Załącznik nr 2 Autoreferat

Transkrypt

1 UNIWERSYTET MEDYCZNY w LUBLINIE Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej Katedra Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych Załącznik nr 2 Autoreferat GraŜyna Zgórka Lublin 2013

2 1. Imię i Nazwisko GraŜyna Zgórka 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej Od 1986 do 1991 r. odbywałam studia magisterskie na Wydziale Farmaceutycznym Akademii Medycznej (obecnie Uniwersytet Medyczny) w Lublinie, a następnie (przez okres 1 roku) byłam uczestnikiem studium doktoranckiego na tym Wydziale. Stopnie naukowe i tytuły zawodowe: tytuł zawodowy magistra farmacji z wyróŝnieniem, uzyskany na Wydziale Farmaceutycznym Akademii Medycznej (obecnie: Uniwersytetu Medycznego) w Lublinie stopień doktora nauk farmaceutycznych z wyróŝnieniem, uzyskany na Wydziale Farmaceutycznym Akademii Medycznej (obecnie: Uniwersytetu Medycznego) w Lublinie Tytuł rozprawy doktorskiej: Badanie i izolacja związków kumarynowych oraz kwasów fenolowych w gatunku Libanotis dolichostyla Schischk. (promotor: prof. dr hab. Kazimierz Głowniak; recenzenci: prof. dr hab. Halina Rządkowska-Bodalska, prof. dr hab. Edward Soczewiński) Posiadane dyplomy oraz świadectwa ukończenia specjalistycznych szkoleń: prawo wykonywania zawodu farmaceuty kurs I oraz II stopnia z chromatografii cienkowarstwowej, prowadzony przez Katedrę Chemii Nieorganicznej i Analitycznej AM w Lublinie, kurs I stopnia z chromatografii cieczowej, prowadzony przez Katedrę Chemii Nieorganicznej i Analitycznej AM w Lublinie, Podyplomowe Studium Chromatograficzne (Wydział Chemii UMCS w Lublinie), warsztaty szkoleniowe analityki laboratoryjnej, dotyczące wdraŝania i zarządzania systemem jakości w laboratorium badawczym (wg normy PN-EN 17025) oraz walidacji metod badawczych, 2005 uzyskanie uprawnień kierownika specjalizacji w specjalności: Lek roślinny, 2007 egzamin państwowy i uzyskanie tytułu specjalisty w zakresie specjalności 2

3 podyplomowej: Lek roślinny, uczestnictwo i uzyskanie certyfikatów w cyklu szkoleń, rozwijających kwalifikacje naukowe i dydaktyczne; tematyka szkoleń: a. nowoczesne metody statystyczne stosowane w planowaniu i ocenie wyników badań naukowych, w tym: statystyka w walidacji metod pomiarowych, analizy chemometryczne w STATISTICA oraz metody analizy wariancji i analizy regresji, b. analiza LC w połączeniu z ESI-TOF-MS, c. analiza GC w połączeniu z EI, CI-QQQ-MS/MS, d. nowoczesne metody spektroskopowe w podczerwieni (FTIR) Ponadto, w Katedrze Farmakognozji UM w Lublinie, pełnię funkcję zastępcą osoby wykwalifikowanej, w związku z posiadanym zezwoleniem Głównego Inspektora Farmaceutycznego, obejmującym kontrolę produktów leczniczych przy zwalnianiu serii. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Miejsce zatrudnienia: Uniwersytet Medyczny w Lublinie, Wydział Farmaceutyczny, Katedra Farmakognozji z Pracownią Roślin Leczniczych, ul. Chodźki 1, Lublin asystent naukowo-dydaktyczny do chwili obecnej - adiunkt 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): 4.1. Tytuł osiągnięcia naukowego: Nowoczesne techniki ekstrakcyjne w badaniach bioaktywnych związków flawonoidowych w gatunkach roślin z rodzaju Scutellaria L. (Lamiaceae) i Trifolium L. (Fabaceae) Ww. osiągnięcie naukowe, zgłoszone do postępowania habilitacyjnego, obejmuje monotematyczny cykl 6 publikacji (PUBL 1-6) oraz 1 zgłoszenie patentowe (Z-PAT). 3

4 4.2. Autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa: PUBL-1 G. ZGÓRKA, A. HAJNOS (2003). The application of solid-phase extraction and reversed phase high-performance liquid chromatography for simultaneous isolation and determination of plant flavonoids and phenolic acids. Chromatographia 57 Suppl., s. S-77-S-80. (Wydawnictwo: Springer) IF: 1,145; pkt KBN: 9 Mój wkład w powstanie tej pracy: Jestem autorką oryginalnej, naukowej koncepcji pracy. Zaplanowałam, nadzorowałam i prowadziłam wszystkie doświadczenia, za wyjątkiem technicznego wykonania procedur ekstrakcyjnych dla flawonoidów i kwasów fenolowych. Opracowałam merytorycznie i graficznie wyniki badań oraz przygotowałam tekst manuskryptu w wersji angielskiej. Mój udział procentowy oceniam na: 80%. PUBL-2 G. ZGÓRKA (2006). Retention behavior of silica-bonded and novel polymeric reversed-phase sorbents in studies on flavones as chemotaxonomic markers of Scutellaria L. genus. J. Chromatogr. A 2006, 1120, (Wydawnictwo: Elsevier) IF: 3,554; pkt MNiSW: 24 Mój wkład w powstanie tej pracy: Jestem autorką oryginalnej, naukowej koncepcji pracy. Zaplanowałam i samodzielnie przeprowadziłam wszystkie opisane procedury ekstrakcyjne oraz analizę HPLC. Opracowałam wyniki badań i przygotowałam tekst manuskryptu w wersji angielskiej. Mój udział procentowy: 100%. PUBL-3 G. ZGÓRKA (2009). Ultrasound-assisted solid-phase extraction coupled with photodiode-array and fluorescence detection for chemotaxonomy of isoflavone phytoestrogens intrifolium L. (Clover) species. J. Sep. Sci. 2009, 32, (Wydawnictwo: Wiley) IF: 2,551; pkt MNiSW: 24 Mój wkład w powstanie tej pracy: Jestem autorką oryginalnej, naukowej koncepcji pracy. Zaplanowałam i samodzielnie przeprowadziłam wszystkie opisane procedury ekstrakcyjne oraz analizę HPLC/DAD/FLD. Opracowałam wyniki badań i przygotowałam tekst 4

5 manuskryptu w wersji angielskiej. Mój udział procentowy: 100%. PUBL-4 G. ZGÓRKA (2009). Pressurized liquid extraction versus other extraction techniques in micropreparative isolation of pharmacologically active isoflavones from Trifolium L. species. Talanta 2009, 79, (Wydawnictwo: Elsevier) IF: 3,290; pkt MNiSW: 24 Mój wkład w powstanie tej pracy: Jestem autorką oryginalnej, naukowej koncepcji pracy. Zaplanowałam i przeprowadziłam doświadczenia, związane z oceną efektywności róŝnorodnych technik ekstrakcyjnych, jak równieŝ analizę chromatograficzną uzyskanych wyciągów. Opracowałam wyniki badań i przygotowałam tekst manuskryptu w wersji angielskiej. Mój udział procentowy: 100%. PUBL-5 G. ZGÓRKA (2011). Studies on phytoestrogenic and nonphytoestrogenic compounds in Trifolium incarnatum L. and other clover species using pressurized liquid extraction and high performance column liquid chromatography with photodiode-array and fluorescence detection. J. AOAC Int. 2011, 94, (Wydawnictwo: AOAC International) IF: 1,199; pkt MNiSW: 27 Mój wkład w powstanie tej pracy: Jestem autorką oryginalnej, naukowej koncepcji pracy. Zaplanowałam i wykonałam izolację bioaktywnych składników z ziela koniczyn oraz analizę HPLC/DAD/FLD otrzymanych wyciągów. Opracowałam wyniki badań i przygotowałam tekst manuskryptu w wersji angielskiej. Mój udział procentowy: 100%. PUBL-6 U. CEGIEŁA, J. FOLWARCZNA, M. PYTLIK, G. ZGÓRKA (2012). Effects of extracts from Trifolium medium L. and Trifolium pratense L. on development of estrogen deficiency-induced osteoporosis in rats. Evid. Based Complement. Alternat. Med. vol. 2012, 11 stron. (Wydawnictwo: Hindawi Publishing Corporation) IF: 4,774; pkt MNiSW: 40 Mój wkład w powstanie tej pracy: Jako kierownik projektu MNiSW Nr N N , w ramach którego ww. praca była realizowana, jestem autorką oryginalnej koncepcji naukowej, zakładającej 5

6 wykonanie badań fitochemicznych i biologicznych, opisanych w publikacji. Ponadto, opracowałam i przeprowadziłam procedurę UAE otrzymania ekstraktów izoflawonowych z ziela koniczyn oraz wykonałam ich standaryzację metodą RP-HPLC/PDA. Ekstrakty te zostały następnie wykorzystane przez współautorów pracy w dalszych badaniach farmakologicznych in vivo. Współuczestniczyłam w przygotowaniu tekstu manuskryptu w wersji angielskiej (opis materiału roślinnego, procedur wykonania ekstraktów z ziela koniczyn, udział w dyskusji wyników badań) oraz jego korektach wydawniczych. Mój udział procentowy w całej pracy oceniam na: 30%. Z-PAT G. ZGÓRKA (2011). Polskie zgłoszenie patentowe nr P z dnia r. na wynalazek: Sposób otrzymywania liofilizatów z ziela koniczyn zawierających bioaktywne związki izoflawonowe. Uniwersytet Medyczny w Lublinie (Lublin, Polska). Mój wkład w powstanie zgłoszenia patentowego polegał na opracowaniu sposobu otrzymywania liofilizatów z ziela koniczyn, zawierających bioaktywne związki izoflawonowe, z wykorzystaniem ekstrakcji wspomaganej działaniem ultradźwięków (UAE) oraz suszenia próŝniowego, a następnie standaryzacji uzyskanych ekstraktów (liofiliozatów) metodą RP-HPLC/PDA. Mój udział procentowy: 100%. Łączna punktacja 7 prac zgłoszonych do oceny w postępowaniu habilitacyjnym: IF: 16,513 (148 pkt KBN/MNiSW) Badania naukowe, opisane w powyŝej wymienionych publikacjach oraz zgłoszeniu patentowym, prowadziłam w oparciu o środki finansowe uzyskane z Uniwersytetu Medycznego w Lublinie (projekt habilitacyjny) oraz 3 grantów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa WyŜszego: 2 P05F , N N oraz N N Podczas realizacji ww. badań wykorzystywałam aparaturę naukową otrzymaną w ramach Projektu, finansowanego ze środków Unii Europejskiej (Europejskiego Funduszu Społecznego), zatytułowanego: "WyposaŜenie innowacyjnych laboratoriów prowadzących badania nad nowymi lekami stosowanymi w terapii chorób cywilizacyjnych i nowotworowych" w ramach Programu Operacyjnego Rozwój Polski Wschodniej Oś priorytetowa I. Nowoczesna Gospodarka. Działanie I.3. Wspieranie Innowacji. 6

7 4.3. Omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania: Cel naukowy prac zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego Cel moich badań naukowych, opisanych w pracach zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego, koncentrował się na opracowaniu i optymalizacji metod izolacji, biologicznie aktywnych związków flawonoidowych (flawonów i izoflawonów), z materiału roślinnego lub ekstraktów, w oparciu o nowoczesne, efektywne techniki ekstrakcyjne, i ich wykorzystaniu w dalszych badaniach fitochemicznych, chemotaksonomicznych i biologicznych. Cel ten realizowałam, wykorzystując, jako materiał roślinny, wybrane gatunki z rodzaju Scutellaria L. (Tarczyca) - reprezentującego rodzinę jasnotowatych (Lamiaceae), oraz rodzaju Trifolium L. (Koniczyna), naleŝącego do rodziny bobowatych (Fabaceae). Gatunki te pozyskiwałam za stanu naturalnego lub upraw w Ogrodzie (Pracowni) Roślin Leczniczych Katedry Farmakognozji UM w Lublinie Wprowadzenie w tematykę badawczą prac zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego w oparciu o przegląd najnowszego piśmiennictwa naukowego Flawony tarczyc i izoflawony koniczyn jako biologicznie aktywne składniki roślin krótka charakterystyka Istotną motywacją podjęcia opisanej powyŝej tematyki badawczej, było moje osobiste zainteresowanie (na gruncie fitoterapii) wysoką aktywnością biologiczną, zarówno związków flawonowych, jak i izoflawonowych. Analiza danych literaturowych wskazuje, Ŝe jest to głównie szeroko pojęta aktywność antybiodegeneracyjna. U jej podstaw, w przypadku flawonów tarczyc, leŝą, przede wszystkim, mechanizmy antyoksydacyjne (antywolnorodnikowe). Decydują one m.in. o właściwościach przeciwzapalnych (Park i wsp., 2001; Nakajima i wsp., 2001; Kim i wsp., 2009), hepato- (Nan i wsp., 2002; Regulska-Ilow i wsp., 2007) i kardioprotekcyjnych (Shao i wsp., 2002; Lee i wsp., 2011), przeciwmiaŝdŝycowych (Pietras i wsp., 2000; Li i wsp., 2000) czy przeciwnowotworowych (Wang i wsp., 2004; Ye i wsp., 2007; Hirunuma i wsp., 2011) związków flawonowych, w tym: bajkaliny, bajkaleiny, wogoniny czy skulkapflawonu I i II. Moją szczególną uwagę, zwróciła jednak mniej znana, ale - w ostatniej dekadzie - intensywnie eksplorowana, aktywność neuroprotekcyjna flawonów tarczyc, nad którą prowadzę obecnie badania w ramach projektu N N , finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego, p.t.: Roślinne składniki bioaktywne o działaniu neuroprotekcyjnym z grupy alkaloidów 7

8 Amaryllidaceae oraz flawonów z rodzaju Scutellaria L. - badania fitochemiczne i biologiczne. Uszkodzenia komórek nerwowych w OUN z udziałem endogennych czynników mogą być m.in. następstwem toksycznego działania glutaminianu (Glu) oraz N-metylo-Dasparaginianu (NMDA), wywołujących nadmierną aktywację struktur receptorowych w neuronach (zjawisko ekscytotoksyczności). W badaniach właściwości oksydoredukcyjnych flawonów tarczycy bajkalskiej: bajkaliny i bajkaleiny w komórkach nerwowych szczurów, wykazano skuteczność tych związków w ograniczaniu neurotoksycznego działania β-amyloidu, powstającego z białka prekursorowego - apolipoproteiny (APP) (Heo i wsp., 2004). Nadprodukcja β-amyloidu w tkance mózgowej, skutkująca wytworzeniem blaszek neuronalnych, charakteryzuje zaawansowane stadium choroby Alzheimera. Białko to stymuluje syntezę tlenku azotu (NO) w komórkach mikrogleju, zaś NO nasila uwalnianie Glu (Goodwin i wsp., 1995). Toksyczne działanie Glu, powoduje z kolei zwiększenie poziomu APP i β-amyloidu, co moŝe doprowadzić do powstania pętli dodatniego sprzęŝenia zwrotnego. Flawony tarczycy bajkalskiej posiadają zdolność łączenia się z odpowiednią domeną wiąŝącą receptora NMDA w wyniku czego hamują indukowaną glutaminianem ekscytotoksyczność (Metz, 2006). Kim i wsp. (2008) w badaniach na myszach, potwierdzili tę aktywność dla flawonu wyodrębnionego z korzeni tarczycy bajkalskiej - oroksyliny A. Komórki mikrogleju w tkance mózgowej podlegają apoptozie w momencie aktywacji stanu zapalnego. Na ten autoregulacyjny proces mają hamujący wpływ egzogenne czynniki o właściwościach antyoksydacyjnych, w tym flawony tarczyc. Ustalono, Ŝe wogoninozaleŝnej inhibicji produkcji NO towarzyszyła supresja aktywności indukowalnej syntazy tlenku azotu (inos) i jądrowego czynnika transkrypcyjnego kappa B (NF-κB) w OUN. NaleŜy dodać, Ŝe, w wyniku aktywacji neuronalnej (wywołanej przez cytokiny, czynniki neurotropowe czy neurotransmitery), NF-κB, rezydujący w cytoplazmie w postaci nieaktywnej, ulega translokacji do jądra komórkowego, gdzie wiąŝe się ze specyficznymi, zgodnymi sekwencjami DNA, regulując transkrypcję genów, związanych z procesami zapalnymi i immunologicznymi (O'Neil i Kaltschmidt, 1997). W badaniach in vitro, wogonina chroniła neurocyty mózgu szczura, w przypadku wystąpienia udaru niedokrwiennego, ograniczając ruchliwość komórek mikrogleju, aktywując camp oraz blokując NF-κB (Piao i wsp., 2008), jak równieŝ hamowała, aktywowaną przez proces zapalny, apoptozę komórek glejowych C6 w hodowli szczurzych astrocytów (Kim i wsp., 2001). Xue i wsp. (2010) udokumentowali z kolei, Ŝe terapia bajkaliną zmniejszała, nawet o 73%, poziom NF-κB w korze mózgowej szczurów w warunkach niedokrwienia, natomiast badania koreańskich naukowców, prowadzone z wykorzystaniem hodowli komórek mikrogleju, dowiodły, Ŝe ten sam mechanizm działania posiada takŝe aglikon bajkaliny - bajkaleina (Suk i wsp., 2003). 8

9 Te wybrane przykłady aktywności neuroprotekcyjnej tarczyc, wskazują, Ŝe badania biologiczne, które obecnie prowadzę w ramach ww. projektu MNiSW (szerszy opis zamieściłam w rozdziale 5.2.), są nowatorskie i bardzo celowe ze względu na obserwowany, w dzisiejszych czasach, postępujący wzrost schorzeń neurodegeneracyjnych (choroba Alzheimer a, Parkinsona i inne) i związaną z tym potrzebę poszukiwania nowych środków leczniczych, w tym pochodzenia roślinnego. Drugą grupą biologicznie aktywnych flawonoidów, której badania prowadziłam w ramach tematyki habilitacyjnej oraz projektu badawczego własnego N N , (finansowanego przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa WyŜszego, p.t.: Selektywne modulatory receptorów estrogenowych w rodzaju Trifolium L. - badania fitochemiczne połączone z oceną aktywności antybiodegeneracyjnej na modelach doświadczalnych in vitro oraz in vivo ), były izoflawony. Związki te naleŝą do klasy fitoestrogenów, t.j. polifenolowych, niesteroidowych składników roślin, charakteryzujących się estrogeno-podobną aktywnością biologiczną. Izoflawony posiadają strukturę chemiczną zbliŝoną do 17-β-estradiolu, głównego Ŝeńskiego hormonu płciowego. To podobieństwo, zauwaŝalne zwłaszcza w przypadku jednego z ich głównych metabolitów ekwolu powoduje, Ŝe bardzo dobrze wpasowują się w domenę wiąŝącą jądrowych receptorów estrogenowych (ER) typu α i β, indukując ekspresję genów i wywołując szereg działań biologicznych, typowych dla endogennych estrogenów, co potwierdzono między innymi w badaniach izoflawonów koniczyny łąkowej (Booth i wsp., 2006). Działania te obejmują stymulację procesów transkrypcji i translacji w komórkach docelowych, z następczą regulacją funkcji fizjologicznych tych komórek, zlokalizowanych głównie w układzie rozrodczym, sercowo-naczyniowym, tkance kostnej czy OUN (Setchell i Adlercreutz, 1988). Pogłębione badania mechanizmu działania izoflawonów wykazały, Ŝe aktywność farmakologiczna tych związków jest zbliŝona do tamoksyfenu czy raloksyfenu, t.j. syntetycznych środków leczniczych, obdarzonych równoczesnymi właściwościami estrogennymi oraz antyestrogennymi. PoniewaŜ izoflawony, po związaniu się receptorami estrogenowymi, indukują odpowiedź agonistyczną lub antagonistyczną, określa się je terminem: selektywnych modulatorów receptorów estrogenowych - Selective Estrogen Receptor Modulators = SERMs (McDonnell, 1999). Główne związki izoflawonowe testowano pod kątem ich względnego powinowactwa do ER, które malało w następującym porządku: 17-β-estradiol (wzorzec odniesienia) > genisteina > ekwol > daidzeina > biochanina A. W badanej grupie, genisteina, daidzeina oraz ekwol silniej wiązały się z ER-β niŝ ER-α, co stanowi ich cechę charakterystyczną. Jednocześnie naukowcy ustalili, Ŝe aktywność izoflawonów jest 10 2 do 10 5 razy niŝsza niŝ endogennych estrogenów sterydowych (Kuiper i wsp. 1998). 9

10 U podstaw działania, związanego ze zmniejszaniem objawów naczynioruchowych u kobiet w okresie menopauzy, leŝy właśnie oddziaływanie izoflawonów z ER-β, zlokalizowanymi w neuronach podwzgórza i hamowanie wydzielania hormonu lutenizującego (LH), odpowiedzialnego m.in. za występowanie zlewnych potów i uderzeń gorąca (Greenwood i wsp., 2000). UwaŜa się, Ŝe przyjmowanie tych związków w duŝych dawkach (30-80 mg/dzień) prowadzi do redukcji objawów naczynioruchowych, choć ich skuteczność jest ok. połowę mniejsza w porównaniu do hormonalnej terapii zastępczej (Cassidy i wsp., 2006). Jako SERMs, izoflawony odznaczają się równieŝ aktywnością antyestrogenną, która odróŝnia je od endogennego 17-β-estradiolu. Przykładowo, w badaniach in vivo izoflawonów obecnych w ekstraktach z ziela koniczyny łąkowej wykazano, Ŝe związki te nie wpływają na proliferację komórek endometrium czy gruczołów piersiowych a nawet mogą zmniejszać ryzyko zachorowania na nowotwory piersi lub trzonu macicy (Atkinson i wsp., 2004; Powles i wsp. 2008). Jak wiadomo, endogenne estrogeny w określonych warunkach stymulują proliferację komórek endometrium czy gruczołów piersiowych, co moŝe skutkować rozwojem procesu karcynogenezy. Izoflawon genisteina posiada natomiast jedynie 1/1000 aktywności hormonalnej naturalnych estrogenów i wiąŝąc się z ER w komórkach gruczołów piersiowych, blokuje do nich dostęp endogennych Ŝeńskich hormonów (Zava i Duwe, 1997). Zakłada się więc, Ŝe jako słabe estrogeny, izoflawony działają wystarczająco silnie na ER, aby stymulować proces przyrostu tkanki kostnej oraz zmniejszać (u kobiet w okresie około- i postmenopauzalnym) ryzyko miaŝdŝycy i pochodnych schorzeń układu krąŝenia, ale niewystarczająco efektywnie, aby indukować hormonozaleŝny proces nowotworzenia (Lichtenstein, 1998). Do grupy istotnych działań antybiodegenearcyjnych, jakie wywołują izoflawony, jako SERMs, zalicza się aktywność antyosteoporotyczną. Aktywność ta wynika bezpośrednio z ich podobieństwa strukturalnego do 17-β-estradiolu, który stymuluje rozwój układu kostnego poprzez przyśpieszanie przekształcania mezenchymatycznych komórek zrębu w osteoblasty oraz zwiększanie wytwarzania kolagenu typu I i kalcytoniny, jak równieŝ hamowanie powstawania i dojrzewania osteoklastów (Beck i wsp., 2005). Działanie antyosteoporotyczne potwierdzono m.in. dla mieszaniny izoflawonów (genisteiny, daidzeiny, biochaniny A oraz formononetyny), wyodrębnionych z ziela koniczyny łąkowej (Trifolium pratense L.), które podawano owariektomizowanym samicom szczurów per os, w dawce 20 lub 40 mg/dzień, przez 14 tygodni. Spowodowało to istotny wzrost gęstości, zawartości składników mineralnych oraz masy kości udowej, jak równieŝ wytrzymałości mechanicznej kości piszczelowej w porównaniu z owariektomizowaną grupą kontrolną (OWX). Uzyskane wyniki dowiodły, Ŝe izoflawony z koniczyny łąkowej mogą chronić przed utratą masy kostnej, 10

11 spowodowanej deficytem estrogenów (Occhiuto i wsp., 2007). W innym badaniu in vivo, owariektomizowanym samicom królika podawano walerianian estradiolu, daidzeinę lub wyciąg z ziela koniczyny łąkowej, przez okres 12 tygodni. NajwyŜszą wartość wskaźnika BMD uzyskano w grupie otrzymującej ekstrakt z koniczyny. W podsumowaniu badań stwierdzono, Ŝe suplementacja diety izoflawonami, w przypadku deficytów estrogenowych, znacząco zwiększa gęstość i integralność tkanki kostnej oraz przepływ krwi w obrębie pochwy, jednocześnie minimalnie wpływając na wzrost masy macicy (Ganesan Adaikan i wsp., 2009). Pozytywne efekty aktywności antyostoporotycznej, odnotowywane w literaturze naukowej, skłoniły mnie (w 2009 r.) do opracowania i zgłoszenia do MNiSW własnego ww. projektu badawczego, w ramach którego była m.in. oceniana aktywność antyosteoporotyczna związków izoflawonowych, zawartych w standaryzowanych ekstraktach z dwóch gatunków koniczyn, podawanych per os owariektomizowanym samicom szczurów. Badania te, zostały opisane w rozdziale Biogeneza i związana z nią izomeria związków flawonowych i izoflawonowych Flawony i izoflawony, naleŝące do pochodnych 1,3-difenylopropanu, są związkami o mieszanym pochodzeniu biogenetycznym, poniewaŝ jeden z pierścieni benzenowych (B), w ich strukturze cząsteczkowej, wywodzi się ze szlaku kwasu szikimowego, zaś drugi (A) powstaje przez redukcję i cyklizację łańcucha poliketydowego, utworzonego z aktywnego octanu (acetylo-coa) i malonianu (malonylo-coa). W końcowym etapie biogenezy, przy udziale 3-węglowego łańcucha oraz grupy hydroksylowej, tworzy się trzeci, sześcioczłonowy pierścień 4-pironu, charakterystyczny dla większości związków flawonoidowych. W ten sposób ostatecznie powstaje szkielet flawonu (2-fenylochromonu = 2-fenylo-benzo-4-pironu), natomiast przesunięcie pierścienia B do C-2 w 3-węglowym łańcuchu, w kolejnych przemianach biogenetycznych, prowadzi do wytworzenia struktury izoflawonu (3-fenylochromonu = 3-fenylo-benzo-4-pironu). Z tego względu, izoflawony i flawony są tzw. izomerami połoŝenia, róŝniącymi się umiejscowieniem ugrupowania fenylowego przy C-2 lub C-3 (Samuelson i Bohlin, 2009). A O 2 B A O 3 O O B flawon (2-fenylo-4H-chromen-4-on) izoflawon (3-fenylo-4H-chromen-4-on) 11

12 Istnienie tej izomerii, i związanego z nią podobieństwa strukturalnego flawonów i izoflawonów, skłoniło mnie do poszukiwania wspólnych rozwiązań, dla obu grup związków, w kwestii doboru odpowiednich technik ekstrakcyjnych, umoŝliwiających pozyskiwanie tych fitoskładników z materiału roślinnego dla celów analitycznych i preparatywnych. Nowoczesne techniki ekstrakcyjne stosowane w analizie i preparatyce fitochemicznej W badaniach fitochemicznych, końcowy proces uzyskania rzetelnych wyników analizy ilościowej, obrazujących realną zawartość oznaczanych składników aktywnych w materiale roślinnym, w bardzo duŝym stopniu zaleŝy od właściwego wyboru metody przygotowania próbek, w tym szczególnie zastosowanych procedur ekstrakcyjnych. W celu izolacji związków flawonoidowych, wykorzystuje się obecnie zarówno klasyczne, jak i nowoczesne metody ekstrakcji. Równocześnie jednak zauwaŝalny jest brak publikacji naukowych, ukierunkowanych na systematyczną analizę, optymalizację i porównanie efektywności róŝnorodnych technik ekstrakcyjnych w celu ustalenia kluczowych kryteriów, wpływających na odzysk fitoskładników przy uŝyciu ww. metod. Jest to szczególnie waŝny problem w badaniach chemotaksonomicznych, gdzie zastosowana metoda preparatyki próbek powinna prowadzić do uzyskania ekstraktów maksymalnie odzwierciedlających profil jakościowy i stęŝenie wiodących składników aktywnych (markerów taksonomicznych) zawartych w materiale roślinnym. Z tego względu, jedynie wykorzystanie zoptymalizowanych i zwalidowanych procedur ekstrakcyjnych pozwala, w dalszych etapach badań, przeprowadzić właściwy proces analizy jakościowej i ilościowej związków zawartych w ekstraktach i gwarantuje formułowanie wiarygodnych wniosków na podstawie uzyskanych wyników badań. W mikropreparatyce związków flawonoidowych, stosowano do niedawna przede wszystkim klasyczne techniki ekstrakcyjne, obejmujące macerację, ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi w kolbach pod chłodnicą zwrotną, czy ekstrakcję kołową w aparacie Soxhleta. Najczęściej wykorzystywanymi ekstrahentami, ze względu na typ budowy cząsteczkowej flawonoidów, są alkohole (metanol, etanol) lub roztwory alkoholowo-wodne, w przypadku izolacji form glikozydowych tych związków. Od kilku lat obserwuje się jednakŝe coraz większy wzrost zainteresowania nowymi, proekologicznymi metodami ekstrakcyjnymi, w których zuŝycie rozpuszczalników organicznych byłoby mniejsze, zaś czas ekstrakcji krótszy. Dodatkowym, zauwaŝalnym trendem jest zwrot ku technikom ekstrakcyjnym, gwarantującym lepszą jakość wyników analizy ilościowej składników próbki, t.j. moŝliwość uzyskania wyŝszych odzysków, lepszej powtarzalności i selektywności metody analitycznej czy niŝszych limitów detekcji dla oznaczanych związków. W wymiarze praktycznym, ww. trendy realizuje się albo poprzez zmianę właściwości fizycznych rozpuszczalnika ekstrakcyjnego, co zachodzi w przypadku izolacji 12

13 składników z próbek stałych, albo, jeśli mamy do czynienia z próbkami ciekłymi (np. wodnymi czy alkoholowymi ekstraktami roślinnymi), poprzez stosowanie selektywnych sorbentów. Raynie (2004), w przeglądowym artykule poświęconym nowoczesnym technikom ekstrakcyjnym, szczegółowo odnosi się do tych trendów, charakteryzując między innymi tzw. ekstrakcyjne ciekłofazowe techniki podziałowe. Autor stwierdza, Ŝe właściwości fizyczne rozpuszczalników stosowanych w ekstrakcji, a szczególnie temperatura i ciśnienie mogą być regulowane tak, aby zwiększyć ich zdolność wyodrębniania określonych analitów z róŝnego rodzaju stałych matryc. Odpowiednia zmiana ww. parametrów moŝe na przykład skutkować wytworzeniem płynu nadkrytycznego o poŝądanych właściwościach fizycznych, jak to obserwuje się w ekstrakcji prowadzonej w warunkach nadkrytycznych (supercritical fluid extraction SFE). Rozpuszczalnik ekstrakcyjny o oczekiwanych właściwościach fizycznych moŝe takŝe powstać wskutek bezpośredniego ogrzewania solwentu powyŝej jego punktu wrzenia (pressurized liquid extraction PLE), albo teŝ zwiększania temperatury ekstrahenta i matrycy z wykorzystaniem energii promieniowania mikrofalowego (microwaveassisted extraction - MAE) lub ultradźwięków (ultrasound-assisted extraction - UAE). W kaŝdym z powyŝej opisanych przypadków, dokonana zmiana właściwości fizycznych rozpuszczalnika ekstrakcyjnego powoduje zmniejszenie jego napięcia powierzchniowego i częstokroć polarności, co wpływa na zwiększenie rozpuszczalności składników próbki i aktywizuje proces dyfuzji. Jedna z wyŝej wymienionych technik MAE jest uwaŝana za alternatywną, ulepszoną metodę izolacji roślinnych metabolitów w stosunku do klasycznej ekstrakcji cieczciało stałe, ze względu na znacznie zredukowany czas ekstrakcji i zuŝycie rozpuszczalników, jak równieŝ zwiększony odzysk składników próbki. Technika ta jest porównywana takŝe z SFE, ze względu na prostotę i niski koszt procesu, jednakŝe, w odróŝnieniu od ekstrakcji płynami w warunkach nadkrytycznych, MAE wymaga dodatkowej filtracji i/lub odwirowywania pozostałości matrycy roślinnej w celu uzyskania czystego wyciągu. Ponadto, z uwagi na charakter oddziaływań promieniowania mikrofalowego z materią, efektywność tej metody moŝe drastycznie zmniejszyć się, jeśli izolowane składniki i rozpuszczalnik ekstrakcyjny nie mają charakteru dipolowego, tzn. nie są polarne. Odrębnym problemem, podkreślanym w wielu pracach naukowych, jest takŝe zmniejszona stabilność ekstrahowanych związków, przy wykorzystaniu tej techniki, zwłaszcza w wysokich temperaturach (Buldini i wsp., 2002; Wang i Weller, 2006). Inną, niezwykle efektywną, nowoczesną technikę izolacji stanowi ekstrakcja wspomagana ultradźwiękami (UAE). W ośrodku ciekłym, fale ultradźwiękowe wywołują zjawisko naprzemiennego spręŝania i rozpręŝania cieczy, co prowadzi do powstania ujemnego ciśnienia, które, pokonując siłę napięcia powierzchniowego, powoduje utworzenie 13

14 w cieczy wewnętrznych pęcherzyków i jam, wypełnionych gazem. Proces ich formowania i wzrostu, a następnie zapadania do wewnątrz (tzw. implozji) nazywany jest kawitacją. UAE jest niezwykle efektywną metodą ekstrakcyjną, poniewaŝ raptowne spręŝenie gazów i par we wnętrzu pęcherzyków generuje wysokie temperatury (ok C), zwiększające rozpuszczalność związków w medium ekstrakcyjnym, oraz ciśnienia (rzędu 1000 atmosfer), które potęgują penetrację i transport składników próbki. Powoduje to rozrywanie komórek matrycy roślinnej i szybkie przenoszenie mas przez silne strumienie cieczy, w wyniku czego następuje uwalnianie wewnątrzkomórkowej treści wprost do roztworu ekstrahenta. Zastosowanie podwyŝszonej temperatury procesu moŝe dodatkowo zwiększać ilość powstających pęcherzyków kawitacyjnych, a tym samym wydajność UAE (Luque-Garcia i Luque de Castro, 2003). W grupie nowoczesnych, mikropreparatywnych technik, stosowanych w ekstrakcji polifenoli roślinnych, wykorzystuje się od niedawna ciśnieniową ekstrakcję cieczową (PLE). Metoda ta nazywana jest takŝe przyśpieszoną ekstrakcją rozpuszczalnikami (accelerated solvent extraction ASE) ze względu na zaprojektowaną, przez amerykańską firmę Dionex, aparaturę i opatentowaną technikę izolacji składników ze stałych i półstałych matryc za pomocą rozpuszczalników, poddanych działaniu podwyŝszonej temperatur ( C) i ciśnienia (najczęściej 10 MPa). Pierwszy z wymienionych czynników temperatura - zwiększa zdolność ekstrahenta do rozpuszczania analitów, czyli siłę elucyjną, doprowadzając do wzrostu szybkości dyfuzji. Udowodniono, Ŝe podwyŝszona temperatura moŝe powodować rozerwanie silnych oddziaływań pomiędzy analitem a matrycą, np. połączeń grup polarnych z miejscami aktywnymi matrycy, a takŝe wiązań wodorowych czy oddziaływań Van der Waals a. Wzrost efektywności PLE wiąŝe się równieŝ z niską lepkością rozpuszczalników w podwyŝszonej temperaturze, co wpływa na lepszą penetrację próbki. Zwiększone ciśnienie pozwala z kolei na utrzymanie rozpuszczalników, ogrzanych powyŝej temperatury wrzenia, w fazie ciekłej. Efektem tego jest znaczące polepszenie wydajności procesu ekstrakcji, w porównaniu z odzyskami uzyskiwanymi w temperaturze pokojowej, pod ciśnieniem atmosferycznym. Głównymi zaletami PLE, w porównaniu z technikami klasycznymi, są niewątpliwie łatwy i szybki sposób przygotowania i ekstrakcji próbki oraz znaczna redukcja ilości zuŝywanych rozpuszczalników. Proces PLE jest w pełni zautomatyzowany, co zapewnia identyczne warunki prowadzenia poszczególnych etapów ekstrakcji i wysokie odzyski ekstrahowanych związków (Giergielewicz MoŜajska i wsp., 2001; Wang i Weller, 2006). Specyficzną odmianą PLE, w której wykorzystuje się rozpuszczalnik wodny zamiast organicznego, jest ciśnieniowa ekstrakcja gorącą wodą (pressurized hot water extraction PHWE lub subcritical water extraction - SWE). W tej metodzie, ciecz ta jest poddawana działaniu wysokiego ciśnienia i temperatur, zawierających się w przedziale powyŝej 100 o C 14

15 (punkt wrzenia) i nie przekraczających 374 o C (wartość temperatury krytycznej). Następstwem działania tak wysokich temperatur jest m.in. zerwanie wiązań wodorowych i zmiana właściwości fizykochemicznych wody (zmniejszenie polarności), która w tych warunkach staje się podobna do alkoholowych rozpuszczalników organicznych typu metanolu czy etanolu. Oprócz ciekłofazowych, ekstrakcyjnych metod podziałowych, opisywanych powyŝej, w preparatyce związków pochodzenia naturalnego wykorzystuje się techniki ekstrakcyjne, oparte na mechanizmach sorpcyjnych. Znalazły one zastosowanie w fiotochemii, m.in. w izolacji i/lub oczyszczaniu związków polifenolowych, obecnych w próbkach ciekłych (najczęściej wodno-alkoholowych wyciągach roślinnych). Ekstrakcyjne techniki sorpcyjne wywodzą się z klasycznej chromatografii kolumnowej, poniewaŝ wykorzystują, w zminiaturyzowanej skali, szereg klasycznych adsorbentów chromatograficznych, ale takŝe nowoczesne fazy stacjonarne, umoŝliwiające prowadzenie bardziej selektywnej izolacji i rozdzielania składników wyciągów roślinnych. Dodatkowo, etap separacji związków wspomagają róŝnorodne rozwiązania konfiguracyjne, związane z upakowaniem złoŝa sorbentu. NaleŜą do nich m.in. klasyczne kolumienki (kartridŝe) czy dyski ekstrakcyjne, wypełnione adsorbentem, wykorzystywane w ekstrakcji do fazy stałej (solid-phase extraction SPE), włókna lub rurki pokryte warstwą adsorbentu, stosowane w zminiaturyzowanej formie ekstrakcji do fazy stałej (solid-phase microextraction SPME), czy, wprowadzane w ostatnich latach, nowoczesne systemy membranowe (hollow fiber membranes), odznaczające się wysoce rozwiniętą powierzchnią aktywną i duŝą selektywnością (Raynie, 2004). Ten ostatni walor przypisywany jest takŝe unikatowej technice SPE z wykorzystaniem tzw. polimerów ze śladem (nadrukiem) molekularnym (molecularly imprinted polymers - MIP), charakteryzujących się zdolnością do selektywnej i wielokrotnej sorpcji określonych struktur cząsteczkowych, duŝą wytrzymałością mechaniczną, jak równieŝ trwałością termiczną i chemiczną (Luliński, 2010). Stosunkowo nowym rozwiązaniem aplikacyjnym, stosowanym od kilku lat w mikropreparatyce fitochemicznej, jest ekstrakcja za pomocą rozpuszczalnika z próbki rozproszonej w ciele stałym (matrix solid-phase dispersion MSPD). Technika ta w znaczącym stopniu eliminuje zjawisko nieodwracalnej adsorpcji oraz niecałkowitej desorpcji analitów, spotykane w klasycznej SPE, dzięki homogenizacji próbki bezpośrednio z sorbentem i prowadzeniu elucji wyodrębnianych składników z wykorzystaniem rozpuszczalników o zróŝnicowanej polarności (Capriotti i wsp., 2010). Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) jest szybką i obecnie najbardziej popularną techniką przygotowywania próbek, która z powodzeniem zastąpiła wiele Ŝmudnych, konwencjonalnych metod izolacji składników ekstraktów roślinnych. Zwiększony rozwój technik SPE przypada na ostatnie lata XX-go i początek XXI wieku, w ciągu których 15

16 dokonano wielu udoskonaleń w zakresie formy mikrokolumienek, automatyzacji procesu, nowych typów sorbentów. Przykładowo, klasyczny Ŝel krzemionkowy, z chemicznie związaną fazą C-18, moŝe występować w formie non-endcapped - z wolnymi grupami silanolowymi dzięki czemu uzyskuje się drugorzędowe oddziaływania polarnych analitów z roztworem. Problem ekstrakcji polarnych związków został równieŝ rozwiązany poprzez wprowadzenie sorbentów o matrycy węglowej oraz wysoko usieciowanego ( cross-linked ) kopolimeru styrenu i diwinylobenzenu (PS-DVB), ze specyficznymi obszarami aktywnymi i bardzo duŝym stopniem czystości. Z kolei sorbenty polimerowe, z wprowadzonymi do nich odpowiednimi grupami funkcyjnymi, okazały się posiadać lepszą zwilŝalność, a w związku z tym zapewniają takŝe lepszy odzysk substancji polarnych. Nowe generacje takich wypełnień, na przykład Oasis (Waters), zaprojektowane są tak, aby ekstrahować szerokie spektrum analitów: od składników hydrofobowych, po polarne: kwasowe, zasadowe i obojętne, przy uŝyciu jednej tylko kolumienki, a sama procedura ekstrakcyjna jest uproszczona i często nie wymaga kondycjonowania. Ze względu na brak usystematyzowanych badań, związanych z optymalizacją technik izolacji flawonów tarczyc oraz związków izoflawonowych koniczyn, zdecydowałam się opracować własne metody mikro- i makropreparatywnego wyodrębniania tych związków, z materiału roślinnego lub wyciągów, z wykorzystaniem wielu nowoczesnych technik ekstrakcyjnych, opisanych powyŝej. Piśmiennictwo Atkinson C., Warren R.M., Sala E., Dowsett M., Dunning A.M., Healey C.S., Runswick S., Day N.E., Bingham S.A.: Red-clover-derived isoflavones and mammographic breast density: a double-blind, randomized, placebocontrolled trial [ISRCTN ]. Breast Cancer Res. 2004, 6, R Beck V., Rohr U., Jungbauer A.: Phytoestrogens derived from red clover: An alternative to estrogen replacement therapy? J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2005, 94, Booth N.L., Overk C.R., Yao P., Burdette J.E., Nikolic D., Chen S.N. et al.: The chemical and biological profile of a red clover (Trifolium pratense L.) phase II clinical extract. J. Altern. Complement. Med. 2006,12, Buldini P.L., Ricci L., Lal Sharma J.: Recent applications of sample preparation techniques in food analysis. J. Chromatogr. A 2002, 975, Capriotti A.L., Cavaliere C., Giansanti P., Gubbiotti R., Samperi R., Lagana A.: Recent developments in matrix solid-phase dispersion extraction. J. Chromatogr. A 2010, 1217, Cassidy A., Albertazzi P., Nielsen I.L., Hall W., Williamson G., Tetens I., Atkins S., Cross H., Manios Y., Wolk A., Steiner C., Branca F.: Critical review of health effects of soybean phyto-oestrogens in post-menopausal women. Proc. Nutr. Soc. 2006, 65, Ganesan Adaikan P., Srilatha B., Wheat A. J.: Efficacy of red clover isoflavones in the menopausal rabbit model. Fertil. Steril. 92, 2009, Giergielewicz MoŜajska H., Dąbrowski Ł., Namieśnik J.: Przegląd technik ekstrakcyjnych wykorzystywanych na etapie wyodrębniania analitów z próbek stałych. Część II. Ekologia i technika. 2001, 9, Goodwin J.L., Uemura E., Cunnick J.E.: Microglial release of nitric oxide by the synergistic action of beta-amyloid and IFNgamma. Brain Res. 1995, 692, Greenwood S., Barnes S., Clarkson T.B., Eden J., Helferich W.G., Hughes C., Messina M., Setchell K.: Role of isoflavones in menopausal health: a consensus opinion of the North American Menopause Society. Menopause 2000, 7,

17 Heo H.J., Kim D.O., Choi S.J., Shin D.H., Lee C.Y.: Potent inhibitory effect of flavonoids in Scutellaria baicalensis on amyloid beta protein-induced neurotoxicity. J. Agric. Food. Chem. 2004, 52, Hirunuma M., Shoyama Y., Sasaki K., Sakamoto S., Taura F., Shoyama Y., Tanaka H., Morimoto S.: Flavonecatalyzed apoptosis in Scutellaria baicalensis. Phytochemistry 2011, 72, Kim H., Kim Y.S., Kim S.Y., Suk K.: The plant flavonoid wogonin suppresses death of activated C6 rat glial cells by inhibiting nitric oxide production. Neurosci. Lett. 2001, 309, Kim D.H., Kim S., Jeon S.J., Son K.H., Lee S., Yoon B.H., Cheong J.H., Ko K.H., Ryu J.H.: The effects of acute and repeated oroxylin A treatments on Abeta(25-35)-induced memory impairment in mice. Neuropharmacol. 2008, 55, Kim E.H., Shim B., Kang S., Jeong G., Lee J., Yu Y-B., Chun M.: Anti-inflammatory effects of Scutellaria baicalensis extract via suppression of immune modulators and MAP kinase signaling molecules. J. Ethnopharmacol. 2009, 126, Kuiper G.G., Lemmen J.G., Carlson B., Corton J.C., Safe S.H., van der Saag P.T., van der Burg B., Gustafsson J.: Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor β. Endocrinology 1998, 139, Lee Y.M., Cheng P.Y., Chim L.S., Kung C.W., Ka S.M., Chung M.T., Sheu J.R.: Baicalein, an active component of Scutellaria baicalensis Georgi, improves cardiac contractile function in endotoxaemic rats via induction of heme oxygenase-1 and suppression of inflammatory responses. J. Ethnopharmacol, 2011, 135, Li B., Xuan W., Yu Y., Liu Y.: Effects of total flavonoids of stem and leaf of Scutellaria baicalensis Georgi. on vascular endothelial cell damage by oxidized low density lipoprotein. Beijing Yike Daxue Xuebao 2000, 32, Lichtenstein A.H.: Soy protein, isoflavones and cardiovascular diseaese risk. J. Nutr. 1998, 128, Luque-Garcia J.L., Luque de Castro M.D.: Ultrasound: a powerful tool for leaching. Trends in Anal. Chem. 2003, 22, Luliński P.: Polimery ze śladem molekularnym w naukach farmaceutycznych. Polimery 2010, 55, Occhiuto F., Pasquale R.D., Guglielmo G., Palumbo D.R., Zangla G., Samperi S., Renzo A., Circosta C.: Effects of phytoestrogenic isoflavones from red clover (Trifolium pratense L.) on experimental osteoporosis. Phytother Res. 2007, 21, McDonnell D.P.: The molecular pharmacology of SERMs. Trends Endocrinol. Metab. 1999, 10, Metz W.A.: NMDA Receptors as targets in medicinal chemistry. Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, Nakajima T., Imanishi M., Yamamoto K., Cyong J.C., Hirai K.: Inhibitory effect of baicalein, a flavonoid in Scutellaria root, on eotaxin production by human dermal fibroblasts. Planta Med. 2001, 67, Nan J.X., Park E.J., Kim Y.C., Ko G., Sohn D.H.P.: Scutellaria baicalensis inhibits liver fibrosis induced by bile duct ligation or carbon tetrachloride in rats. J. Pharm. Pharmacol. 2002, 54, O'Neil L.A., Kaltschmidt C.: NF-kappa B: a crucial transcription factor for glial and neuronal cell function. Trends Neurosci. 1997, 20, Park B.K., Heo M.Y., Park H., Kim H.P.: Inhibition of TPA-induced cyclooxygenase-2 expression and skin inflammation in mice by wogonin, a plant flavone from Scutellaria radix. Eur. J. Pharmacol. 2001, 425, Piao H.Z., Choi I.Y., Park J-S., Kim H-S., Cheong J.H., Son K.H., Jeon S.J., Ko K.H., Kim W.-K.: Wogonin inhibits microglial cell migration via suppression of nuclear factor-kappa B activity. Int. Immunopharmacol. 2008, 8, Pietras T., Suchocka E., Strzelecki A., Bąkowicz K., Małolepsza U., Glinka R., Górski P.: The influence of baicalin on serum lipid peroxidation induced by hydrogen peroxide. Biul. Kosmetol. 2000, 2, Powles T.J., Howell A., Evans D.G., McCloskey E.V., Ashley S., Greenhalgh R., Affen J., Flook L.A., Tidy A.: Red clover isoflavones are safe and well tolerated in women with a family history of breast cancer. Menopause Int. 2008,14, Raynie D.E.: Modern extraction techniques. Anal. Chem. 2004, 76,

18 Regulska-Ilow B., Kowalski P., Biernat J., Ilow R., Grajeta H., Lamer-Zarawska E.: The influence of bioflavonoids from the radix of Scutellaria baicalensis on liver enzymes and the antioxidative system in laboratory rats receiving diets containing fresh or oxidized fats. Adv. Clin. Exp. Med. 2007, 16, Samuelson G., Bohlin L.: Drugs of Natural Origin. A Treatise of Pharmacognosy. 6 th Apotekarsocieteten Swedish Pharmaceutical Society, Stockholm revised edition. Setchell K.D.R., Adlercreutz H.: Mammalian lignans and phytoestrogens. Recent studies on their formation, metabolism and biological role in health and disease. In: Rowland I.A., ed. The Role of Gut microflora in Toxicity and Cancer. Academic Press, New York 1988, pp Shao Z.H., Vanden Hoek T.L., Qin Y., Becker L.B., Schumacker P.T., Li C.Q., Dey L., Barth E., Halpern H., Rosen G.M., Yuan C.S.: Baicalein attenuates oxidant stress in cardiomyocytes. J. Physiol. 2002, 282, H999- H1006. Suk K., Lee H., Kang S.S., Cho G.J., Choi W.S.: Flavonoid baicalein attenuates activation-induced cell death of brain microglia. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003, 305, Wang L., Weller C.L.: Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants. Trends Food Sci. Technol. 2006, 17, Wang J., Yu Y., Hashimoto F., Sakata Y., Fujii M., Hou D.X.: Baicalein induces apoptosis through ROS-mediated mitochondrial dysfunction pathway in HL-60 cells. Int. J. Mol. Med. 2004, 14, Xue X., Qu X.J., Yang Y., Sheng X.H., Cheng F., Jiang E.N., Wang J.H., Bu W., Liu Z.P.: Baicalin attenuates focal cerebral ischemic reperfusion injury through inhibition of nuclear factor κb p65 activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010, 403, Ye F., Jiang S., Volshonok H., Wu J., Zhang D.Y.: Molecular mechanism of anti-prostate cancer activity of Scutellaria baicalensis extract. Nutr. Canc , 57, Zava D.T., Duwe G.: Estrogenic and antiproliferative properties of genistein and other flavonoids in human breast cancer cells in vitro. Nutr. Cancer 1997, 27, Omówienie tematyki badań i osiągniętych wyników w pracach zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego Zgodnie ze sprecyzowanym (w rozdziale ), celem doświadczeń naukowych, opisanych w pracach zgłoszonych do postępowania habilitacyjnego, przez ostatnie 10 lat prowadziłam intensywne badania, związane z opracowaniem i optymalizacją metod izolacji flawonów tarczyc oraz izoflawonów koniczyn z wykorzystaniem róŝnorodnych technik ekstrakcyjnych. Badania te moŝna sklasyfikować w 3 głównych płaszczyznach tematycznych: fitochemicznej chemotaksonomicznej biologicznej Uwzględniając powyŝszą kategoryzację, poniŝej przedstawiam omówienie tematyki moich badań i osiągniętych wyników. 18

19 A. Zastosowanie nowoczesnych technik ekstrakcyjnych w badaniach fitochemicznych W początkowym okresie badań fitochemicznych, koncentrowałam się na doskonaleniu technik ekstrakcyjnych, opartych na mechanizmach sorpcyjnych, umoŝliwiających izolację związków flawonowych tarczyc z ekstraktów alkoholowo-wodnych. Badania te opisałam w pracy oznaczonej symbolem PUBL-1. Obejmowały one równoczesną mikropreparatywną izolację flawonoidów i fenolokwasów z wyciągów metanolowo-wodnych, otrzymanych z ziela i korzeni tarczycy bajkalskiej (Scutellaria baicalensis Georgi.). W tym celu zastosowałam własną, nowo opracowaną procedurę ekstrakcji do fazy stałej (SPE), obejmującą następujące etapy izolacji i rozdzielania ww. grup związków: wyodrębnianie średnio polarnych (skutelareina) oraz niepolarnych związków flawonowych (bajkaleina, chryzyna) na kolumienkach SPE, wypełnionych Ŝelem krzemionkowym z chemicznie związaną fazą oktadecylową (Octadecyl, 500 mg, J.T. Baker, Phillipsburg, USA) rozdzielanie zespołów wolnych kwasów fenolowych od polarnych flawonoidów (bajkalina), zawartych w frakcjach wodno-wodorowęglanowych, na kolumienkach SPE, wypełnionych Ŝelem krzemionkowym z chemicznie związaną fazą typu czwartorzędowej aminy (Quaternary Amine, 500 mg, J.T. Baker, Phillipsburg, USA), poprzez adsorpcję tych pierwszych związków na złoŝu anionowymiennego sorbentu. Nowatorstwo, a zarazem trudność opracowanej metodyki, wiązała się z koniecznością izolacji i równoczesnego rozdzielania związków o zbliŝonej polarności (kwasy fenolowe i glukuronid flawonowy bajkalina). W kolejnej pracy (PUBL-2), badałam przydatność zarówno klasycznych (oktadecylowych, fenylowych), jak i nowoczesnych (SDB-1 i Oasis HLB) SPE adsorbentów, w izolacji farmakologicznie aktywnych związków flawonowych (bajkaliny, luteoliny, apigeniny, wogoniny i chryzyny) z ekstraktów otrzymanych z części nadziemnych trzynastu gatunków i podgatunków tarczyc: S. alpina L., S. alpina L. ssp. alpina, S. alpina (L.) I. Richardson ssp. supina, S. albida L., S. albida L. ssp. velenovskyi, S. altissima L., S. baicalensis Georgi., S. barbata D. Don, S. columnae All., S. galericulata L., S. orientalis L., S. minor Huds. and S. pontica C. Koch. Rośliny te były uprawiane w Ogrodzie Roślin Leczniczych Katedry Farmakognozji UM w Lublinie. Izolację związków flawonowych z materiału roślinnego wykonałam z wykorzystaniem nowoczesnej techniki ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękami (UAE), w uprzednio zoptymalizowanych warunkach procesu: 75% MeOH (jako ekstrahent), temperatura ekstrakcji (75 o C), częstotliwość emitowanych ultradźwięków (35 khz). 19

20 Następnie, z otrzymanych metodą UAE ekstraktów, izolowałam zespoły związków flawonowych z wykorzystaniem kolejnej techniki ekstrakcyjnej - SPE. Wynikiem moich badań było wskazanie kilku waŝnych róŝnic we właściwościach retencyjnych kaŝdego z zastosowanych adsorbentów. Hydrofobowe oddziaływania alkilowych C18 łańcuchów, zarówno z polarnymi (bajkaleina, luteolina), jak i apolarnymi (wogonina, chryzyna) flawonami, zakłócały ich proces desorpcji na adsorbencie oktadecylowym, dlatego flawony ulegały silniejszej retencji w porównaniu do adsorbentów fenylowych. Drugim problemem, jaki zaobserwowałem, była silniejsza retencja flawonów tarczyc na adsorbentach polimerowych: Oasis HLB (kopolimer styrenu, diwinylobenzenu i N-winylopirolidonu PS-DVB-NVP) i SDB-1 (kopolimer styrenu, diwinylobenzenu i etylowinylobenzenu PS-DVB-EVB). O N N O struktura chemiczna adsorbentu Oasis HLB (Waters, USA) Efekt ten potwierdziłam dla wszystkich pięciu flawonów i powiązałam go z bardzo duŝą powierzchnią właściwą tych adsorbentów: około 800 m 2 /g i > 1000 m 2 /g, odpowiednio dla Oasis HLB i SDB-1. Dodatkowo, zwiększona retencja analitów na adsorbencie Oasis HLB, moŝe wynikać z obecności grup pirolidonowych, mających charakter akceptorów jonu wodorowego. Aby przeciwdziałać temu zjawisku, przeprowadziłam optymalizację procesu elucji na tych dwóch adsorbentach. Ustaliłam, Ŝe eluent składający się z 75% metanolu (10 ml), z następczo zastosowanym 100% metanolem (10 ml), był najbardziej przydatny i dopiero wtedy uzyskałam wysokie i powtarzalne odzyski wszystkich flawonów oraz właściwe oczyszczenie ekstraktów ze związków balastowych (chlorofilu). Podsumowując wszystkie uzyskane wyniki, postawiłam wniosek, Ŝe w grupie czterech testowanych SPE adsorbentów, fenylowy posiadał najlepsze, pośrednie właściwości retencyjne. Wykorzystując ten adsorbent, otrzymałam odzyski pięciu flawonów bliskie lub równe 100% oraz wysoką czystość ekstraktów roślinnych, poddawanych dalszej analizie HPLC. 20

21 Eluaty SPE, zawierające badane flawony, analizowałam, stosując (opracowaną przez siebie) gradientową metodę rozdzielenia, opartą na wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych, sprzęŝonej z detekcją diodową (RP-HPLC/PDA). Uzyskałam bardzo dobrą liniowość (r 2 > ) dla krzywych wzorcowych sporządzonych dla kaŝdego z flawonów. Współczynnik zmienności wyników oznaczeń ilościowych nie przekraczał 5% dla większości badanych związków. W kolejnej pracy (PUBL-3), zajęłam się analizą farmakologicznie aktywnych aglikonów izoflawonowych: genisteiny, daidzeiny, formononetyny i biochaniny A w częściach nadziemnych trzynastu gatunków koniczyn (Trifolium L.), występujących w polskiej florze. W celu izolacji aglikonów izoflawonowych, wykorzystałam moją własną, nowo opracowaną technikę mikropreparatywną, łączącą SPE, na adsorbentach oktadecylowych, cykloheksylowych i fenylowych, typu BakerBond, z ekstrakcją wspomaganą ultradźwiękami i zoptymalizowaną procedurą hydrolityczną dla glikozydowych form izoflawonów. Następnie porównałam efektywność wszystkich trzech sorbentów w procesie oczyszczania ekstraktów z koniczyn, odnotowując bardzo wysokie odzyski (> 96%) dla wszystkich czterech izoflawonów. JednakŜe, zaobserwowałam takŝe pewne róŝnice pomiędzy nimi. Interakcje długich, oktadecylowych łańcuchów z izoflawonami były najsilniejsze ze wszystkich testowanych grup i utrudniały desorpcję związków na tym adsorbencie. Dodatkowo, odnotowałam występowanie polarnych oddziaływań i bardziej selektywną adsorpcję, wynikającą z interakcji typu π-π, pomiędzy adsorbentem fenylowym i badanymi izoflawonami. Powodowało to minimalnie gorsze odzyski analitów w porównaniu z adsorbentem cykloheksylowym. Z tego względu, w końcowym porównaniu wszystkich trzech testowanych kartridŝy do SPE, cykloheksylowy okazał się posiadać najlepsze właściwości sorpcyjne, dając odzyski równe 100%, dla genisteiny, formononetyny i biochaniny A, oraz wyŝsze niŝ 98%, dla daidzeiny. Nowością w PUBL-3 było takŝe zastosowanie podwójnej detekcji: fotodiodowej (PDA) i, bardzo czułej, fluorescencyjnej (FL), w połączeniu z wysokosprawną chromatografią cieczową w układzie faz odwróconych, co pozwoliło uzyskać wysoką rzetelność wyników analizy jakościowej i ilościowej izoflawonów. W następnej pracy (PUBL-4), podjęłam systematyczne badania nad zastosowaniem ekstrakcyjnych ciekłofazowych metod podziałowych w analizie izoflawonów koniczyn. W tym celu wykorzystałam nową technikę preparatyki próbek, ciśnieniową ekstrakcję cieczową (PLE), w połączeniu z RP-HPLC/PDA, aby wyodrębnić i oznaczyć ilościowo izoflawony (biochaninę A, formononetynę, daidzeinę i genisteinę) w ekstraktach otrzymanych z części nadziemnych pięciu gatunków koniczyn. 21