MIKROBIOLOGICZNE TRANSFORMACJE ZWIĄZKÓW BIOLOGICZNIE CZYNNYCH POCHODZĄCYCH Z CHMIELU ORAZ ICH POCHODNYCH

Transkrypt

1 Tomasz Tronina MIKRBILGICZNE TRANSFRMACJE ZWIĄZKÓW BILGICZNIE CZYNNYCH PCHDZĄCYCH Z CHMIELU RAZ ICH PCHDNYCH Praca doktorska wykonana w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu pod kierunkiem dr hab. inż. Ewy Huszczy WRCŁAW 2012

2 Z ogromną przyjemnością składam serdeczne podziękowania Pani dr hab. inż. Ewie Huszczy za wszelką pomoc, poświęcony czas, cenne rady i sugestie, które okazały się niezwykle istotne w trakcie przygotowywania niniejszej rozprawy. Dziękuję również za cierpliwość, entuzjazm i okazane mi wsparcie.

3 Wyrazy podziękowania składam Pani dr hab. Joannie Wietrzyk oraz Pani mgr inż. Beacie Filip-Psurskiej i Pani mgr. inż Magdalenie Milczarek z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej im. Ludwika Hirszfelda PAN we Wrocławiu za wykonanie testów biologicznych wobec komórek nowotworowych. Dziękuję Panu mgr. inż. Pawłowi Dąbrowskiemu oraz Panu dr. Sławomirowi Paluchowi za wykonanie analiz NMR. Dziękuję Panu mgr Markowi Jonowi za wykonanie widm masowych Wyrazy podziękowania kieruję do moich koleżanek i kolegów z laboratorium: Agnieszki Bartmańskiej, Jarka Popłońskiego, Ani Madej, Pawła Mituły, Witka Gładkowskiego, Tomka Janeczko, li Grudniewskiej, Asi Nowak, Pawła Seiferta i Krzyśka Solarza. Jestem Wam niezmiernie wdzięczny za niezwykle miłą atmosferę panującą w trakcie realizacji pracy, twórcze dyskusje i chęci wspólnego pokonywania przeciwności.

4 Szczególne podziękowania składam Rodzicom za Wasz trud, wsparcie i niewyczerpalną wiarę we mnie. Kasi, osobie najbliższej memu sercu, za cierpliwość, wyrozumiałość, ogromne wsparcie, entuzjazm i wszelką pomoc... Dziękuję

5 Część badań zamieszczonych w pracy doktorskiej była współfinansowana przez Unię Europejską z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach projektu Biotransformacje użyteczne w przemyśle farmaceutycznym oraz kosmetycznym Nr PIG /158/09 oraz przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego ze środków na naukę w ramach projektu badawczego Nr N N

6 SPIS TREŚCI WYKAZ SKRÓTÓW STRESZCZENIE WPRWADZENIE I CEL PRACY BUDWA RAZ KLASYFIKACJA FLAWNIDÓW BILGICZNA I CHEMICZNA SYNTEZA KSANTHUMLU Biosynteza ksantohumolu Chemiczna synteza ksantohumolu WŁAŚCIWŚCI BILGICZNE KSANTHUMLU Właściwości przeciwnowotworowe Faza inicjacji nowotworu Faza promocji nowotworu Faza progresji nowotworu Właściwości przeciwdrobnoustrojowe, antymalaryczne i przeciwwirusowe Właściwości przeciwutleniające Właściwości przeciwzapalne BITRANSFRMACJE FLAWNIDÓW Mikrobiologiczne transformacje flawonoidów Biotransformacje flawonoidów chmielowych MÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Syntezy chemiczne trzymywanie (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu trzymywanie chalkonaringeniny Badanie stabilności subtratów do biotransformacji Mikrobiologiczne transformacje ksantohumolu Selekcja drobnoustrojów Preparatywne transformacje ksantohumolu Transformacja ksantohumolu przez Absidia coerulea AM 93 oraz Rhizopus nigricans UPF Transformacja ksantohumolu przez Mortierella mutabilis AM Transformacja ksantohumolu przez Baeuveria bassiana AM Transformacja ksantohumolu przez Apergillus ochraceus AM Transformacja ksantohumolu przez Penicillium albidum AM Transformacja ksantohumolu przez Fusarium tricinctum AM Transformacja ksantohumolu przez Fusarium avenaceum AM 11 oraz Fusarium oxysporum AM Transformacja ksantohumolu przez Spicaria fusispora AM Mikrobiologiczne transformacje (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu Selekcja drobnoustrojów Transformacja (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu przez Absidia glauca AM Transformacja (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu przez Baeuveria bassiana AM Transformacja (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu przez Penicillium chermesinum AM

7 7.5. Biotransformacje ksantohumolu przez Absiadia glauca AM 93 prowadzone w bioreaktorze mieszadłowym Reakcje fotochemiczne ksantohumolu Dobór rozpuszczalnika Reakcja fotochemiczna ksantohumolu w skali preparatywnej Aktywność biologiczna Właściwości przeciwutleniające Właściwości przeciwnowotworowe PDSUMWANIE CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA Zastosowane metody Substraty do transformacji mikrobiologicznych Ksantohumol (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauron Chalkonaringenina Badania stabilności substratów do reakcji biotransformacji Transformacje mikrobiologiczne Substraty wykorzystane w biotransformacjach Podłoża hodowlane Mikroorganizmy Badania selekcyjne Metody hodowli Hodowle selekcyjne Hodowle preparatywne Hodowle w bioreaktorze mieszadłowym Inokulum Namnażanie hodowli w bioreaktorze mieszadłowym Biotransformacje ksantohumolu w bioreaktorze mieszadłowym Reakcje fotochemiczne Dobór rozpuszczalnika w reakcji fotochemicznej ksantohumolu Reakcja fotochemiczna ksantohumolu w skali preparatywnej Aktywność biologiczna znaczanie właściwości przeciwutleniającej znaczanie aktywności cytotoksycznej wobec komórek nowotworowych Metody statystyczne Produkty biotransformacji ksantohumolu Produkty biotransformacji (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu Produkty reakcji fotochemicznej ksantohumolu LITERATURA

8 WYKAZ SKRÓTÓW A-2780 komórki ludzkiego nowotworu jajnika AML12 ludzkie prawidłowe komórki wątroby BVDV wirus biegunki bydła i choroby błon śluzowych C4-2 komórki ludzkiego nowotworu gruczołu krokowego CMV cytomegalowirus CSY ang. correlation spectroscopy CX-1 konstytutywna cyklooksygenaza CX-2 indukowana cyklooksygenaza CSFV wirus klasycznego pomoru świń CYP 450 cytochrom P450 DEPT ang. distortionless enhancement by polarization transfer DMAPP difosforan dimetylaallilu (22) DPPH 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl DU 145 komórki ludzkiego nowotworu gruczołu krokowego DXN dezmetyloksantohumol (23) ERD -demetylaza-7-etoksyrezorufiny FRAP test oceny siły redukujacej jony żelaza FRTL-5 ludzkie prawidłowe komórki tarczycy Glu-XN 4 --β-d-glukozyd ksantohumolu (129) HA22T/VGH komórki ludzkiego nowotworu wątroby HCT-166 komórki ludzkiego nowotworu okrężnicy HCV wirus zapalenia wątroby typu C Hep3B komórki ludzkiego nowotworu wątroby Hepa 1c1c7 mysie komórki ludzkiego nowotworu wątroby HIV-1 ludzki wirus niedoboru odporności HMBC ang. heteronuclear multiple-bond correlation spectroscopy HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa HSV-1 wirus opryszki pospolitej HSV-2 wirus opryszczki pospolitej HT-29 komórki ludzkiego nowotworu okrężnicy IFN-γ interferon gamma IL-12 interleukina 12 ins syntaza tlenku azotu (II) IQ 2-amino-3-metyloimidazo[4,5-f]chinolina IκBα białko inhibitorowe kompleksu NF-κB LNCaP komórki ludzkiego nowotworu gruczołu krokowego LPS lipopolisacharyd MCF-7 komórki ludzkiego nowotworu gruczołu sutkowego mhrpc przerzutowy hormonoodporny rak gruczołu krokowego NF-κB jądrowy czynnik transkrypcyjny kappab RAC test całkowitej zdolności zmiatania wolnych rodników tlenowych PARP-1 polimeraza 1 poli(adp-rybozy) PC-3 komórki ludzkiego nowotworu gruczołu krokowego RAW komórki mysich makrofagów SIN-1 3-morfolino-sydnonimina Sk-Br-3 komórki ludzkiego nowotworu piersi SAC test zdolności do neutralizacji tlenu singletowego SD test zdolności zmiatania rodników ponadtlenkowych t-bhp wodornatlenek tert-butylu TLC cienkowarstwowa chromatografia cieczowa UDP-glukoza urydynodifosfoglukoza UGPaza pirofosforylaza UDP-glukozy UTP urydynotrifosforan VEGF czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego XN ksantohumol (24) 8

9 Streszczenie 1. STRESZCZENIE W wyniku mikrobiologicznych transformacji ksantohumolu (24) otrzymano dziesięć pochodnych, z których dwie: auron 157 oraz α,β-dihydrochalkon 159 są związkami nowymi, nieopisanymi dotąd w literaturze. Biotransformacja ksantohumolu (24) przez grzyby Fusarium tricinctum AM 16 okazała się nowym sposobem otrzymywania α,βdihydroksantohumolu (158), występujacego w śladowych ilościach w chmielu zwyczajnym (Humulus lupulus). Do otrzymywania (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu (156) zastosowano po raz pierwszy metodę z wykorzystaniem octanu rtęci (II) w pirydynie, co pozwoliło 10- krotnie zwiększyć wydajność otrzymywania tego związku w porównaniu do sposobu innych badaczy. Efektem mikrobiologicznych transformacji (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7- prenyloauronu (156) były 3 pochodne ( ), będące związkami nowymi. Na drodze fotochemicznych przekształceń ksantohumolu (24) otrzymano dwie pochodne o szkielecie α,β-dihydrochalkonu (163 i 164), które są związkami nowymi. Substraty oraz produkty otrzymane w wyniku mikrobiologicznych bądź fotochemicznych przekształceń poddano badaniom na aktywność przeciwutleniającą oraz antyproliferacyjną w stosunku do linii ludzkich nowotworów: gruczołu sutkowego (MCF-7), gruczołu krokowego (PC-3) oraz okrężnicy (HT-29). Dwie pochodne ksatohumolu (129 i 157) posiadały silniejsze zdolności do zmiatania wolnego rodnika DPPH niż wyjściowy substrat, przy czym auron 157 okazał być się aż 8,6 razy efektywniejszym antyoksydantem niż ksantohumol (24) i 2,3 razy niż L-kwas askorbinowy, który powszechnie uznawany jest za silny przeciwutleniacz. Trzy związki (24, 156, 158) wykazywały silniejszą aktywność antyproliferacyjną wobec linii MCF-7 niż referencyjna, wykorzystywana w terapii antynowotworowej cisplatyna. W stosunku do linii PC-3 tylko ksantohumol (24) był efektywniejszym inhibitorem wzrostu niż cisplatyna, natomiast wobec odpornego na działanie leków nowotworu okrężnicy linii HT-29 aż 10 związków posiadało wyższą aktywność inhibicyjną niż ksantohumol (24). Ponadto znaczna ilość badanych związków wykazywała wysoką aktywność cytotoksyczną wobec testowanych linii nowotworowych. 9

10 Wprowadzenie i cel pracy 2. WPRWADZENIE I CEL PRACY Flawonoidy stanowią liczną grupę wtórnych metabolitów szeroko występujących w świecie roślin, w których pełnią wiele ważnych funkcji. Mają istotny wpływ na wzrost i rozwój rośliny, na ekspresje różnych genów, fotoczułość oraz transfer energii, chronią przed negatywnym działaniem promieniowania ultrafioletowego, przed infekcjami bakteryjnymi oraz grzybicznymi, a także nadają barwę owocom i kwiatom [1-6]. prócz funkcji fizjologicznych, jakie pełnią w wytwarzających je roślinach, związki te stanowią ważny składnik diety chroniąc również organizm ludzki, w szczegołnosci serce i układ krążenia, działając przeciwzapalnie, przeciwutleniająco i przeciwnowotworowo, [7-9]. Z tego względu cieszą się niesłabnącym zainteresowaniem naukowców oraz przemysłu farmaceutycznego, spożywczego i kosmetycznego. Wiele naturalnych flawonoidów posiada w swej strukturze dodatkowe ligandy w postaci grup prenylowych, czy geranylowych, co w znaczący sposób wpływa na ich właściwości biologiczne. Jednym z niezwykle aktywnych prenylowanych chalkonów jest biosyntetyzowany wyłącznie przez chmiel zwyczajny (Humulus lupulus) oraz azjatycką roslinę Sophora flavescens ksantohumol (24). Związek ten wykazuje m.in działanie przeciwnowotworowe, przeciwutleniające, przeciwzapalne, przeciwirusowe oraz przeciwmalaryczne [10-15]. Tanim i bogatym źródłem ksantohumolu, jest poekstrakcyjny odpad chmielowy wychmieliny. Powstają one podczas ekstrakcji szyszek chmielowych w celu otrzymania bogatych w kwasy gorzkie oraz olejki eteryczne ekstraktów dodawanych do piwa w celu nadania mu charakterystycznego aromatu i gorzkiego smaku. Wykorzystywane do ekstrakcji dwutlenek węgla w stanie nadkrytycznym słabo rozpuszcza flawonoidy zawarte w szyszkach przez pozostają one w materiale odpadowym wychmielinach, skąd można je w praktyczny sposób izolować. W Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu od lat prowadzone są badania nad mikrobiologiczną funkcjonalizacją związków biologicznie czynnych pochodzenia naturalnego, w tym głównie steroidów i terpenoidów, a ostatnio również flawonoidów. Wykorzystanie biotransformacji jako narzędzia funkcjonalizacji cząsteczek stwarza możliwość otrzymania pochodnych, które w przyrodzie występują w niewielkich ilościach, oraz nowych analogów w ilościach umożliwiających nie tylko określenie ich 10

11 Wprowadzenie i cel pracy struktury, ale również przeprowadzenie badań biologicznych. Biotransformacje często są źródłem pochodnych o zwiększonej aktywności biologicznej, a co za tym idzie efektywniejszym działaniu terapeutycznym w stosunku do wyjściowych substratów. Ponadto zgodnie z prawem Unii Europejskiej (dyrektywa EU 88/388/EEC) produkty otrzymane w wyniku biotransformacji związków naturalnych uznawane są również jako naturalne. Pierwszym celem niniejszej pracy doktorskiej było otrzymanie pochodnych o interesujących i użytecznych właściwościach biologicznych na drodze mikrobiologicznych oraz fotochemicznych przekształceń ksantohumolu (24). Realizacja tego celu obejmowała zakrojone na szeroką skalę badania selekcyjne w celu wyłonienia drobnoustrojów zdolnych do transformacji ksantohumolu (24), obejmujące organizmy należące do grzybów strzępkowych, drożdży oraz bakterii, z których najefektywniejsze wykorzystano w biotransformacjach preparatywnych. Ponadto prowadzenie reakcji fotochemicznych ksantohumolu (24) w różnych rozpuszczalnikach w fotoreaktorze wyposażonym w średniociśnieniową lampę próżniową (125 W) jako generator promieniowania oraz filtr wykonany ze szkła borowo-krzemowego (Pyrex). Szerokie spektrum aktywności biologicznych wyjściowego substratu było podstawą do przeprowadzenia badań biologicznych otrzymanych pochodnych w kierunku aktywności przeciwutleniającej oraz antyproliferacyjnej wobec trzech linii ludzkich komórek nowotworu gruczołu sutkowego (MCF-7), gruczołu krokowego (PC-3) oraz okrężnicy (HT- 29), co było drugim celem niniejszej pracy doktorskiej. Auron 157 posiadający w swej strukturze dwie grupy hydroksylowe przy pierścieniu B otrzymany na drodze mikrobiologicznej transformacji ksantohumolu (24) przez Aspergillus ochraceus AM 456, wykazywał ponad 8,5-krotnie wyższą zdolność do zmiatania wolnego rodnika DPPH od wyjściowego substratu. Stało się to inspiracją do syntezy pochodnej ksantohumolu o szkielecie auronu, posiadającej jedną grupę hydroksylową w pozycji para w pierścieniu B i wyznaczenia kolejnego celu pracy doktorskiej. Mikrobiologiczne transformacje otrzymanego na drodze chemicznej auronu 156, a następnie określenie aktywności biologicznej produktów stały się więc kolejnym celem niniejszej pracy. Przeprowadzono badania selekcyjne, na podstawie których wyłoniono drobnoustroje wykorzystane następnie w biotransformacjach preparatywnych. Auron 156 oraz jego 11

12 Wprowadzenie i cel pracy metabolity poddano tym samym badaniom na aktywność biologiczną, co mikrobiologiczne i fotochemiczne pochodne ksantohumolu (24). kreślenie wpływu czynników strukturalnych, a w szczególności grupy prenylowej oraz cukrowej na aktywność biologiczną otrzymanych pochodnych ksantohumolu (24) oraz auronu 156, stało się ostatnim celem, wypływającym naturalnie z wcześniej postawionych zadań i wieńczącym jednocześnie dotychczasowe dokonania. 12

13 Budowa oraz klasyfikacja flawonoidów 3. BUDWA RAZ KLASYFIKACJA FLAWNIDÓW Jedne z pierwszych doniesień na temat flawonoidów pochodzą z początku dwudziestego wieku. Węgierscy naukowcy którym przewodził laureat Nagrody Nobla Albert Szent-Györgyi zaobserwowali wówczas, iż w niektórych owocach, a w szczególności cytrusowych, wraz z witaminą C występują substancje zwiększających właściwości przeciwszkorbutowe kwasu askorbinowego. W 1936 roku udało się odseparować owe związki od witaminy C i nadano im nazwę witamina P [16]. Późniejsze badania, dowiodły, że pomimo ich bardzo pozytywnego wpływu na organizm ludzki, nie są substancjami niezbędnymi do jego prawidłowego funkcjonowania i w miejsce terminu witamia P zaproponowano nową nazwę bioflawonoidy. Dziś znanych jest ponad 8000 związków należących do tej grupy, występujących naturalnie, w różnych części roślin, owocach, nasionach, kwiatach, łodydze oraz korze. Termin flawonoidy określa szeroką grupę naturalnych związków posiadających w swojej budowie szkielet, w którym dwa pierścienie aromatyczne A i B połączone są trójwęglowym fragmentem, tworzącym najczęściej dodatkowy heterocykliczny pierścień C, który wraz z pierścieniem A tworzy układ chromanu (dihydrobenzopiranu) bądź chromenu (benzopiranu). W zależności od pozycji przyłączenia aromatycznego pierścienia B do pochodnej benzopiranu flawonoidy wg zaleceń IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) możemy podzielić na trzy główne klasy: flawonoidy, izoflawonoidy oraz neoflawonoidy [17, 18] (Ryc. 1). Natomiast flawonoidy nie mające układu chromanu lub chromenu określa się mianem flawonoidy drugorzędowe [18] A 5 C ' 3' B 6' 4' 5' A C 3 B A C 4 B flawonoidy izoflawonoidy neoflawonoidy Rycina 3.1. Podział flawonoidów ze względu na podstawowy szkielet węglowy [18] 13

14 Budowa oraz klasyfikacja flawonoidów Ze względu modyfikacje struktury podstawowej (stopień utlenienia pierścienia heterocyklicznego) główne klasy flawonoidów podzielono dodatkowo na podklasy (Ryc ). A C * B * flawan flawon flawanon H * * H * * H flawonol dihydroflawonol flawan-3-ol * * H * * * H H flawan-4-ol flawan-3,4-diol * centrum stereogeniczne Rycina 3.2. Podklasy flawonoidów o szkielecie 2-fenylobenzopiranu [18] W literaturze jako podklasa flawonoidów, dość powszechnie spotykane są również antocyjanidyny [1, 19-24], będące pochodnymi jonu flawyliowego. + jon flawyliowy 14

15 Budowa oraz klasyfikacja flawonoidów * * izoflawan izoflawon izoflawanon a 9 D C * B * 10 * * 12a H 1 izoflaw-3-en izoflawanol rotenoid 5 A A B * 6a a C D kumestan 3-arylokumaryna kumaronochromen * * A B * 11a 6a * C D kumaronochromon pterokarpan * centrum stereogeniczne Rycina 3.3. Podklasy flawonoidów o szkielecie 3-fenylobenzopiranu (izoflawonoidów) [18] * 4-arylokumaryna 3,4-dihydro-4-arylokumaryna neoflawen * centrum stereogeniczne Rycina 3.4. Podklasy flawonoidów o szkielecie 4-fenylobenzopiranu (neoflawonoidów) [18] Flawonoidy odbiegające strukturalnie od wyżej wymienionych klas głównych, nie mające w swej strukturze układu benzopiranu, często określane są mianem flawonoidów drugorzędowych (Ryc. 3.5). Do grupy tej należą ważne z punktu widzenia biosyntezy prekursory wszystkich klas związków flawonoidowych 2 -H-chalkony, oraz ich pochodne 15

16 Budowa oraz klasyfikacja flawonoidów 2 -H-dihydrochalkony, 2 -H-retro-chalkony oraz aurony i ich utlenione pochodne auronole. Chalkony i dihydrochalkony nie posiadają heterocyklicznego pierścienia C, lecz trójwęglowy acykliczny fragment łączący pierścienie aromatyczne A i B, aurony i auronole posiadają z kolei w swej strukturze układ benzofuranu. B 2' H A 2' H H 2' H 2 -H-chalkon 2 -H-dihydrochalkon 2 -H-retro-chalkon B A auron * H auronol * centrum stereogeniczne Rycina 3.5. Flawonoidy drugorzędowe [18] Poszczególne klasy flawonoidów zostały zatem wyróżnione na podstawie miejsca przyłączenia pierścienia aromatycznego B do układu benzopiranu lub odmiennej budowy jednostki C 3, natomiast podklasy ze względu na stopień utlenienia pierścienia heterocyklicznego C. Z kolei przedstawiciele danej podklasy różnią się między sobą rodzajem oraz pozycją przyłączenia podstawników w pierścieniach aromatycznych. Zróżnicowanie wynika głównie z ogólnej liczby oraz położenia grup hydroksylowych. Grupy te dodatkowo mogą podlegać reakcjom -metylacji, acylacji czy sulfatacji. Ponadto większość występujących w przyrodzie flawonoidów to glikozydy. Glikozylacja odbywa się przez przyłączenie reszty cukrowej do grupy hydroksylowej, jak również bezpośrednio do atomu węgla w szkielecie flawonoidowym. Najpowszechniej występującym cukrem w cząsteczkach flawonoidów jest glukoza, często obserwuje się również: galaktozę, ramnozę, arabinozę, rutynozę (glukoramnozę) i ksylulozę. Wiele znanych flawonoidów posiada dodatkowo grupy alkilowe, najczęściej prenylową bądź geranylową, które z kolei mogą ulegać rozmaitym reakcjom, co często prowadzi do ich cyklizacji, poszerzając tym samym jeszcze bardziej tą ciekawą grupę związków. 16

17 Budowa oraz klasyfikacja flawonoidów Szczególną grupę flawonoidów stanowią również ich polimerowe formy, zwane taninami, zbudowane głównie z jednostki flawan-3-olu, których masa cząsteczkowa często przekracza 1000 Da [18]. 17

18 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu 4. BILGICZNA I CHEMICZNA SYNTEZA KSANTHUMLU 4.1. Biosynteza ksantohumolu Biosynteza flawonoidów jest prawdopodobnie najlepiej poznaną ścieżką syntezy roślinnych metabolitów wtórnych i stanowi część większego szlaku fenylopropanoidów, prowadzących do otrzymywania kwasów fenolowych, lignin, lignanów oraz stylbenów [19]. W ostatniej dekadzie, dzięki postępowi w biologii molekularnej oraz inżynierii genetycznej, udało się określić poszczególne enzymy biorące udział w biosyntezie tych związków. Najlepiej poznanymi szlakami są biosynteza flawonów, flawonoli, izoflawonoidów oraz barwnych antocyjanów, które mają szerokie zastosowanie w przemyśle spożywczym i kosmetycznym, jako naturalne barwniki, oznaczane symbolem E163 [19]. Prekursorami w biosyntezie flawonoidów są 4-kumaroilo-CoA (4) oraz malonylo-coa (5) (Ryc ). Pierwszy powstaje z aminokwasu aromatycznego L-fenyloalaniny (1), drugi zaś z acetylo-coa (6). W wyniku reakcji nieoksydatywnej deaminacji, katalizowanej przez amoniakoliazę fenyloalaninową (PAL), L-fenyloalanina (1) przekształcana jest do kwasu trans-cynamonowego (2). Związek ten przy udziale 4-hydroksylazy kwasu cynamonowego (C4H) ulega reakcji hydroksylacji do kwasu p-kumarowego (3), który w obecności ligazy 4- kumarylo-coa (4CL) przekształcany jest do 4-kumaroilo-CoA (4). W wyniku kondensacji 4- kumaroilo-coa (4) z trzema cząsteczkami malonylo-coa (5), katalizowanej przez syntazę chalkonową (CHS), powstaje chalkonaringenina (8), nazywana również chalkonem naringeniny (2,4,4,6 -tetrahydoksychalkon). Związek ten jest prekursorem pozostałych klas flawonoidów [19]. trzymany w ten sposób chalkon (8) w wyniku reakcji katalizowanej przez izomerazę chalkonową (CHI) przekształcany jest w (2S) naringeninę (11), która jest intermediatem w biosyntezie m.in. flawonów, flawonoli, dihydroflawonoli, flawan-3-oli oraz flawan-4-oli [25]. 18

19 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu H NH 2 fenyloalanina (1) PAL C4H 4CL H H kwas cynamonowy (2) H H kwas p-kumarowy (3) ACC acetylo-coa (6) 3x malonylo-coa (5) H AUS H H CoA 4-kumaroilo-CoA (4) H CHS H stylbeny STS 3x malonylo-coa (5) CHS + PKR H H H H izolikwirytygenina (6) 6'-deoksychalkon AUS? H H H aureuzydyna (7) auron H H chalkonaringenina (8) chalkon CHI H hispidol (9) auron H FNS I FNS II H FNR H H H H apigenina (10) flawon H H FLS H H naringenina (11) flawanon F3H H H H H H apiforol (12) ANS + H H kemferol (13) flawonol H H dihydrokemferol (14) dihydroflawonol DFR H H apigenidyna (15) 3-deoksyantocyjanidyna H H H H H H H H H H 2-flawen-2,3-diol (16) H 3-flawen-2,3-diol (18) (pseudozasada) F3GT Glc H H 3--glukozyd 3-flawen-2,3-diolu (20) ANS -H 2 +H 2 H H H H H H H + + H leukopelargonidyna (17) leukoantocyjanidyna ANS H pelargonidyna (19) antocyjanidyna F3GT Glc H H 3--glukozyd pelargonidyna (21) antocyjanina PAL amoniakoliaza fenyloalanowa C4H 4-hydroksylaza kwasu cynamonowego 4CL ligaza 4-kumarylo-CoA STS syntaza stylbenowa CHS syntaza chalkonowa PKR reduktaza poliketydowa AUS syntaza aurezydynowa CHI izomeraza chalkonowa FNS I syntaza flawonowa I FNS II syntaza flawonowa II FNR 4-reduktaza flawanonowa F3H 3β-hydroksylaza flawanonowa FLS syntaza flawonolwa ANS syntaza antocyjanidynowa DFR 4-reduktaza dihydroflawonolowa F3GT UDP-zależna 3--glukozylotransferaza antocyjanidynowa Rycina Główny szlak biosyntezy fenylopropanoidów i flawonoidów [19] 19

20 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu Głównym prenylowanym flawonoidem występującym w chmielu (Humulus lupulus L.) jest ksantohumol (3 -[3,3 -dimetyloallilo]-2,4,4-trihydroksy-6 -metoksychalkon) (24) [26-28]. Enzymy odpowiedzialne za biosyntezę ksantohumolu oraz innych prenylowanych flawonoidów obecne są wyłącznie w gruczołach lupulinowych, zlokalizowanych w kwiatostanach żeńskich szyszkach chmielowych [27]. Gruczoły te wydzielają żywicę bogatą w gorzkie kwasy (humulony i lupulony), olejki eteryczne oraz prenylowane flawonoidy chmielowe [28]. becność terpenofenoli, takich jak humulony czy prenyloflawonoidy, związana jest prawdopodobnie z obroną chmielu przed owadami żywiącymi się szyszkami oraz ich nasionami [27]. Udowodniono, iż gorzkie kwasy wykazują silną aktywności antyfidantą oraz owadobójczą [29, 30], natomiast wciąż niewiele wiadomo o takim działaniu prenyloflawonoidów [27], chociaż ich obecność w gruczołach lupulinowych kwiatostanów żeńskich sugeruje taką aktywność. Przemawia za tym również fakt, iż inne terpenofenole, takie jak psychoaktywne kannabinoidy, zlokalizowane w przylistkach żeńskich kwiatów konopi, czy prenylowane floroglucinole, takie jak hyperkalina A, obecne w kwiatach dziurawca kielichowatego (Hypercium calycinum), chronią żeńskie narządy płciowe przed zwierzętami roślinożernymi [27]. Pierwszym etapem biosyntezy ksantohumolu (24) jest kondensacja p-kumaroilokoenzymu A (4) z trzema cząsteczkami malonylo-koenzymu A (5) do chalkonaringeniny (8) katalizowana przez syntazę chalkonową (CHS E.C ) (Ryc ). Etap ten jest kluczowy w biosyntezie flawonoidów, a otrzymany w ten sposób chalkon (8) ulega izomeryzacji do flawanonu (2S)-naringeniny (11), która z kolei stanowi prekursor dla syntezy innych klas flawonoidów (Ryc ). W przypadku biosyntezy ksantohumolu (24) enzymatyczna prenylacja oraz metylacja w pierścieniu A hamują tworzenie flawanonu [27]. Prenylacja w pozycji C3 odbywa się przy udziale difosforanu dimetyloallilu (DMAPP) (22), w efekcie czego powstaje dezmetyloksantohumol (23), w którym grupa hydroksylowa w pozycji 6 ulega następnie enzymatycznej metylacji, co z kolei prowadzi do powstania ksantohumolu (24). becność dezmetyloksantohumolu (23) w szyszkach chmielowych w ilości od 0,05 do 0,3% [31, 32] sugeruje, iż prenylacja ma miejsce przed -metylacją [27], niemniej mechanizm tych dwóch reakcji nie został do końca poznany. Naukowcy dopuszczają możliwość pierwszeństwa reakcji -metylacji nad prenylacją, gdyż to ona w znaczący sposób uniemożliwia tworzenie naringeniny (11) z chalkonaringeniny (8). Potwierdzeniem tego faktu, może być wyizolowana z amerykańskiej odmiany chmielu Galena flawokawina 20

21 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu (27), o dwóch grupach metoksylowych w pozycji 4 oraz 6, nie posiadająca natomiast ugrupowania prenylowego. H CoA p-kumaroilo-coa (4) syntaza chalkonowa 3x CoA malonylo-coa (5) H H H H chalkonaringenina (8) aromatyczna prenylotramsferaza PP DMAPP (22) H H H H dezmetyloksantohumol (23) -metylotransferaza H H H ksantohumol (24) Rycina Biosynteza ksantohumolu (24) [27, 33, 34] Pomimo, iż skład jakościowy oraz ilościowy prenylowanych flawonoidów chmielowych różni się znacząco w europejskich, amerykańskich oraz japońskich odmianach chmielu, ksantohumol (24) jest zawsze głównym flawonoidem kwiatostanów żeńskich, a jego ilość waha się od 0,1 do 1% suchej masy szyszek [27]. Stężenie pozostałych chalkonów w żywicy chmielowej jest od 10 do 100 razy mniejsze. Dzięki przebadaniu ogromnej ilości odmian chmielowych pochodzących z całego świata, naukowcom udało się oznaczyć aż 24 21

22 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu flawonoidy syntezowane przez gruczoły lupulinowe w szyszkach chmielowych [28, 35] (Ryc ). H 4' 6' H H H 2' H H ksantohumol (24) ksantogalenol (25) R 1 R 2 R 3 R 4 R 2 R 1 R 3 H R 4 H 26 Pn H 4 --metyloksantohumol 27 H H flawokawina 23 Pn H H H dezmetyloksantohumol 28 Gn H H H 3 -geranylochalkonaringenina 29 Pn H Pn H 3,5 -diprenylochalkonaringenina 30 Pn H Pn 5 -prenyloksantohumol Pn - grupa prenylowa, Gn - grupa geranylowa H 6" H 5" H 4" H H ksantohumol C (32) ksantohumol B (31) 5"' 4"' 6"' CH H H 3 H H H 2 C 1" H 4" 3 C 1" 4" 5" H 5" H ksantohumol D (33) ksantohumol E (34) H H H 4' 6' H 3 C 6" H 5" 2' 4" H H H α,β-dihydroksantohumol (35) hydrat izo-dehydrocykloksantohumol D (36) R 1 R 2 R 3 R 4 37 H H Pn izoksantohumol 38 H Pn H 7--metylo-6-prenylonaringenina R 3 R 2 R R ' 4' H 39 H H Pn 7--metylo-8-prenylonaringenina 40 H Pn 5,7-di--metylo-8-prenylonaringenina 41 H H 5,7-di--metylonaringenina 42 H Pn H H 6-prenylonaringenina 43 H H H Pn 8-prenylonaringenina 44 H Pn H Pn 6,8-diprenylonaringenina 45 H Gn H H 6-geranylonaringenina 46 H H H Gn 8-geranylonaringenina Pn - grupa prenylowa, Gn - grupa geranylowa Rycina Flawanoidy syntezowane przez chmiel (Humulus lupulus L.) [28, 35] 22

23 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu Do biosyntezy ksantohumolu (24), oprócz chmielu zwyczajnego (Humulus lupulus L.), zdolna jest również azjatycka roślina Sophora flavescens [36]. Występuje ona powszechnie na terenie Chin, Japonii oraz Korei, a jej korzenie bogate we flawonoidy od wieków wykorzystywane są w tradycyjnej medycynie chińskiej. Niemniej zawartość ksantohumolu (24) jest znikoma w stosunku do innych biologicznie aktywnych związków tej rośliny. Dlatego najważniejszym źródłem tego prenylowanego chalkonu oraz innych flawonoidów z ugrupowaniem dimetyloallilu w ludzkiej diecie jest piwo [27]. Ksantohumol (24) nie jest jednak głównym prenylowanym flawonoidem tego popularnego na całym świecie trunku. Jego ilość jest znacznie niższa niż izoksantohumolu (37), którego zawartość w zależności od rodzaju piwa może wynosić od 40 do 3440 µg/l [37]. Wynika to z termicznej izomeryzacji chalkonu do flawanonu jaka ma miejsce podczas gotowania brzeczki chmielowej (Ryc ) [38]. Z kolei dezmetyloksantohumol (23), ze względu na obecność dwóch wolnych grup hydroksylowych w pierścieniu A w pozycjach 2 oraz 6, ulega konwersji do mieszaniny złożonej z ekwiwalentnych ilości 6- oraz 8-prenylonaringeniny (42,43) [39, 40], związków o silnym działaniu estrogennym (Ryc ). Ponieważ ksantohumol (24) wydaje sie być związkiem cenniejszym pod względem właściwości prozdrowotnych w stosunku do jego izomeru izoksantohumolu (37), podjęto produkcję ekstraktów chmielowych oraz piwa o zwiększonym udziale tego prenylowanego chalkonu, efektem czego było pojawienie się na niemieckim rynku piwa Weihenstephaner Xan Hefeweißbier o zawartości 1,3 mg ksantohumolu (24) w litrze, w Czechach natomiast dostępny jest ciemny lager Žatec Xantho, w którym ilość tego chalkonu wynosi 0,3 mg na litr [41]. Biologiczny potencjał ksantohumolu (24) docenili również inni producenci niemiecka firma TA-XAN AG wprowadziła na rynek bezalkoholowy napój Xan Wellness oraz napoje herbaciane Xan Tea. H 4' 6' H ΔT H 2' 6' H 8' H ksantohumol (24) (±) izoksantohumol (37) (±) izoksantohumol (?) (24) Rycina Termiczna izomeryzacja ksantohumolu (24) zachodząca podczas gotowania brzeczki chmielowej [38-40] 23

24 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu H 4' 6' H H 2' H dezmetyloksantohumol (23) ΔT H H H 6' 8' + H 6' 8' H H (±) 6-prenylonaringenina (42) (±) 8-prenylonaringenina (43) Rycina Termiczna izomeryzacja dezmetyloksantohumolu (23) zachodząca podczas gotowania brzeczki chmielowej [38-40] 24

25 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu 4.2. Chemiczna synteza ksantohumolu Pierwszą metodę chemicznej syntezy ksantohumolu (24) opracowali Khupse i Erhardt [42] (Ryc ). Jako substrat wykorzystano floroacetofenon (2,4,6 trihydroksyacetofenon) z zabezpieczonymi grupami hydroksylowymi w pozycjach 4 i 6 grupą metoksymetylową (MM) (47). Pochodną acetofenonu w wyniku reakcji Mitsunobu przekształcono w prenylowany eter (50), wykorzystując jako donor grupy prenylowej 3- metylo-2-buten-1-ol (48). trzymany eter (50) poddano reakcji przegrupowania Claisena, w wyniku czego nastąpiło przyłączenie ugrupowania dimetyloallilowego do pierścienia aromatycznego (51). W kolejnym etapie przeprowadzono -metylację wolnej grupy hydroksylowej. Powstały w ten sposób związek (52), poddano kondesacji z aldehydem 4-metoksymetylobenzoesowym (53) w reakcji Claisena-Schmidta, w konsekwencji czego otrzymano α,ß nienasycony keton, metoksymetylowaną pochodną ksantohumolu (54). Vogel i wsp. zmodyfikowali wyżej opisaną metodę [43], wykorzystując mniej toksyczne reagenty oraz łagodniejsze warunki podczas reakcji -prenylacji (Ryc ). Ponadto stosując bromek dimetyloallilu (49) jako donor grupy prenylowej uzyskano o 11 % wyższą wydajność produktu pośredniego (50). MM MM MM MM H 47 + H Br A A B MM MM B C MM MM H C D D H MM H H H E MM MM MM 53 E A DEAD, PPH 3, Toluen/THF,RT; B N,N-dimetyloanilina, refluks; C ( ) 2 S 2, K 2 C 3, ( ) 2 C, refluks; D NaH/H 2, MeH, refluks, 4h; E stężony HCl (ph=1), MeH/H 2, RT, 12h [42] A ( ) 2 C, K 2 C 3, refluks, 24h; B N,N-dimetyloanilina, refluks, 3h, atm. argonu; C ( ) 2 S 2, NaH, DMC/H 2, TBAI, RT, 24h; D KH, EtH/H 2, 72h, 0 C; E MeH/3M HCl, refluks, 15 min [43] Rycina Chemiczna synteza ksantohumolu (24) wg Khupsego i Erhardta [42] oraz Vogel i wsp. [43] 25

26 Biologiczna i chemiczna synteza ksantohumolu Jak dotąd podstawową metodą otrzymywania chalkonów na drodze chemicznej, jest reakcja Claisena-Schmidta, polegająca na kondensacji odpowiednio podstawionej pochodnej acetofenonu z benzaldehydem w obecności wodnego roztworu zasady, lub zasadowego katalizatora [44]. Alternatywą dla tej reakcji może być nowa, prosta i szybka metoda zaproponowana przez Kakatiego i Sarmę. Naukowcy stosując jako katalizator tlenek glinu nasycony jodem oraz promieniowanie mikrofalowe, zsyntezowali z wysoką wydajnością (79-95%) 15 różnych chalkonów, w tym ksantohumol (24) (Ryc ) [44]. Nowy sposób syntezy ma ogromną przewagą nad wykorzystywanymi do tej pory klasycznymi reakcjami. Metoda nie wymaga stosowanie substratów z zablokowanymi grupami hydroksylowymi, czas trwania reakcji nie przekracza 5 min, a co najważniejsze, proces przebiega bez użycia jakichkolwiek rozpuszczalników, jest więc przyjazny dla środowiska. H H 2,4-dihydroksy-6-metoksy- 3-prenyloacetofenon (55) + H H 4-hydroksybenzaldehyd (56) I 2 -Al 2 3 MW, 90 sec H H ksantohumol (23) H Rycina Chemiczna synteza ksantohumlu wg Kakatiego i Sarmy [44] Mimo tak znacznego uproszczenia ostatniego etapu syntezy ksantohumolu metoda jest złożona i czasochłonna. Sumaryczna wydajność procesu zaproponowanego przez Khupsego i Erhardta wynosi 10 % [41]. Tańszą i efektywniejszą metodą pozyskiwania ksantohumolu (24) jest izolowanie tego związku z poekstrakcyjnego odpadu chmielowego jakim są wychmieliny. W wyniku ekstrakcji szyszek chmielowych nadkrytycznym dwutlenkiem węgla, powstaje ekstrakt bogaty w gorzkie kwasy (humulony i lupulony) oraz olejek chmielowy. Ekstrakt ten dodany do piwa nadaje mu odpowiedni aromat, oraz charakterystyczny goryczkowy smak. Produktem ubocznym procesu wydobywania tych cennych dla browarnictwa związków są wychmieliny. Nowoczesne metody ekstrakcji, oparte przede wszystkim na wykorzystaniu dwutlenku węgla w stanie nadkrytycznym, umożliwiają bardzo efektywne wydobycie kwasów gorzkich i olejków, nie wydobywając przy tym związków bardziej polarnych, stąd produkt odpadowy zawiera znaczne ilości flawonoidów, co czyni go niezwykle atrakcyjnym źródłem pozyskiwania biologicznie aktywnych substancji, w tym przede wszystkim ksantohumolu (24). 26

27 Właściwości biologiczne ksantohumolu 5. WŁAŚCIWŚCI BILGICZNE KSANTHUMLU Chalkony wykazują różnorodną aktywność biologiczną. Związki te znane są jako silne czynniki przeciwnowotworowe [45-51], antyoksydacyjne [9, 52-55], przeciwzapalne [7, 9, 50, 56], antybakteryjne [7, 57-59], przeciwgrzybiczne [7, 57, 58], antymalaryczne [7, 51, 60, 61], oraz przeciwgruźlicze [62]. Niezwykle wysoką aktywność biologiczną posiada ksantohumol - główny prenylowany flawonoid chmielowy (24). W ostatniej dekadzie pojawiła się znaczna ilość publikacji dotyczących tego tematu Właściwości przeciwnowotworowe Ksantohumol (24) uważany jest za silny czynnik przeciwnowotworowy o szerokim spektrum działania [27]. Wykazuje on zarówno aktywność chemoprewencyjną, czyli zapobiega powstawaniu oraz rozwojowi nowotworów w organizmie [63, 64], jak również terapeutyczną, bowiem indukuje efekt cytotoksyczny [63] oraz apoptozę [10, 65, 66] w istniejących już komórkach guza, efektywnie go niszcząc. Aktywność ochronna ksantohumolu jako czynnika przeciwnowotworowego objawia się w trzech fazach nowotworzenia: w fazie inicjacji w wyniku inhibicji metabolicznej aktywacji czynnika prokarcenogennego, oraz poprzez aktywację enzymów odpowiedzialnych za detoksykację karcenogenów, w fazie promocji przez hamowanie stanu zapalnego oraz angiogenezy, w fazie progresji przez zahamowanie rozwoju guza [27] Faza inicjacji nowotworu Działanie prewencyjne ksantohumolu (24) objawiające się zahamowaniem procesu indukcji nowotworzenia związane jest z aktywnością przeciutleniającą, ze zdolnością do zmiany aktywności enzymów fazy I detoksykacji oraz zdolnością do wywoływania nadekspresji genów kodujących enzymy odpowiedzialne za fazę II. Udowodniono, iż bardzo niskie stężenie ksantohumolu (24) (0,01µM) hamuje metaboliczną aktywację 2-amino-3- metyloimidazo[4,5-f]chinoliny (IQ) [67, 68], prokarcenogennego związku, który powstaje podczas termicznej obróbki mięsa [69]. W pierwszej fazie detoksykacji, w wyniku działania 27

28 Właściwości biologiczne ksantohumolu enzymów cytochromu P450, prokarcenogen przekształcany jest w rakotwórczą pochodną w reakcji katalizowanej przez cytochrom P450 1A2 (CYP 1A2) [68]. Ksantohumol (24) okazał się inhibitorem tego enzymu, jest więc zdolny do hamowania transformacji prokarcenogennych heterocyklicznych amin w związki rakotwórcze. Podobną aktywność wykazywały również inne prenylowane flawonoidy chmielowe 8-prenylonaringenina (44) oraz izoksantohumol (37) [68, 69]. Wykazano również, iż prenylowane flawonoidy chmielowe, już przy niskich stężeniach wykazują zdolność do inhibicji innych enzymów cytochromu P450 z rodziny CYP1 [70] odpowiedzialnych za metaboliczną aktywację prokarcenogenów, takich jak wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (CYP1A1, CYP1B1) [71], aflatoksyna B1 oraz heterocykliczne aminy (CYP1A2) [71, 72]. Najaktywniejszym inhibitorem spośród przebadanych związków okazał się ksantohumol (24), który przy stężenie 10 µm hamował prawie całkowicie aktywność -demetylazy-7-etoksyrezorufiny (ERD) związanej z CYP1A1 oraz z CYP1B1 [70]. W przeprowadzonych badaniach stwierdzono również, iż ksantohumol (24) oraz 8-prenylonaringenina (43) znacząco obniżają zdolność wiązania znakowanej aflatoksyny B1 do białek mikrosomalnych, przez co przeciwdziałają mutagenezie [70]. Aktywność inhibicyjną ksantohumolu (24) oraz izoksantohumolu (37) względem CYP1A potwierdzili Gerhäuser i wsp. ustalając IC 50 na poziomie 0,022 µm dla ksantohumolu (24) oraz 0,3 µm dla izoksantohumolu (37) [73]. Przeprowadzone badania dowiodły jednoznacznie, że prenylowane flawonoidy chmielowe poprzez inhibicję odpowiednich enzymów cytochromu P450, hamują aktywację wielu czynników karcenogennych oraz działają przeciwmutagennie [27]. Dowiedziono również, że prenylowane flawonoidy chmielowe są zdolne do aktywacji enzymów fazy II detoksykacji, odpowiedzialnych za koniugację ksenobiotyków z glutationem, glicyną, kwasem glukuronowym, octowym czy siarkowym w celu łatwiejszego usunięcia ich z ustroju. Duże znaczenia w efektywnym usuwaniu niebezpiecznych dla organizmu związków odgrywa NAD(P)H zależna reduktaza chinonowa, która katalizuje redukcję chinonów do hydrochinonów. Te z kolei stanowią substraty do enzymatycznych reakcji sprzęgania. Badania in vivtro przeprowadzone na mysich komórkach ludzkiego raka wątroby linii Hepa 1c1c7 dowiodły, iż ksantohumol oraz 6 innych prenylowanych 28

29 Właściwości biologiczne ksantohumolu flawonoidów chmielowych w stężeniu 2,1-10,1 µm zwiększają dwukrotnie aktywność reduktazy chinonowej [74]. Dzięki inhibicji enzymów fazy I oraz aktywacji enzymów fazy II detoksykacji, prenylowane flawonoidy chmielowe, a w szczególności ksantohumol (24) mogą mieć znaczący wpływ na zwiększenie efektywności i szybkości usuwania ksenobiotyków, których obecność w organizmie może prowadzić do powstania i rozwoju nowotworów Faza promocji nowotworu Niekontrolowana proliferacja komórek nowotworowych jest związana m. in. ze zwiększoną produkcją związków takich jak prostaglandyny, które wywołują w organizmie stan zapalny [27]. Biosynteza tych tkankowych hormonów związana jest bezpośrednio z aktywnością cyklooksygenazy (CX), katalizującej cyklizację wielonienasyconego kwasu arachidonowego do prekursora prostaglandyn. Wiadomo również, iż prostaglandyny inicjują proces angiogenezy powstawania nowych naczyń krwionośnych ze śródbłonka naczyń już istniejących. Proces ten odgrywa niezwykle istotną rolę w rozwoju guza, determinuje on zarówno jego wzrost poprzez możliwość dostarczenia składników odżywczych, jak i zdolność do metastazy (przerzutów). Ponieważ przez nowo utworzone naczynia krwionośne, oderwane od guza pierwotnego komórki mogą swobodnie przemieszczać się do innych narządów [75]. Gerhäuser i wsp. udowodnili, iż ksantohumol może być skutecznym związkiem przeciwzapalnym, gdyż hamuje syntezę prostaglandyn poprzez inhibicję dwóch izoenzymów cyklooksygenazy: konstytutywnej CX-1 oraz indukowanej CX-2 [73]. IC 50 ksantohumolu (24) jako inhibitora tych białek określono na poziomie 16,6 µm dla CX-1 oraz 41,5 µm dla CX-2. W badaniach przeprowadzonych na mysich makrofagach linii RAW stymulowanych lipopolisacharydem (LPS) oraz interferonem gamma (IFN-γ) wykazano, iż ksantohumol (24) hamuje wydzielanie syntazy tlenku azotu (ins), katalizującej produkcję tlenku azotu II (N) z L-argininy [76]. Mechanizm tego procesu nie został jeszcze poznany, wiadomo jednak, że wysokie stężenie tlenku azotu w organizmie aktywuje biosyntezę czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF), silnego aktywatora procesu angiogenezy. W innych badaniach przeprowadzonych przez Cho i wsp. na tych samych liniach mysich makrofagów stymulowanych LPS oraz IFN-γ, określono molekularny mechanizm 29

30 Właściwości biologiczne ksantohumolu aktywności przeciwzapalnej głównego prenylowanego flawonoidu chmielowego. Udowodniono bowiem inhibicyjny wpływ ksantohumolu (24) na aktywacje czynnika trankrypcyjnego NF-κB [77], który w jądrze komórkowym aktywuje ekspresję licznych genów kodujących cytokiny odpowiedzialne za rozwój stanu zapalnego w organizmie. W 2010 roku Albini i wsp. zobserwowali, iż ksantohumol (24) in vivo wpływa na aktywność kinazy Akt, która przez reakcję fosforylacji aktywuje wiele białek, w tym m.in syntazę tlenku azotu (ins), oraz kinazę IKK, która z kolei wpływa na aktywację wspomnianego wcześniej czynnika transkrypcyjnego NF-κB indukującego proces zapalny [78]. Spożywanie niewielkiej ilości ksantohumolu (24) (dawka 2 µm w wodzie) skutecznie hamuje proces angiogenezy, warunkujący rozwój nowotworu oraz możliwość jego przerzutów. Stąd autorzy pokusili się o wprowadzenie nowego określenia angioprewencji, a ksantohumol (24) nazwali czynnikiem angioprewencyjnym [78]. Przeprowadzone badania dowiodły, iż ksanatohumol (24) oraz inne prenylowane flawonoidy chmielowe, dzięki swej aktywności przeciwzapalnej oraz inhibicji tworzenia nowych naczyń krwionośnych ze śródbłonka już istniejących, mogą znacząco wpływać na proces i rozwój onkogenezy, zarówno w fazie inicjacji, jak i na etapie promocji nowotworzenia Faza progresji nowotworu Aktywność ochronna ksantohumolu jako czynnika przeciwnowotworowego na etapie progresji procesu nowotworzenia jest wielokierunkowa i związana m. in. : z hamowaniem syntezy DNA (przez inhibicję polimerazy DNA α, oraz przyłączenie tymidyny do nowo zsyntetyzowanego DNA), aktywację programowanej śmierci komórek (apoptozy), blokowaniu cyklu komórkowego w fazie S, oraz różnicowaniem komórek [41, 73]. Badania przeprowadzone na liniach komórkowych raka piersi MCF-7, raka okrężnicy HT-29 oraz raka jajnika A-2780 dowiodły, iż ksantohumol (24) oraz 5 innych prenylowanych flawonoidów wyizolowanych z chmielu, wykazują zdolność do hamowania proliferacji komórek nowotworowych, w stężeniu nie wpływającym na wzrost prawidłowych hepatocytów [63]. Najsilniejszym inhibitorem dla wszystkich spośród przebadanych linii 30

31 Właściwości biologiczne ksantohumolu komórkowych ludzkich nowotworów okazał się ksantohumol (24), którego IC 50 dla linii komórek raka piersi MCF-7 wyniosło po dwóch dniach inkubacji 13,3 µm. W przypadku dwukrotnego wydłużenia czasu inkubacji wartość IC 50 spadła blisko czterokrotnie do 3,47 µm. Komórki ludzkiego nowotworu jajnika, okazały się jeszcze bardziej wrażliwe na obecność ksantohumolu (24). W pierwszych godzinach inkubacji IC 50 dla tych linii wyniosło 0,52, a po dwóch oraz czterech dniach 5,2 µm. Zmniejszająca się wrażliwość na antyproliferacyjne działanie ksantohumolu (24) wraz ze zwiększaniem czasu ekspozycji na ten związek, tłumaczone jest z prawdopodobną detoksykacją ksantohumolu (24) przez enzymy cytochromu P450 komórek nowotworowych, oraz obecnością białek oporności wielolekowej w tych liniach [63]. Najbardziej opornym spośród przebadanych nowotworów okazał się ludzki nowotwór okrężnicy (linia HT-29), który nie wykazywał wrażliwości na prenylowane flawonoidy chmielowe w stężeniu do 10 µm, natomiast jego wzrost był całkowicie hamowany dopiero przy stężeniu 100 µm. W przypadku tej linii komórkowej nie określono wartości IC 50 dla żadnego z przebadanych flawonoidów. Badania nad możliwością hamowania wzrostu nowotworu okrężnicy przez ksantohumol (24) kontynuowane przez Pana i wsp. wykazały, że jest on skutecznym czynnikiem antyproliferacyjnym oraz proapoptotycznym wobec linii komórkowej ludzkiego nowotworu okrężnicy 40-16, która wywodzi się z linii HCT-166 [11]. Wartość IC 50 ksantohumolu (24) dla tych komórek wynosiła 4,1 µm po 24 godzinnej ekspozycji, i zmniejszała się odpowiednio do 3,6 po 36 godzinach oraz 2,6 µm przy 72 godzinnej inkubacji. Ponadto 24 godzinna obecność ksantohumolu w stężeniu równym 15 µm oraz 72 godzinna przy stężeniu 5 µm skutecznie indukowała proces programowanej śmierci komórek nowotworowych [11]. Monteiro i wsp. prowadzili natomiast badania nad wpływem ksantohumolu (24) na wzrost i rozwój raka piersi in vivo. Wprowadzili oni linię ludzkiego nowotworu MCF-7 do nagich myszy laboratoryjnych, by następnie podając oralnie ksantohumol (24) w postaci zawiesiny badać postęp w proliferacji i rozwoju komórek rakowych oraz proces zapalny mający miejsce w trakcie wzrostu nowotworu [13]. Podawany oralnie ksantohumol (24) wywoływał centralną martwicę guza, zmniejszał ilość ognisk zapalnych i gęstość naczyń krwionośnych w rozwijających się strefach nowotworu oraz zwiększał liczbę komórek apoptotycznych [13]. 31

32 Właściwości biologiczne ksantohumolu Ksantohumol (24), izoksantohumol (37) oraz 8-prenylonaringenina (43) wykazują antyproliferacyjne oraz proapoptotyczne właściwości również względem innej linii komórkowej ludzkiego nowotworu piersi Sk-Br-3 [79]. prócz zdolności do indukcji apoptozy oraz hamowania syntezy DNA w komórkach nowotworowych, wykazano również hamujący wpływ na aktywność aromatazy P450, katalizującej konwersję androgenów w estrogeny. Przeprowadzone badania sugerują obecność innego alternatywnego mechanizmu zwalczania raka piersi przez prenylowane flawonoidy chmielowe, poprzez blokowanie syntezy estrogenów [41, 79]. Badania przeprowadzone na liniach komórkowych ludzkiego nowotworu prostaty PC- 3 oraz DU 145 dowiodły, iż ksantohumol (24) wykazuje silne właściwości antyproliferacyjne również wobec tego bardzo powszechnie występującego nowotworu [64]. prócz ksantohumolu (24), przepadano również inny prenylowany chalkon chmielowy dezmetyloksantohumol (23), oraz prenylowane flawanony: izoksantohumol (37), 8- i 6- prenylonaringeninę (43, 42). Ksantohumol (24), którego IC 50 dla komórek DU 145 oraz PC-3 przy dwudniowej inkubacji wynosiły odpowiednio 12,3 i 13,2 µm okazał się najsilniejszym inhibitorem spośród przeanalizowanych związków. Natomiast najsłabsze właściwości antyproliferacyjne wykazywał drugi z przebadanych chalkonów dezmetyloksantohumol (23). Wartości IC 50 dla tego związku były czterokrotnie wyższe w stosunku do ksantohumolu (24) [64]. Z badań tych wynika, że obecność grupy metoksylowej w pozycji C6 wpływa istotnie na zdolności do inhibicji proliferacji komórek nowotworowych. Dokładny mechanizm działania ksantohumolu (24) jako czynnika hamującego proliferację komórek rakowych prostaty określili Deeb i wsp. [66]. Przebadali cztery linie komórkowe ludzkiego nowotworu gruczołu krokowego PC-3, DU 145, LNCaP oraz C4-2 i stwierdzili, że stężenie ksantohumolu (24) w przedziale µm, znacząco hamuje rozwój wszystkich przebadanych linii ludzkiego nowotworu prostaty po 3-dniowej inkubacji. Zahamowanie rozwoju nowotworu miało miejsce w wyniku procesu apoptozy wywołanej aktywacją prokaspaz -3, -8, -9, wiązaniem aneksyn V-FITC, inaktywację polimerazy 1 poli(adp-rybozy) (PARP-1) oraz depolaryzację błony mitochondrialnej. Ksantohumol (24) indukował ten proces hamując kinazę Akt, czynnik transkrypcyjny NF-κB oraz cząsteczki sygnałowe mtr, jak również inhibitory apoptozy z rodziny Bcl-2 oraz surwiwiny [66]. Poznanie mechanizmu indukcji apoptozy w komórkach nowotworowych przy udziale ksantohumolu (24) może mieć ogromne znaczenie w opracowaniu skutecznej metody leczenia przerzutowego hormonoodpornego raka gruczołu krokowego (mhrpc). 32

33 Właściwości biologiczne ksantohumolu Zahamowanie proliferacji komórek nowotworowych poprzez wywołanie procesu apoptozy w obecności ksanohumolu stwierdzono również w badaniach in vitro nad limfocytami pobranymi od pacjentów cierpiących na przewlekłą białaczkę limfocytarną (B- CLL). Ksantohumol (24) indukował śmierć komórek nowotworowych przy LD 50 równym 24,4 µm niezależnie od obecności znanych niekorzystnych czynników prognostycznych, m.in. takich, jak utrata funkcjonalnego białka p53 oraz bez względu na stopień odporności na leczenie [80]. Silne działanie proapoptotyczne ksantohumolu (24) wykazano również wobec komórek ludzkiej białaczki szpikowej K562 odpornych na imatinib inhibitor kinazy tyrozynowej Bcr-Abl [81]. Ta onkogenna kinaza aktywuje wiele szlaków sygnałowych, wywołuje odporność na apoptozę mieloidalnych komórek białaczki Bcr-Abl(+) [81] oraz odpowiedzialna jest za fenotyp złośliwy przewlekłej białaczki szpikowej (CML) oraz ostrej białaczki limfatycznej (ALL) [82]. Udowodniono, iż ksantohumol (24) wykazuje aktywność in vitro wobec komórek Bcr-Abl(+). Główny prenylowany flawonoid chmielowy zmniejszał żywotność komórek ludzkiej białaczki szpikowej K562 odpornej na mesylan imatinibu, poprzez indukcję apoptozy, zwiększenie ekspresji białek p21 i p53 oraz obniżenie ilości wytwarzanych surwiwin inhibitorów apoptozy. Ksantohumol (24) okazał się być silnym inhibitorem onkogennej kinazy poprzez hamowanie ekspresji genu kodującego to białko, jak również wobec samego białka. Ponadto zmniejszał adhezję komórek rakowych do komórek śródbłonka, przez co efektywnie przeciwdziała rozprzestrzenianiu się nowotworu do innych tkanek [81]. Silne działanie przeciwzapalne, antyproliferacyjne oraz antyangiogenne ksantohumolu (24) wobec komórek nowotworowych szpiku kostnego potwierdzili również Harikumara i wsp [65]. Badali oni wpływ ksantohumolu (24) na konstytutywną oraz indukowaną aktywację czynnika jądrowego-κb (NF-κB). Czynnik ten reguluje ekspresję około 200 genów związanych m. in. z różnicowaniem, proliferacją oraz apoptozą komórek, zarówno prawidłowych, jak i nowotworowych oraz odgrywa kluczową rolę w regulacji odpowiedzi komórkowej na infekcję. Jednym z głównych mechanizmów prowadzących do aktywacji NF-κB jest fosforylacja białka inhibitorowego IκBα przez swoiste kinazy (IKKs). Po fosforylacji, inhibitor odłącza się od NF-κB i ulega degradacji w proteosomie, natomiast pozbawiony inhibitora (aktywowany) czynnik transportowany jest z cytoplazmy do jądra komórkowego, gdzie inicjuje transkrypcje określonych genów [83]. 33

34 Właściwości biologiczne ksantohumolu Ksantohumol (24) skutecznie hamuje fosforylację i degradację białka IκBα oraz translokację podjednostki p65 czynnika transkrypcyjnego do jądra, przeciwdziałając tym samym transkrypcji genów zależnych od czynnika jądrowego NF-κB [65]. Przeprowadzone badania dowiodły, iż ksantohumol (24) wykazuje silne działanie przeciwzapalne, antyangiogenne oraz aktywuje proces apoptozy w komórkach białaczki, przez inhibicję aktywacji jądrowego czynnika-κb [65]. Na podstawie przeprowadzonych badań można wnioskować, że zdolność ksantohumolu (24) do hamowania rozwoju komórek białaczki, opiera się na wielu mechanizmach działania. Związek ten, może więc okazać się bardzo skuteczną bronią w walce z tą śmiertelną chorobą i skutecznie wspomóc istniejące już metody leczenia. prócz zdolności hamowania wzrostu i rozwoju wyżej opisanych nowotworów, ksantohumol (24) wykazuje zdolność inhibicji w stosunku do dwóch linii ludzkiego nowotworu wątroby Hep3B oraz HA22T/VGH. Wartości IC 50 wywołujące apoptozę w komórkach rakowych wynosiły dla Hep3B 108 µm oraz 166 µm dla HA22T/VGH. kreślono również stężenie wywołujące programowaną śmierć w połowie populacji prawidłowych hepatocytów (linia AML12), które wyniosło 211 µm [84]. Dawka terapeutyczna ksantohumolu (24) hamująca wzrost i rozwój komórek nowotworowych wątroby okazała się bezpieczną w stosunku do prawidłowo rozwijających się hepatocytów. W badaniach przeprowadzonych na prawidłowych komórkach tarczycy FRTL-5, udowodniono z kolei wpływ ksantohumolu na zdolność pobierania ze środowiska jodu w postaci I -. Inkubacja szczurzych tyreocytów wraz z ksantohumolem w stężeniu 1 nm spowodowała zwiększenie wchłaniania jodu o 50% po trzech dniach inkubacji. Nie stwierdzono negatywnego wpływu na przeżywalność komórek traktowanych ksantohumolem (24) [85]. Jedną z podstawowych metod leczenia nowotworu tarczycy jest radioterapia z wykorzystaniem radioaktywnego izotopu jodu (radiojodu). Promieniotwórczy izotop jest gromadzony w tarczycy w ten sam sposób, co naturalnie występujący w przyrodzie, dzięki czemu może efektywnie niszczyć komórki nowotworowe. Jednak ma on również negatywny wpływ na prawidłowe komórki. Dlatego w tego rodzaju terapii ważne jest stosowanie możliwie najmniejszych dawek radioaktywnego izotopu. Ksantohumol (24), dzięki zdolności zwiększeniu wchłaniania jodu, może znacząco obniżyć dawki promieniotwórczego pierwiastka wykorzystywane w radioterapii nowotworów tarczycy. 34

35 Właściwości biologiczne ksantohumolu 5.2. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe, antymalaryczne i przeciwwirusowe Jako pierwsi aktywność przeciwdrobnoustrojową ksantohumolu (24) opisali w 1984 roku Mizobuchi i Sato [86]. Badali oni prenylowane flawonoidy chmielowe pod kątem zdolności do hamowania wzrostu bakterii Gram dodatnich oraz pleśni. Najsilniejsze właściwości antybakteryjne w stosunku do Staphylococcus aureus posiadał ksantohumol (24) oraz 6-prenylonaringenina (42). Flawonoidy te wraz z 8-prenylonaringeniną (43) wykazywały również silne właściwości fungistatyczne wobec Trichophyton mentagrophytes oraz Trichophyton rubrum, oraz umiarkowane przeciwko Mucor rouxianus. Związki te nie były natomiast aktywne w stosunku do grzybów strzępkowych Fusarium oxysporum, drożdży Candida albicans oraz bakterii Escherichia coli. Jako kontrolę w badaniach wykorzystano naringeninę, która okazała się być słabym inhibitorem wzrostu przebadanych drobnoustrojów. Na tej podstawie, badacze wysnuli wniosek, iż obecność grupy prenylowej sprzyja transportowi flawonoidów do wnętrza komórki lub ułatwia blokowanie enzymów przez wiązanie w centrum aktywnym [86]. Bhattacharya i wsp. [87] badali wpływ substancji pochodzących z chmielu, w tym ksantohumolu, na wzrost bakterii z rodzaju Streptococcus. Dla porównania właściwości antydrobnoustrojowych, przebadano również terpeny hamujące wzrost bakterii wywołujących próchnicę, będące składnikami olejków eterycznych powszechnie stosowanych w płynach do płukania jamy ustnej. Ksantohumol (24) wykazywał silne właściwości przeciwbakteryjne w stosunku do S. mutans, S. salivarius i S sangius. kazało sie, że aktywne substancje pochodzące z chmielu wykazują silniejsze właściwości bakteriobójcz niż związki stosowane w środkach do płukania jamy ustnej takie jak tymol, nerol, mentol czy eukaliptol [87]. Jednak wykorzystywanie ekstraktów chmielowych w walce z próchnicą może mieć ograniczony zakres ze względu na charakterystyczny gorzki smak. Ksantohumol (24) oraz sześć innych składników chmielu przebadano również z myślą wykorzystania jako potencjalne leki przeciwtrądzikowe [88]. Pod uwagę wzięto trzy główne czynniki patogenezy trądziku: rozwój patogennych mikroorganizmów, nadprodukcję sebum wywołaną reaktywnymi formami tlenu oraz nadmierną przebudowę macierzy zewnątrzkomórkowej związanej z degradacją kolagenu. Niezmiernie ważnym okazało się określenie aktywności związków chmielowych przeciwko pięciu głównym bakteriom wywołującym trądzik pospolity: Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Kocuria rhizophila oraz Staphylococcus pyogenes. Ksantohumol (24) 35

36 Właściwości biologiczne ksantohumolu oraz lupulon wykazywały najsilniejsze właściwości przeciwbakteryjne spośród przebadanych związków. Ponadto tak silnych aktywności inhibicyjnych w stosunku do bakterii wywołujących trądzik nie odnotowano do tej pory dla żadnych naturalnych związków pochodzących z roślin jadalnych. Wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost porównywalne były do klindamycyny oraz erytromycyny, antybiotyków powszechnie stosowanych w miejscowym leczenia trądziku [88]. Ksantohumol (24) okazał się również silnym inhibitorem procesu degradacji kolagenu, bowiem znacząco hamował metaloproteinazy macierzy (kolagenazę śródmiąższową MMP-1 oraz kolagenazę neutrofilową MMP-8), podczas gdy pozostałe związki chmielu wykazywały tylko nieznaczną aktywność. Przeprowadzone badania dotyczące zdolności do neutralizacji aktywnych form tlenu, dowiodły również silnych właściwości przeciwutleniających ksantohumolu (24) w testach na całkowitą zdolność zmiatania wolnych rodników tlenowych (RAC) oraz w zdolności do neutralizacji tlenu singletowego (SAC) [88]. Jak wynika z przedstawionych wyżej wyników badań, ksantohumol (24) hamuje wszystkie z badanych czynników wywołujących trądzik, można więc przypuszczać, że może być efektywnie wykorzystywany w metodach leczenia tego powszechnego schorzenia. Z badań przeprowadzonych przez Natarajana i wsp. [89] wynika, że substancje pochodzące z chmielu mogą również wspierać antybiotykoterapię. Naukowcy badając szereg antybiotyków podawanych wraz z ksantohumolem (24), humulonem oraz lupulonem stwierdzili, że składniki chmielu wywierają pozytywny wpływ w hamowaniu szerokiej gamy mikroorganizmów in vitro. Ksantohumol (24) i lupulon wykazywały synergizm w stosunku do trzech spośród przebadanych antybiotyków: siarczanu polimyksyny B, tobramycyny oraz cyprofloksacyny. becność tych naturalnych związków nie tylko zwiększała efektywność antybiotyku, ale również zmieniała selektywność jego działania. Nieaktywna wobec Gram dodatnich bakterii polimyksyna w połączeniu ze związkami chmielowymi wykazywała zdolność do ich hamowania [89]. Związki o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych mogą niekorzystnie wpływać na naturalną mikroflorę jelitową. Hanske i wsp. [90] zbadali wpływ ksantohumolu (24) na mikroflorę jelitową szczura. Związek ten podawany był w ilości 100 mg na kilogram masy ciała dziennie, przez cztery tygodnie. Mimo, iż trakcie doświadczenia wykrywano znaczą zawartość ksantohumolu (24) w kale (2,3 mg/g), dzienna dawka tego chalkonu nie wpływała hamująco na mikroflorę jelitową przebadanych zwierząt [90]. 36

37 Właściwości biologiczne ksantohumolu prócz aktywności przeciwbakteryjnej oraz fungistatycznej główny prenylowny flawonoid chmielowy wykazuje silne działanie przeciwmalaryczne oraz antywirusowe. Herath i wsp. [15] stwierdzili, że ksantohumol (24) hamował wzrost Plasmodium falciparum pierwotniaka wywołującego malarię u ludzi. Chalkon ten przeciwdziałał rozwojowi zarówno pierwotniaka wrażliwego (P. falciparum D6) jak i odpornego (P. falciparum W2) na działanie chlorochininy, związku wykorzystywanego w leczeniu chorób wywołanych pierwotniakami, w tym malarii. wartość IC 50 ksantohumolu (24) wynosiła odpowiednio 3,3 µg/ml dla zarodźca wrażliwego oraz 1,0 µg/ml dla odpornego na działanie przeciwmalarycznego leku [15]. Buckwold i wsp. zbadali działanie związków wyizolowanych z szyszek chmielowych przeciwko DNA i RNA wirusom in vitro [91]. Ksanthohumol (24) wykazywał zdolności hamowania replikacji w stosunku do wirusów, które jako nośnik informacji genetycznej wykorzystywały głównie DNA, choć działał również na niektóre RNA wirusy i okazał się silniejszy od swojego izomeru izoksantohumolu (37). Hamował namnażanie wirusa wywołującego biegunkę, dziesiątkującego stada bydła (BVDV), cytomegalowirusa (CMV) oraz wirusy opryszczki pospolitej (HSV-1, HSV-2) w zakresie stężeń IC 50 = 4,2 7,6 µm. Natomiast stężenia wymagane do unieczynnienia żywych komórek zainfekowanych wirusem w celu zmniejszenia jego rozprzestrzeniania były od 2,6 do 6,3 razy wyższe i wynosiły TC 50 = 17,2 25,1 µm [91, 92]. Ksantohumol (24) nie wykazywał aktywności wobec rinowirusa wywołującego przeziębienia u ludzi, replikacja tego RNA wirusa była natomiast hamowana przez izokasntohumol (37) [91]. Jak wykazali Wang i wsp. [14] ksantohumol (24) posiada właściwości przeciwwirusowe w stosunku do ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV- 1), jego działanie opierało się głównie na hamowaniu odwrotnej transkryptazy, co uniemożliwia namnażanie wirusa. Stężenie chalkonu niezbędne do hamowania działania wirusowego eznymu nie powodowało efektu toksycznego wobec zakażonych limfocytów [14]. Badano również zdolność ksantohumolu (24) do hamowania replikacji wirusa biegunki u bydła (BVDV) [93]. Ten (+)ssrna wirus jest powszechnie wykorzystywany jako zastępczy model w zwalczaniu wirusa HCV, wywołującego wirusowe zapalenie wątroby typu C, które nie leczone prowadzi do marskości, a następnie nowotworu tego organu. Ze względu na brak skutecznego systemu namnażanie wirusa HCV w kulturach tkankowych, konieczne jest stosowanie modeli zastępczych. Najczęściej używane do tego celu są podobne morfologiczne i genetyczne, należące do tej samej rodziny Flaviviridae, wirusy klasycznego 37

38 Właściwości biologiczne ksantohumolu pomoru świń (CSFV) oraz wirusowej biegunki u bydła (BVDV). Zdolność hamowania replikacji wirusa BVDV przez ksantohumol (24) porównywana była z aktywnością znanych czynników przeciwko HCV rybawiryny oraz interferonu α [93]. Główny prenylowany flawonoid chmielowy okazał się blisko dwukrotnie silniejszym inhibitorem replikacji wirusowego RNA niż rybawiryna, był jednak mniej aktywny od interferonu [93]. Dalsze badania in vitro wykazały, że jednoczesne stosowanie ksantohumolu (24) oraz interferonu α- 2b przeciwko BVDV dają znacznie lepsze efekty terapeutyczne, niż każdy ze związków stosowany samodzielnie [94]. Zatem równoczesne stosowanie ksantohumolu (24) oraz interferonu może skutecznie przeciwdziałać namnażaniu się wirusa wywołującego zapalenie wątroby typu C. dkrycie to jest niezwykle ważne, gdyż do tej pory nie udało się stworzyć skutecznej szczepionki przeciwko temu niebezpiecznemu dla zdrowia i życia ludzi wirusowi Właściwości przeciwutleniające Nadmierne stężenie reaktywnych form tlenu, jakie często towarzyszy stresowi oksydacyjnemu w ustroju, może doprowadzić do uszkodzenia struktur komórkowych, wywołać apoptozę czy martwicę i ma istotne znaczenie w procesie inicjacji nowotworu. Ksantohumol (24) wykazuje silne właściwości antyoksydacyjne i efektywnie neutralizuje wolne rodniki. Jest blisko dziewięciokrotnie silniejszym zmiataczem wolnych rodników hydroksylowych oraz trzykrotnie nadtlenkowych niż Trolox (kwas 6-hydroksy-2,5,7,8- tetrametylchroman-2-karboksylowy), rozpuszczalna w wodzie pochodna witaminy E [73]. Ksantohumol (24) posiada również zdolność do neutralizowania anionorodników ponadtlenkowych generowanych przez oksydazę ksantynową, nie hamując przy tym aktywności tego enzymu. Przy stężeniu IC 50 = 2,6 µm ma również zdolność hamowania powstawania anionorodników ponadtlenkowych w różnicujących się komórkach ludzkiej ostrej białaczki promielocytowej HL-60, podczas gdy jego izomer izoksantohumol (38) nie wykazuje takiej aktywności [73]. W badaniach in vitro prenylowane flawonoidy chmielowe wykazywały działanie ochronne przeciwko indukowanemu jonami Cu 2+ utlenianiu lipoprotein o niskiej gęstości (LDL) [12]. Najsilniejszymi antyoksydantami okazały się chalkony: ksantohumol (24) oraz dezmetyloksantohumol (23). Związki te w stężeniu 5 µm hamowały proces peroksydacji lipidów o ponad 70% przy pięciogodzinnej inkubacji w stosunku do kontroli (LDL + Cu 2+ ). 38

39 Właściwości biologiczne ksantohumolu Ich aktywność była wyższa od α-tokoferolu oraz izoflawonu genisteiny. Prenylowane flawanony, oraz chalkony zawierające w swej strukturze więcej niż jedno ugrupowanie dimetyloalillowe wykazywały znacznie mniejszą aktywność przeciwutleniającą, natomiast flawonoidy całkowicie pozbawione tej grupy (naringenina (11) oraz chalkonaringenina (8)) stymulowały proces oksydacji lipidów [12]. Pozytywny wpływ grupy prenylowej na właściwości przeciwutleniające wykazali w badaniach in vitro Rodriguez i wsp. [95]. Monoprenylowane chalkony wykazywały silniejsze zdolności do hamowania procesu peroksydacji mikrosomalnej frakcji lipidowej indukowanej jonami żelaza oraz wodoronadtlenkiem tert-butylu (t-bhp) niż chalkony pozbawione grupy prenylowej [95]. Związki zawarte w chmielu, kwasy gorzkie (humulony i lupulony) oraz ksantohumol (24), badano pod kątem zdolności do neutralizacji aktywnych form tlenu [88]. Zastosowano sześć różnych aktywnych form tlenu powstających w skórze. W teście na całkowitą zdolność zmiatania wolnych rodników tlenowych (RAC) prenylowany flawonoid (24) okazał się być równie silnym antyoksydantem, co kontrolny, ekstrahowany z zielonej herbaty Polifenon 60 (frakcja polifenoli zawierająca min. 60% katechin) oraz znacznie silniejszym niż witaminy C i E, oraz chmielowe kwasy gorzkie. Ksantohumol (24) posiadał również niezwykle wysoką zdolność do neutralizacji tlenu singletowego (SAC), od 15 do 35 razy silniejsze właściwości od witaminy E oraz innych związków pochodzących z chmielu, i blisko 8 razy od Polifenonu 60 [88]. Posiadał również najwyższą aktywność w teście oceny siły redukującej jony żelaza (FRAP) oraz zdolności neutralizowania rodników ponadtlenkowych (SD) [88]. becność grupy prenylowej w szkielecie chalkonowym zwiększa właściwości przeciwutleniejące, co obserwowano in vitro w różnych układach utleniających lipidy [12, 95]. W ostatnich latach próbowano określić wpływ obecności oraz pozycji podstawienia grup hydroksylowych i metoksylowych, oraz ugrupowań geranylowych i prenylowych w chalkonach na właściwości biologiczne, w tym aktywność przeciwutleniającą [43, 96, 97]. Zsyntezowano ksantohumol (24) oraz inne chalkony chmielowe, produkty procesu detoksykacji ksantohumolu (24) w fazie I i II oraz nie występujące naturalnie układy, strukturalnie podobne do ksantohumolu (24) (Ryc ). Zastąpienie grupy prenylowej grupą geranylową nie wpływa znacząco na zdolność antyoksydacyjną w teście RAC [96]. Natomiast ważne okazało się podstawienie pozycji C-4 oraz C-6 w pierścieniu A. becność dwóch grup hydroksylowych (23 i 59), bądź dwóch grup metoksylowych (24 i 26) w tych pozycjach zwiększa znacząco zdolność zmiatania wolnych rodników tlenowych [43, 96]. Ponadto wydaje się, iż w przypadku dimetoksylowych pochodnych obecność grupy 39

40 Właściwości biologiczne ksantohumolu prenylowej w pozycji 3 nie wpływa na badaną aktywność związku (Tabela 5.3.2). dmienną zależność zaobserwowano dla flawonoidów posiadających jednocześnie w swej strukturze grupę hydroksylową w pozycji C-4 oraz metoksylową w C-6. kazuje się bowiem, iż związek 58 różniący sie od ksantohumolu (24) brakiem ugrupowania dimetyloallilowego w pozycji C-3 wykazuje dwukrotnie wyższą aktywność w teście RAC. -metylacja grupy 2 - H w ksantohumolu (24) oraz obecność grupy metoksylowej C-3 w pierścieniu B (przy braku grupy prenylowej) (60) ma znaczący wpływ na podwyższenie zdolności nautralizacji wolnych rodników tlenowych. Duże znaczenia ma również utlenienie grupy prenylowej do 3- hydroksy-3metylobutylowej (61). Addycja cząsteczki wody do wiązania olefinowego w dimetyloallilu spowodowała bowiem ponad dwukrotne zwiększenie aktywności przeciwutleniającej w stosunku do kontrolnego ksantohumolu (24) [96]. 3" 5" 4" 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' β 2 α H H H H H C H 3 H H H H H H H H H H H H H H H H H H Rycina Chalkony wykazujące najwyższy potencjał antyoksydacyjnym w teście RAC [43, 96, 97] Tabela 1. Zdolność doneutralizowania wolnych rodników tlenowych (RAC) wybranych chalkonów, wyrażona jako ekwiwalent Trolox [43, 96, 97] Związek Ekwiwalent Trolox XN (23) 2,3 26 3,8 57 4,0 58 4,4 DXN (23) 3,8 59 5,2 60 6,0 61 4,8 40

41 Właściwości biologiczne ksantohumolu 5.4. Właściwości przeciwzapalne Jedną z przyczyn rozwoju stanu zapalnego w organizmie jest aktywacja transkrypcyjnego czynnika jądrowego NK-κB, który inicjuje proces transkrypcji licznych genów, w tym kodujących enzymy wywołujące stan zapalny, takich jak cyklooksygenaza (CX-2) odpowiedzialnej za syntezę prozapalnych prostaglandyn, czy syntaza tlenku azotu II (ins). Rozwój stanu zapalnego ma również duży wpływ na zjawisko onkogenezy, dlatego zdolności do hamowania aktywacji czynnika NF-κB, oraz inhibicyjny wpływ ksantohumolu (24) na CX-2 oraz ins, opisane zostały w podrozdziałach oraz Ksantohumol (24) oprócz właściwości przeciwzapalnych, wpływających znacząco na hamowanie rozwoju i wzrostu komórek nowotworów, wykazuje silną aktywność przeciwdziałającą przewlekłemu alergicznemu kontaktowemu zapaleniu skóry in vivo [98]. Ksantohumol (24), izoksantohumol (37), 8-prenylonaringenina (43) oraz ich glikozydowe pochodne badane były pod kątem hamowania wytwarzania cytokiny (IL-12) w komórkach makrofagów, w których indukowano stan zapalny za pomocą LPS oraz INF-γ. IL-12 jest najważniejszym czynnikiem w odpowiedzi immunologicznej pomocniczych limfocytów T, prowadzących do wystąpienia uczulenia. Spośród przebadanych związków ksantohumol (24) najsilniej hamował wytwarzanie IL-12 przez komórki makrofagów. Po badaniach in vitro na liniach komórkowych przeprowadzono następnie eksperymenty in vivo na myszach, u których wywołano przewlekłe zapalenie skóry ucha. Ksantohumol (24) wykazywał silne działanie przeciwzapalne, poprzez hamowanie produkcji IL-12 również w tym modelu badań [98]. Liczba publikacji oraz patentów dotyczących głównego prenylowanego flawonoidu chmielowego wzrasta sukcesywnie każdego roku. Związek ten wykazuje ogromną różnorodność właściwości biologicznych, które pozytywnie wpływają na organizm ludzki. Dzięki swojemu wszechstronnemu działaniu może zapobiegać powstawaniu schorzeń takich jak nowotwory czy osteoporoza [99] oraz mieć ogromne znaczenie w leczeniu wielu chorób, gdyż stężenia terapeutyczne hamujące ich rozwój są bezpieczne dla prawidłowego funkcjonowaniu organizmu. Ponieważ ilość ksantohumolu (24) w piwie, które stanowi główne źródło tego związku w diecie ludzkiej, jest niewielka, można spodziewać się w najbliższym czasie pojawienia na rynku wielu produktów zawierających w swym składzie ten drogocenny związek. 41

42 Biotransformacje flawonoidów 6. BITRANSFRMACJE FLAWNIDÓW 6.1. Mikrobiologiczne transformacje flawonoidów Znanych jest już ponad 8000 naturalnych flawonoidów, a liczba doniesień literaturowych o nowych izolatach rośnie z roku na rok. Niezwykle szeroka gama aktywności biologicznych, jakie posiadają te metabolity wtórne sprawia, iż cieszą się niesłabnącym zainteresowaniem naukowców na całym świecie. kreślenie aktywności nowo poznanych flawonoidów jest bardzo ważne, gdyż wśród nich trafiają się związki o szczególnie pożądanych i unikatowych cechach. Równolegle prowadzi się badania prowadzące do modyfikacji struktury poznanych już związków, w celu otrzymania jeszcze aktywniejszych form, zwiększeniu ich biodostępności, czy nadaniu zupełnie nowych cech. Narzędziami najczęściej wykorzystywanymi do tego celu są metody syntezy chemicznej oraz transformacje przy użyciu katalizatorów biologicznych. Dzięki wykorzystaniu biokatalizatorów, które cechuje m. in regio- czy stereoselektywność, możliwe jest przekształcenie cząsteczki w pożądanym kierunku w sposób prostszy i tańszy w porównaniu do często kosztownych, wieloetapowych i trudnych do przeprowadzenia konwencjonalnych metod chemicznych. Biotransformacje przy użyciu mikroorganizmów oraz czystych enzymów, mogą być również wykorzystywane jako modele przydatne w określaniu szlaków metabolizmu ksenobiotycznych związków w organizmach ssaków. Spośród wszystkich podklas flawonoidów najliczniej reprezentowane są flawony, flawanony, oraz flawonole [100]. Stąd największa liczba publikacji dotyczących biotransformacji flawonoidów obejmuje właśnie te związki. Dla niepodstawionego flawonu (62) najczęstszym przekształceniem jest jego utlenienie na drodze hydroksylacji [101]. Grzyby strzępkowe z rodzajów Aspergillus, Cunninghamella, Helicostylum, Penicillium oraz Linderina wykazywały zdolność do monolub dihydroksylacji pierścienia B w pozycjach 4 (63) oraz 3 4 (64). Z kolei mikroorganizmy z rodzaju Absidia, Rhizopus, Manascus oraz Gymnascella rozkładały substrat zastosowany do biotransformacji (65, 66) (Ryc ). 42

43 Biotransformacje flawonoidów H H 3' H 4' 4' H 62 H H H 65 H 66 Rycina Główne produkty mikrobiologicznej transformacji niepodstawionego flawonu (62) [101] W badaniach nad wpływem położenia grup hydroksylowych obecnych w pierścieniu A flawonu na przebieg mikrobiologicznej hydroksylacji przez szczep Streptomyces fulvissimus NRRL 1453B, zdolny do przekształcenia 5-hydroksy (67), 6-hydroksy (70) oraz 7-hydroksyflawonu (71), otrzymano 4 hydroksylowane pochodne (68,69,72,73). Dodatkowo jednym z głównych produktów biotransformacji 5-hydroksyflawonu była dihydroksylowa pochodna 5,3,4 -trihydroksyflawon (69) (Ryc ). Wydajność reakcji utlenienia pierścienia aromatycznego B była zależna od odległości grupy karbonylowej (pozycja C4) do grupy hydroksylowej w pierścieniu A [102]. H H 4' 3' H 4' 5 H H 4 H H 4' R 2 7 R 2 7 R R 1 6 R 1=H, R 2=H (70) R 1=H, R 2=H (72) R 2=H, R 1=H (71) R 2=H, R 1=H (73) 4 Rycina Transformacje hydroksyflawonów (67,70,71) przez Streptomyces fulvissimus [102] becność grup hydroksylowych w cząsteczce flawonoidów ma zasadniczy wpływ na ich działanie przeciwutleniające. Efektywność zmiatania wolnych rodników zależy w znaczącym stopniu od stopnia hydroksylacji pierścienia B. Wprowadzenie jednej grupy 43

44 Biotransformacje flawonoidów hydroksylowej poprawia właściwości antyoksydacyjne, natomiast dwóch lub trzech (układ katecholu oraz pirogalolu) znacząco zwiększa zdolność do neutralizowania rodników, oraz hamuje proces oksydacji lipidów. Wiąże się to z możliwością chelatowania jonów metali, będących jedną z przyczyn utleniania lipidów. Mikrobiologiczne hydroksylacje niepodstawionych flawonoidów są zatem bardzo pożądane, gdyż w znaczący sposób mogą poprawiać właściwości antyoksydacyjne tych związków. Przedmiotem licznych badań były również mikrobiologiczne transformacje niepodstawionego flawanonu (74). Najbardziej powszechnymi reakcjami zachodzącymi w kulturach grzybów z rodzaju Absidia, Aspergillus, Penicillium oraz bakterii Streptomyces okazały się hydroksylacje pierścienia B oraz rozpad pierścienia C (Ryc ) [103]. H H 4' 76 H H 4' ' H H 4' 74 H 3' H H 4' Rycina Główne produkty transformacji niepodstawionego flawanonu (74) otrzymane w kulturach grzybów Aspergillus, Penicillium oraz bakterii Streptomyces [103] Kostrzewa i wsp. [104] opisali, również mikrobiologiczną hydroksylację pierścienia A w niepodstawionym flawanonie (74). Grzyby Aspergillus niger MB wykazywały zdolność do wprowadzenia grupy hydroksylowej w pozycji 6 (80). Szczep ten katalizował również reakcję rozpadu pierścienia C, w efekcie którego zarówno z flawanonu (74) jak i jego 6- hydoksypochodnej (80) powstały dihydrochalkony (76,81). 74 H H H 76 H 5' 81 Rycina Transformacja flawanonu (74) przez Aspergillus niger MB [104] 44

45 Biotransformacje flawonoidów W wyniku transformacji flawanonu (74) przez otrzymane na drodze mutagenezy szczepy Aspergillus niger 13/5 oraz A. niger SBP powstał 7-hydroksyflawan-4-ol (82) [105]. Mikroorganizmy te były również zdolne do dehydrogenacji w pozycji C2, prowadzącej do flawonu (83). Trzeci mutant, A. niger IBR 6/2, katalizował z kolei przekształcenie niepodstawionego flawanonu (74) do flawonolu (84). Dziki szczep A. niger KB wykazywał jedynie zdolność do redukcji grupy karbonylowej w pierścieniu heterocyklicznym (85) (Ryc ). A. niger KB oraz A. niger 13/5 wykazywały również zdolność do przekształcenia 6- hydroksyflawanonu (80). W wyniku ich metabolizmu wprowadzony do hodowli substrat ulegał przekształceniu odpowiednio do 6-hydroksyflawan-4-olu (86) oraz 6-hydroksyflawonu (70) (Ryc ). Pozostałe testowane szczepy A. niger nie wykazywały zdolności do przekształcania tego związku [105]. H 7 4 H H H H Aspergillus niger KB 6 H 86 H 6 80 Aspergillus niger 13/5 H 6 70 Rycina Transformacje flawanonu (74) oraz 6-hydroksyflawanonu (80) przez różne szczepy Aspergillus niger [105] Chalkony będące prekursorami w biosyntezie innych flawonoidów, występują w roślinach w znacznie mniejszej ilości, dlatego też liczba doniesień literaturowych na temat mikrobiologicznych transformacji tych związków jest niewielka. 45

46 Biotransformacje flawonoidów Jednym z przykładów takiej biotransformacji jest wykorzystanie rekombinanta Escherichia coli z klonowanymi genami dioksygenazy bifenylowej oraz dehydrogenazy dihydrodiolu, do przekształcenia niepodstawionego chalkonu (87) w jego hydroksylowane pochodne 2-hydroksychalkon (88), oraz 2,3-dihydroksychalkon (89) (Ryc. 20) [106]. rekombinant E. coli H + 2 H 3 H Rycina Mikrobiologiczne hydroksylacje pierścienia B chalkonu przez rekombinowane bakterie Escherichia coli [106] Sanchez-Gonzalez i Rosazza przeprowadzili badania mające na celu wyselekcjonowania mikroorganizmów zdolność do naśladowania metabolizmu roślin, poprzez cyklizację chalkonów do odpowiednich flawanonów [107]. Wyłonili oni szczep Aspergillus alliaceus UI 315, który wykazywał zdolny do hydroksylacji, -demetylacji oraz cyklizacji typu chalkon flawanon (Ryc ). Dalsze badania z wykorzystaniem inhibitorów cytochromu P450 (CYP450): proadifenu (SKF525A), metyraponu oraz fenylotiokarbamidu, które wprowadzono do hodowli, wykazały, iż w katalizę wyżej wymienionych reakcji zaangażowane są trzy różne systemy enzymatyczne związane z CYP450 [107]. cyklaza 91 3' 2' demetylaza H 2' 3' 3' 2' H 90 demetylaza H 2' 3' H cyklaza 93 hydroksylaza 92 3' H 2' H 3 2 H cyklaza H ' 2' H Rycina Możliwe szlaki konwersji chalkonu (90) przez Aspergillus alliaceus UI 315 [100, 107] 46

47 Biotransformacje flawonoidów Sanchez Gonzalez i Rosazza zaobserwowali również, że szczep Aspergillus alliaceus UI 315 jest zdolny do cyklizacji typu chalkon auron [108]. Wprowadzony do kultury 4,2,4 -trihydroksychalkon (96) ulegał reakcji hydroksylacji w pozycji 3 w pierścieniu B do buteiny (97), a następnie cyklizacji do auronu sulfuretyny (98) (Ryc ). Tym samym potwierdzono, iż Aspergillus alliaceus UI315 zdolny jest do naśladowania metabolizmu roślin. Naukowcy zaproponowali również prawdopodobny mechanizm cyklizacji chalkonów z układem katecholu w pierścieniu B do rzadko występujących, nadających roślinom żółto-pomarańczową barwę, auronów (Ryc ). H 4' 2' H 4 H 96 H H H 4' 2' H H 3 H 4 H 6 3' 4' Rycina Transformacje 4,2,4 -trihydroksychalkonu (96) przez Aspergillus alliaceus UI 315 [108] H H H H H H H H H H H H H H H Rycina Proponowany mechanizm tworzenia auronów przez Aspergillus alliaceus UI 315 [108] 47

48 Biotransformacje flawonoidów 6.2. Biotransformacje flawonoidów chmielowych Bardzo silne i jednocześnie pożądane właściwości biologiczne flawonoidów chmielowych stwarzają szansę stosowania ich jako leki przeciwko licznym schorzeniom, dlatego konieczne stało się określenie ich metabolizmu w organizmie człowieka. Jako modele do tego celu wykorzystuje się głównie szczury, frakcje mikrosomalne z wątroby szczurzej oraz ludzkiej, ludzkie enzymy, mikroorganizmy oraz tkanki roślinne. Badania te dotyczą głównie ksantohumolu (24), izoksantohumolu (37) oraz 8-prenylonaringeniny (43). Na podstawie badań z wykorzystaniem mikrosomalnej frakcji z wątroby ludzkiej oraz szczurzej wykazano, że podstawowym typem przekształcenia ksantohumolu (24) jest jego sprzęganie z kwasem glukuronowego w pozycjach C-4 oraz C-4 [109]. Ze względu na obecność przestrzennej zawady, jaką stanowi grupa prenylowa w pierścieniu A, uprzywilejowanym miejscem glukuronidacji jest pozycja C-4 (pierścień B). Mikrosomy wątroby ludzkiej [110] oraz szczurzej [111] mają również zdolność do hydroksylacji pierścienia B w pozycji C-3 oraz modyfikacji grupy prenylowej, co często prowadzi do jej cyklizacji (Ryc ). R 1 4' H 4 R 2 H H R 1= R 2= H CH H 101 H H H H H H H H H H R 2= R 1= H CH H H H H H CH 2 H H H H H H H H CH CH3 106 CH3 Rycina Produkty transformacji ksantohumolu (24) przez mikrosomy wątroby ludzkiej i szczurzej [ ] W celu dokładnego określenia metabolizmu głównego prenylowanego flawonoidu chmielowego wykorzystano szczury laboratoryjne, które karmiono ksantohumolem (24) w ilości 1 gram na kilogram masy ciała. Następnie zbierano i analizowano odchody z wykorzystaniem najnowszych technik, w tym wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z magnetycznym rezonansem jądrowym. prócz ksantohumolu stanowiącego 89% ekstraktu zebrano również 11% metabolitów, z których oznaczono 22 związki (Ryc ). 48

49 Biotransformacje flawonoidów trzymane metabolity były produktami hydroksylacji, -metylacji, -acetylacji, epoksydacji, cyklizacji grupy prenylowej oraz glukuronidacji w pozycji C-4 [112]. H R H H R= H R= H R= H 2 C H R 1 H R 2 R 1= H, R 2= Me 107 R 1=H, R 2=Ac 108 H H R 1= R 2= H CH H 101 H H H H R H R= 37 H H 109 R= H C H 3 H R H R= H 106 R= Me 112 H H R H R=H 113 R= H 114 H R H H R= 115 R= H 116 R= H 117 C H 3 H H C H 3 C H 3 R H H H R H 118 R= H 32 R= Me 119 R= H 120 R= H 121 Rycina Metabolity ksantohumolu (24) wyizolowane ze szczurzych odchodów [112] Badania nad II fazą metabolizmu ksantohumolu (24) z wykorzystaniem ludzkich rekombinowanych UDP-glukuronylotransferaz oraz sulfonotransferaz wykazały, że w wątrobie oraz przewodzie pokarmowym mogą tworzyć się trzy różne monoglukuronidy oraz monosiarczany ksantohumolu (24) [113]. Jirásko i wsp. [114], do badań II fazy detoksykacji wykorzystali szczury laboratoryjne karmione ekstraktem chmielowym, lub zizomeryzowanym ekstraktem chmielowym. W odchodach analizowanych z wykorzystaniem techniki HPLC-ESI-MS/MS, wykryto dwa metabolity I fazy oraz pięć fazy II. Były to produkty reakcji sulfatacji, uwodornienia oraz utleniania. Ksantohumol (24) w fazie I ulegał reakcji hydratacji oraz cyklizacji do flawanonu, następnie w fazie II metabolizmu sprzęganiu z resztą kwasu siarkowego. Na podstawie 49

50 Biotransformacje flawonoidów wyników fragmentacji, zaproponowano możliwe struktury sulfonowych pochodnych ksantohumolu (Ryc ). - S H H H H S H H H H - S H S - H Rycina Prawdopodobne struktury szczurzych sulfonowych metabolitów ksantohumolu (24) [114] Ilość doniesień dotyczących mikrobiologicznych przekształceń ksantohumolu (24) jest niewielka. Dotychczas ukazało się zaledwie pięć prac [15, ]. Herath i wsp. [115] w wyniku badań selekcyjnych przeprowadzonych na 20 mikroorganizmach wyłonili dwa grzyby zdolne do efektywnej transformacji ksantohumolu (24). Drożdże Pichia membranifaciens ATCC 2254 tworzy trzy produkty (Ryc ), w których fragment prenylowy cząsteczki ulegał cyklizacji, jeden z tych metabolitów produktem cyklizacji chalkonu do flawanonu (126) [115]. Z kolei grzyby strzępkowe Cunninghamella echinulata NRRL 3655, prowadziły reakcję hydroksylacji terminalnych grup metylowych w ugrupowaniu dimetylloallilowym, oraz cyklizację typu chalkon flawanon (Ryc ) [15]. H H H H H H H Cunninhamella echinulata Rycina Metabolity ksantohumolu (24) otrzymane w kulturach Pichia membranifaciens ATCC 2254 oraz Cunninhamella echinulata NRRL 3655 [15, 115] H H 24 H H Pichia membranifaciens H 113 H H H H H był H 50

51 Biotransformacje flawonoidów W badaniach przeprowadzonych przez Kima i Lee [116] wyselekcjonowano trzy mikroorganizmy wykazujące zdolność do przekształceń ksantohumolu (24). Grzyby Penicillium chryzogenum KCTC 6933 katalizowały przyłączanie glukozy do cząsteczki substratu, w wyniku czego otrzymano 4 --β-glupiranozyd (129) oraz 4,4 --βdiglukopiranozyd ksantohumolu (130). Grzyby Rhizopus oryzae KCTC 6946, oprócz - glukozylacji w pozycji C-7 przekształcały szkielet chalkonu w układ flawanonu (131), podczas gdy Cunninghamella elegans var. elegans KCTC 6992, katalizowały wyłącznie izomeryzację ksantohumolu (24) do izoksantohumolu (37) (Ryc ). H H H Penicillium chrysogenum 24 Cunninghamella elegans H H R 1= R 2= H R 1 4' H 129 H H R 1,R 2= H H 4 R 2 H H 130 H Rhizopus oryzae H H H H H H 37 Rycina Transformacje ksantohumolu przez Cunningamella elegans, Rhizopus oryzae i Penicillium chrysogenum [116] Badania selekcyjne przeprowadzone przez Huszczę i wsp. na 29 mikroorganizmach wyłoniły 11 grzybów zdolnych do biotransformacji ksantohumolu (24) [117, 118]. Najbardziej efektywne z nich wykorzystano do biotransformacji w skali preparatywnej. Grzyby Absidia glauca AM 177 prowadziły reakcję -glukozylacji w pozycji C-4, podobnie jak opisana wyżej kultura P. chrysogenum KCTC 6933 [116], jednakże z ponad trzykrotnie wyższą wydajnością. Zdolność do przyłączania reszty cukrowej do grupy hydroksylowej w pozycji C-4 wykazywała również kultura Beauveria bassiana AM 278, przy czym dołączanym węglowodanem była 4--metoksyglukopiranoza. Grzyby Pezicula cinnamomea ARK wykazywały zdolność addycji cząsteczki wody do wiązania olefinowego w ugrupowaniu prenylowym, w wyniku czego powstawał z wysoką wydajnością ksantohumol H (61), wykazujący bardzo silne właściwości przeciwutleniające w teście RAC [96], 51

52 Biotransformacje flawonoidów występujący w chmielu w śladowych ilościach. Kultura Fusarium equiseti AM 15 przekształcała ksantohumol (24) do dwóch flawanonów 126a i 126b oraz chalkonu 106, posiadających w swej strukturze układ dihydrofuranu (Ryc ) [117]. H H H H H H 4' H H 4' H H H 129 Absidia glauca Beauveria bassiana 132 H H H H H H Fusarium equiseti 24 Pezicula cinnamomea H H 106 H H H H H H CH 3 126a b Rycina Mikrobiologiczne transformacje ksantohumolu (24) [117] Ze względu na termiczną izomeryzację ksantohumolu (24) zachodzącą w trakcie gotowania brzeczki chmielowej, znacząco wzrasta ilość izoksantohumolu (37). Jego stężenie w niektórych gatunkach piwa może wynosić blisko 3,5 mg/l [38]. Izoksantohumol (37) jest jednocześnie prekursorem najsilniejszego znanego fitoestrogenu, jakim jest 8- prenylonaringenina (43). Istotne stało się zatem określenie ścieżek metabolizmu tego związku w organizmie ludzkim. Ilość publikacji dotycząca tego zagadnienia ogranicza się do zaledwie kilku prac. Jako modele metabolizmu wykorzystywano głównie frakcje mikrosomalne wątroby ludzkiej [110, 119] oraz mikroorganizmy [ ]. Wiedzę o możliwych przekształceniach izoksantohumolu (37) w przyrodzie poszerzają badania z udziałem tkanek roślinnych [124]. 52

53 Biotransformacje flawonoidów Badania nad metabolizmem izoksantohumolu (37) z wykorzystaniem ludzkich cytochromów P450 potwierdziły znaczenie tego związku jako prekursora 8- prenylonaringeniny (43). prócz reakcji demetylacji, następowała również hydroksylacja terminalnych grup metylowych ugrupowania prenylowego, zarówno w izoksantohumolu (37) jak i 8-prenylonaringeninie (43) (Ryc ) [119]. H H H H H H H H H H 135 H H H H H 43 H H H H Rycina Transformacje izoksantohumolu (37) przez ludzkie cytochromy P450 [119] Nikolic i wsp. [110] zidentyfikowali dziesięć metabolitów izoksantohumolu (37) otrzymanych w mikrosomach wątroby ludzkiej. Enzymy wątrobowe katalizowały głównie reakcje utleniania fragmentu prenylowego oraz pierścieni aromatycznych, jak również - demetylację, w wyniku której powstała 8-prenylonaringenina (43) (Ryc ). Możliwość otrzymania 8-prenylonaringeniny (43) z izoksantohumolu (37) stała się przedmiotem badań naukowców z Belgii [ ]. Wykorzystując próbki kału, wyselekcjonowali oni mikroorganizmy naturalnie zasiedlające układ pokarmowy człowieka, zdolne do prowadzenia reakcji -demetylacji. Najbardziej efektywna do przekształcenia izoksantohumolu (37) w 8-prenylonaringeninę (43) okazała się kultura Eubacterium limosum. Bakterie te zdolne były do prowadzenia wspomnianej reakcji z wydajnością 80-90% [120, 122]. 53

54 Biotransformacje flawonoidów H H H 2 C. H H 2 C H H H H H H H H H H H H H H H H H H 140 H H H H 143 H Rycina Metabolity izoksantohumolu (24) otrzymane we frakcji mikrosomalnej ludzkiej wątroby [110] W badaniach przeprowadzonych przez Bartmańską i wsp. [123] wyłoniono trzy mikroorganizmy zdolne do efektywnej transformacji izoksantohumolu (37). Grzyby Absidia glauca AM 177 oraz Bauveria bassiana AM 278 katalizowały reakcję -glikozylacji, w wyniku której do cząsteczki izoksantohumolu (37) przyłączane były odpowiednio glukopiranoza oraz 4-metoksyglukopiranoza. Kultura Fusarium equiseti AM 15 była z kolei zdolna do selektywnej cyklizacji grupy prenylowej w jednym spośród dwóch użytych w reakcji enecjomerów izoksantohumolu (37) (Ryc ). 54

55 Biotransformacje flawonoidów H H H H H H Beauveria bassiana Absidia glauca Fusarium equiseti a,b H H H H H H H 131 Rycina Mikrobiologiczne transformacje izokasntohumolu (37) [123] Niezwykle wysoka aktywność estrogenna 8-prenylonaringeniny (43) stwarza potencjalną możliwość wykorzystania tego związku m. in. w terapii łagodzenia objawów menopauzy i w przeciwdziałaniu osteoporozie [27]. Uzasadnionym stało się zatem dokładne określenie szlaków przekształceń tego związku w organizmie ludzkim. Jako modele do badań wykorzystywano frakcje mikrosomalne ludzkiej wątroby [125, 126] i mikroorganizmy [127, 128]. Zierau, Nikolic i wsp. otrzymali 12 metabolitów 8-prenylonaringeniny (43) [125, 126]. Jako model do badania metabolizmu wykorzystali frakcje mikrosomalne pochodzące z wątroby ludzkiej. Dwa główne produkty biotransformacji, posiadały terminalną grupę metylową we fragmencie prenylowym utlenioną do alkoholu (136) lub aldehydu (145) (Ryc ). Główne ścieżki przekształceń 8-prenylonaringeniny (43) we frakcjach mikrosomalnych wątroby ludzkiej związane są z reakcjami hydoksylacji oraz cyklizacji grupy prenylowej. Mikrosomy katalizowały utlenianie zarówno w reszcie dimetylloallilu, jak również pierścieniu B i C, nie obserwowano natomiast hydroksylacji w pierścienu A. Cyklizacja grupy prenylowej prowadziła z kolei do otrzymania pochodnych z układem piranu (150) oraz dihydrofuranu (148, 149). Zaobserwowano również produkt degradacji 8- prenylonaringeniny (152). 55

56 Biotransformacje flawonoidów H H H H H H C H 3 H H H 2 C H H H H 145 H 135 H 136 H H 145 H H H H H 146 H H H H 153 H H H 43 H H 147 C H 3 H H 148 H H H 149 H H 150 H H H H H 151 H 152 Rycina Metabolity 8-prenylonaringeniny (43) otrzymane w mikrosomach ludzkiej wątroby [126] Badania z wykorzystaniem mikroorganizmów jako katalizatorów do przekształceń najsilniejszego znanego fitoestrogenu prowadzone były przez Kima i wsp. [127] oraz Bartmańską i wsp. [128]. W wyniku badań selekcyjnych, wyłoniono cztery, które efektywnie transformowały 8-prenylonaringeninę (43). Grzyby Mucor hiemalis KCTC 6165 oraz Rhizopus oryzae KCTC 6399 katalizowały reakcje -glikozylacji w pozycji C7. Przyłączanym cukrem okazała się glukopiranoza lub jej 6--hydroskypropionylowa pochodna. Układ enzymatyczny grzybów Cunninghamella elegans var, elegans KCTC 6992, oraz Fusarium equuisaeti AM 15 zdolny był z kolei do oksydacyjnej cyklizacji fragmentu prenylowego do dihydrofuranowej pochodnej (149) (Ryc ). 56

57 Biotransformacje flawonoidów H H H H R H R=H 154 H R= H 155 H Rhizopus oryzae H H Fusarium equiseti 43 Cunninghamella elegans H Mucor hemalis H H H H H 154 H H 149 Rycina Mikrobiologiczne transformacje 8-prenylonaringeniny [127, 128] W badaniach przeprowadzonych przez Anioła jako biokatalizatory do transformacji naringeniny (11) oraz flawonoidów chmielowych: ksantoumolu (24), izoksantohumolu (37) i 8-prenylonaringeniny (43) wykorzystano rozdrobnione tkanki roślinne [124]. Spośród 14 owoców i warzyw większość degradowała stosowane substraty. Korzeń buraka ćwikłowego (Beta vulgaris ssp. vulgaris), prowadził hydroksylację w pozycji C3 w substratach o szkielecie flawanonu (Ryc ). ptymalizacja procesu biotransformacji z wykorzystaniem różnych mediów reakcyjnych, wykazała, że obecność glicerolu lub 30% roztworu alkoholu etylowego sprzyja procesowi transformacji. R 1 H H H R 2 Beta vulgaris H R 1 H R 1 = R 2 = 37 R 1 = R 2 = H 43 R 2 R 1 = H R 2 = H 11 Rycina Biotransformacje izoksantohumolu (37), 8-prenylonaringneniny (43) oraz naringeniny (11) przez korzeń buraka ćwikłowego [124] Wykorzystanie frakcji mikrosomalnych do biotransformacji stwarza możliwość dokładnego określenie ścieżek metabolizmu ksenobiotyków w organizmie. Jednak ilości otrzymywanych w ten sposób związków są niewielkie, wystarczające jedynie na określenie ich struktury. Transformacje z wykorzystaniem mikroorganizmów stały się zatem efektywnym narzędziem otrzymywania określonych metabolitów w znacznych ilościach, umożliwiających przeprowadzenie badań biologicznych w celu określenia ich aktywności. 57

58 mówienie i dyskusja wyników 7. MÓWIENIE I DYSKUSJA WYNIKÓW Ksantohumol (24) jest niezwykle aktywnym biologicznie naturalnym związkiem syntetyzowanym przez dwie rośliny: Humulus lupulus i Sophora flavescens, z których jedynie chmiel wykorzystywany jest na dużą skalę. Rosnące zapotrzebowanie przemyslu browarniczego na ekstrakt chmielowy przyczynia się do rosnącej z roku na rok produkcji materiału odpadowego zwanego wychmielinami bogatego we flawonoidy, w tym ksantohumol (24). Wynikiem badań naukowych nad właściwościami prenylowanych flawonoidów jest poszerzenie oferty firm takich jak Hopsteiner, sprzedających do niedawna jedynie granulat i ekstrakt chmielowy o preparaty zawierające ksantohumol (24), izoksantohumol (37) i 8-prenylonaringeninę (43). Ze względu na pożądane m.in. przez przemysł farmaceutyczny, spożywczy i kosmetyczny właściwości ksantohumolu (24), uzasadnione jest wykorzystanie tego związku do otrzymywania jego pochodnych, a następnie ocena, czy wprowadzone zmiany struktury wpłynęły pozytywnie na aktywność produktu. Ksantohumol (24) niezbędny do przeprowadzenia badań opisanych w niniejszej dysertacji wyizolowano z poekstrakcyjnego odpadu chmielowego (rozdział 9.2.1). Jako główny sposób przekształceń wykorzystano biotransformacje z wykorzystaniem kultur mikroorganizmów. W wyniku przeprowadzonych badań selekcyjnych wyłoniono organizmy zdolne do przekształceń ksantohumolu (24) oraz otrzymanej na drodze chemicznej jego cyklicznej pochodnej (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy- 7-prenyloauronu (156). Spośród testowanych drobnoustrojów tylko grzyby strzępkowe okazały się zdolne do efektywnej transformacji. W celu określenia wpływu grupy prenylowej oraz metoksylowej na aktywność biologiczną chalkonów, zaplanowano również poddanie biotransformacji występującego w chmielu prekursora ksantohumolu (24) - chalkonaringeniny (8) Jednak nietrwałość tego związku w środowisku wodnym w szerokim zakresie ph 2,6-8,8 uniemożliwił przeprowadzenie takich eksperymentów. W kolejnym etapie badań prowadzono reakcje fotochemiczne. Ze względu na zdolność prostych strukturalnie chalkonów do izomeryzacji cis-trans, spodziewano się otrzymać pochodne trans-ksantohumolu, które mogłyby posłużyć jako substraty do biotransformacji. Mimo sprawdzenia wielu układów reakcyjnych nie udało się przekształcić tego flawonoidu w jego formę trans. trzymano natomiast nowe, nieopisane do tej pory pochodne. 58

59 mówienie i dyskusja wyników statnim etapem badań było określenie aktywności biologicznej substratów oraz produktów otrzymanych na drodze biotransformacji oraz przekształceń fotochemicznych. Związki przebadano pod kątem zdolności zmiatania wolnego rodnika DPPH (1,1-difenylo-2- pikrylohydrazyl) oraz aktywności cytotoksycznej w stosunku do trzech linii komórkowych ludzkich nowotworów Syntezy chemiczne trzymywanie (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu Jak dotąd dostępna jest wyłącznie jedna publikacja dotycząca (Z)-6,4 -dihydroksy-4- metoksy-7-prenyloauronu (156). Związek ten z niską wydajnością 6,2 %, otrzymano w wyniku reakcji ksantohumolu (24) z 3-morfolino-sydnoniminą (SIN-1) [129]. Ilość otrzymanego auronu 156 okazała się wystarczające jedynie do określenia jego struktury. Jedną z metod otrzymywania Z-auronów jest cyklizacja chalkonów posiadających grupą hydroksylową przy węglu C-2. W metodzie opisanej przez Venkateswarlu i wsp. równomolową mieszaninę octanu rtęci (II) oraz określonego 2 -hydroksychalkonu w pirydynie ogrzewano pod chłodnicą zwrotną, otrzymano więc serię flawonoidów o szkielcie auronowy [130]. Powyższą metodę wykorzystano do otrzymania (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7- prenyloauronu (156) z ksantohumolu (24) (Ryc ). 3" 5" 4" 5 2" H 1" 6 4 3' H 4' H 3 1 2' β 2 5' α 1' 6' Hg(Ac) 2 Py, 135ºC 3" 5" 4" H 5' 2" 4' 1" 6' 3' 7 H 6 8 1' 2' 2 5 β Rycina Cyklizacja ksantohumolu (24) do (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu (156) W celu uzyskania (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu (156) w ilości umożliwiającej przeprowadzenie jego biotransformacji oraz badań biologicznych 0,1 mmola ksantohumolu (24) (354,4 mg) poddano reakcji cyklizacji (rozdział 9.2.2). trzymano w ten sposób 228,3 mg (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu (156) o czystości powyżej 59

60 AU AU mówienie i dyskusja wyników 98% wg HPLC. Wydajność izolowana produktu 156 wyniosła 64,78 %. Przeprowadzona synteza auronu 156 z wykorzystaniem octanu rtęci (II) w pirydynie okazała się zatem ponad dziesięciokrotnie wydajniejsza od metody opisanej przez Stevensa i wsp. [129]. Strukturę auronu (156) określono z wykorzystaniem metod magnetycznego rezonansu jądrowego, spektroskopii masowej, spektroskopii UV oraz poprzez porównanie otrzymanych danych z literaturowymi. W wyniku reakcji cyklizacji szkieletu chalkonowego do auronowego nastąpiło wytworzenie dodatkowego, hetrocyklicznego pierścienia C, w efekcie czego konieczna jest zmiana numeracji poszczególnych atomów węgla. Jednym z dowodów cyklizacji jest przesunięcie charakterystycznego dla chalkonów maksimum absorpcji w kierunku fal o większej długości. Maksimum ksantohumolu (24) wynosi 368,1 nm, podczas gdy produkt (156) posiada dwa pasma, jedne obecne przy λ = 399,6 nm oraz drugie o znacznie niższej intensywności, widoczne przy λ = 337,1 nm. 0,70 368,1 0,30 0,28 399,6 0,65 0,26 0,60 0,24 0,55 0,22 0,50 0,20 0,45 0,18 0,40 0,16 337,1 0,35 0,14 0,30 0,12 0,25 0,10 0,20 0,08 0,15 0,06 0,10 0,04 0,05 0,00 0,02 0,00 497,0 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm Rycina Widma UV ksntohumolu (24) (lewe) oraz (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7-prenyloauronu (156) (prawe) Brak sygnałów pochodzących od protonów wiązania α,β olefinowego, które na widmie 1 H NMR ksantohumolu (24) widoczne są w postaci jednoprotonowych dubletów o stałej sprzężenia 15,6 Hz przy 7,67 (H-α) i 7,77 ppm (H-β) potwierdza przekształcenie szkieletu chalkonowego. Natomiast na widmie produktu (156) obecny jest jednoprotonowy singlet o przesunięciu chemicznym δ: 6,58 ppm, jest to sygnał od protonu benzylidynowego (H-β) (Ryc ). Poza niewielkim przemieszczeniem niektórych z sygnałów pochodzących od atomów wodoru, nie zaobserwowano innych znaczących zmian w widmach protonowych ksantohumolu (24) oraz produktu jego cyklizacji (156). 60

61 mówienie i dyskusja wyników H-α H-β H-β Rycina Fragmenty widm 1 H NMR ksntohumolu (24) (górne) oraz (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7- prenyloauronu (156) (dolne) Większe różnice zaobserwować można, natomiast porównując widma węglowe 13 C NMR ksantohumolu (24) oraz produktu jego cyklizacji (156). Znacznemu przesunięciu uległy sygnały od atomów węgla pozycjach α oraz β w stosunku do grupy karbonylowej, które w widmie substratu 24 widoczne są przy przesunięciu chemicznym δ: 123,8 (C-α) oraz 142,6 (C-β), podczas gdy w produkcie 156 atom węgla C-2 wchodzący w skład powstalegopięciowęglowego pierścienia C obecny jest przy 146,0 ppm, a sygnał od benzylidynowy atomu (C-β) przy 109,5 ppm (Ryc ). Wartość przesunięcia chemicznego tego ostatniego informuje o konfiguracji wiązania podwójnego w związku (156), bowiem zakres δ między 108,1 112,8 ppm charakterystyczny jest dla Z (cis) auronów, podczas, gdy 119,8 122,2 ppm dla auronów o konfiguracji E (trans) [131]. trzymany w wyniku reakcji cyklizacji auron 156 posiada zatem konfigurację Z. Sygnał od C-2 jest niewidoczny na widmie DEPT 135º produktu 156, co potwierdza, iż pochodzi od czwartorzędowego atomu węgla. Przesunięciu uległy również sygnały od atomów węgla, znajdujące się w otoczeniu miejsca modyfikacji cząsteczki. Sygnał od karbonylowego atomu węgla (C=) na widmie 13 C NMR ksantohumolu (24) obecny jest przy δ: 191,7, natomiast w produkcie 156 przy znacznie wyższym polu δ: 179,0. (Ryc ). 61

62 mówienie i dyskusja wyników C-β C-α C= C-2 C-β Rycina Fragmenty widm 13 C NMR ksntohumolu (24) (górne) oraz (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7- prenyloauronu (156) (prawe) Przeprowadzona analiza wysokorozdzielczej spektroskopii mas (HR ESI-MS) dostarczyła informacji o dokładnej masie atomowej analizowanego związku 156 m/z: 351,1258 [M- H + ], podczas, gdy wartość wyliczona dla związku o wzorze sumarycznym C 21 H H wynosi 351,1227. Porównanie danych widm magnetycznego rezonansu jądrowego z literaturowymi [129] potwierdza, iż otrzymany w wyniku reakcji związek to (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy- 7-prenyloauron (156). Tabela Porównanie sygnałów obecnych na widmie 1 H NMR produktu (156) z danymi literaturowymi [129] Atom wodoru Dane literaturowe * Produkt 156 ** H-5 6,19 6,23 H-2 /6 7,78, 2H, d J=8,7 Hz 7,78, 2H, m H-3 /5 6,85, 2H, d, 8,7 Hz 6,85, 2H, m H-1 3,32, 2H, d, J=7,3 Hz 3,33, 2H, m H-2 5,26, 1H, t, J=7,3 Hz 5,26, 1H, m H-4 1,8, 3H, s 1,80, 3H, s H-5 1,65, 3H, s 1,65, 3H, s C-β 6,54, 1H, s 6,58, 1H, s C4-3,78, 3H, s 3,81, 3H,s * DMS-d 6, 500 MHz, ** DMS-d 6, 600 MHz Różnica w multipletowości sygnałów, wynika prawdopodobnie z zastosowania pewnych uproszczeń w interpretacji widm przez Steavensa i wsp. 62

63 mówienie i dyskusja wyników Tabela Porównanie sygnałów od atomów węgla na widmie 13 C NMR produktu (156) z danymi literaturowymi [129] Atom Dane lit. * Produkt Atom Dane Produkt węgla (156) węgla lit. * (156) C-2 146,3 146,0 C-3 /5 115,9 115,9 C-3 178,6 179,0 C-4 158,7 158,9 C-4 157,1 157,0 C-1 21,2 21,2 C-5 94,3 94,0 C-2 122,2 122,0 C-6 166,2 165,2 C-3 130,7 131,0 C-7 103,9 103,9 C-4 17,7 17,6 C-8 165,2 164,8 C-5 25,5 25,5 C-9 103,2 103,0 C-β 108,9 109,5 C-1 123,5 123,4 C4-55,5 55,6 C-2 /6 132,7 132,8 * DMS-d 6, 500 MHz, ** DMS-d 6, 600 MHz trzymywanie chalkonaringeniny Chalkonaringeninę (8) otrzymano w wyniku reakcji izomeryzacji typu flawanonchalkon w środowisku zasadowym z komercyjnie dostępnej (±) naringeniny (11) (Sigma- Aldrich) metodą opisaną przez Mirandę i wsp. [12]. W reakcji tej następuje otwarcie heterocyklicznego pierścinia C w flawanonie, w efekcie czego powstaje jej izomer chalkon naringeniny (8) (chalkonaringenina, ((E)-4,2,4,6 -tetrakydroksychalkon) (Ryc ). H H 4 5' 4' H 6' 1' 3' 2 2' 3 NaH, H, 70 ºC 6 3' H 4' 2' H 1 β 5' α 1' 6' H H Rycina Izomeryzacja (±) naringeniny (11) do chalkonaringeniny (8) Strukturę otrzymanego produktu (8) określono z wykorzystaniem metod magnetycznego rezonansu jądrowego, spektroskopii masowej oraz spektroskopii UV. Dowodem na przekształcenie szkieletu flawonowego na chalkonowy jest m.in. zmiana maksimum absorpcji na widmie UV. Naringenina (11) posiada maksimum przy λ =286,7 nm, podczas gdy otrzymany produkt (8) posiada pasmo charaktrystyczne dla chalkonów z wolną grupą hydroksylową przyłączoną do atomu wegla C-2 (λ = 365,7 nm) (Ryc ). 63

64 AU AU mówienie i dyskusja wyników 2,20 2,00 1,80 0,42 0,40 0,38 0,36 0,34 0,32 365,7 1,60 1,40 1,20 286,7 0,30 0,28 0,26 0,24 0,22 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 300,00 400,00 nm -0,02 300,00 400,00 nm Rycina Widma UV naringeniny (11) (lewe) oraz chalkonaringeniny (8) (prawe) Ze względu obecność centrum stereogenicznego (C-2), na widmie 1 H NMR naringeniny (11) obecne są sygnały od sprzężonych ze sobą geminalnie (J = 17,1 Hz) diastereotopowych atomomów wodoru przyłączonych do atomu węgla C-3. Sygnały te widoczne w postaci dubletów dubletów przy δ: 2,68 ppm (H-3 ekwaorialny) oraz 3,26 (H-3 aksjalny) daja korelację z dubletem dubletów pochodzącym od H-2 stałą sprzężenia J H2-H3ekw = 2,9 Hz oraz J H2-H3aks = 17,1 Hz. W widmie produktu (8) nie obserwuje się tych sygnałów, obecne są natomiast dwa korelujace ze sobą jednoprotonowe dublety przy δ: 7,57 (H-β) oraz 8,11 (H-α) pochodzące od atomów wiązania olefinowego (Ryc ). H-2 H-3 aks H-3 ekw H-α H-β Rycina Fragmenty widm 1 H NMR naringeniny (11) (górne) oraz chalkonaringeniny (8) dolne 64

65 mówienie i dyskusja wyników Na widmie 13 C NMR naringeniny (11) widoczne są sygnały pochodzące od atomów węgla C-3 (42,0 ppm) oraz C-2 (78,5 ppm), których brak w produkcie (8). Z kolei w chalkonaringeninie (8) obecne są sygnały od atomów węgla nowoutworzonego wiązania podwójnego: C-α przy δ: 125,4 oraz C-β widoczny przy 143,2 ppm. Wyniku reakcji nastąpiła więc izomeryzacja typu flawanon-chalkon. Potwierdzają to przeprowadzone analizy wysokorozdzielczej spektroskopii masowej (HR ESI-MS), w których pik jonu molekularnego w substracie (11) oraz jego produkcie (8) mają tę samą wartość: m/z: 269,0484 [M-H + ], co jest zgodne dla związków o wzorze C 15 H 10 5 (obliczony dla C 15 H H, 269,0444). Jest to dowód na to, że związki te są względem siebie izomerami konstytucyjnymi Badanie stabilności subtratów do biotransformacji Badania wykazywały, iż ksantohumol (24) oraz (Z)-6,4 -dihydroksy-4-metoksy-7- prenyloauron (156) wykazują całkowitą stabilność w warunkach prowadzenia doświadczenia testowano środowisko kwaśne o ph 2,8, zasadowe ph o 8,8, sterylne podłoże hodowlane Sabourauda o ph 6,15, wytrząsanie bez dostępu światła przez 1 dzień, 7 dni oraz 14 dni. Ksantohumol (24) wykazywał stabilność również w podłożu przeznaczonym dla bakterii o ph 6,50 i 6,57. Trwałości auronu 156 w tych podłożach nie badano. W przypadku chalkonaringeniny (8) już po pierwszym dniu prowadzenia doświadczenia zaobserwowano wyraźny brak stabilności. Chalkon ten w zależności od wartości ph ulegał częściowej lub całkowitej izomeryzacji do flawanonu - naringeniny (11). W celu dokładniejszego określenia stopnia izomeryzacji przeprowadzono dodatkowe badanie, w którym analizowano stosunek procentowy obydwu związków w czasie 1h, 3h, 6h oraz 24 h prowadzenia doświadczenia (Tabela.7.2.1). Tabela Procentowa zawartość chalkonaringeniy (8) oraz naringeniny (11) w środowisku o różnym ph ph 2,8 ph 6,15 * ph 8,8 CN N CN N CN N 1h 97,61 2,39 65,43 34, h 94,41 5,59 16,52 83, h 91,55 8, h 70,22 29, * podłoże Sabouraud, CN-chalkonaringenina (8) [%], N-naringenina (11) [%] 65

66 mówienie i dyskusja wyników W środowisku zasadowym reakcja izomeryzacji chalkonaringeniny (8) do naringeniny (11) przebiegała najszybciej. Po pierwszej godzinie doświadczenia nie wykrywano już obecności chalkonu (8), a wyłącznie flawanon (11). W podłożu Sabouraud a całkowite przekształcenie związku (8) obserwowane było w szóstej godzinie doświadczenia. Natomiast w środowisku kwaśnym konwersja przebiegała najwolniej. Chalkonaringenina (8) rozpuszczona w acetonie, mimo lekko kwaśnego charakteru rozpuszczalnika, nie ulegała reakcji cyklizacji nawet po kilkunastu dniach wytrząsania, co sugeruje, iż proces izomeryzacji wymaga środowiska wodnego. Ze względu na niestabilności chalkonaringeniny (11) w środowisku wodnym w szerokim zakresie ph, nie wykorzystano tego związku jako substratu do transformacji mikrobiologicznych. 66

67 mówienie i dyskusja wyników 7.3. Mikrobiologiczne transformacje ksantohumolu Selekcja drobnoustrojów W celu wyłonienia mikroorganizmów zdolnych do efektywnego przekształcenia ksatohumolu (24) przeprowadzono badania selekcyjne z wykorzystaniem kultur stu piętnastu szczepów należących do bakterii, drożdży oraz grzybów strzępkowych (rozdział 9.3.4). Wybór mikroorganizmów wykorzystanych w badań opierał się na przeprowadzonych uprzednio studiach literaturowych oraz dostępności materiału biologicznego (większość z wykorzystanych mikroorganizmów pochodziła z kolekcji Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu). Czterdzieści sześć szczepów wykazywało zdolność do mikrobiologicznej transformacji głównego prenylowanego flawonoidu chmielowego, jako kryterium oceny brano pod uwagę stopień konwersji substratu w siedmiodniowej hodowli skriningowej większy niż 15 % (wg. HPLC). Z poczynionych obserwacji wynika, iż grzyby strzępkowe (45 szczepów) częściej i efektywniej transformowały ksantohumol (24) niż przebadane bakterie czy drożdże. Mikroorganizmami zdolnymi do efektywnych przekształceń ksantohumolu (24) były: Fusarium culmorum AM 7, Fusarium culmorum AM 10, Fusarium avenaceum AM 11, Fusarium tricinctum AM 16, Fusarium oxysporum AM 21, Aspergillus sp. AM 31, Penicillium albidum AM 79, Penicillium camembertii AM 83, Absidia coerulea AM 93, Penicillium spinulosum AM 114, Cladosporium avellaneum AM 135, Spicaria fusispora AM 136, Mortierella vinacea AM 149, Fusarium culmorum AM 196, Fusarium scirpi AM 199, Aspergillus glaucus, AM 211, Mortierella isabellina AM 212, Botrytis cinerea AM 235, Aspergillus nidulans AM 243, Absidia glauca AM 254, Fusarium culmorum AM 282, Mucor circinelloides AM 385, Mortierella mutabilis AM 404, Beauveria bassiana AM 446, Aspergillus ochraceus AM 456, Pholiota aurivella AM 521, Melogramma camphylosporum AM 563, Rhizopus nigricans UPF 701, Aspergillus niger UPF 702, Aspergillus niger UPF 709, Pleurotus eryngii UPF 720, Aspergillus niger UPF 724, Penicillium notatum UPF 725, Rhizopus stolonifer UPF 726, Fusarium oxysporum UPF 727, Pleurotus erygii UPF 728, Coryneum betulinum ARK 6534, Disculina betulina ARK 6538, ARK 6593, Chalara sp. ARK 6664, ARK 6666, Didymosphaeria igniaria ARK 6670, Cryptosporiopsis radicicola ARK 6671, Aspergillus niger KCh 730 i Candida tropicalis PCM

68 mówienie i dyskusja wyników Preparatywne transformacje ksantohumolu Na podstawie wyników analiz ekstraktów hodowli selekcyjnych do dalszych badań w skali preparatywnej wybrano dziesięć szczepów grzybów strzępkowych. wyborze decydował stopień przereagowania substratu wyższy niż 50 % oraz skład jakościowy produktów biotransformacji w siedmiodniowych hodowlach selekcyjnych. Mikroorganizmami wyselekcjonowanymi do preparatywnych transformacji ksantohumolu (24) były: Fusarium avenaceum AM 11, Fusarium tricinctum AM 16, Penicillium albidum AM 79, Absidia coerulea AM 93, Spicaria fusispora AM 136, Mortierella mutabilis AM 404, Beauveria bassiana AM 446, Aspergillus ochraceus AM 456, Rhizopus nigricans UPF 701, Fusarium oxysporum UPF " 5" 4" H 4"' 6"' 1"' H 3"' 2"' H H 2"' CH 3"' 3 1"' 2" 3" H 2"' 3"' 1"' 2" 3" 5' 3" 5" 4" 4' 1" 6' 3' ' β 5' 3 126a,b 1' 2" 2' H 1' 2' 6' 1' H 4' 5' 2' 3' β α H 4' 3' 6 1 H H 2"' 3"' 1"' 2" 3" 4' 5' 6' H 4"' 6"' H 1"' H 3"' 2"' H 4 3 3' H 1' 2' i h H a 6 1 β α H g ' 5' 4' 3" 5" 4" 4' 4 1" 6' 1" 3 6' 3' 3' H 1' 1' 2" 2' 2" 2' H H β α b β α f H 2"' 3"' 1"' 2" 3" 4' 5' H H 4"' 6"' H 1"' H 3"' 2"' H 6' 3' 1' H 2' H e c d 6 1 β α " 5" 4" " " 5' 4 4' 2 3 6' 1' 5' 2' 131a CH H 3 3" CH 5" 4" 3 4 H 3 H 5' H 1" 6' 3' 1' 2" 2' H 3" 5" 4" 4' 1" 6' 3' 1' 2" 2' H β α 4' 3' 6 β α 1 H H 4 3 H Rycina Metabolity ksantohumolu (24) otrzymane w wyniku transformacji preparatywnych w hodowlach: a) Beauveria bassiana AM 446, b) Rhizopus nigricans UPF 701, Absidia coerulea AM 93, Mortierella mutabilis AM 404, c) Mortierella mutabilis AM 404, d) Penicilium albidum AM 79, e) Fusarium tricinctum AM 16, f) Fusarium avenaceum AM 11, Fusarium oxysporum AM 727, g) Spicaria fusispora AM 136, Aspergillus ochraceus AM 456, h-i) Aspergillus ochraceus AM

69 mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Absidia coerulea AM 93 oraz Rhizopus nigricans UPF 701 W wyniku transformacji ksantohumolu (24) przez Absidia coerulea AM 93 oraz Rhizopus nigricans UPF 701 otrzymano 4 --β-d-glukopiranozylo-4,2 -dihydroksy-6 - metoksy-3 -prenylochalkon (129). Po przeprowadzeniu trwającej dziewięć dni transformacji ksantohumolu (24) w kulturze Absidia coerulea AM 93 ze 120 mg substratu otrzymano 50,73 mg czystego produktu (wydajność 29%), podczas gdy z czternastodniowej transformacji z użyciem Rhizopus nigricans UPF 701 wyizolowano 24,84 mg produktu (wydajność 14,2 %). 3" 5" 4" 3" 5" 4" 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' 5 5 H 2" 6 4 H 1" 6 Absidia coerulea AM 93, 9 dni 4"' 6"' H 3' 3 1"' H 1 H 4' 1 β 2 3"' 2"' 2' β H 2 Rhizopus nigricans UPF 701, 14 dni α 5' α 1' 6' H Rycina Transformacje ksantohumolu (24) przez Absidia coerulea AM 93 oraz Rhizopus nigricans UPF 701 Produkt 129 powstał w wyniku reakcji -glikozylacji w pozycji 4 ksantohumolu (24). Jego strukturę zidentyfikowano na podstawie analizy widm magnetycznego rezonansu jądrowego. Przyłączenie fragmentu cukrowego do cząsteczki substratu potwierdza pojawienie się sześciu dodatkowych sygnałów na widmie 13 C NMR, pięciu w zakresie ppm, odpowiadających przesunięciom chemicznym atomów węgli C-2 (73,4 ppm), C-3 (77,0 ppm), C-4 (70,1 ppm), C-5 (77,6 ppm) i C-6 (60,9 ppm) cząsteczki glukopiranozy (Ryc ) oraz jednego obserwowanego przy δ: 100,2, pochodzącego od atomu węgla C-1, charakterystycznego dla anomeru beta [116, 132]. Przyłączenie cząsteczki glukopiranozy potwierdza również pojawienie się na widmie 1 H NMR dodatkowych sygnałów w zakresie 3,10-3,75 ppm, pochodzących od protonów H-2, H-3, H-4 i H-5. Jednoznaczne przypisanie tych sygnałów do określonych pozycji, pomimo faktu iż często nakładają się one na siebie, możliwe było dzięki obecności sprzężeń z odpowiednimi atomami węgla na dwuwymiarowym widmie korelacyjnym HMQC (Ryc ). Sygnał pochodzący od atomu węgla C-6 grupy metylenowej (60,9 ppm) daje korelację z dwoma multipletami leżącymi przy 3,44 oraz 3,75 ppm pochodzącymi od diastereotopowch protonów. Sygnał od atomu węgla C-4 (70,1 ppm) daje korelacje z jednoprotonowym multipletem przy 3,13 ppm. 69

70 C-5 C-3 C-2 C-4 mówienie i dyskusja wyników H-1 b H-3 H-5 H-2 H-6 H-4 H-1 a C-6 Rycina Fragmenty widm 13 C NMR (lewy) oraz HMQC (prawy) przedstawiające sygnały pochodzące od atomów węgla i sprzężonych z nimi atomów wodorów glukopiranozy produktu 129 Atom C-2 widoczny przy 73,4 ppm sprzęga się z protonem przy 3,34 ppm, przy tym samym przesunięciu chemicznym występuje również inny sygnał skorelowany z sygnałem atomu C- 3 (77,0 ppm). Natomiast proton H-5 nałożony na jeden z protonów H-6 sprzęga się z atomem węgla przy δ: 77,6 (C-5 ). prócz sygnałów od atomów węgla oraz protonów pochodzących od fragmentów glukopiranozy, na widmie HMQC możemy zaobserwować również efekty sprzężenia atomu węgla o przesunięciu 21,5 ppm z dwoma protanami: 3,13 ppm (nałożony na H-4 ) oraz 3,35 (nałożony na sygnały H-2 i H-3 ). Sygnały te pochodzą od grupy metylenowej reszty prenylowej (H-1 ) i w cząsteczce substratu widoczne były w postaci dwuprotonowego dubletu o stałej sprzężenia J = 7,1 Hz przy δ: 3,13. Sygnały Na widmie CSY dają one korelację z multipletem pochodzącym od H-2 (5,17 ppm), co jednoznacznie potwierdza, iż przyłączone są do węgla C-1. Brak znaczących różnic w przesunięciu sygnałów od pierścienia B w substracie i produkcie biotransformacji sugeruje, iż -glukozylacja nastąpiła w pierścieniu A. Proton grupy hydroksylowej w pozycji C2 tworzy wiązanie wodorowe z tlenem grupy karbonylowej, przez co sygnał od tej grupy występuje przy bardzo niskim polu: w ksantohumolu (24) 14,69 ppm, a w produkcie (129) otrzymanym w wyniku biotransformacji kulturami Absidia coerulea AM 93 oraz Rhizopus nigricans UPF 701 przy 14,20 ppm. becność tego sygnału oraz zmiana przesunięcia chemicznego jednoprotonowego singletu pochodzącego od H-5, który w cząsteczce ksantohumolu (24) obecny jest przy δ: 6,08, podczas gdy w produkcie przy 6,41 ppm wskazuje, iż miejscem przyłączenie reszty cukrowej była grupa hydroksylowa w pozycji C4. 70

71 mówienie i dyskusja wyników H-5 δ = 6,08 H-5 δ = 6,41 C-2 -H C-2 -H Rycina Fragmenty widm 1 H NMR ksantohumolu (24) (lewy) oraz produktu (129) (prawy) przedstawiające różnice w przesunięciu sygnałów protonów H-5 oraz obecność grup hydroksylowych C-2 -H W celu dodatkowego potwierdzenia przyłączenia reszty cukrowej do substratu wykonano analizę ESI-MS umożliwiającą precyzyjne wyznaczenie masy cząsteczkowej analizowanego związku. Jako metodę jonizacji wykorzystano negatywne elektrorozpylanie, w wyniku którego otrzymany pik molekularny różni się od masy cząsteczkowej o 1. trzymany wynik analizy m/z: 515,2 [M-H] - odpowiada cząsteczce o wzorze C 27 H (m/z obliczony dla C 27 H H, 515,2). 4 --β-d-glukopiranozylo-4,2 -dihydroksy-6 -metoksy-3 -prenylochalkon (129) jest związkiem znanym. trzymany został również na drodze transformacji mikrobiologicznej, jednak z niższymi wydajnościami w kulturach Absidia glauca AM 177 (18,3 %) [117] oraz Penicillium chrysogenum 6933 (5,5 %) [116]. becność reszty cukrowej w cząsteczce znacząco podwyższa polarność, rozpuszczalność w wodzie produktu 129 w stosunku do całkowicie nierozpuszczalnego ksantohumolu (24). Reakcja -glikozylacji może okazać się zatem użyteczną metodą funkcjonalizacji trudno rozpuszczalnego ksantohumolu (24), pod kątem możliwości wykorzystania go jako dodatku do produktów bazujących na wodzie, np. prozdrowotnych napojów. 71

72 mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Mortierella mutabilis AM 404 W wyniku siedmiodniowej transformacji 120 mg ksantohumolu (24) przez Mortierella mutabilis AM 404 otrzymano 85,7 mg mieszaniny (2S)-7--β-D-glukopiranozylo-4 - hydroksy-5-metoksy-8-prenyloflawanonu (131a) oraz (2R)-7--β-D-glukopiranozylo-4 - hydroksy-5-metoksy-8-prenyloflawanon (131b) (de = 89,9 %). Wydajność izolowana mieszaniny wyniosła 49%. 3" 5" 4" 3" 5" 4" 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' β 2 α H Mortierlla mutabilis AM 404 4dni 2" H 1" 4"' 6"' H 3' 1"' H H 4' 3"' 2"' 2' H 5' 1' 6' β 2 α 129 H 7 dni 3" 5" 4" 3" 5" 4" H 4"' 6"' H 1"' H 3"' 2"' H 7 6 1" 8 5 2" ' 6' 1' 2 2' 3 131a 4' 3' H H 4"' 6"' H 1"' H 3"' 2"' H 7 6 1" 8 5 2" ' H 6' 4' 3' 1' 2 2' 3 131b Rycina Biotransformacja ksantohumolu (24) przez Mortierella mutabilis AM 404 Kultura Mortierella mutabilis AM 404, podobnie jak szczepy Absidia coerulea AM 93 oraz Rhizopus nigricans UPF 701, katalizowała reakcję przyłączenia β-d-glukopiranozy do cząsteczki ksantohumolu (24) w pozycji C4 -H. Po czterodniowej transformacji otrzymano 4 --β-glukozyd ksantohumolu (129) z wydajnością 76 % (wg. HPLC), który po dalszej inkubacji w wyniku izomeryzacji typu chalkon-flawanon, przekształcany był do mieszaniny izomerów (2S) i (2R) 7--β-glukozydu izoksantohumolu (131a,b). becność na widmie 13 C NMR sześciu dodatkowych sygnałów o wartościach przesunięcia chemicznego charakterystycznych dla sygnałów atomów węgla β-dglukopiranozy [19], świadczy o przyłączeniu tego cukrowca do cząsteczki flawonoidu. kreślenie często nakładających się na siebie sygnałów protonów pochodzących od sacharydu możliwe było dzięki obserwacji sprzężeń tych atomów z odpowiednimi atomami węgla widocznymi na dwuwymiarowym korelacyjnym widmie HMQC (Ryc ). 72

73 AU AU AU mówienie i dyskusja wyników H-6 H-5 H-2 H-3 H-4 C-5 C-3 C-2 C-4 C-6 Rycina Fragmenty widm 13 C NMR (lewy) oraz HMQC (prawy) przedstawiające sygnały pochodzące od atomów węgla i sprzężonych z nimi atomów wodoru β-d-glukopiranozy produktu 131a,b Diastereotopowe protony H-6 a i H-6 b dające sygnały odpowiednio przy 3,66 i 3,95 ppm sprzęgają się z atomem węgla o sygnale widocznym na widmie 13 C NMR przy δ: 62,8 (C-6 ). Sygnał pochodzący od atomu węgla C-4 daje korelację z multipletem obecnym przy 3,40 ppm. Atomy węgla C-3 i C-2 sprzęgają się z protonami dającymi nałożone na siebie sygnały o przesunięciu 3,54 ppm (H-3 ) i 3,56 ppm (H-2 ), natomiast atom węgla C-5 z protonem dającym sygnał widoczny przy δ: 3,61. W wyniku reakcji izomeryzcji szkieletu chalkonowego do flawanonowego nastąpiło wytworzenie dodatkowego, hetrocyklicznego pierścienia C, co wymaga zmiany numeracji poszczególnych atomów węgla. Jednym z dowodów cyklizacji jest przesunięcie maksimum absorpcji w widmach UV, które dla ksantohumolu (24) i 4 --β-glukozyd ksantohumolu (131a,b) wynoszą odpowiednio 368,1 i 365,7 nm i są charakterystyczne dla chalkonów, podczas gdy 7 --β-glukozyd izoksantohumolu daje dwa pasma: główne charakterystyczne dla flawanonów (280,8 nm) i drugie, o znacznie niższej intensywności obecne przy 323,9 nm. 0,70 368,1 0,028 0, ,7 0,48 210,7 0,46 0,65 0,60 0,024 0,022 0, ,2 0,44 0,42 0,40 0,38 0,55 0,018 0,36 0,50 0,45 0, ,0 0,014 0,012 0,34 0,32 0,30 0,28 0,40 0,010 0,26 0,35 0,30 0,008 0,006 0,004 0,24 0,22 0,20 0,18 280,8 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0,002 0,000-0,002-0,004-0,006-0,008-0,010-0, ,4 560,7 477,5510,5 598,8 528,9 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00-0,02 323,9 420,2 408,1 439,7467,7 487,3 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm 300,00 400,00 500,00 600,00 nm 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm Rycina Widma UV ksntohumolu (24) (lewe), 4 --β-glukozydu ksantohumolu (129) (środkowe) oraz 7 --β-glukozydu izoksantohumolu (131a,b) (prawe) 73

74 mówienie i dyskusja wyników Brak sygnałów pochodzących od protonów wiązania α,β olefinowego, które na widmie 1 H NMR substratu widoczne są w postaci jednoprotonowych dubletów o stałej sprzężenia 15,6 Hz leżą przy 7,67 (H-α) i 7,77 ppm (H-β), potwierdza przekształcenie szkieletu chalkonu we flwawanon. W widmie produktu, ze względu na wytworzenie nowego centrum stereogenicznego, protony przyłączone do atomu węgla w pozycji α do grupy karbonylowej (C-3) są nierównocenne, przez co dają oddzielne sygnały na widmie 1 H NMR. Proton ekwatorialny H-3a widoczny jest przy 2,65 ppm, natomiast aksajalny H-3b przy 2,96 ppm, a sprzężony z nimi proton przy asymetrycznym atomie węgla (C-2) leży przy δ: 5,37. Znacznemu przesunięciu w stosunku do substratu uległy również sygnały od atomów węgla C-α i C-β, które na widmie substratu obecne są odpowiednio przy 123,8 i 142,6 ppm, natomiast na widmie produktu są podwojone i leżą przy znacznie wyższym polu 46,17/46,34 ppm (C-3) oraz 79,21/79,60 ppm (C-2) (Ryc ). becność podwojonych sygnałów dla poszczególnych atomów węgla świadczy obecności dwóch diatereoizomerów w analizowanej próbce. Fakt, iż kultura Mortierella mutabilis AM 404 w pierwszym etapie biotransformacji katalizowała przyłączenie cząsteczki β-d-glukopiranozy, a następnie cyklizację szkieletu chalkonu do flawanonu z wytworzeniem centrum stereogenicznego przy atomie węgla C-2 świadczy, iż są to izomery 2R oraz 2S 7--β-D-glukopiranozylo-4 -hydroksy-5-metoksy-8- prenyloflawanonu (131). Podwojeniu uległy nie tylko sygnały atomów węgla obecne bezpośrednio przy centrum asymetrii, ale większość obecnych w cząsteczce (Ryc ). C-2 C-3 Rycina Fragmenty widm 13 C NMR ksantohumolu (24) (górny) oraz produktu flawanonu (131a,b) (dolny) 74

75 mówienie i dyskusja wyników Na widmie 1 H NMR produktu (131a,b) wiele sygnałów od obu diastreoizomerów nakłada się na siebie, co wprawdzie uniemożliwia ich precyzyjne przypisanie do określonego składnika mieszaniny, jednak nie przeszkadza w określeniu ich dokładnej pozycji w cząsteczce, ponieważ pozostałe nienakładające się na siebie sygnały od protonów znajdujących się w tej samej pozycji w obu związkach korelują wyłącznie z jednym z podwojonych sygnałów od atomów węgla (Ryc ). Interpretację ułatwia dodatkowo znaczna różnica w wartości integracji obu izomerów. trzymane diastereoizomery nie występują więc w stosunku równomolowym, a więc katalizowana przez grzyby Mortierella mutabilis AM 404 reakcja cyklizacji jest stereoselektywna (Ryc ), a stosunek otrzymanych w jej wyniku diastereoizomerów jest wynosi 10:1. H-6 C5- C5-4,01 (0,3 H)/79,20 3,83 (3H)/79,21 Rycina Fragmenty widm 1 H NMR oraz HMQC mieszaniny diastereoizomerów 7--β-Dglukopiranozylo-4 -hydroksy-5-metoksy-8- prenyloflawanonu (131a,b) Na podstawie wyników analizy dichroizmu kołowego stwierdzono, iż diastereoizomer występujący w przewadze (90,91%) ma na atomie C-2 S, o czym świadczy negatywny efekt Cottona przy długości fali λ= 291 nm ([θ] 291 = 9,42) [133]. Przesunięcia chemiczne atomów węgla C-2, C-3, C-4 i C-5 świadczą jednoznacznie, że przyłączonym do cząsteczki flawonoidu sacharydem jest D-glukopiranoza. Położenie sygnałów od atomów węgla C-1 od obu diastereoizomerów przy 101,72 ppm (2R) i 101,79 ppm (2S) oraz korelujących z nimi sygnałów od protonów odpowiednio przy 5,08 ppm (integracja 0,1H) i 5,07 ppm (integracja 1H) dowodzą obecności anomeru beta. Rozprzęganie sygnału od protonów grupy metylenowej reszty prenylowej na dwa, leżące przy 3,23 ppm (H-1 a) oraz 3,40 ppm (H-1 b) oraz znaczne przesunięcie sygnałów protonu w pozycji H-6 izomeru 2R (6,50 ppm, 0,1H) oraz izomeru 2S (6,57 ppm, 1H) w stosunku do substratu (24) (6,08 ppm) świadczą, iż reszta cukrowa przyłączona została do grupy hydroksylowej w pozycji C7. 75

76 mówienie i dyskusja wyników Przyłączenia reszty cukrowej do cząsteczki flawonoidu potwierdzono dodatkowo wykonując analizę ESI-MS. Jako metodę jonizacji wykorzystano negatywne elektrorozpylanie. trzymany wynik analizy m/z: 515,2 [M-H] - odpowiada cząsteczce o wzorze C 27 H (m/z obliczony dla C 27 H H, 515,2). 76

77 mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Baeuveria bassiana AM 446 W wyniku trzydniowej transformacji 120 mg ksantohumolu (24) przez grzyby Baeuveria bassiana AM 446 otrzymano 4 --β-d-4 -metoksy-glukopiranozylo-4,2 - dihydroksy-6 -metoksy-3 -prenylochalkon (132) z wydajnością 23 % (41,3 mg). 3" 5" 4" 3" 5" 4" 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' 6 1 β α H Baeuveria bassiana AM 446 3dni H 4"' 6"' 1"' H 3"' 2"' H 2" 1" 3' 4' H 2' 5' 1' 6' 6 1 β α H Rycina Biotransformacje ksantohumolu (24) przez Beauveria bassiana AM 446 Produkt biotransformacji powstał w wyniku przyłączenia reszty D-4-metoksyglukopiranozy do grupy hydroksylowej C4 -H. Świadczy o tym obecność dodatkowych sygnałów na widmach 13 C NMR oraz 1 H NMR. Na widmie węglowym zaobserwowano 7 dodatkowych sygnałów, z czego trzy odpowiadają dokładnie przesunięciom chemicznym charakterystycznym dla β-glukopiranozy [116, 132]. Są to sygnały pochodzące od atomów węgla C-2 (73,5 ppm), C-6 (60,5 ppm,) oraz C-1 (99,8). Sygnały C-3 oraz C-5 są nieznacznie przesunięte i widoczne odpowiednio przy 76,5 ppm oraz 79,5 ppm. Największa różnica położenia dotyczy sygnału od atomu węgla C-4 fragmentu cukrowego, który widoczny jest przy δ: 76,0, podczas gdy w glikozylowanych pochodnych z przyłączoną cząsteczką β-glukopiranozy leżał w zakresie 69,8-71,8 ppm, w zależności od rodzaju i pozycji wiązania glikozydowego oraz wykorzystanego w podczas analizy NMR deuterowanego rozpuszczalnika [19]. becność sygnałów charakterystycznych dla β-glukopiranozy, niewielkie przesunięcia położenia sygnałów od atomów węgla C-3, C-5 oraz znaczące sygnału od atomu C-4, świadczą o modyfikacji przyłączonej do ksantohumolu (24) reszty β-glukopiranozy (Ryc ). prócz sygnałów pochodzących od cukrowca obecny jest również dodatkowy sygnał przy 59,8 ppm, który na widmie HMQC daje korelację z trójprotonowym singletem przy 3,46 ppm, co świadczy o obecności grupy -metylowej. Na widmie tym można zaobserwować również sprzęganie sygnałów od atomów węgla z sygnałami od protonów, nie występującymi na widmie ksantohumolu (24). Na tej podstawie przypisano poszczególne protony określonym atomom węgla w cząsteczce omawianego produktu 132 (Ryc ). 77

78 mówienie i dyskusja wyników C4 - H-4 H-6 H-3 H-2 H-5 C-5 C-4 C4 - C-3 C-2 C-6 Rycina Fragmenty widm 13 C NMR (lewy) oraz HMQC (prawy) przedstawiających sygnały pochodzące od atomów węgla i sprzężonych z nimi atomów wodoru 4 -metoksy-glukopiranozy produktu 132 Sygnał od atomu węgla C-5 (79,5 ppm) sprzęga się z jednoprotonowym trypletem o stałej sprzężenia 9,1 Hz położonym przy δ: 2,99. Natomiast sygnał pochodzący od atomu węgla C-2 (73,5 ppm) daje korelację z protonem obecnym przy 3,35 ppm, a sygnał od C-3 (76,5 ppm) z sygnałem obecnym przy 3,44 ppm. Na sygnał ten na widmie 1 H NMR nałożony jest również trójprotonowy singlet skorelowany z sygnałem widocznym przy 59,8 ppm (C4 - ). Integracja, multipletowość oraz wartość przesunięcia chemicznego równa 3,46 ppm (efekt odsłaniający tlenu) wskazuje na obecność grupy -metylowej. Dokładną wartość przesunięcia chemiczne sygnału od protonu H-4 (3,50 ppm) określono na podstawie korelacji z sygnałem od atomu C-4, widocznym przy δ: 76,5. Diastereotopowe protony od grupy metylenowej fragmentu cukrowego widoczne są przy przesunięciu 3,51 oraz 3,67 ppm i sprzęgają się z atomem C-6 dającym sygnał widoczny przy 60,5 ppm. Najniżej położony sygnał fragmentu cukrowego pochodzący od atomu węgla C-1 leżący przy δ: 99,8 koreluje się z jednoprotonowym dubletem o stałej sprzężenia 7,8 Hz, widocznym przy 5,03 ppm. Przesunięcie chemiczne tych sygnałów jednoznacznie dowodzi, iż przyłączona pochodna glukopiranozy jest anomerem beta. Wykonanie widma w deuterowanym dimetylosulfotlenku (DMS-d 6 ) daje możliwość zaobserwowania sygnałów pochodzących od grup hydroksylowych analizowanej cząsteczki (4,85-5,45 ppm). Ponadto w rozpuszczalniku tym na widmie CSY atom wodoru od grupy hydroksylowej sprzęga się z protonem przyłączonym do tego samego atomu węgla. 78

79 mówienie i dyskusja wyników Precyzyjne określenie sygnałów od atomów wodoru reszty cukrowej daje więc możliwość dokładnego przypisania pozycji grupy hydroksylowej w sacharydzie. C2 -H C3 -H H-2 H-1 C6 -H H-1 H-2 H-4 H-6 Rycina Fragmenty widma CSY pokazujący sprzężenia pomiędzy sygnałami protonów reszty cukrowej produktu 132 Fragment korelacyjnego widma CSY (Ryc ) przedstawia sygnały będące efektem sprzężenia atomów wodoru H-2, H-3 oraz H-6 z protonami grup hydroksylowych, przyłączonych odpowiednio w pozycjach C-2, C-3 oraz C-6. Jak można zauważyć, sygnał od protonu H-4 nie jest skorelowany z żadnym innym sygnałem, co dowodzi braku grupy hydroksylowej w pozycji C-4. W przedstawionym powyżej fragmencie widma możemy również zaobserwować sprzężenia między protonami reszty cukrowej: H-1 i H-2 oraz grupy prenylowej koreluje sygnał od protonu H-2 i protonów H-1, które uległy rozszczepieniu na dwa sygnały (dublet dubetów, oraz multiplet) widoczne przy 3,12 i 3,32 ppm. Na widmie substratu atomy wodoru tej grupy dają jeden sygnał, co sugeruje, iż -glikozylacja nastąpiła w sąsiedztwie ugrupowania dimetyloallilowego (pierścień B). Zmiana przesunięcia chemicznego sygnału pochodzącego od protonu H-5, które na widmie produktu 132 wynosi 6,37 ppm podczas, gdy w substracie 6,08 ppm oraz obecność sygnału od grupy hydroksylowej w pozycji C2 (14,19 ppm), wskazuje, iż przyłączenie cukrowca miało miejsce w pozycji C4 -H. Brak znaczących różnic w położeniu pozostałych sygnałów sugeruje, iż nie nastąpiła żadna dodatkowa modyfikacja szkieletu chalkonowego, ani grupy prenylowej. Natomiast obecność dodatkowej grupy metoksylowej widocznej na widmie 1 H NMR przy 3,46 ppm, znaczne przesunięcie sygnału atomu węgla C-4 oraz brak grupy hydroksylowej przy tym atomie, dowodzi jednoznacznie, iż przyłączony do cząsteczki substratu sacharyd to β-d-4-metoksy-glukopiranoza. 79

80 mówienie i dyskusja wyników Przeprowadzona analiza spektroskopii mas (ESI-MS) potwierdziła, iż otrzymana na drodze biotransformacji pochodna ksantohumolu (24) ma masę cząsteczkową równą m/z: 529,2 [M-H] -, co odpowiada strukturze o wzorze sumarycznym C 28 H 34 10, jaki posiada 4 -β-d-4 -metoksy-glukopiranozylo-4,2 -dihydroksy-6 -metoksy-3 -prenylochalkon (132). -β-d-4 -metoksy-glukopiranozyd ksantohumolu (132) otrzymany został również w wyniku transformacji ksantohumolu (24) w toku badań przeprowadzonych w Katedrze Chemii Uniwersytetu przyrodniczego we Wrocławiu przez dr hab. Ewę Huszczę w sześciodniowej hodowli Baeuveria bassiana AM 278 z wydajnością 24,7 % [117]. Przeprowadzone studia literaturowe, dowiodły, iż wiele szczepów tego owadobójczego gatunku grzyba wykazuje zdolności prowadzenia reakcji glikozylacji zróżnicowanych strukturalnie substratów, przy czym przyłączanym sacharydem jest zwykle β-d-4 -metoksyglukopiranoza [ ]. 80

81 mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Apergillus ochraceus AM 456 W wyniku dziewięciodniowej transformacji 120 mg ksantohumolu (24) przez Aspergillus ochraceus AM 456 otrzymano cztery produkty biotransformacji. Głównym metabolitem okazał się (Z)-2 -(2 -hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3-6,7]-3,4 - dihydroksy-4-metoksyauron (157) otrzymany z wydajnością 21,18 % (27,7 mg). Związek ten jest nowy, do tej pory niepublikowany. W procesie tym otrzymano również 2 -(2 - hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3 :3,4 ]-4,2 -dihydroksy-6 -metoksychalkon (106) z wydajnością 12,84% (16,1 mg) oraz równomolową mieszaninę (2S,2 S) i (2S,2 R) 2 -(2 - hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3 :7,8]-4 -hydroksy-5-metoksyflawanon (126a,b) z wydajnością 5,66 % (7,1 mg). 3" 5" 4" 2" 1" 6 3' H 4' H 1 2' β 5' α 1' 6' H Aspergillus ochraceus AM dni H 2"' CH 3"' 3 H 5' 3 C 1"' 2" 3" 6' β H 2"' 3"' 6' 1"' 2" 3" H 4' H 3' 1' 2' 157 5' 4' H 8 9 3' 7 1' 2 2' H 2"' 3"' 1"' 2" 3" H 2"' 3"' 1"' 2" 3" 4' 5' 6' 8 3' 9 1' 2' H 7 2 6' 6 1 β α 1' 106 5' 2' ' 3' 3 H H a b Rycina Biotransformacja ksantohumolu (24) przez Aspergillus ochraceus AM 456 Szczep Aspergillus ochraceus AM 456 katalizował reakcje: cyklizacji łańcucha prenylowego, stereoselektywną cyklizację typu chalkon-flawanon, hydroksylację pierścienia B oraz oksydacyjną cyklizację typu chalkon-auron. W przeprowadzonych badaniach zaobserwowano iż w kulturze Aspergillus ochraceus AM 456 w pierwszych dniach transformacji powstaje głównie chalkon (106), który przy dalszej inkubacji przekształcany jest w auron (157) oraz flawanony (126a i 126b). 81

82 mówienie i dyskusja wyników 2 -(2 -hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3 :3,4 ]-4,2 -dihydroksy-6 -metoksychalkon (106) Chalkon (106) powstał w wyniku cyklizacji grupy prenylowej z wytworzeniem dodatkowego pierścienia dihydrofuranowego. Na widmie 1 H NMR produktu (106) nie zaobserwowano sygnałów charakterystycznych dla protonów grupy metylenowej łańcucha prenylowego: dwuprotonowego dubletu o stałej sprzężenia 7,1 Hz, który na widmie substratu widoczny jest przy 3,13 ppm (H-1 ) oraz multipletu przy 5,14 ppm, pochodzącego od protonu H-2. Dowodzi to, iż nastąpiła modyfikacja fragmentu dimetyloalliu w cząsteczce ksantohumolu (24). wytworzeniu nowego centrum stereogenicznego w cząsteczce świadczy obecność na widmie 1 H NMR produktu (106) sygnałów od diastereotopowych atomów wodoru. Jeden z tych sygnałów ma postać jednoprotonowego dubletu dubletów o stałych sprzężenia 15,1 i 9,6 Hz i widoczny jest przy 3,06 ppm (H-3 a), drugi zaś dubletu dubletów o stałych sprzężenia 15,1 i 7,9 Hz i obecny jest przy δ: 3,12 (H-3 b). Na protonowym widmie korelacyjnym CSY atomy te sprzęgają się z protonem dającym dubletem dubletów (J = 9,6 i 7,9 Hz), widocznym przy 4,79 ppm (H-2 ) (Ryc ), co świadczy o obecności układu -CH()-CH 2 - w pierścieniu dihydrofuranu. H-2 H-3 b H-3 a H-2 H-3 Rycina Fragmenty 1 H NMR i CSY ukazujące położenie i sprzężenia sygnałów H-2 i H-3 a i b produktu 106 Modyfikację w łańcuchu prenylowym potwierdza również na widmie 13 C NMR produktu (106) brak sygnałów pochodzących od atomów węgla tworzących wiązanie olefinowe w dimetyloallilu, które w substracie widoczne są przy 123,1 ppm (C-2 ) i 130,0 (C- 3 ). Ze względu na obecność dodatkowego pierścienia, wystąpiła konieczność zmiany numeracji poszczególnych atomów węgla ugrupowania prenylowego. Sygnały oznaczone na widmie substratu jako C-2 oraz C-3 na widmie produktu widoczne są przy znacznie 82

83 mówienie i dyskusja wyników wyższym polu: C-2 przy 92,7 ppm oraz C-2 przy 71,4 ppm. Wartość przesunięcia chemicznego atomu węgla C-2 dowodzi, iż tworzy on wiązanie z heteroatomem pierścienia dihydrofuranowego, natomiast wysoka wartość przesunięcia sygnału od atomu węgla C-2 sugeruje, iż przyłączona jest do niego dodatkowa grupa hydroksylowa (efekt odsłaniający tlenu), a więc atom ten jest czwartorzędowy, co potwierdza widmo DEPT 135º (brak sygnału). obecności grupy hydroksylowej w pozycji C-2 świadczą również wartości przesunięcia chemicznego sygnałów od terminalnych terminalnych grup metylowych łańcucha prenylowego widoczne na widmie 1 H NMR przy δ: 1,26 i 1,29. Mechanizm cyklizacji grupy prenylowej w ksantohumolu (24) zachodzącej w procesie biotransformacji opisany został przez Yilmazera i wsp. [111] oraz Heratha i wsp. [115]. Zakłada on, iż w pierwszym etapie następuje epoksydacja wiązania olefinowego grupy prenylowej, a w drugim atak nukleofilowy grupy hydroksylowej w pozycji C-2 lub C-4 na atom węgla C-2 wchodzący w skład pierścienia oksiranowego. W ten sposób mogą powstać dwa produkty posiadające dodatkowy pierścień dihydrofuranowy (Ryc ). 2" 2" H 4' 2' H H epoksydacja H 4' 2' H H 24 nukleofilowa cyklizacja H 4' 2" 2' H H C H 3 H 4' 2" 2' H H H H H 4' 2' H 4' 2' H H Rycina Proponowany mechanizm cyklizacji grupy prenylowej w wyniku biotransformacji [111, 115] 83

84 AU AU AU mówienie i dyskusja wyników becność na widmie 1 H NMR produktu sygnału od protonu grupy hydroksylowej przyłączonej do węgla C-2 widocznego przy 14,44 ppm dowodzi, iż w ataku nukleofilowym na węgiel pierścienia epoksydowego bierze udział grupa hydroksylowa przyłączona do węgla C-4. Potwierdza to również charakterystyczna dla prenylowanych chalkonów z wolną grupą hydroksylową w pozycji C2 wartość maksimum absorpcji otrzymanego produktu, która wynosi 370,5 nm (Ryc ). W przypadku zablokowania tej grupy maksimum absorpcji wynosiłoby około 346 nm [137]. Wynika stąd, iż otrzymany produkt biotransformacji to 2 - (2 -hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3 :3,4 ]-4,2 -dihydroksy-6 -metoksychalkon (106). (Z)-2 -(2 -hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3-6,7]-3,4 -dihydroksy-4- metoksyauron (157) Produkt 157 powstał w wyniku hydroksylacji pierścienia B oraz cyklizacji typu chalkon-auron z chalkonu (106) opisanego powyżej. transformacji do auronu, świadczy zmiana maksimum absorpcji na widmie UV produktu 157, mianowicie przesunięcie maksimum charakterystycznego dla prenylowanych chalkonów (λ = nm), w kierunku wyższych wartości (λ= 406,9 nm) (Ryc ). 0,70 368,1 0,24 370,5 0, ,9 0,65 0,22 0,045 0,60 0,20 0,040 0,55 0,18 0,50 0,16 0,035 0,45 0,40 0,14 0,030 0,35 0,12 0,025 0,30 0,10 0,020 0,25 0,20 0,08 0,06 0,015 0,15 0,10 0,04 0,010 0,05 0,00 0,02 0,00 0,005 0, ,0 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm ksantohumol (24) chalkon 106 auron 157 Rycina Widma UV ksantohumolu (24), chalkonu 106 oraz auronu 157 Przekształcenie szkieletu chalkonowego do auronowego potwierdzają badania spektroskopowe. Na widmie 1 H NMR produktu brak jest jednoprotonowych dubletów o stałej sprzężenia 15,6 Hz widocznych przy 7,67 oraz 7,77 ppm, pochodzących od protonów wiązania α,β olefinowego ksantohumolu (24). Pojawia się natomiast sygnał od protonu benzylidynowego (H-β), widoczny przy 6,51 ppm. Sygnały od atomów węgla w pozycji α i 84

85 mówienie i dyskusja wyników β w stosunku do grupy karbonylowej również uległy przemieszczeniu. W substracie (24) sygnał od od C-α widoczny jest przy 123,8 ppm, podczas gdy w auronie 157 przy 145,5 ppm (C-2), natomiast sygnał C-β w ksantohumolu (24) daje przesunięcie δ: 142,6, w produkcie obecny jest przy 110,6 ppm. Wartość przesunięcia chemicznego sygnału od atomu benzylidynowego (C-β) w auronach umożliwia dokładne określenie konfiguracji związku. becność tego sygnału w zakresie 108,1-112,8 ppm jest charakterystyczna dla (Z) auronów, podczas gdy w (E)-auronach sygnał ten widoczny jest w zakresie 119,8 122,2 ppm [131]. Brak charakterystycznego sygnału od protonu grupy hydroksylowej (C2 -H) tworzącego wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe z tlenem karbonylowym, leżącego przy bardzo niskim polu (14,69 ppm), potwierdza cyklizację szkieletu chalkonowego. modyfikacji grupy prenylowej w auronie 157 świadczy brak sygnałów pochodzących od atomów węgla tworzących wiązanie podwójne we fragmencie dimetyloallilu, które na widmie 13 C NMR substratu 24 widoczne są odpowiednio przy 123,1 (C-2 ) oraz 130,0 ppm (C-3 ). Na widmie produktu sygnały od tych atomów pojawiały się przy 70,0 ppm (C-2 ) oraz 92,2 ppm (C-2 - w substracie oznaczony jako C-3 ). Ponadto na widmie 1 H NMR produktu 157 nie zaobserwowano sygnału od protonów (H-1 ) grupy metylenowej fragmentu prenylowego, który na widmie ksantohumolu (24) leży przy 3,13 ppm oraz jednoprotonowego multipletu o przesunięciu δ: 5,14 pochodzącego od H-2. Na widmie wykonanym w deuterowanym dimetylosulfotlenku (DMS-d 6 ) pojawiły się dodatkowo dwuprotonowy dublet przy 3,24 ppm (H-3 ), oraz sprzężony z nim jednoprotonowy tryplet, widoczny przy 4,85 ppm (H-2 ). Gdy analizę wykonano w deuterowanym acetonie, sygnały te występowały jako dublety dubletów: dwa pochodzące od diastereotopowych protonów grupy metylenowej, widoczne przy 3,29 ppm (H-3 a) i 3,34 ppm (H-3 b) oraz sprzężony z nim dublet dubletów od protonu H-2 obecny przy 4,93 ppm (Ryc ). Brak rozprzęgania sygnałów od diastereotopowych protonów w widmach wykonywanych w deuterowanym DMS jest dość powszechny, nawet przy zastosowaniu aparatu o dużej rozdzielczość (600 MHz). Pomimo iż protony te są nierównocenne, sygnały nie rozprzęgają się, przez co obserwujemy klasyczny dublet, a dla H-2 tryplet, natomiast w acetonie nierównocenne atomy wodoru grupy metylenowej (H-3 ) są sprzężone geminalnie, i dodatkowo każdy z nich wicynalnie, przez co dają dublety dubletów, podobnie jak sygnał H

86 mówienie i dyskusja wyników H-3 a i H-3 b H-2 Rycina Fragmenty widm 1 H NMR auronu 157 wykonanych w deuterowanym DMS i acetonie (600 MHz) Na podstawie analizy widm 1 H NMR oraz 13 C NMR można stwierdzić jednoznacznie, iż szczep Aspergillus ochraceus AM 456 katalizował również reakcję hydroksylacji pierścienia B w pozycji C-3. Protony od para podstawionego aromatycznego pierścienia B H-2/H-6 DMS-d 6 aceton-d 6 DMS-d 6 aceton-d 6 H-3/H-5 Rycina Sygnały od protonów p- podstawionego pierścienia B ksantohumolu (24) tworzą klasyczny układ spinowy AA BB, który jest bardzo dobrze widoczny na widmie 1 H NMR ksantohumolu (24). Sygnały od protonów H-3/H-5 oraz H-2/H-6 dają bardzo charakterystyczne dla tego układu multiplety (Ryc ), które często w publikacjach naukowych, szczególnie jeśli widmo związku wykonane zostało z wykorzystaniem aparatów o niższej rozdzielczości (< 500 MHz), są błędnie określone jako dublety. Na widmie protonowym otrzymanego w wyniku biotransformacji auronu 157 zamiast dwóch dwuprotonowych multipletów od protonów para podstawionego pierścienia, widoczne są trzy jednoprotonowe sygnały: dwa dublety oraz jeden dublet dubletów (Ryc ), co jednoznacznie wskazuje na modyfikację tego fragmentu cząsteczki. Proton H-6 dający dublet leżący przy 6,51 ppm sprzęga się wicynalną stałą sprzężenia (J = 8,2 Hz) z protonem H-5, który rozprzęgany jest dodatkowo przez atom wodoru w pozycji H-2 (7,41 ppm, J = 2,1 Hz), co daje dublet dubletów (J = 8,2, 2,1 Hz) widoczny przy δ: 7,19. Na podstawie widma korelacyjnego HMQC można jednoznacznie przypisać atomy węgla sprzężone z odpowiednimi protonami w pierścieniu (Ryc ). 86

87 mówienie i dyskusja wyników H-2 H-5 H-6 H-2 H-5 H-6 5' H 4' 6' 3' H 2' Rycina Fragmenty widma 1 HNMR oraz HMQC auronu (157), przedstawiające sygnały od protonów pierścieniu B Brak sygnału od protonu sprzężonego z atomem węgla C-3 oraz znaczne przesunięcie sygnału od tego atomu ku niższemu polu (145,9 ppm) świadczy o przyłączeniu grupy hydroksylowej (odsłaniający efekt tlenu). Wyniki przeprowadzonej analizy HR ESI-MS potwierdziły postulowany wzór sumaryczny auronu 157 C 21 H 20 7 (m/z: 383,1151 [M H] +, obliczony dla C 21 H 20 7 H, 383,1282). Czerwono-pomarańczowe aurony nadają intensywną barwę niektórym kwiatom, dlatego cyklizacja chalkonów do auronów jest często obserwowana w świecie roślin. Do tej pory poznano dwa enzymy katalizujące ten typ reakcji: wyizolowaną z ziaren soi peroksydazę zależną od nadtlenku wodoru [138] oraz syntazę aureuzydyny [139], występującą m. in. w wyżlinie większym (Antirrhinum majus), powszechnie znanym jako lwia paszcza. Tworzenia auronów przez mikroorganizmy, jest słabo udokumentowane prawdopodobnie z powodu dużej aktywności bakteriobójczej i fungistatycznej flawonoidów tej klasy [140, 141]. Sanchez-Gonzalez i Rosazza wykazali, że grzyby Aspergillus alliaceus UI315 posiadają zdolność do przekształcania 4,2,4 -trihydroksychalkonu (96) do 7,3,4 -trihydroksyauronu (sulfuretyny) (98) [108]. Naukowcy zaproponowali również mechanizm tworzenia auronów z chalkonów (Rozdział 6.1, Ryc ) zakładający, że pierwszym etapem reakcji jest hydroksylacja w pozycji C-3 katalizowana przez monooksygenazę cytochromu P450, następnie wytworzenie o-chinonu w pierścieniu B przy udziale oksydazy katecholowej i ostatecznie wewnątrzcząsteczkowy atak nukleofilowy grupy hydroksylowej C-2 na atom węgla w pozycji α, w konsekwencji którego dochodzi do wytworzenia dodatkowego pięcioczłonowego pierścienia heterocyklicznego. trzymany produkt pośredni ulega 87

88 AU AU AU mówienie i dyskusja wyników następnie tautomeryzacji do sufuretyny (98) [108]. becność grupy hydroksylowej w pozycji C-3 w sulfuretynie (98) i auronie (157) oraz przynależność obu biokatalizatorów do rodzaju Aspergillus sugerować może, iż otrzymany w wyniku transformacji ksantohumolu (24) auron 157 powstał analogicznie, według tego samego mechanizmu reakcji. (2S,2 S)-2 -(2 -hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3 :7,8]-4 -hydroksy-5- metoksyflawanon (126a) i (2S,2 R)-2 -(2 -hydroksyizopropylo)-dihydrofurano-[2,3 :7,8]- 4 -hydroksy-5-metoksyflawanon (126b) Grzyby Aspergillus ochraceus AM 456 oprócz enzymów katalizujących reakcję cyklizacji typu chalkon-auron, posiadają również izomerazę chalkonową zdolną do stereoselektywnej izomeryzacji typu chalkon w flawanon. Substratem tej reakcji jest powstający z ksantohumolu (24) w pierwszych dniach biotransformacji chalkon 106. Zmiana maksimum absorpcji z około 370 nm na 290,3 nm świadczy o modyfikacji szkieletu chalkonu do flawanonu (Ryc ). 0,70 0,65 368,1 0,24 0,22 370,5 213,0 0,55 0,60 0,20 0,50 0,55 0,18 0,45 0,50 0,16 0,40 0,45 0,14 0,35 290,3 0,40 0,35 0,12 0,30 0,30 0,10 0,25 0,25 0,08 0,20 0,20 0,06 0,15 0,15 0,10 0,04 0,10 0,05 0,02 0,05 0,00 0,00 0,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 300,00 400,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm nm nm ksantohumol (24) chalkon 106 flawanony 126a,b Rycina Widma UV ksantohumolu (24), chalkonu 106 oraz flawanonów 126a,b Na widmach 1 H NMR oraz 13 C NMR obecne są podwojone sygnały od określonych atomów wodoru i węgla, co świadczy o obecności dwóch związków w analizowanej próbce. Integracja tych sygnałów na widmie 1 H NMR ma tę sama wartość, co dowodzi, iż otrzymane związki występują w stosunku równomolowym. W wyniku cyklizacji chalkonu 106 do flawanonu następuje wytworzenie dodatkowego (drugiego) centrum stereogenicznego w pozycji C-2, w efekcie czego możliwe do uzyskania są aż cztery diastereoizomery (2S,2 S; 2R,2 R; 2S,2 R, 2R,2 S), z czego 2S,2 S i 2R,2 R oraz 2S,2 R i 2R,2 S stanowią pary enancjomerów (Ryc ). 88

89 mówienie i dyskusja wyników H H H H 2" H 2" H 2" H 2" H S,2 S 2R,2 R 2S,2 R 2R,2 S Rycina Diastereoizomery mogące powstać w wyniku cyklizacji chalkonu 106 Jeśli analiza wykonana zostanie w achiralnym deuterowanym rozpuszczalniku, to protony pochodzące od enacjomerów dają na widmie 1 H NMR pojedyncze sygnały. Natomiast sygnały protonów pochodzących od diastereoizomerów mają zazwyczaj różne przesunięcia chemiczne. Bez dodatkowych analiz niemożliwe jest jednoznaczne określenie, czy sygnały pochodzą od dwóch diastereoizomerów, czy dwóch par enancjomerów. kreślenie konfiguracji absolutnej na atomie C-2 we flawanonach możliwe jest dzięki analizom metodami chiralooptycznymi. W analizie dichroizmu kołowego badana próbka wykazywała ujemny efekt Cottona przy λ=291 nm ([θ] 291 = 4,38), co świadczy, że atom węgla C-2 w analizowanym związku posiada konfigurację S [133], zatem reakcja enzymatycznej izomeryzcji była stereoselektywna. Wynik tej analizy oraz fakt identycznej integracji w podwojonych sygnałach od protonów na widmie 1 H NMR dowodzi, iż w analizowanej próbce znajdowały się dwa diastereoizomery o konfiguracji 2S,2 S oraz 2S,2 R. becność podwojonych sygnałów pozwala na precyzyjne przypisanie pozycji, atomu od którego dany sygnał pochodzi, nie można jednak jednoznacznie określić, który z spośród dwóch diastereoizomerów jest jego źródłem. cyklizacji chalkonu do flawanonu świadczy brak na widmie 1 H NMR jednoprotonowych dubletów od protonów wiązania olefinowego obecnych na widmie substratu 24 przy 7,67 ppm (H-α) oraz 7,77 ppm (H-β), oraz obecność dwóch dubletów dubletów pochodzących od ekwatorialnego (2,601/2,607 ppm) oraz aksjalnego (2,953/2,962 ppm) protonu przy węglu C-3 sprzężonych ze sobą geminalnie (J = 16,2 Hz), oraz jednoprotonowego dubletu dubletów, pochodzącego od protonu przy asymetrycznym atomie węgla a C-2 (5,396/5,406 ppm J = 12,6 Hz, 3,0 Hz) sprzężonego z nimi wicynalnie (Ryc ). 89

90 mówienie i dyskusja wyników H-2 H-2 H-3 b, H-3 a, H-3 aks H-3 ekw Rycina Fragment widma 1 H NMR flawanonów 126a,b H-3 aks H-3 ekw H-2 Rycina Fragment widma CSY ukazujący sprzężenie protonów H-3 z protonem H-2 w produkcie (126a,b) Pomimo dużej ilości sygnałów nakładających się na siebie w zakresie 2,9 3,1 ppm (Ryc ), na podstawie sprzężeń spinowo-spinowych udało się dokładnie przypisać podwojone sygnały odpowiednim protonom: H-3 (Ryc ), oraz H-3 a i H-3 b. Rycina Fragmenty widma 1 H NMR przedstawiające diastereoizomerach 126 a,b sygnały od aksjalnych protonów H-3 w Przekształcenie szkieletu chalkonu do flawanonu potwierdza brak obecności sygnału od grupy hydroksylowej C2 -H obecnej na widnie 1 H NMR substratu przy 14,69 ppm oraz znaczne przemieszczenie na widmie 13 C NMR sygnałów od atomów węgla C-α i C-β, które w ksantohumolu (24) tworzą wiązanie podwójne, przez co ich sygnały posiadają wysokie 90

91 mówienie i dyskusja wyników wartości przesunięcia chemicznego: 123,8 i 142,6 ppm, natomiast na widmie produktu widoczne są przy znacznie wyższym polu 47,29/47,38 ppm (C-3) oraz 80,55/80,64 ppm (C- 2). Ponadto, na widmie DEPT 135 sygnał od atomu C-3 jest skierowany do dołu, co oznacza, że pochodzi od atomu węgla grupy metylenowej. Analizy HPLC próbek pobranych w czasie trwania transformacji ksantohumolu (24) przez kulturę Aspergillus ochraceus AM 456 wykazały, iż flawanony (126a,b) tworzone były z chalkonu (106) w ostatnich dniach prowadzonych hodowli. Występowanie układu -CH()-CH 2 - w produktach (126a,b) potwierdza analiza widm 1 H NMR oraz 13 C NMR. Taka sama wartość integracji podwojonych sygnałów od protonów oraz stereoselektywność reakcji izomeryzacji typu chalkon-flawanon (konfiguracja S przy atomie węgla C-2 ) wskazują, iż reakcji cyklizacji uległy dwa enancjomery (2 S oraz 2 R) w stosunku równomolowym, dając mieszaninę racemiczną. becność centrum asymetrii w pozycji C-2 powoduje, iż protony H-3 nie są równocenne i dają oddzielne sygnały w postaci jednoprotonowych dubletów dubletów, leżące w zakresie 3,0 3,1 ppm (Ryc ). A H-3 a ( J = 15,1, 9,3 Hz) A H-3 a ( J = 15,2, 9,6 Hz) B H-3 b ( J = 15,1, 8,4 Hz) B H-3 b ( J = 15,2, 7,8 Hz) Rycina Fragmenty widma 1 H NMR obrazujące sygnały od protonów H-3 a (A i A ) oraz H-3 b (B i B ) produktów 126 a,b W jednym z diastereoizomerów proton H-3 a dający dublet dubletów widoczny przy 3,011 ppm (Ryc A) sprzęga się geminalnie ze stałą o wartości 15,1 Hz z protonem H-3 b, dającym dublet dubletów leżący przy δ: 3,073 (Ryc B), oraz wicynalnie z 91

92 mówienie i dyskusja wyników protonem H-2 obecnym przy 4,731 ppm (J H3 a-h2 = 9,3 Hz). Z tym samym protonem sprzężony jest ze stałą sprzężenia o wartości 8,4 Hz drugi z atomów wodoru przyłączony do węgla C-3. Natomiast w drugim diastereoizomerze dublety dubletów od protonów H-3 są nieznacznie przesunięte w kierunku niższego pola (H-3 a 3,021 ppm, H-3 b 3,095), różnią się również stałymi sprzężeń. ile w stałej geminalnej różnica jest niewielka (J H3 a- H3 b = 15,2 Hz), to w wicynalnych między protonami H-3 a H-2 jest już znaczna (J H3 a-h2 = 9,6 Hz, J H3 b-h2 = 7,8 Hz). Związane jest to z różnym położeniem protonów względem siebie, wynikającym z odmiennej konfiguracji na atomie węgla C-2. Sprzężenia między protonami H-3 oraz H-2 w obu izomerach można również zaobserwować na widmie CSY (Ryc ). H-2 ( J = 9,3, 8,4 Hz) H-2 ( J = 9,6, 7,8 Hz) H-3 b H-3 b H-3 a H-3 a H-2 H-2 Rycina Fragmenty widm 1 H NMR oraz CSY flawanonów 126,a,b By móc dokładnie przypisać distereoizomerom określone sygnały należałoby rozdzielić te związki, następnie określić konfigurację absolutną na atomie węgla C-2 np. metodą krystalografii oraz ponownie wykonać widma NMR rozdzielonych związków. Podjęto zatem próby rozdzielenia flawanonów 126a,b, jednak mimo zastosowania różnorodnych technik rozdziału, nie udało się otrzymać czystych izomerów. trzymane w wyniku biotransformacji flawanony 126a,b zostały wcześniej opisane jako produkty przekształceń ksantohumolu (24) przez grzyby Fusarium equiseti AM 15 [117] oraz Pichia membranifaciens ATTC 2254 [115]. Wiadomo też, że flawanon o konfiguracji 2S wykazuje działanie bójcze względem zarodźca Plasmodium falciparum - jednego z trzech głównych pasożytów wywołujących malarię [15]. 92

93 mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Penicillium albidum AM 79 W wyniku ośmiodniowej transformacji 150 mg ksantohumolu (24) przez kulturę Penicillium albidum AM 79 otrzymano 3 -[3 -hydroksy-3 -metylobutylo]-4,2,4 - trihydroksy-6 metoksychalkon (79) z wydajnością 22,84 % (36 mg). 3" 5" 4" 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' 6 1 β α H Penicilium albidum AM 79 8 dni H 4' 5' H 3" CH 5" 4" 3 2" 1" 6 3' H 1 2' β α 1' 6' H Rycina Biotransformacja ksantohumolu (24) przez Penicillium albidum AM 79 Grzyby Penicillium albidum AM 79 katalizowały reakcję addycji cząsteczki wody do wiązania olefinowego grupy prenylowej. Brak na widmie 1 H NMR produktu 79 brak sygnału pochodzącego od protonu H-2 przy atomie węgla tworzącym wiązanie podwójne w dimetyloallilu, obecnym na widmie substratu w postaci jednoprotonowego multipletu przy δ: 5,14 (Ryc ) dowodzi modyfikacji reszty prenylowej. Z kolei sygnał od atomu węgla C- 2, który na widmie 13 C NMR ksantohumolu (24) leży przy 123,1 ppm, w produkcie 79 widoczny jest przy znacznie wyższym polu δ: 42,6. Sygnał ten na widmie DEPT 135 ma wartość ujemną (skierowany jest w dół) co oznacz, iż pochodzi od grupy metylenowej (Ryc ). Potwierdza to na widmie HMQC korelacja sygnału C-2 z dwuprotonowym multipletem obecnym przy 1,46 ppm, który z kolei daje sygnał korelacyjny na widmie CSY z sygnałami od atomów wodorów H-1 (Ryc ). Świadczy to, że sygnał widoczny przy δ: 1,46 pochodzi od dwóch protonów H-2. Zmianie uległy również sygnały protonów od terminalnych grup metylowych, które na widmie substratu 24 obecne są w postaci dwóch singletów (1,61 ppm i 1,70 ppm), natomiast w produkcie 79 dają jeden singlet o integracji 6, który widoczny jest przy przesunięciu chemicznym 1,13 ppm (Ryc ). Sugeruje to, iż grupy metylowe mają identyczne otoczenie chemiczne. 93

94 mówienie i dyskusja wyników H-2 H-4 H-5 H-1 H-4 /H-5 H-2 H-1 Rycina Fragmenty widm 1 H NMR ksantohumolu (24) (górne) oraz produktu 79 (dolne) przedstawiające zmiany w sygnałach od grupy prenylowej DEPT 135 C-2 C-3 Rycina Widma 13 C NMR oraz DEPT 135º produktu 79 94

95 mówienie i dyskusja wyników H-2 H-1 H-2 H-2 C-2 H-1 Rycina Fragmenty widm HMQC oraz CSY produktu 79 Znacznemu przemieszczeniu uległ również sygnał od atomu węgla C-3, który na widmie substratu 24, ze względu na tworzenie wiązania podwójnego, widoczny jest przy wysokich wartościach przesunięcia chemicznego δ: 130,0. W chalkonie 79 sygnał od tego atomu węgla obecny jest przy 69,0 ppm i nie występuje na widmie DEPT 135º, co oznacza, że pochodzi od czwartorzędowego atomu węgla (Ryc ). Ponadto wartość przesunięcia chemicznego tego sygnału wskazuje na połączenie z atomem tlenu (efekt odsłaniający). Zmiany zaobserwowano również w przesunięciu chemicznym oraz multipletowości sygnału od protonów H-1, które w widmie substratu ze względu na sprzężenie z atomem wodoru H-2 przy wiązaniu podwójnym dają dublet obecny przy 3,13 ppm, natomiast w widmie produkt 79 obecny jest przy wyższym polu (2,50 ppm) w postaci multipletu nałożonego na sygnał od rozpuszczalnika (Ryc ). Nie zauważono znaczących zmian w sygnałach pozostałych atomów, co dowodzi, iż oprócz reakcji addycji wody do wiązania olefinowego grupy prenylowej, nie nastąpiła inna modyfikacja w cząsteczce. Analiza HR ESI-MS jednoznacznie potwierdziła, iż analizowany związek posiada masę cząsteczkową odpowiadającą związkowi o wzorze sumarycznym C 21 H 24 6 (m/z: 371,1457 [M-H] -, obliczony dla C 21 H 24 6 H, 371,1489). 95

96 AU AU mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Fusarium tricinctum AM 16 W wyniku czternastodobowej transformacji 120 mg ksantohumolu (24) przez kulturę Fusarium trincinctum AM 16 otrzymano α,β-dihydroksantohumol (4,2,4 -trihydroksy-6 - metoksy-3-prenylo-α,β-dihydrochalkon (158)) z wydajnością 24 % (29 mg). 3" 5" 4" 3" 5" 4" 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' 6 1 β α H Fusarium trincinctum AM dni 2" 1" 3' H 4' H 2' 5' 1' 6' 6 1 β α H Rycina Biotransformacja ksantohumolu (24) przez Fusarium trincinctum AM 16 Grzyby Fusarium trincinctum AM 16 prowadziły reakcję enzymatycznej hydrogenacji wiązania α,β-olefinowego w cząsteczce ksantohumolu (24) w wyniku czego otrzymano występujący naturalnie w chmielu α,β-dihydroksantohumol (158). Zmiana maksimum absorpcji na widmie UV produktu (24) świadczy o przekształceniu chromatoforowego fragmentu cząsteczki. Przesunięcie maksimum charakterystycznego dla prenylowanych chalkonów z wolną grupą hydroksylową w przy atomie węgla C2 (λ ~ 370 nm) ku krótszej długości fali (λ ~ 292,7 nm) świadczy o zmianie układu chalkonu (Ryc ). 0,70 0,65 0,60 368,1 0,130 0,120 0,110 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,100 0,090 0,080 0,070 0,060 0,050 0,040 0, ,7 0,10 0,05 0,00 0,020 0,010 0, ,0 497,0 461,6 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm 300,00 400,00 nm Rycina Widma UV ksanatohumolu (24) (lewe) i α,β-dihydroksantohumolu (158) (prawe) Modyfikację szkieletu chalkonowego potwierdza brak sygnałów pochodzących od protonów wiązania α,β olefinowego, które na widmie 1 H NMR substratu (24) występują w postaci dwóch jednoprotnowych dubletów o stałej sprzężenia J = 15,6 Hz, widocznych przy δ: 7,67 (H-β) i 7,77 (H-α). Przemieszczeniu uległy również sygnały od atomów węgla 96

97 mówienie i dyskusja wyników tworzących wiązanie nienasycone, które na widmie 13 C NMR ksantohumolu (24) ze względu na obecność wiązania podwójnego, widoczne są przy wysokich wartościach przesunięcia chemicznego: 123,8 ppm (C-α) i 142,6 ppm (C-β). W otrzymanym produkcie 158 sygnały od tych atomów widoczne są przy znacznie wyższym polu: C-α (47,5 ppm), C-β (31,6 ppm) (Ryc ) i na widmie DEPT 135º posiadają ujemną wartość, co dowodzi, iż pochodzą od grup metylenowych. Położenie zmieniły również sygnały od atomów węgla C= oraz C-1, co dodatkowo potwierdza fakt modyfikacji w tym fragmencie cząsteczki (Ryc ). C= C-1 C-α C-β C= C-β C-1 C-α Rycina Widma węglowe α,β-dihydroksantohumolu (158) (górne i środkowe) i ksantohumolu (24) (dolne) Sygnał od protonów H-β widoczny jest na widmie 1 H NMR produktu w postaci dwuprotonowego multipletu przy 2,83 ppm, natomiast sygnał od H-α w postaci multipletu o integracji 4 przy 3,20 ppm. Wynika to z faktu nałożenie się na siebie sygnałów od dwóch grup metylenowych (H-α i H-1 ). Potwierdza to widmo korelacyjne HMQC, na którym można zaobserwować sprzężenie od protonów dających sygnał widoczny przy 3,20 ppm z dwoma atomami węgla C-1 (22,2 ppm) oraz C-α (47,5 ppm) (Ryc ). 97

98 mówienie i dyskusja wyników H-α, H-1 H-β C-1 H-α, H-1 H-β C-β C-α Rycina Fragmenty widm 1 H NMR oraz HMQC α,β-dihydroksantohumolu (158) Nie zaobserwowano znaczących zmian w położeniu pozostałych sygnałów, co sugeruje, że wynikiem biotransformacji ksantohumolu (24) była wyłącznie hydrogenacja wiązania α,β olefinowego. Analiza HR ESI MS potwierdziła, iż badany związek posiada wzór sumaryczny C 21 H 24 5 ; m/z: 357,1755 [M+H] + obliczony dla C 21 H H, 357,1697, zgodny z postulowanym dla α,β-dihydrochalkonu 158. α,β-dihydroksantohumol (158) występuje naturalnie w chmielu [35, 137], jednak ilości tego flawonoidu są znikome (0,00048%) [137], stąd opracowana metoda biotransformacji może okazać się przydatna w pozyskiwaniu tego związku na większą skalę. 98

99 AU AU mówienie i dyskusja wyników Transformacja ksantohumolu przez Fusarium avenaceum AM 11 oraz Fusarium oxysporum AM 727 W wyniku transformacji ksantohumolu (24) przez szczepy Fusarium avenaceum AM 11 oraz Fusarium oxysporum AM 727 otrzymano 2 -(2 -hydroksyizopropylo)- dihydrofurano-[2,3 :3,4 ]-4,2-dihydroksy-6 -metoksy-α,β-dihydrochalkon (159). Znacznie lepszym katalizatorem okazała się kultura F. avenaceum AM 11, z której po siedmiodniowej transformacji 120 mg ksantohumolu (24) wyizolowano 32,8 mg czystego produktu (159) (wydajność 28%). Drugi z mikroorganizmów nie był tak efektywny, tę samą ilość substratu przekształcał z wydajnością 10,2 % (12,86 mg), przy czym czas trwania biotransformacji był ponad dwukrotnie dłuższy (16 dni). trzymany produkt 159, jest związkiem nowym dotychczas nie publikowanym. H 5' 3" 5" 4" 4' 1" 6' 3' 1' 2" 2' H β α H Fusarium avenaceum AM 11, 7 dni Fusarium oxysporum UPF 727, 16 dni H 2"' 3"' 1"' 2" 3" CH ' 5' 6' 3' 1' 2' H 6 1 β α H Rycina Biotransformacja ksantohumolu (24) przez Fusarium avenaceum AM 11 i Fusarium oxysporum AM727 Produkt biotransformacji ksantohumolu przez szczepy Fusarium avenaceum AM 11 i Fusarium oxysporum AM727 powstał w wyniku uwodornienia wiązania α,β olefinowego, oraz cyklizacji grupy prenylowej. przekształceniu układu chalkonu do nasyconej pochodnej świadczy brak maksimum absorpcji charakterystycznego dla prenylowanych 2 -H chalkonów (λ~370 nm), oraz obecność pasma przy λ=295,1 nm. 0,70 0,65 368,1 0,50 0,45 211,9 0,60 0,55 0,50 0,40 0,35 295,1 0,45 0,40 0,30 0,35 0,25 0,30 0,25 0,20 0,20 0,15 0,15 0,10 0,10 0,05 0,05 0,00 0,00 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm 250,00 300,00 350,00 400,00 450,00 nm Rycina Widma UV ksantohumolu (24) (lewe) oraz produktu 159 (prawe) 99

100 mówienie i dyskusja wyników Brak korelacji jednoprotonowych dubletów przy δ: 7,67 ppm i 7,77 ppm pochodzących od protonów H-α oraz H-β nienasyconego wiązania, oraz znaczne przemieszczenie ku wyższemu polu sygnałów od atomów węgla C-α i C-β, które w substracie 24 obecne są odpowiednio przy 123,8 ppm i 142,6 ppm, natomiast na widmie produktu 159 pojawiają się przy 46,9 ppm i 30,8 ppm (Ryc ) świadczą, o uwodornieniu wiązania α,β olefinowego. Potwierdza to również widmo DEPT 135, na którym sygnały od tych atomów węgla pojawiają się z odwróconą fazą, co oznacza, iż pochodzą od grup metylenowych (Ryc ). Położenie zmieniły również sygnały od atomów węgla C= oraz C-1, co dodatkowo potwierdza modyfikację cząsteczki w tym rejonie (Ryc ). DEPT 135 C= C-2 C-2 C-α C-β C-1 C-2 C= C-β C-1 C-α C-2 C-3 C-5 C-5 C-4 Rycina Widma węglowe α,β-dihydroksantohumolu (159) (górne i środkowe) i ksantohumolu (24) (dolne) 100

101 mówienie i dyskusja wyników Na widmie 1 H NMR produktu 159 H-α H-β sygnały od protonów H-α i H-β, widoczne w postaci dwóch C-β dwuprotonowych multipletów leżących odpowiednio przy 3,24 ppm i 2,85 ppm, sprzęgają się z C-α atomami węgla C-α i C-β (widmo HMQC) (Ryc ). Rycina Fragment widma HMQC produktu 159 Modyfikację fragmentu prenylowego potwierdza na widmie produktu 159 brak dwuprotonowego dubletu od grupy metylenowej (H-1 ), który w substracie daje sygnał przy 3,13 ppm, oraz sprzężonego z nim jednoprotonowego multipletu od atomu wodoru H-2, który w ksantohumolu (24) obecny jest przy 5,14 ppm. Pojawiły się natomiast dodatkowe sygnały w postaci trzech jednoprotonowych dubletów dubletów. Dwa z nich pochodzące od protonów H-3 a i H3 b widocznych przy 3,01 ppm i 3,07 ppm i sprzężonych się ze sobą geminalnie (J = 15,1 Hz) oraz wicynalnie (J H-3 a-h-2 = 9,6 Hz; J H-3 b-h-2 = 7,9 Hz) z protonem H-2 dającym dublet dubletów przy δ: 4,75 ppm (Ryc ). becność nierównocennych, diastereotopowych atomów wodoru H-3 a i H-3 b dowodzi, iż nastąpiło wytworzenie centrum sterogenicznego w cząsteczce otrzymanego flawonoidu. Wysoka wartość przesunięcia chemicznego sygnału od H-2, świadczy o tym, że do atomu węgla C-2 przyłączony jest atom tlenu związany z pierścieniem aromatycznym. Sugeruje to obecność układu -CH()-CH 2 -. H-β H-2 H-α H-3 H-2 H-α H-3 b H-3 a H-β H-3 H-α H-2 Rycina Fragmenty widm 1 H NMR i CSY produktu