórek nowotworowych, jak również z naciekaniem narządów i tworzeniem przerzutów nowotworowych Metaloproteinazy macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs) są enzymami proteolitycznymi o budowie wielodomenowej. Następstwem działania MMPs w obrębie naczyń krwionośnych jest migracja komórek śródbłonka oraz komórek nowotworowych do macierzy zewnątrzkomórkowej i neoangiogeneza tworzenie nowych naczyń w degradowanej przez MMPs przestrzeni. Metaloproteinazy, a zwłaszcza żelatynazy MMP-2 i MMP-9, ze względu na zdolność degradacji kolagenu IV, znajdującego się w błonach podstawnych naczyń i w obrębie ECM, odgrywają szczególną rolę w progresji nowotworu. MMPs przez swoją właściwość przebudowywania macierzy zewnątrzkomórkowej i trawienia kolagenu typu IV, stwarzają możliwości do rozwoju nowotworu, migracji komórek nowotworowych i powstawania ognisk przerzutowych do węzłów chłonnych i narządów odległych. Metaloproteinazy regulują także różnicowanie i apoptozę komórek biorących udział w budowie śródbłonka naczyń i mogą wpływać na wzrost guza poprzez uwalnianie insulinopodobnego czynnika wzrostu. Uszkadzają też receptory dla interleukiny-2, znajdujące się na limfocytach T, co hamuje odpowiedź immunologiczną przeciw komórkom nowotworowym. Enzymy te odgrywają istotną rolę w regulacji układu immunologicznego, zaś funkcja ich jest złożona i nie sprowadza się tylko do przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej. Komórki nowotworowe mogą wytwarzać czynnik stymulujący syntezę MMPs przez fibroblasty. Aktywuje on fibroblasty do wytwarzania różnych metaloproteinaz, w tym stromielizyny, żelatynazy A, kolagenazy oraz ich aktywatorów. Prowadzi to do proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej w obrębie guza nowotworowego. W konsekwencji następuje migracja komórek nowotworowych, co umożliwia wzrost guza i tworzenie przerzutów. Po aktywacji metaloproteinaz zostają uwolnione ich tkankowe inhibitory (TIMPs), kontrolujące aktywność tych enzymów. Bardzo istotna w rozwoju nowotworów jest równowaga pomiędzy MMPs a ich inhibitorami. TIMPs wykazują działanie przeciwnowotworowe poprzez degradację i regulację wzrostu, różnicowania i apoptozy komórek. Jednakże w pewnych warunkach inhibitory metaloproteinaz mogą również stymulować wzrost nowotworu. Zwiększoną ekspresję MMPs oraz TIMPs wykazano w tkankach guzów o różnej lokalizacji, np. w raku trzustki, piersi, jelita grubego oraz raku żołądka. Ekspresja MMP-9 w tkankach raka przełyku i raka żołądka, a także w komórkach zapalnych podścieliska guza korelowała ze stopniem zaawansowania nowotworu (TNM), wielkością guza oraz obecnością przerzutów do węzłów chłonnych. W raku żołądka ekspresja TIMP- w komórkach nowotworowych wzrastała wraz ze stopniem zaawansowania nowotworu, a w komórkach zapalnych stanowiła niezależny, niekorzystny czynnik prognostyczny przeżycia chorych. 297

16 WYKŁADY Wykazano również znamienny wzrost stężeń MMP-9 i TIMP- we krwi chorych na raka żołądka, trzustki, jelita grubego oraz obniżone stężenia MMP-2 i TIMP-2 w surowicy chorych na raka żołądka i jelita grubego. Stwierdzono, że MMPs mogą mieć znaczenie diagnostyczne jako markery nowotworowe. Pole powierzchni pod krzywą ROC (AUC) dla MMP-9 było wyższe niż CEA w raku przełyku. Inhibitory metaloproteinaz wykazały się również większą mocą diagnostyczną różnicowania między chorobą nowotworową a osobami zdrowymi. AUC dla TIMP- było wyższe niż CEA w raku żołądka; w raku jelita grubego i trzustki wyższe niż dla CEA i CA 9-9, zaś dla TIMP-2 wyższe niż dla CEA i SCC u chorych na raka przełyku. Podwyższone stężenia metaloproteinaz i ich inhibitorów mogą mieć także znaczenie rokownicze przeżycia chorych na nowotwory złośliwe. Zwiększone stężenie MMP-9 w surowicy okazało się niezależnym, niekorzystnym czynnikiem prognostycznym przeżycia chorych na raka trzustki. Chorzy na raka żołądka, u których obserwowano wyższe stężenia TIMP- w osoczu, mieli znamiennie krótszy czas przeżycia. Przedstawione wyniki sugerują użyteczność oznaczania MMPs i TIMPs jako markerów przydatnych w monitorowaniu i prognozowaniu przebiegu chorób nowotworowych. XI. PROBLEM NIESPÓJNOŚCI WYNIKÓW BADAŃ LABORATORYJ- NYCH W ENDOKRYNOLOGII Trudności w diagnostyce zespołu Cushinga Tomasz Bednarczuk Zespół Cushinga (ZC) jest zespołem różnorodnych objawów klinicznych związanych z nadmiarem glikokortykosteroidów (GKS). ZC ma najczęściej podłoże jatrogenne i wynika z długotrwałej terapii GKS. Endogenny ZC wynika z nadmiernego wydzielania kortyzolu przez korę nadnerczy i może być spowodowany przez nadmiar ACTH (ACTH-zależny ZC, najczęściej związany z guzem przysadki wydzielającym ACTH lub znacznie rzadziej z ektopowym wydzielaniem ACTH) lub występować niezależnie od ACTH (ACTH-niezależny ZC w przebiegu najczęściej guza nadnercza). Endogenny ZC występuje bardzo rzadko (zapadalność ok. -0 przypadków/mln/rok), ale nawet w łagodnej postaci, nieleczony ZC istotnie zwiększa umieralność w porównaniu z ogólna populacją. Stąd ZC należy uwzględnić w diagnostyce różnicowej różnych częstych chorób, takich jak nadciśnienie tętnicze, cukrzyca lub osteoporoza. Niestety nie istnieje pojedynczy test przesiewowy potwierdzający lub wykluczający ZC. Za podstawowe badania przesiewowe w kierunku ZC uznaje się: (i) test hamowania mg deksametazonu (DXM), (ii) dobowe wydalanie wolnego kortyzolu, (iii) oznaczenie stężenia kortyzolu w surowicy (lub wolnego kortyzolu w ślinie) późnym wieczorem. Jednakże interpretacja wyników musi uwzględnić obraz kliniczny oraz możliwość wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. W przypadku łagodnej hiperkortyzolemii, konieczna jest nieraz obserwacja objawów klinicznych i wykonanie wielu badań. Dodatkowym utrudnieniem jest zespół pseudo-cushinga ; jest to stany nadmiernej aktywacji osi podwzgórze-przysadka i czynnościowej hiperkortyzolemii z towarzyszącymi czasami cechami klinicznymi ZC (np. ciąża, depresja, alkoholizm, otyłość olbrzymia, źle wyrównana metabolicznie cukrzyca, jadłowstręt psychiczny). Chromogranina A (CgA) wpływ różnych czynników in vivo, in vitro oraz współistniejących chorób na jej stężenie we krwi Piotr Glinicki Chromogranina A (CgA) jest kwaśną glikoproteiną, należącą do rodziny białek określanych jako chromograniny / sekretograniny. Występuję ona w prawidłowych i zmienionych chorobowo komórkach neuroendokrynnych. Jest ona wydzielana do krążenia na drodze egzocytozy i może być oznaczana jako, tzw. krążący marker nowotworowy, w tym przede wszystkim jako niespecyficzny marker guzów neuroendokrynnych (NET). Czułość CgA w tych guzach wg różnych autorów waha się 0 00%, specyficzność 60 00%. CgA jest stabilnym białkiem (cykle rozmrażania / zamrażania nie uszkadzają cząsteczki) i może być długo przechowywana (-25 C). Wykazuje zmienność dobową (20-25%), wyższe stężenia obserwuje się późnym popołudniem i w nocy. Do tej pory uważano, iż stężenie CgA nie zależy od płci, jednak w jednej z ostatnich prac autorzy zaobserwowali wyższe stężenia u kobiet niż u mężczyzn. Wyższe stężenia CgA obserwuje się w osoczu (EDTA, heparynowe) niż w surowicy. Po posiłku stężenie CgA może wzrosnąć o 20-30%. Liczne czynniki in vivo, in vitro i stany chorobowe mogą wpływać na stężenie CgA. Wysokie stężenia CgA poza guzami NET obserwuje się w przewlekłym atroficznym zapaleniu błony śluzowej żołądka typu A (gastritis atrophicans), w niewydolności nerek (egfr < 30 ml/min/,73m²), reumatoidalnym zapaleniu stawów przebiegającym z wysokim stężeniem czynnika RF w klasie IgM i w raku prostaty. Pośród innych różnych chorób lub stanów patologicznych i fizjologicznych w których stężenie CgA może być umiarkowanie podwyższone wymienia się najczęściej: niespecyficzne zapalenia błony śluzowej jelita (colitis ulcerosa, choroba Leśniowskiego-Crohna), upośledzenie funkcji wątroby (np. marskość), nadczynność tarczycy, ostre zespoły wieńcowe i nadciśnienie tętnicze, chorobę obturacyjną płuc, zespół jelita wrażliwego, chorobę Parkinsona, ciążę. Wśród leków które mogą wpływać znacząco na stężenie CgA wymienia się przede wszystkim leki z grupy inhibitorów pompy protonowej (np. omeprazol, pantoprazol, lansoprazol), inhibitorów receptorów histaminowych typu H₂ (np. ranitydyna), chemioterapeutyki (np. streptozotocyna), oraz glikokortykoidy. W celu prawidłowego rozpoznania guza neuroendokrynnego, a następnie monitorowania skutków leczenia niezbędne jest uwzględnienie wszystkich wymienionych czynników mogących mieć wpływ na stężenie chromograniny A we krwi. Wpływ wysokocząsteczkowych izoform hormonów na wynik oznaczenia diagnostycznego Zbigniew Bartoszewicz Stężenie zdecydowanej większości hormonów jest oznaczane metodami immunochemicznymi. Na wynik pomiaru wpływają czynniki związane z użytą metodą takie jak stosowane przeciwciała, analogi, sposób wprowadzania znaczników i ich detekcji oraz standaryzacją reakcji wieloetapowych. Rzadko zdajemy sobie sprawę z tego, że istotne różnice w wynikach mogą być spowodowane heterogennością hormonów, których stężenia oznaczamy, co w szczególnych przypadkach może prowadzić do niezgodności pomiędzy uzyskanymi wynikami a stanem klinicznym pacjenta i skutkować nieprawidłowym wyborem metody leczenia. Heterogenność hormonów, w szczególności hormonów białkowych związana jest z ich modyfikacjami posttranslacyjnymi (PTM -ang. posttranslational modifications). PTM prowadzą do powstawania różnych form tego samego hormonu: izoform wysokocząsteczkowych, niskocząsteczkowych oraz izoform o ciężarze podobnym do podstawowej izoformy monomerycznej ale o zmodyfikowanym składzie chemicznym. Dodatkowo niektóre geny kodujące w czasie obróbki mrna mogą podlegać procesowi pomijania egzonu (ang. exon skipping), w wyniku którego powstają krótsze izoformy danego białka. Zdecydowana większość oznaczeń hormonalnych wykonywana jest z surowicy lub osocza krwi obwodowej, w których występują związki swoiście lub w sposób nieswoisty wiążące się z hormonami. Część hormonów ma również naturalną tendencję do agregacji tworząc dimery, oligomery i multimery. Powstałe izoformy wysokocząsteczkowe w różnym stopniu są rozpoznawalne przez przeciwciała użyte w teście immunochemicznym, co w konsekwencji prowadzi do uzyskania różnych wyników dla tej samej próbki pacjenta w zależności od rodzaju użytego testu. Udział izoform wysokocząsteczkowych w całkowitej puli izoform danego hormonu może być dominujący i one same mogą stanowić użyteczne markery diagnostyczne (np. wysokocząsteczkowa adiponektyna). Często izoformy wysokocząsteczkowe hormonów powstają w wyniki oddziaływań z krążącymi we krwi przeciwciałami. U części pacjentów z hiperprolaktynemią występuje izoforma prolaktyny wysokocząsteczkowej tzw. makroprolaktyna, która poza prolaktyną monomeryczną zawiera izoformę glikozylowaną, przeciwciała przeciwprolaktynowe oraz prawdopodobnie rozpuszczalny fragment receptora dla prolaktyny. Dla surowic zawierających makroprolaktynę wyniki pomiaru stężeń prolaktyny w tej samej próbce pacjenta mogą różnić się nawet 5-krotnie ze względu na inne powinowactwo używanych w testach przeciwciał do cząsteczki makroprolaktyny. Tworzenie się izoform wysokocząsteczkowych na skutek oddziaływań z przeciwciałami występuje również dla innych hormonów np. gonadotropin (LH i FSH), insuliny i jest szczególnie częste w sytuacjach, gdy w krwiobiegu występuje wysokie stężenie przeciwciał np. w chorobach autoimmunologicznych, w stanach zapalnych, podczas stosowania terapii przeciwciałami oraz u pacjentów po długotrwałym kontakcie z alergenami roślinnymi i zwierzęcymi. Wysokocząsteczkowe izoformy immunokompleksu hormon białkowy-przeciwciało mogą w istotny 298

17 WYKŁADY sposób zmienić wynik oznaczenia stężenia hormonu niezwiązanego np. obecność przeciwciał przeciw tyreoglobulinie (TgAb) w chorobach autoimmunologicznych tarczycy może powodować zaniżenie stężenia tyreoglobuliny w surowicy. Hormony białkowe powstają z większych cząsteczek prekursorów i prohormonów, które w różnym stopniu są rozpoznawane przez używane w testach przeciwciała i mogą zawyżać wynik oznaczenia stężenia hormonu. Przykładowo testy immunochemiczne stosowane dla oznaczeń stężenia hormonu adenokortykotropowego (ACTH), który powstaje z dużego białka proopiomelanokortyny (POMC) i poprzez pro-acth jest degradowany do biologicznie czynnej cząsteczki właściwego hormonu, reagują krzyżowo z POMC i proacth wpływając na wynik oznaczenia ACTH. Sam prekursor lub prohormon może być użytecznym markerem diagnostycznym np. pomiar stężenia proinsuliny obok insuliny i C-peptydu jest pomocniczym oznaczeniem w nowotworach trzustki. Trudności w interpretacji wyników TSH, ft4 i ft3 Agnieszka Kondracka Interpretacja wyników laboratoryjnych testów tarczycowych (TSH, ft4 i ft3) jest zwykle jednoznaczna i zgodna za stanem klinicznym pacjenta. Jednak czasem występuje nietypowa konfiguracja wyników lub wyniki niezgodne ze stanem klinicznym pacjenta. Do najczęstszych należą stany subklinicznej niedoczynności (rzadziej subklinicznej nadczynności), kiedy stężeniu hormonów tarczycy w zakresie normy towarzyszy podwyższony (lub obniżony) poziom TSH. Także podczas leczenia L-tyroksyną lub lekami przeciwtarczycowymi obserwujemy konfiguracje nieadekwatne do stanu klinicznego, m.in. przez wiele miesięcy może utrzymywać się poziom TSH sprzed rozpoczęcia leczenia, występuje dysproporcja stężeń ft4 i ft3 i tp. Trudności w interpretacji wyników testów tarczycowych mogą także wynikać ze szczególnego stanu fizjologicznego jak ciąża (wymagająca stosowania odpowiednich wartości referencyjnych dla każdego z trymestrów), supresja osi podwzgórzeprzysadka u pacjentów ze współistniejącymi przewlekłymi lub ostrymi schorzeniami pozatarczycowymi oraz stosowanie suplementacji lub leczenia hormonami sterydowymi. Leki, których efektem ubocznym jest modyfikacja funkcji tarczycy lub metabolizmu hormonów tarczycy oraz leki powodujące oddysocjowanie hormonów tarczycy od białek transportowych także zaburzają równowagę osi podwzgórze-przysadkatarczyca, co może prowadzić do zaskakujących wyników szczególnie bezpośrednio po rozpoczęciu oraz po zaprzestaniu terapii. Do bardzo rzadko występujących przyczyn niezgodnych wyników należą: wydzielanie przez guzy przysadki nietypowo glikozylowanego TSH, wrodzona oporność na hormony tarczycy lub defekt konwersji T4 do T3. Źródłem niezgodności mogą ponadto być: obecność nietypowych białek wiążących hormony tarczycy (jak np w hipertyroksynemii związanej z rzadkimi genetycznymi wariantami albuminy lub transtyretyny), stężenia białek nośnikowych znacznie odbiegające od normy, obecność autoprzeciwciał przeciwko hormonom tarczycy lub TSH oraz obecność wysokich stężeń czynnika reumatoidalnego, przeciwciał heterofilnych i innych. Występowanie nietypowej konfiguracji wyników testów tarczycowych na skutek obecności przeciwciał interferujących może przejawiać się tylko przy zastosowaniu określonego testu immunochemicznego, podczas, gdy wyniki innych testów nie wykazują wpływu interferencji. Jeżeli podejrzewamy, że źródłem niezgodności są anomalie białek wiążących lub ich nietypowe stężenia wskazane może być wykonanie dodatkowych analiz, jak: oznaczenia poziomu całkowitych hormonów tarczycy, wykonanie testu wiązania tyroksyny, zastosowanie oznaczeń wskaźnikowych lub oznaczenie poziomu białek wiążących. Istnienie defektów genetycznych można potwierdzić wykazując obecność określonych mutacji. W przypadku podejrzenia, że nietypowa, trudna do interpretacji konfiguracja wyników testów tarczycowych jest skutkiem obecności przeciwciał lub innych czynników interferujących możliwe jest podjęcie następujących działań pomocnych niekiedy w wyjaśnieniu niezgodności: wykonanie oznaczeń za pomocą testów innego producenta wykonanie testu rozcieńczeń (może być bezpiecznie stosowany w przypadku TSH, interpretacja wyników oznaczeń wolnych hormonów wymaga znacznego doświadczenia) związanie przeciwciał heterofilnych za pomocą odpowiednich przeciwciał lub proteiny A lub G wytrącenie kompleksów z autoprzeciwciałami za pomocą glikolu polietylenowego. Zaprezentowano przypadki wskazujące na istnienie interferencji w próbkach pochodzących od pacjentów z nietypowymi wynikami testów tarczycowych wybrane z piśmiennictwa oraz z doświadczenia własnego Laboratorium Naukowego Kliniki Endokrynologii WUM. XII. BIOMARKERY W PREWENCJI I DIAGNOSTYCE CHORÓB - TERAŹNIEJSZOŚĆ I PRZYSZŁOŚĆ Nowe biomarkery w diagnostyce i monitorowaniu chorób neurologicznych Agnieszka Słowik Streszczenia nie nadesłano Diagnostyka molekularna cukrzycy Maciej Małecki Streszczenia nie nadesłano Epigenetyka a pamięć metaboliczna nowe narzędzie nutrigenomiki i diagnostyki Beata Kieć-Wilk Streszczenia nie nadesłano Lipidomika od chorób rzadkich po choroby społeczne Iwona Wybrańska Streszczenia nie nadesłano XIII. DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA ZABURZEŃ UKŁADU OD- PORNOŚCIOWEGO Nowoczesne technologie w diagnostyce immunologicznej Urszula Demkow W ostatnich latach obserwujemy bardzo intensywny rozwój nowych technologii badawczych pozwalających na coraz dokładniejsze diagnozowanie zaburzeń odporności. Między innymi istotny postęp dokonał się w dziedzinie obrazowania komórek układu odpornościowego oraz oceny ich struktury wewnętrznej, funkcji i aktywności. Nową, udoskonaloną technologią diagnostyczną jest cytometria obrazowa. Ta technologia polega na ilościowym wieloparametrowym pomiarze budowy i funkcji komórek, (lokalizacji struktur w komórce, kształtów i wielkości organelli lub całych komórek, ruchu komórek itd.) korzystając z obrazu mikroskopowego. Metoda ta pozwala na obiektywny, niezależny od obserwatora, opis ilościowy funkcji komórek. Układ ten jest połączeniem cytometrii przepływowej i mikroskopu fluorescencyjnego z systemem komputerowej analizy obrazu. Analiza przestrzennej dystrybucji fluorochromu może służyć do wykrywania translokacji białek z jadra do cytoplazmy lub białek szlaków sygnałowych. Możliwa jest ocena statyczna morfologiczna. Dodatkowo zapis rzeczywistego obrazu komórek pozwala na dostęp do informacji niemożliwej do uzyskania za pomocą klasycznego cytometru przepływowego. Jakość obrazu uzyskanego za pomocą cytometru obrazowego pozwala na analizę kilkuset różnych cech wybranych subpopulacji komórkowych. Cytometria obrazowa może służyć do oceny apoptozy komórki, do wykrywania translokacji różnych elementów w komórce, oceny zmiany kształtu komórki, formowania pseudopodii i migracji komórek, identyfikacji komórek o określonym profilu markerów, diagnostyki metodą FISH, oceny cyklu komórkowego, identyfikacji synaps immunologicznych pomiędzy limfocytem T a komórką prezentującą antygen. Metoda jest również niezwykle przydatna do poszukiwania populacji rzadkich komórek (choroba resztkowa).znajduje również zastosowanie w mikrobiologii. Przedstawiona nowoczesna metoda rozpoznawania chorób pozwalają na wyjaśnienie molekularnej podstawy wielu chorób o podłożu immunologicznym i hematologicznym oraz dobór indywidualnej terapii tych chorób u każdego chorego. 299

18 WYKŁADY Diagnostyka niedoborów odporności Maciej Siedlar Diagnostyka pierwotnych niedoborów odporności (PNO) oparta jest na ścisłej współpracy lekarza immunologa klinicznego ze specjalistycznym laboratorium diagnostycznym. Diagnoza odpowiedniego PNO w zasadniczej mierze wspiera się o wyniki badań laboratoryjnych, możliwych do wykonania jeszcze poza ośrodkiem referencyjnym. Powinna rozpocząć się od oznaczenia morfologii krwi z rozmazem oraz od wykonania pomiarów poziomów poszczególnych klas immunoglobulin w surowicy krwi. Specjalistyczna diagnostyka PNO humoralnej obejmuje ponadto oznaczenia dotyczące poziomu podklas IgG, liczebności dojrzałych limfocytów B, a w szczególnych przypadkach dziewiczych limfocytów B, limfocytów B strefy brzeżnej, pamięci po przełączeniu klas, przejściowych, tzw. class-switched plasmablasts, a także na ocenie produkcji swoistych przeciwciał. Z kolei, na ocenę odporności komórkowej składają się badania liczebności subpopulacji limfocytów T, subpopulacji komórek T dziewiczych oraz pamięci, a także komórek NK. Oceniany może być również tzw. chimeryzm matczyno-płodowy, ekspresja receptorów limfocytów T (TCR) αβ/γδ, poziom ekspresji cząsteczek HLA-DR, CD25, CD69 oraz CD7 na limfocytach T, a także poziom TREC (T-cell receptor excision circles). W szczególnych przypadkach, ocenie podlega ekspresja cząsteczek CD40 oraz CD40L oraz poziom tzw. podwójnie ujemnych (CD4 - CD8 - ) limfocytów T z receptorem αβ. Do testów funkcjonalnych dotyczących limfocytów T i B zalicza się testy transformacji blastycznej komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po stymulacji mitogenami (PHA, ConA, PWM), przeciwciałami monoklonalnymi (np. anty-cd3) oraz antygenami (PPD, kandidyna). Stopień proliferacji limfocytów po nieswoistej stymulacji można również określać metodami cytofluorymetrycznymi (np. z wykorzystaniem barwnika CSFE lub bromodeoksyurydyny). Można również badać poziom uwalnianych mediatorów cytokinowych po nieswoistej aktywacji limfocytów in vitro, np.: TNF, IFNγ, IL-2p40/p70, a także cytofluorymetrycznie, na powierzchni limfocytów i/lub monocytów, poziom ekspresji receptorów dla tychże cytokin. W każdym przypadku stymulacji wynik należy odnieść do spoczynkowej aktywności komórek. Z kolei, aktywność komórek żernych (głównie granulocytów obojętnochłonnych) badamy oceniając produkcję wolnych rodników tlenowych w teście chemiluminescencji lub redukcji błękitu tetrazolowego (NBT) oraz cytofluorymetrycznie, z wykorzystaniem tzw. phagoburst-test. Możemy również cytofluorymetrycznie oceniać wewnątrzkomórkową ekspresję podjednostek NADPH oksydazy (np. gp9phox), mieloperoksydazy, a na ich powierzchni - poziom ekspresji wybranych cząsteczek adhezyjnych. W diagnostyce wybranych PNO istotne jest określenie chemotaksji komórek. Do rutynowych badań zaliczamy oznaczenie surowiczego poziomu wybranych składników kaskady dopełniacza zwykle C3c oraz C4. Z uwagi na znaczący postęp w określaniu genetycznego podłoża PNO, diagnostyka molekularna stanowi obecnie podstawę rozpoznania większości poznanych ciężkich, złożonych niedoborów odporności. Testy laboratoryjne oceniające odporność komórkową Jarosław Baran Mechanizmy komórkowe odgrywają kluczową rolę zarówno w reakcjach odporności nieswoistej (wrodzonej), jak i swoistej (nabytej). Ta pierwsza, miediowana jest przez wyspecjalizowane komórki żerne fagocyty, do których należą neutrofile i monocyty krwi obwodowej oraz makrofagi tkankowe. Z kolei odporność komórkowa swoista dla danego antygenu, mediowana jest przez limfocyty T i w dużej mierze zależy od sprawnego funkcjonowania monocytów i makrofagów tkankowych, które wraz z komórkami dendrytycznymi pełnią rolę komórek prezentujących antygen. Prawidłowy przebieg reakcji odpornościowej w trakcie toczącej się odpowiedzi immunologicznej wymaga więc współdziałania wszystkich komórek układu odpornościowego, zarówno odporności nieswoistej, jak i swoistej i podlega regulacji przez czynniki humoralne i komórkowe. W prezentacji przedstawione zostaną testy laboratoryjne stosowane w nowoczesnej diagnostyce immunologicznej do oceny jakościowej i ilościowej komórek zaangażowanych w nieswoiste i swoiste reakcje odpornościowe. Omówione zostaną również najczęstsze schorzenia (niedobory odporności) związane z upośledzeniem funkcji określonych populacji. Diagnostyka laboratoryjna zespołu hemofagocytarnego Katarzyna Popko Limfohistiocytoza hemofagocytarna (HLH) jest rzadko występującym zarówno w populacji dzieci jak i dorosłych zespołem objawów, związanych z hiperaktywacją makrofagów, pojawiającą się w konsekwencji upośledzenia mechanizmów regulacyjnych układu immunologicznego. Najbardziej charakterystyczne objawy obejmują: gorączkę, pancytopenię, hepatosplenomegalię, hiperferrytymemię, hipertriglicerydemię, hipofibrynogenemię oraz upośledzenie funkcji cytotoksycznych komórek NK i cytotoksycznych limfocytów T (CD8). W przypadku braku prawidłowej diagnozy zespół ten stanowi poważne zagrożenie życia pacjenta. Identyfikuje się dwie formy zespołu HLH: postać genetycznie uwarunkowaną, związaną z obecnością mutacji zaburzających proces cytolizy oraz postać wtórną rozwijającą się w konsekwencji występowania chorób autoimmunizacyjnych, nowotworów lub infekcji wirusowych. Postać wtórna stanowi ponad 90% wszystkich przypadków diagnozowanych w populacji polskiej. W przypadkach genetycznie uwarunkowanych jedyną skuteczną metodą leczenia jest transplantacja szpiku kostnego. Poza standardowymi badaniami laboratoryjnymi niezwykle istotną rolę w diagnostyce HLH pełnią badania immunologiczne. Diagnostyka zespołu HLH w dużej mierze opiera się na badaniu sprawności immunologicznej komórek zaangażowanych w regulację odpowiedzi zapalnej. Cytometria przepływowa stanowi obecnie jedną z podstawowych metod diagnostyki immunologicznej. Pozwala ona na precyzyjną identyfikację poszczególnych subpopulacji oraz ocenę ekspresji enzymów wewnątrzkomórkowych (perforyny, granzymy) biorących aktywny udział w reakcjach immunologicznych. Poprzez zastosowanie testów czynnościowych pozwala ona również na ocenę sprawności funkcjonowania komórek zdolnych do spontanicznej cytotoksyczności. XIV. ALERGIA CZY SZARLATANERIA JAK DIAGNOZOWAĆ Epidemiologia chorób alergicznych wyzwania dla medycyny XXI wieku Bolesław Samoliński Streszczenia nie dostarczono Nowoczesna diagnostyka alergii IgE-zależnej Sławomir Białek Alergia jest klasyfikowana jako rodzaj reakcji nadwrażliwości, gdzie objawy powstają na drodze mechanizmów immunologicznych. Wyniki badań epidemiologicznych wskazują, iż wśród osób cierpiących na choroby alergiczne największy odsetek stanowią pacjenci z alergią IgE-zależną. W rozpoznawaniu chorób alergicznych istotne jest stwierdzenie na co chory jest uczulony oraz czy mechanizm tego uczulenia ma podłoże alergiczne (immunologiczne). Ponadto istotne jest wykazanie czy to, na co chory jest uczulony, tłumaczy występowanie jego objawów. W przypadku trudności w wykazaniu związku przyczynowo-skutkowego pomiędzy uczulającymi alergenami a objawami uczulenia konieczne jest zastosowanie badań laboratoryjnych. Powszechnie stosowana w diagnostyce chorób alergicznych immunoglobulina E została odkryta i opisana w 966 r. IgE wykazuje większe powinowactwo do połączeń z makrofagami, mastocytami, bazofilami i eozynofilami poprzez wysoce swoisty receptor FcR (uczulanie komórek) niż do występowania w postaci wolnej w krwi. Stężenie IgE w surowicy krwi jest ściśle związane z wiekiem pacjenta, w krwi pępowinowej większości noworodków IgE występuje w ilościach śladowych. Oznaczenie stężenia IgE całkowitego w surowicy jest parametrem charakterystycznym dla procesu alergicznego. Należy jednak pamiętać, iż podwyższony poziom IgE całkowitego nie zawsze koreluje z alergią i może być związany np. z różnymi niedoborami, chorobami pasożytniczymi, z paleniem papierosów. Również prawidłowe stężenie IgE całkowitego nie pozwala na wykluczenie choroby alergicznej. Rola oznaczeń IgE całkowitego zwiększyła się ponownie po wprowadzeniu do praktyki klinicznej Omalizumabu, leku który jest humanizowanym przeciwciałem pochodzenia mysiego, skierowanym przeciwko IgE. Lek jest stosowany w terapii ciężkiej astmy, pokrzywki oraz innych ciężkich 300

19 WYKŁADY alergii IgE-zależnych. Na podstawie odpowiednio wysokich stężeń IgE całkowitego pacjenci są klasyfikowani do prowadzenia terapii tym lekiem. Przy dobrym efekcie klinicznym leczenia, stężenie IgE całkowitego powinno wzrastać i wracać do wartości wyjściowych po roku od zakończenia leczenia. Natomiast oznaczenie IgE alergenowo-swoistych dla konkretnych alergenów jest podstawowym badaniem laboratoryjnym stosowanym w diagnostyce alergologicznej. Może być wykonywane u chorych w każdym wieku, u pacjentów ze zmniejszoną reaktywnością skóry i co najważniejsze nie wymaga odstawienia leków przeciwalergicznych. Obecnie można wyróżnić trzy generacje metod oznaczania IgE swoistych, różniących się przede wszystkim rodzajem fazy stałej, przeciwciałem wykrywającym, granicą wykrywalności, stopniem automatyzacji oraz czasem oczekiwania na wynik. W metodach trzeciej generacji granica wykrywalności IgE dla klasy I została przesunięta do wartości 0, IU/ml. Przede wszystkim ma to znaczenie przy diagnostyce alergii na roztocza u małych dzieci, gdzie wartości IgE swoistych przeciwko alergenom roztoczy wahają się w granicach 0, 0,35 IU/ml. Wykrycie nawet tak małych stężeń przeciwciał IgE jest wskazaniem do eliminacji kurzu z otoczenia dziecka i prowadzi do zatrzymania marszu alergicznego. Ponadto u pacjentów diagnozowanych z powodu uczulenia na jady owadów błonkoskrzydłych, stężenia swoistych IgE przeciwko tym alergenom również mieszczą się w takich samych granicach. Istotną trudnością w interpretacji oznaczeń IgE swoistych, zwłaszcza w diagnozowaniu alergii na jady owadów błonkoskrzydłych i lateks jest obecność przeciwciał IgE dla tzw. determinant węglowodanowych (CCDs ang. cross reactive carbohydrate determinants). Niektóre glikoproteiny posiadające specyficzne wiązania np. N-acetylo-glukozy z ksylozą, wiążą nieswoiście przeciwciała IgE. Przeciwciała IgE reagujące z CCD powodują fałszywie dodatnie wyniki oznaczeń z alergenami zawierającymi glikany. Występowanie tych przeciwciał nie ma jednak znaczenia klinicznego, ich oznaczanie wykonuje się przy stwierdzeniu obecności swoistych IgE np. dla jadów owadów i lateksu przy braku objawów klinicznych uczulenia na te alergeny. W ostatnim czasie dużego znaczenia nabiera zastosowanie diagnostyki molekularnej alergii czyli tzw. diagnostyki epitopowej. Epitop to fragment antygenu, który łączy się bezpośrednio z wolnym przeciwciałem. Dany epitop może silniej lub słabiej pobudzać układ odpornościowy. Diagnostyka epitopowa polega na oznaczaniu swoistych IgE dla poszczególnych epitopów alergenowych, co pozwala na rozróżnienie prawdziwej alergii na konkretny alergen od objawów wywołanych przez reakcje krzyżowe. Ponadto można dokonać oceny ryzyka wystąpienia groźnych reakcji systemowych po kontakcie z badanym alergenem. Uzyskanie powyższych informacji stwarza możliwość wyboru lepszej procedury postępowania z pacjentem np.: czy wymaga intensywnego leczenia przeciwalergicznego podanie epinefryny, czy może zostać poddany próbie prowokacyjnej z testowanym alergenem bez zbyt wysokiego ryzyka wystąpienia reakcji systemowej, czy wystarczy tylko unikanie kontaktu z badanym alergenem. Ponadto immunoglobulina E jako marker laboratoryjny, zarówno całkowita jak i alergenowo-swoista jest parametrem stabilnym. Długie nawet kilkuletnie przechowywanie zamrożonych próbek w temperaturze -20 C nie wpływa wiarygodność uzyskanego wyniku. Również surowice żółtaczkowe, lipemiczne czy shemolizowane nie wpływają na jakość wyniku. Oznaczenia IgE można wykonywać w surowicy krwi, osoczu heparynowym, cytrynianowym, wersenianowym, oraz w popłuczynach z drzewa oskrzelowego i błon śluzowych nosa. Inne możliwości diagnostyki laboratoryjnej schorzeń alergicznych Urszula Demkow Złotym standardem w diagnostyce chorób atopowych są testy skórne i oznaczanie poziomu swoistego IgE. Obecnie możliwa jest również cytometryczna ocena aktywacji bazofilów jako komórek efektorowych w reakcjach atopowych. Do identyfikacji bazofilów wykorzystuje się m. in. antygen CRTH2. Do oceny stopnia aktywacji (degranulacji) bazofilów stosuje się ocenę powierzchniowej ekspresji antygenu CD63 lub antygenu CD203c. Antygen CD63 jest białkiem związanym z wewnątrzcytoplazmatycznymi ziarnistościami bazofilów. Po aktywacji komórek zachodzi uwalnianie z ich ziarnistości mediatorów, jak również dochodzi do fuzji błony komórkowej z błonami ziarnistości, w wyniku której antygen CD63 pojawia się na powierzchni bazofilów. Ekspresja tego białka jest ściśle zależna od stopnia degranulacji komórki. Antygen CD203c w bardzo niewielkiej ilości jest stale obecny w błonie bazofilów. Natomiast po degranulacji, wywołanej kontaktem z alergenem, bądź przeciwciałami anty Ig-E, jego ekspresja znacząco wzrasta, co świadczy o rezerwach tego białka w cytoplazmie bazofilów. CD203c jest to neuronalny powierzchniowy antygen różnicowania neuronów, E-NPP3, PD- Iβ, B0, gp30 RB3-6 należący do wielogenowej rodziny pirofosfataz/fosfodiesteraz, który jest aktywowany po pobudzeniu receptorów FcεRI. Powierzchniowa ekspresja antygenu CD203c wzrasta nagle po mostkowaniu receptorów FcεRI, zatem jest on bardzo dobrym markerem reakcji IgE zależnych. Test z wykorzystaniem detekcji antygenu CD63 i CD203c może być bardzo użyteczny w diagnostyce alergii i w monitorowaniu immunoterapii swoistej a także monitorowaniu terapii antyige. Wyciągi alergenowi czyli od trafnej diagnozy do skutecznej immunoterapii swoistej Piotr Kuna Streszczenia nie dostarczono XV. BIOMARKERY W KARDIOLOGII GDZIE JESTEŚMY, DOKĄD ZMIERZAMY Czy wynik badania laboratoryjnego może zmienić losy chorego? Janina Stępińska Streszczenia nie nadesłano Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach naglących Anna Konopka W kardiologicznych stanach nagłych najistotniejszym elementem postępowania diagnostyczno-leczniczego jest ratowanie życia chorych. Z tego powodu, czas potrzebny na zdiagnozowanie przyczyny ciężkiego stanu chorego powinien być jak najkrótszy. Do kardiologicznych przyczyn stanów nagłych zalicza się ostry zespół wieńcowy (OZW) z jego groźnymi powikłaniami takimi jak ostra niewydolność serca, mechaniczne powikłania zawału serca w tym perforacja przegrody międzykomorowej, ostra niedomykalność zastawki mitralnej czy tamponada serca. Stanem nagłym jest ostra niewydolność serca (obrzęk płuc i/lub wstrząs kardiogenny) wywołana np.: kardiomiopatią rozstrzeniową, zapaleniem mięśnia serca, ostrą niedomykalnością zastawki mitralnej lub aortalnej, zatorowością płucną wysokiego ryzyka czy też groźnymi zburzeniami rytmu serca. Do stanów nagłych zalicza się także: ostre rozwarstwienie aorty, choroby przebiegające z bardzo wysokim ciśnieniem tętniczym, towarzyszące chorobom kardiologicznym ostre uszkodzenie nerek oraz ciężkie powikłania krwotoczne w tym krwawienia z przewodu pokarmowego lub z dużych naczyń po zabiegach inwazyjnych i po operacjach kardiochirurgicznych. W OZW z uniesieniem odcinka ST (STEMI), czas upływający od chwili wystąpienia objawów do udrożnienia tętnicy wieńcowej odpowiedzialnej za STEMI decyduje o wielkości nieodwracalnego uszkodzenia mięśnia serca i wpływa na rokowanie. Oprócz nietypowych objawów klinicznych takich jak ból w klatce piersiowej, groźne zaburzenia rytmu serca, zasłabnięcie czy hipotonia oraz charakterystycznego obrazu EKG potwierdzeniem choroby jest wzrost stężenia biomarkerów w tym troponin we krwi. W STEMI biomarkery stanowią wskaźnik wielkości martwiczego/ niedokrwiennego uszkodzenia mięśnia i mają znaczenie dla odległego rokowania chorych. W STEMI postępowanie interwencyjne na naczyniach wieńcowych nie jest uzależnione od wzrostu stężenia biomarkerów z wyjątkiem sytuacji nietypowego przebiegu choroby W OZW bez uniesienia odcinka ST (NSTEMI) wzrost stężenia troponin decyduje o rozpoznaniu oraz o wskazaniach do pilnego leczenie i wyborze metody postępowania. Oznaczane troponin za pomocą testów wysokoczułych, to znaczy takich, które wykrywająją 0, a nawet 00-krotnie niższe stężenia troponiny niż testy klasyczne, umożliwiło wcześniejsze potwierdzenie niedokrwienia lub martwicy mięśnia serca. Oznaczanie stężenia D-dimerów ma zastosowanie u chorych z podejrzeniem ostrej zatorowości płucnej (ZP). D-dimery charakteryzuje wysoka negatywna wartość predykcyjna tzn. że przy prawidłowym stężeniu D-dimeru ZP i głęboka zakrzepica żylna są mało prawdopodobne. Z kolei pozytywna wartość predykcyjna D-dimeru jest niska co wynika z faktu, 30

20 WYKŁADY że wzrost stężenia D-dimeru obserwuje się również w innych chorobach takich jak: nowotwór, stan zapalny, infekcja, martwica czy rozwarstwienie aorty. W zależności od rodzaju testu czułość i swoistość badania zmienia się. Według dwupoziomowego schematu oceny klinicznego prawdopodobieństwa ZP ujemny wynik oznaczenia stężenia D-dimeru wykonany za pomocą testów wysoce jak i umiarkowanie czułych w sposób bezpieczny wyklucza ZP u chorych z małym prawdopodobieństwem choroby. W około % przypadków potwierdzonej zatorowości płucnej wynik oznaczenia D-dimerów może być fałszywie ujemny. Ostre uszkodzenie nerek (AKI) jest częstym rozpoznaniem u pacjentów hospitalizowanych w oddziałach intensywnej terapii i charakteryzuje się wysoką śmiertelnością. Szybka diagnostyka potwierdzająca AKI umożliwia wczesne leczenie zabiegające dalszemu postępującemu uszkodzeniu nerek. Ocena funkcji nerek jest również istotna u chorych wymagających pilnej diagnostyki i/lub leczenia za pomocą metod wymagających użycia kontrastu radiologicznego, wyboru leczenia przeciwzakrzepowego oraz przy antybiotykoterapii. Obecnie do oceny funkcji nerek stosuje się oznaczanie stężenia kreatyniny z obliczeniem GFR. Duże nadzieje wiąże się z oznaczaniem NGAL (lipokalina związana z żelatynazą neutrofili). NGAL pojawia się w moczu i krwi już w pierwszych godzinach od momentu uszkodzenia nerek i poprzedza wzrost kreatyniny. Prokalcytonina (PCT) jest wykorzystywana jest do różnicowania ciężkich zakażeń bakteryjnych i wirusowych. Wielkość wzrostu stężenia PCT w surowicy koreluje ze stopniem uogólnienia stanu zapalnego. Antybiotykoterapia pod kontrolą stężeń PCT u chorych niechirurgicznych hospitalizowanych w oddziałach intensywnej terapii pozwala skrócić czas leczenia i potencjalnie ograniczyć antybiotykooporność bakterii. W diagnostyce i leczeniu stanów nagłych konieczne może być również pilne oznaczenie morfologii krwi a zwłaszcza HT, Hb i liczby płytek krwi, a także stężenia glukozy, elektrolitów oraz parametrów krzepliwości krwi, a zwłaszcza INR i APTT. Badania takie mogą być niezbędne dla rozpoznania i różnicowania w stanach nagłych oraz dla podjęcia decyzji o dalszej diagnostyce zwłaszcza inwazyjnej, a także wpływa na decyzje o pilnym leczeniu i determinuje jego rodzaj. Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach naglących: Komentarz laboratoryjny Dariusz Sitkiewicz Pod koniec ubiegłej dekady opublikowano pierwsze badania dotyczące wczesnej diagnostyki zawału mięśnia sercowego, w których oznaczenia troponin wykonywano testami o wysokiej czułości (hs-ctn). Zakres detekcji nowych testów obejmuje pełne spektrum chorób sercowo-naczyniowych a także obrazuje fizjologiczny obrót komórkowy. Wysoko czułe testy udowodniły, że stężenie troponin w surowicy jest zmienną ciągłą a interpretacja wyniku wymaga szczegółowego uwzględnienia kontekstu klinicznego. Jednym z problemów związanych z ultraczułymi testami troponinowymi jest fakt, iż samo podwyższenie stężenia troponin w surowicy powyżej 99-tego percentyla nie odzwierciedla mechanizmu odpowiedzialnego za uszkodzenie/martwicę kardiomiocytów. Mechanizm prowadzący do uwolnienia troponin jest kluczowy dla rozpoznania i podjęcia adekwatnych decyzji klinicznych. Niezwykle ważnym zadaniem badawczym stojącym zatem przed kardiologią kliniczną i medycyną laboratoryjną jest poszukiwanie relacji pomiędzy stężeniem troponin a obecnością w krążeniu innych markerów obrazujących przede wszystkim stan niedokrwienia mięśnia sercowego. W przypadku niedokrwienia mięśnia sercowego, N-końcowa część albuminy ulega modyfikacjom strukturalnym co prowadzi do utraty zdolności wiązania jonów Co 2+. Modyfikacja oksydacyjna albuminy zachodzi bardzo szybko, w ciągu kilku minut niedotlenienia. Stężenie modyfikowanej niedokrwieniem albuminy (IMA) wzrasta więc szybko a maksimum osiąga po 2-4 godzinach i powraca do wyjściowego stężenia w ciągu 6 godzin. IMA jest jednak nieswoista dla mięśnia sercowego (wzrost w udarach, niektórych nowotworach, w marskości wątroby, krańcowym stadium niewydolności nerek ) Obiecującym markerem, który może być pomocny w ocenie obecności niewielkich stężeń troponin w surowicy może być także sercowe białko wiążące kwasy tłuszczowe (h-fabp). h-fabp jest białkiem o niskim ciężarze cząsteczkowym (5 kda) zlokalizowanym w cytoplazmie kardiomiocytów. Biologiczna funkcja h-fabp polega na wiązaniu długołańcuchowych kwasów tłuszczowych działających jako aktywatory mitochondrialnych białek rozprzęgających i mieć związek z przemianą metabolizmu tlenowego na beztlenowy podczas niedokrwienia mięśnia sercowego. Ostatnio pojawia się coraz więcej doniesień o obecności w osoczu cząsteczek mikro-rna i możliwości ich wykorzystania jako swoistych markerów uszkodzenia tkanek. Mikro-RNA są krótkimi, niekodującymi cząsteczkami RNA składającymi się z nukleotydów, których podstawową funkcją jest negatywna regulacja ekspresji genów (tzw. uśpienie genów ). Mechanizm działania mirna polega na wiązaniu ze swoistymi nie ulegającymi translacji 3 regionami mrna, co w efekcie powoduje destabilizację transkryptów oraz blokowanie translacji. Wiele danych wskazuje, że cząsteczki mirna, a w szczególności swoista dla mięśnia serca cząsteczka mirna-208 może być użytecznym klinicznie markerem uszkodzenia mięśnia sercowego tak w następstwie zawału jak i pomostowania aortalno-wieńcowego. Ostanie badania wskazują na kluczową rolę cząsteczek mirna 43 i 45 także w homeostazie komórek mięsni gładkich naczyń co może sugerować ich udział w procesach destabilizacji blaszek miażdżycowych a także w mechanizmach restenozy w stencie. Kliniczne znaczenie przewlekłych Marcin Grabowski biomarkerów w kardiologicznych stanach Zastosowanie w praktyce diagnostyki biochemicznej w przewlekłych chorobach kardiologicznych cechuje się pewną specyfiką i odmiennością w stosunku do ostrych stanów kardiologicznych. Jest to nie tylko związane zastosowaniem odmiennych markerów biochemicznych ale także z dynamiką ich stężeń, różnymi wartościami referencyjnymi oraz potencjalnym zastosowaniem w przewlekłym monitorowaniu i ewentualnym dostosowaniu terapii. Odmienność dotyczy także wartości rokowniczej i diagnostycznej wybranych wskaźników biochemicznych. W przypadku przewlekłych schorzeń kardiologicznych takich jak niewydolność serca, stabilna choroba wieńcowa czy miażdżyca ogólnoustrojowa znaczenie już mają podstawowe wskaźniki (wyrównanie glikemii, funkcja nerek, lipidogram, układ krzepnięcia, morfologia krwi), które z jednej strony wskazują na ogólne obciążenie stanami współistniejącymi, z drugiej zaś odzwierciedlają ryzyko progresji schorzenia sercowo-naczyniowego. Parametry te mają również znaczenie w kontekście możliwości zastosowani (wskazania i przeciwskazania) odpowiedniej terapii. Zastosowanie nowych testów troponinowych, tych o wysokiej czułości powoduje coraz częstsze wykrywanie cech uszkodzenia mięśnia sercowego u pacjentów z przewlekłą niewydolnością serca czy zaawansowaną chorobą wieńcową. Odzwierciedla to nie tylko gorsze rokowanie tych pacjentów ale także większe prawdopodobieństwo obecności istotnych i wielonaczyniowych zmian w tętnicach wieńcowych. W praktyce problematyczne jest rozróżnienie przewlekłego uszkodzenia mięśnia sercowego od świeżej martwicy spowodowanej ostrym niedokrwieniem. Coraz częściej dyskutuje się czy wykrycie biochemicznych cech uszkodzenia kardiomiocytu zawsze wynika z martwicy czy jednak w niektórych przypadkach może oznaczać odwracalne uszkodzenie. Markery stresu hemodynamicznego jakim są peptydy natriuretyczne mają ugruntowaną pozycję w algorytmie diagnostycznym niewydolności serca. W przypadku przewlekłej niewydolność serca zaleca się stosowanie różnych wartości odcięcia jako wartości wskazujących na niewydolność serca, w zależności od tego czy objawy dekompensacji krążenia narastały powoli czy nagle. Peptydy natriuretyczne, które mają potwierdzoną wartość rokowniczą w przewlekłych schorzeniach kardiologicznych, szczególnie w niewydolności serca, niestety nie potwierdziły jak na razie użyteczności w wykorzystaniu ich do optymalizacji terapii (tzw. bnp-guided therapy ). Porównując z ostrymi stanami kardiologicznymi, w przypadku schorzeń przewlekłych wydaje się, że większe znaczenie mają markery zapalne (białko C-reaktywne, interleukiny, 6, 8), stresu oksydacyjnego (ox- LDL, mieloperoksydaza) czy wykładniki remodelingu zewnątrzkomórkowego (tkankowe inhibitory metaloproteinaz, propetydy kolagenu). Spośród nowych markerów badanych pod kątem użyteczności diagnostycznej i biochemicznej w stanach kardiologicznych można wymienić m.in.: ST2, galektynę, proadremodulinę, czy adiponektynę. Kliniczne znaczenie biomarkerów w kardiologicznych stanach przewlekłych. Komentarz laboratoryjny Marek Paradowski Streszczenia nie nadesłano 302