MARKERY MOLEKULARNE dr Janusz Piechota dr Magdalena Wołoszyńska Plan wykładów:

Transkrypt

1 MARKERY MOLEKULARNE dr Janusz Piechota dr Magdalena Wołoszyńska Plan wykładów: Definicja słowa marker Markery związane z kwasami nukleinowymi rodzaje wykrywanie zastosowanie w diagnostyce medycznej, medycynie sądowej, archeologii, analizie behawioralnej, systematyce organizmów żywych Wybrane przykłady markerów białkowych przykłady wykorzystania w diagnostyce medycznej, podstawowe metody wykrywania markerów białkowych.

2 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Definicje markerów Marker ang. znacznik, wskaźnik Marker molekularny cząsteczka DNA, RNA lub inna cząsteczka biochemiczna, której występowanie lub postać (np. sekwencja) odróżnia dwa stany. Dwoma rozróżnianymi stanami mogą być np. dwie różne osoby, lub dwa stany fizjologiczne (stan zdrowia i choroby), obecność patogenu itp.

3 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Definicje markerów Marker biochemiczny substancja wielkocząsteczkowa umożliwiająca odróżnienie organizmu lub komórki prawidłowej od zmienionej chorobowo (np. nowotworowej) białko, aktywność enzymatyczna, cząsteczka będąca wynikiem aktywności (lub braku aktywności) enzymu.

4 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych LDH (dehydrogenaza mleczanowa) Katalizuje ostatni etap szlaku glikolitycznego przekształcenie pirogronianu w mleczan U człowieka występuje 5 izomerów (LDH1-LDH5), różniących się specyficznością tkankową. W surowicy występują wszystkie, ale największą aktywność posiadają izoformy LDH1 i LDH2 występujące głównie w sercu. Poziom LDH we krwi silnie wzrasta we wczesnym okresie zawału mięśnia sercowego. Poziom LDH we krwi jest podwyższony w różnych chorobach wątroby

5 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych enzymy wątrobowe: aminotransferazy ALAT i AspAT i alkaliczna fosfataza ALAT (aminotransferaza alaninowa) przekształca pirogronian w alaninę (izoforma cytozolowa) lub na odwrót (izoforma mitochondrialna) AspAT (aminotransferaza asparaginowa) przekształca szczawiooctan w asparaginian (izoforma cytozolowa) lub na odwrót (izoforma mitochondrialna) alkaliczna fosfataza katalizuje defosforylację estrów fosforanowych. Optimum działania w środowisku zasadowym. Podwyższona aktywność we krwi: nieprawidłowa funkcja wątroby, wysoka aktywność: uszkodzenie wątroby, marskość wątroby. Badania aktywności enzymów wątrobowich połączonych oznaczaniem poziomu bilirubiny nazywa się próbami wątrobowymi.

6 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Przykłady typowych markerów biochemicznych/molekularnych Bilirubina powstaje na drodze rozpadu hemu uwolnionego z hemoglobiny. Cały proces zachodzi w śledzionie, wątrobie i szpiku kostnym podczas niszczenia czerwonych krwinek. Podwyższony poziom wraz z enzymami wątrobowymi zaburzenie funkcji wątroby Podwyższony izolowany poziom zespół Gilberta (choroba metaboliczna spowodowana mutacją w genie UGT1A1 kodującym UDPglukuronylotranferazę, prowadzącą do zaburzeń metabolizmu bilirubiny w wątrobie. Wysoki poziom hiperbilirulemia (żółtaczka) wskazuje na uszkodzenie wątroby spowodowane np. wirusowym zapaleniem wątroby (HAV, HBV, HCV).

7 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Cechy dobrego markera molekularnego Łatwy do wykrycia za pomocą specyficznej metody Niskie koszty wykrycia/określenia poziomu Możliwie specyficzny dla danego stanu chorobowego Diagnoza w próbce, którą łatwo pobrać od człowieka (osoby zdrowej, pacjenta itp.). Idealnie, jeżeli obecny jest w moczu, ślinie, krwi, włosach, skórze.

8 MARKERY MOLEKULARNE DEFINICJA i RODZAJE Marker genetyczny charakterystyczna właściwość organizmu, wykorzystywania do określenia jego genotypu. Zwykle jest to gen występujący przynajmniej w dwóch łatwo rozróżnialnych allelach. Markery genetyczne można wykorzystać do rozróżnienia osobników, gatunków, szczepów mikroorganizmów, jak również do określenia położenia innych genów w genomie (tzw. mapy genowe). Markery morfologiczne cechy zewnętrzne organizmu, będące wynikiem ekspresji genów. Są łatwe do zaobserwowania, ale posiadają wiele wad (ograniczona liczba, mała ilość alleli, epistaza, wpływ środowiska). Markery DNA sekwencje DNA występujące w dwóch lub większej liczbie łatwych do rozróżnienia wersji (allelach). Stosunkowo łatwe do analizy (wiele technik detekcji). Dla wielu schorzeń i cech nie przypisano genów, które leżą u ich podstawy. Markery biochemiczne/molekularne są bezpośrednio oparte na właściwościach kwasów nukleinowych. Np. białka o zmienionej sekwencji, enzymy o zmienionej aktywności, zmieniony poziom związków drobnocząsteczkowych, będących wynikiem działania enzymów itp.

9 Geny jako markery molekularne Geny odpowiadające fenotypom rozróżnialnym wzrokowo Różne fenotypy = różne allele Muszka owocowa barwa ciała, kolor oczu geny koloru oczu czerwony, jasnoczerwony, cynober, kolor granatu, cielisty, sepia, szkarłat, różowy, purpura, bordo Markery biochemiczne allele wielokrotne w wielu istotnych genach Grupy krwi Białka immunologiczne antygeny leukocytów człowieka (HLA ang. Human leukocyte antigens) HLA-DRB1 59 alleli HLA-B 60 alleli

10 Geny jako markery molekularne Czasami markerem genetycznym może być stwierdzenie obecności danego genu lub cechy, którą on warunkuje. Przykłady: Markerem transformacji bakterii są geny nadające opornoć na antybiotyki oporność na antybiotyk oznacza posiadanie określonego genu wprowadzanego do komórki bakteryjnej podczas transformacji. Wykrywanie patogenów (wirusów, bakterii grzybów) warunkujących określone choroby może być wykonywane poprzez wykrywanie genów (sekwencji DNA) charakterystycznych dla danego patogenu. Wykazanie obecności danego genu wskazuje na obecność określonego. Zatem geny takie są markerami określonej choroby (np. SeptiTest).

11 Markery DNA/RNA Sekwencja DNA/RNA występująca w dwóch lub większej liczbie łatwych do odróżnienia wersji. Obecność sekwencji DNA/RNA lub jej brak wskazujący na określony stan fizjologiczny (np. zakażenie określonym patogenem. Obecność sekwencji w różnych wariantach jest wynikiem istnienia mutacji i polimorfizmów.

12 Polimorfizmy (mutacje) DNA Polimorfizm długości prostych sekwencji (ang. SSLP simple sequence length polymorphism) - minisatelity zmienna liczba powtórzeń tandemowych (ang. VNTR variable number of tandem repeats), jednostka powtarzana to kilkanaście lub kilkadziesiąt nukleotydów - mikrosatelity proste powtórzenia tandemowe (ang. STR simple tandem repeats lub SSR simple sequence repeats) jednostka powtarzana to 1 6 nukleotydów Polimorfizmy punktowe (ang. SNP single nucleotide polymorphism), pojedyncze mutacje punktowe

13 Sekwencje powtórzone 40% ludzkiego genomu rozproszone tandemowe krótkie (SINES) długie (LINES) minisatelity mikrosatelity nt kilka tys. nt nt 1 6 nt 10% genomu 20% genomu Alu 1 mln kopii kilka tys. loci co 6 10 kpz tworzenie par chromosomów są w centromerach: w centromerach homologicznych, rekombinacja sekwencja (GGAAT)n struktura chromosomów są w centromerach: sekwencja α, trwałość transkryptów, regulacja ekspresji

14 Inne typy polimorfizmów DNA RFLP (restriction fragment length polymorphism) polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych namnożonych w reakcji PCR. AFLP (Amplified fragment length polymorphism) polimorfizm długości powielonych fragmentów DNA cdna-aflp podobnie, jak AFLP, tylko materiałem do trawienia enzymem restrykcyjnym jest cdna.

15 RFLP (restriction fragment length polymorphism) polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych. Wykrywa polimorfizmy typu SNP i VNTR SNP VNTP

16 PCR-RFLP - polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych namnożonych w reakcji PCR. Bardzo wygodny w użyciu. Najczęściej jest to polimorfizm typu SNP.

17 AFLP (Amplified fragment length polymorphism) polimorfizm długości powielonych fragmentów DNA Wykrywa polimorfizmy typu SNP i VNTR. Szczególnie przydatny do wykrywania nowych polimorfizmów

18 cdna-aflp podobnie, jak AFLP, tylko materiałem do trawienia enzymem restrykcyjnym jest cdna. Wykrywa polimorfizmy typu SNP. Szczególnie przydatny do wykrywania polimorfizmów w sekwencjach ulegających ekspresji.

19 Polimorfizmy typu RFLP i AFLP to nie jest specjalna klasa polimorfizmów DNA. Są raczej wynikiem stosowania określonych technik do ich wykrywania!!!

20 Minisatelity Można je zapisać w postać motywu nukleotydów typu (TCAGGC) n ; Długość sekwencji powtórzonej: nukleotydów (najczęściej kilkadziesiąt); Wszystkie powtórzenia w tej samej orientacji; Ilość powtórzeń bywa bardzo różna (od kilku do 1000); Duża zmienność powtórzeń w populacji nadają się do identyfikacji poszczególnych osobników. Zmienność ilości powtórzeń jest generowana w wyniku błędów w rekombinacji.

21 Minisatelity HaeIII 5'-GGCC-3' Fragmenty restrykcyjne zawierające VNTR duża zmienność VNTR 17-pz powtórzony razy wykazuje różnorodność długości od 1.2 do 7.6 kpz

22 Trzy allele VNTR (A, B i C) u sześciu osób Trzy różne allele 3 układy heterozygotyczne i 3 homozygotyczne Dla n różnych alleli (n)x(n+1)/2 możliwych genotypów

23 Markery DNA biologiczny dowód tożsamości Polimorfizmy VNTR są idealnymi markerami wykorzystywanymi w medycynie sądowej i kryminalistyce. Dobrze nadają się do określania podobieństwa/pokrewieństwa pomiędzy dwoma próbkami DNA. Są pomocne np. w ustalaniu ojcostwa, sprawców gwałtów itp.

24 Markery DNA biologiczny dowód tożsamości

25 Kryteria, jakie muszą spełniać markery genetyczne stosowane w ekspertyzie sądowej

26 Sekwencje satelitarne w ustalaniu pokrewieństwa Ustalenie genetycznych cech śladu biologicznego jest dla sądów, prokuratury i policji ważnym i najbardziej obiektywnym dowodem, chociaż oficjalnie jest tylko dowodem pomocniczym. Ustalanie pokrewieństwa: łączenie rodzin, sprawy spadkowe, obowiązek alimentacyjny. Matka kobieta, która urodziła dziecko; ojciec mężczyzna wskazany przez matkę brak zgody sporne ojcostwo. Dzieci urodzone w związku małżeńskim: Jeżeli dziecko urodziło się w czasie trwania małżeństwa albo przed upływem 300 dni od jego ustania lub unieważnienia, domniemywa się, że pochodzi ono od męża matki. Zaprzeczenie ojcostwa wymaga wykazania niepodobieństwa, aby mąż matki dziecka mógł być ojcem tegoż dziecka. Dzieci urodzone poza małżeństwem: uznanie albo orzeczenie sądowe. Powództwo o ustalenie ojcostwa (jeden mężczyzna w jednym procesie): matka przedstawia fakty uprawdopodabniające ojcostwo danego mężczyzny, mężczyzna musi udowodnić, że niepodobieństwem jest aby był ojcem. Ekspertyza genetyczna jest zlecana przez sąd lub wykonywana na zlecenie prywatne jeśli zgadzają się na to prawni opiekunowie dziecka.

27 Uzasadnienie Sądu Najwyższego do wyroku z 2001 roku: Wynik badania DNA przeprowadzony przez uznaną placówkę naukową wyposażoną w nowoczesną aparaturę i opracowany, tzn. wyrażający w liczbach zarówno szansę, jak i prawdopodobieństwo ojcostwa pozwanego, odzwierciedla w sposób praktycznie pewny (co najmniej w tysięcznych częściach procentu) rzeczywiste związki biologiczne między parą rodzicielską a dzieckiem.

28

29 Lokalizacja markerów W sprawach kryminalnych stosuje się zazwyczaj 4 do 6 sond VNTR Markery VNTR rozróżniają do 30 alleli w jednym locus. Może istnieć genotypów w jednym locus. 6 markerów może dostarczyć aż do 4 trylionów różnych profili DNA

30 Częstotliwość występowania alleli VNTR D1S80 w populacji Jeśli dwa allele mają częstotliwości p i q w populacji, to dla osobnika heterozygotycznego prawdopodobieństwo P posiadania obu alleli wynosi: P= 2pq

31 Oczekiwana częstotliwość danego profilu DNA w populacji iloczyn prawdopodobieństw dla każdego locus Prawdopodobieństwo Profilu = (P1) (P2)... (Pn)

32 Diagnostyka prenatalna ofiar gwałtów ustalanie ojcostwa

33 DNA profiling SLS (ang. single locus system) analiza pojedynczego locus, analiza jednopunktowa Aby potwierdzić ojcostwo lub ustalić pokrewieństwo za pomocą SLS należy wykonać badania co najmniej 4 (7) niezależnych loci.

34 Opis sondy: - nazwa: Sondy D4S139 specyficzne locus na chromosomie 4 DNA chromosom precyzyjna lokalizacja sondy S unikatowy segment DNA Z fragment wysoce powtarzalny w danym miejscu F rodzina homologicznych fragmentów na licznych chromosomach - Sprzężenia ze znanymi loci - Liczba alleli - Typ dziedziczenia - Częstość mutacji i rekombinacji - Wielkość w liczbie par zasad

35 DNA fingerprinting MLS (ang. multilocus system) jednoczesna analiza wielu loci, analiza wielopunktowa Jeffreys, 1985 DNA trawiono enzymem HinfI, zastosowano sondę (CAC) 5

36 Sondy wielu loci Sondy Jeffreysa i 33.6 wielokrotne powtórzenie sekwencji 16 i 37 zasad, pochodzą z genu mioglobiny ludzkiej dziedziczonych alleli - hybrydyzują z prążkami - stosowane razem pozwalają zbadać 35 niezależnie % oznaczanych alleli jest wspólnych dla osób niespokrewnionych, a 62% dla rodzeństwa niejednojajowego Sonda MZ1.3 dziki fag M13 Sondy oligonukleotydowe (CAC) 5, (GTG) 5 i (GACA) 4 hybrydyzują z krótkimi powtarzalnymi sekwencjami leżącymi w wielu miejscach genomu

37 Szansa powtórzenia się wzoru fragmentów oznaczanych sondą MZ1.3 u dwóch niespokrewnionych osób wynosi 1 na 6x10 12

38 DNA trawiono HinfI, Hybrydyzacja z sondą MZ1.3 Długość żelu 140 mm Grubość prążka 1.4 mm 100 stref elektroforetycznych W każdej strefie jedna z 8 kombinacji prążków Współczynnik wartości prążków wspólnych BSR (band sharing rate): BSR AB = S AB /2 x (1/n A +1/n B ) x 100% BSR dla osób niespokrewnionych: do 45% Dla par rodzic-dziecko: 35 85% Jeśli BSR powyżej 45% - uznanie ojcostwa, poniżej 35% - wykluczenie 1 pozwany, 2 dziecko, 3 matka, 4 DNA pozwanego i dziecka BSR = 28% BSR = 65%

39 Próba wykorzystania VNTR jako markera zwiększonego ryzyka wystąpienia defektów centralnego układu nerwowego (ang. NTD neural tube defect) NTD - poważne defekty polegające na niedorozwoju mózgu, rdzenia kręgowego i tkanek okrywających te organy. - wynikają z niekompletnego zamknięcia cewki nerwowej, które powinno nastąpić w 3 i 4 tygodniu ciąży. - rozszczep kręgosłupa bardzo częsty defekt, w USA dotyka jednego na 1000 noworodków. Przyczyny NTD Zaburzony metabolizm homocysteiny - dzieci chore i ich matki mają podwyższony poziom homocysteiny kwas foliowy MTHFR homocysteina CBS MTHFR metylenetetrahydrofolate CBS cystathionine β-synthase metionina cystationina

40 Mutacje w genach kodujących MTHFR i CBS MTHFR 677 C > T zmniejszona aktywność MTHFR podwyższony poziom homocysteiny CBS 31 pz VNTR powtórzenie o długości 31 pz, którego liczba powtórzeń osiąga 15-21, - 18 powtórzeń to najpowszechniejszy allel - aktywność CBS maleje wraz ze wzrostem liczby powtórzeń - poziom homocysteiny rośnie Czy te mutacje mogą być markerami zwiększonego ryzyka NTD?

41 Zaobserwowano wyraźny związek między CBS VNTR i polimorfizmem MTHFR 677 C>T a poziomem homocysteiny, ale nie ma korelacji z ryzykiem NTD.

42 Polimorfizmy VNTR w genie DRD4 oraz w promotorze genu 5HTT a osobowość DRD4 receptor dopaminowy D4 - w egzonie 3 genu DRD4 występuje zmienna liczba powtórzeń o długości 48 pz (48 pz VNTR) - najpowszechniejsza forma genu zawiera 4 powtórzenia, nieco rzadsza jest forma posiadająca 7 powtórzeń - występowanie 7 powtórzeń jest skorelowane z 2-3- krotnym spadkiem wiązania receptora z cyklazą adenylową 5HTT gen transportera serotoniny - w promotorze tego genu występuje 22 pz VNTR - dwa warianty: długi 16 powtórzeń częsty krótki 14 powtórzeń - forma krótka powoduje zmniejszenie wydajności transkrypcji genu transportera serotoniny i wiązania receptora z serotoniną

43 Dopamina należy do neurotransmiterów katecholaminowych (epinefryna, norepinefryna, L-dopa) - nadprodukcja dopaminy w mózgu oraz nadwrażliwość receptorów powoduje objawy psychotyczne i schizofrenię - niedobór choroba Parkinsona - receptor D4 inhibicja cyklazy adenylowej, Serotonina należy do grupy neurotransmiterów aminokwasowych i ich pochodnych - działa poprzez receptor związany z białkiem G - powoduje gwałtowny wzrost stężenia camp w komórce - wiele leków antydepresyjnych (Prozac) hamuje zwrotne wychwytywanie serotoniny w efekcie w synapsach jest więcej serotoniny

44 Novelty seeking osoby wykazujące tę cechę są ciekawe świata, łatwo się nudzą, są impulsywne, ekstrawaganckie, nieuporządkowane Externalizing behavior agresja wobec przedmiotów i osób, kłótliwość, skłonność do kradzieży, kłamstwa, oszukiwania, brak samokontroli, niezdolność do rozwijania i utrzymywania satysfakcjonujących relacji z ludźmi

45 Allele DRD4 i 5HTT a osobowość Kombinacja allelu DRD4 zawierającego 7 powtórzeń i przynajmniej jednego długiego allelu 5HTT koreluje ze wzrostem współczynnika poszukiwania nowości (ang. novelty seeking) Brak allelu DRD4 zawierającego 7 powtórzeń przy jednoczesnej homozygotyczności pod względem krótkiego allelu 5HTT gorsza orientacja, większa skłonność do złości Krótki allel 5HTT koreluje z negatywnymi cechami emocjonalności Allel DRD4 zawierający 7 powtórzeń zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia zespołu niedoboru koncentracji i nadpobudliwości (ang. ADHD attention deficit/hyperactivity disorder) Allel DRD4 zawierający 7 powtórzeń występuje częściej u rocznych dzieci, które nie mają dobrego kontaktu z matką Dzieci posiadające dwa długie allele 5HTT wykazywały częściej externalizing behavior jeśli ich rodzice byli nieprzystosowani do funkcjonowania w społeczeństwie Jeden bądź dwa krótkie allele 5HTT sprzyjają externalizing behavior jeśli w rodzinie występował alkoholizm