Przegląd Naukowy. Cena 12,50 zł ISSN Uprzednio pod tytułem PORADNIK FARMACEUTY. Miesięcznik. ROK V (IX) Nr 3/2008 (38) MARZEC

Transkrypt

1 Farmaceutyczny Cena 12,50 zł Index Copernicus 2,51 PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Uprzednio pod tytułem PORADNIK FARMACEUTY ROK V (IX) Nr 3/2008 (38) MARZEC HISTORIA FARMACJI KIERUNKI POSZUKIWAŃ I NOWE POLA BADAWCZE GLIKOZYDAZY LIZOSOMALNE KRWI CHORYCH NA SKLERO- DERMĘ ELEKTRONICZNA BAZA IDENTYFIKACJI LEKÓW E-TABLETKI 1 DOSTĘPNOŚĆ FARMACEUTYCZNA METOTREKSATU Z UKŁA- DÓW TERMOWRAŻLIWYCH OTRZYMANYCH NA BAZIE PLURO- NICU F-127 DERYWATYZACJA ON-LINE W OZNACZANIU IBUPROFENU I NAPROKSENU TECHNIKĄ GC/MS CIEKŁE KRYSZTAŁY W NAUKACH FARMACEUTYCZNYCH CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH OLEJÓW ROŚLINNYCH POD KĄTEM SYNTEZY SPRZĘŻONYCH DIENÓW KWASU LINO- LOWEGO (SKL) BADANIE WPŁYWU WYBRANYCH PARAMETRÓW OZNACZEŃ SIARKOWODORU W WĄTROBIE I MÓZGU ŚWIŃ NA UZYSKANE WYNIKI BADANIE WPŁYWU POCHODNEJ BISPEROKSOWANADU NA PEROKSYDACJĘ KWASU LINOLOWEGO IN VITRO BADANIE STANU RÓWNOWAGI KOMPLEKSÓW KWASU MLE- KOWEGO Z EUDRAGITEM E-100 BADANIA TRWAŁOŚCI PODŁOŻY HYDROFILOWYCH SPORZĄ- DZONYCH ZA POMOCĄ UNGUATORA ORAZ METODĄ TRADY- CYJNĄ BADANIE PROFILI ROZPUSZCZANIA FORM TABLETOWANYCH PARACETAMOLU SKOMBINOWANEGO Z DIKLOFENAKIEM W ROZTWORZE 0,1M KWASU SOLNEGO AZOTANY III I V W WYBRANYCH PREPARATACH ZIOŁOWYCH ANALIZA POOPERACYJNEGO OZNACZANIA ANTYGENU KAR- CINOEMBRIONALNEGO CEA U CHORYCH NA RAKA JELITA GRUBEGO AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA SYNTETYCZNYCH TIOPURYN W HODOWLACH LABORATORYJNYCH CHLORELLA VULGARIS

2

3 Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Redaktor Naczelny: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Adres redakcji: Sosnowiec, ul. Jedności 8 Tel Fax. 032/ Mail: fpn@kwiecinski.pl Konsultacyjna Rada Naukowa Przewodniczący: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Członkowie: Prof. dr hab. Barbara Błońska Fajfrowska Prof. dr hab. Jerzy Brandys Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska Prof. dr hab. Ewa Buszman Prof. dr hab. Zofia Dzierżewicz Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz Prof. dr hab. Krzysztof Jędrzejko Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko Prof. dr hab. Jan Kowalski Prof. dr hab. Jerzy Kwapuliński Prof. dr hab. Jan Pachecka Prof. dr hab. Jerzy Pałka Prof. dr hab. Janusz Pluta Prof. dr hab. Janusz Solski Prof. dr hab. Artur Stojko Prof. dr hab. Maria Wardas Prof. dr hab. marek Wesołowski Prof. dr hab. Ludmiła Węglarz Dr hab. Barbara Pilawa prof. nadzw. ŚUM Dr hab. Zdzisława Kondera Anasz Dr hab. Urszula Mazurek Dr hab. Andrzej Plewka Dr hab. Krzysztof Solarz Dr hab. Krystyna Trzepietowska Stępień Sekretarz Naukowy: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka Członkowie Kolegium Redakcyjnego: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Kornelia Kuźnik-Trocha Wydawca: Grupa Dr. A. R. Kwiecińskiego Adres Wydawcy: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, Bielsko-Biała, tel. (0-33) fax (0-33) Prezes: dr n. med. Adam Kwieciński Marketing Manager: Mgr Katarzyna Pytlarczyk kpytlarczyk@wizja.net.pl Opracowanie graficzne: Robert Cyganik Skład: Jerzy Partyka Uprzednio pod tytułem PORADNIK FARMACEUTY Index Copernicus 2,51 Nakład: do egz. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. SPIS TREŚCI HISTORIA FARMACJI KIERUNKI POSZUKIWAŃ I NOWE POLA BADAWCZE 4 GLIKOZYDAZY LIZOSOMALNE KRWI CHORYCH NA SKLERODERMĘ 10 ELEKTRONICZNA BAZA IDENTYFIKACJI LEKÓW E-TABLETKI 14 DOSTĘPNOŚĆ FARMACEUTYCZNA METOTREKSA- TU Z UKŁADÓW TERMOWRAŻLIWYCH OTRZYMA- NYCH NA BAZIE PLURONICU F DERYWATYZACJA ON-LINE W OZNACZANIU IBU- PROFENU I NAPROKSENU TECHNIKĄ GC/MS 22 CIEKŁE KRYSZTAŁY W NAUKACH FARMACEU- TYCZNYCH 25 CHARAKTERYSTYKA WYBRANYCH OLEJÓW RO- ŚLINNYCH POD KĄTEM SYNTEZY SPRZĘŻONYCH DIENÓW KWASU LINOLOWEGO (SKL) 29 BADANIE WPŁYWU WYBRANYCH PARAMETRÓW OZNACZEŃ SIARKOWODORU W WĄTROBIE I MÓ- ZGU ŚWIŃ NA UZYSKANE WYNIKI 33 BADANIE WPŁYWU POCHODNEJ BISPEROKSOWA- NADU NA PEROKSYDACJĘ KWASU LINOLOWEGO IN VITRO 37 BADANIE STANU RÓWNOWAGI KOMPLEKSÓW KWASU MLEKOWEGO Z EUDRAGITEM E BADANIA TRWAŁOŚCI PODŁOŻY HYDROFILO- WYCH SPORZĄDZONYCH ZA POMOCĄ UNGUATO- RA ORAZ METODĄ TRADYCYJNĄ 43 BADANIE PROFILI ROZPUSZCZANIA FORM TABLE- TOWANYCH PARACETAMOLU SKOMBINOWANE- GO Z DIKLOFENAKIEM W ROZTWORZE 0,1M KWA- SU SOLNEGO 46 AZOTANY III I V W WYBRANYCH PREPARATACH ZIOŁOWYCH 49 ANALIZA POOPERACYJNEGO OZNACZANIA AN- TYGENU KARCINOEMBRIONALNEGO CEA U CHO- RYCH NA RAKA JELITA GRUBEGO 52 AKTYWNOŚĆ BIOLOGICZNA SYNTETYCZNYCH TIOPURYN W HODOWLACH LABORATORYJNYCH CHLORELLA VULGARIS 57

4 Historia farmacji kierunki poszukiwań i nowe pola badawcze History of Pharmacy: Present Trends and New Fields of Research Interests Anita Magowska Zakład Historii Nauk Medycznych Uniwersytet Medyczny im. Karola Marcinkowskiego Streszczenie: W niniejszej pracy przeprowadzona została analiza publikacji wybranych spośród artykułów i wydawnictw zwartych, odnotowanych w internetowej bazie Pub- Med. Dzięki dostępowi do poszczególnych artykułów i recenzji książek w wersji on line stwierdzono, że publikacje te cechuje bogactwo tematyki, najczęściej z zakresu ostatniego wieku. Nowymi tendencjami są: medykalizacja historii farmacji, uwzględnianie szerokiego kontekstu społecznego w pracach historyczno-farmaceutycznych, a także stosowanie metod ilościowych i korzystanie z zasobów internetowych. Słowa kluczowe: historia farmacji, historiografia, historia medycyny, metody ilościowe w historii Abstract: This study aims to analyze some new research trends and fields of interests in the worldwide history of pharmacy. The database PubMed provided a knowledge about more then five thousands papers and books on the history of pharmacy, easily accessible thanks to library resources and journals on-line. The majority of these papers and books presents the changes of pharmacy during the last century. There are some new research trends: medicalization of the history of pharmacy, the new social history of pharmacy, introduction of quantitative methods into historical-pharmaceutical research and the development of the Internet-based research. Key words: history o pharmacy, historiography, history of medicine, quantitative methods in history 1. Wprowadzenie Dwanaście lat temu, podczas XVI Zjazdu Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego, w wykładzie zatytułowanym Współczesne modele europejskiej historiografii farmaceutycznej prof. Barbara Kuźnicka wyodrębniła reprezentatywne dla światowego piśmiennictwa historyczno- -farmaceutycznego struktury metodologiczne i wskazała, że farmacja przedstawiana jest w pracach historycznych przede wszystkim jako: ewolucja leków, nauka powiązana z toksykologią, dziedzina kulturotwórczą i dziedzina związana z antropologią i etnografią. 1) Do tego podsumowania współczesnego stanu historii farmacji chciałabym nawiązać, poszukując jednak wyłącznie nowych kierunków i pól badawczych. Podstawą doboru publikacji do analizy była internetowa baza bibliograficzna PubMed, która dzięki internetowej wyszukiwarce (search: history of: pharmacy/ drugs/ medicines/ pharmacies/ pharmaceutical industry) odegrała rolę spisu ponad pięciu tysięcy (po selekcji ponad trzech tysięcy) publikacji (oryginalnych artykułów, recenzji, wspomnień i wydawnictw zwartych) z zakresu historii farmacji. Wybrane z bazy PubMed artykuły odtworzono dzięki zasobom bibliotecznym on-line dostępnym na serwerze Biblioteki Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, a przedstawione książki zostały opisane z autopsji. Celem analizy było rozpoznanie, jak zaznaczający się w ostatnich dziesięcioleciach przewrót w myśleniu o historii i jej badaniu, przewrót, który zmniejszył dystans między nami a przeszłością, zaznaczył się w obszarze światowej historii farmacji i jaki nowy kontekst dzięki temu zyskała. 2) 2. Ewolucja historii farmacji w drugiej połowie XX w. W drugiej połowie XX w. badania naukowe w dziedzinie historii zostały radykalnie przeorientowane dzięki fali postmodernizmu, który podważył prawdy absolutne i takie pojęcia ogólne, jak kultura, naród, cywilizacja, a ponadto wykazał, że język ma wpływ na wyjaśnianie przeszłości, a obiektywna interpretacja źródeł historycznych jest niemożliwa. W konsekwencji klasyczny opis historyczny 1) Barbara Kuźnicka, Współczesne modele europejskiej historiografii farmaceutycznej. Farmacja Polska 1996 s ) Ogólnej wiedzy na temat współczesnych przeobrażeń historii i warsztatu badawczego historyka dostarcza np.: Jerzy Topolski, Wprowadzenie do historii. Poznań Farmaceutyczny

5 Nr 3 / 2008 nawiązujący do wydarzeń politycznych został zastąpiony narracyjnymi i metaforycznymi obrazami przeszłości, konstruowanymi tak, by przybliżyć ją czytelnikowi i budzić jego emocje. Przełom językowy zaznaczył się również w obszarze historii medycyny i historii farmacji, będąc przede wszystkim zasługą badaczy różnej narodowości i o różnym wykształceniu, m.in. lekarzy, historyków, psychologów, matematyków, biologów, bibliotekarzy, którzy od lat siedemdziesiątych XX w. korzystali ze stypendiów i grantów fundacji Henry ego Wellcome, założyciela firmy farmaceutycznej Borroughs-Wellcome. Na mocy testamentu, H. Wellcome przeznaczył część zysków firmy na fundację wspierającą badania naukowe, w tym historyczno-medyczne. Działalność fundacji przyczyniła się do rozwoju historii medycyny i farmacji. Różnorodne wykształcenie badaczy sprawiło, że ich publikacje były nowatorskie, oryginalne i interdyscyplinarne, co wyraźnie odróżniało je od prac powstałych w krajach niemieckojęzycznych. O ile historycy medycyny i farmacji z państw anglojęzycznych podejmowali głównie problematykę społeczną, to badacze z państw niemieckojęzycznych specjalizowali się w problematyce historycznych związków między medycyną, stanem zdrowia ludności, państwem a prawem, kontynuując wcześniejsze zainteresowania, dla których typowa była problematyka związków farmacji ze sztuką oraz biografii wybitnych Niemców. 3) Nowe, usytuowane na pograniczu socjologii, geografii, demografii i historii medycyny oraz farmacji, obszary poznania zaczęto eksplorować za pomocą narzędzi badawczych uznawanych wcześniej za obarczone nadmiernym redukcjonizmem i dehumanizujące historię. Narzędziami tymi stały się metody ilościowe, których użyteczność wynikała z możliwości wykorzystania technologii informatycznych i objęcia perspektywą badawczą licznych i różnorodnych danych (np. wiek, płeć, wzrost, sposób odżywiania, zamożność, długość życia) dotyczących już nie tylko jednostek, lecz całych populacji. Okazało się, że odrzucana przez pozytywistów i ich kontynuatorów statystyka jest w swej istocie zamrożoną historią, a analiza statystyczna, zwłaszcza dokonywana za pomocą programów komputerowych, pozwala na bardziej wnikliwe niż opis słowny odkrywanie i wyjaśnianie związków przyczynowych. Metody ilościowe zrewolucjonizowały czasochłonne studia nad starożytnymi i średniowiecznymi manuskryptami botaniczno-medycznymi, bo pozwoliły na wybranie reprezentatywnej statystycznie próby złożonej z pewnej liczby stron i rozciągnięcie wnioskowania na całość dzieła. Najbardziej znaczące przewartościowania dokonały się za sprawą metod ilościowych w historii ekonomii, w której zastosowano je już pół wieku temu, co pozwoliło na przeprowadzanie analiz gospodarki i oraz poszukiwanie optymalnych modeli jej rozwoju. Następnie metody ilościowe zrewolucjonizowały historię demografii, ponieważ dzięki nim możliwe było poznanie wpływu postępu (np. uprzemysłowienia, komunikacji) na populacje. W 1987 r. metody te wkroczyły do historii medycyny i farmacji pozwalając na ilościowe badania zdrowia i chorób ludzi, a co za tym szło, na przeprowadzanie analizy różnych systemów opieki zdrowotnej i poszukiwanie ich optymalnych modeli. Metody ilościowe zapewniły badaniom historyczno-medycznym i historyczno-farmaceutycznym nieznaną przedtem głębię i implikacje w sferze polityki zdrowotnej. Tak dopełnił się proces wyodrębniania nowego pola badawczego określanego jako nowa społeczna historia medycyny, a mającego kontekst polityczny, geograficzny, demograficzny i ekonomiczny. W polu tym znalazła się m.in. problematyka dziejów leków i zaopatrzenia w leki oraz społecznych następstw postępu nauk farmaceutycznych. 4) I tak, stopniowo, zmieniały się tory myślenia o przeszłości medycyny i farmacji, a zainteresowania badawcze historyków zostały przeniesione z wybitnych jednostek lekarzy i farmaceutów - na ogół pacjentów, a zwłaszcza na struktury społeczne i zwyczaje jako na czynniki kształtujące zdrowie populacji w większym stopniu niż wydarzenia polityczne. Odkrywano fascynującą i ważną problematykę badawczą, potwierdzając spostrzeżenia w ostatnich latach często cytowanego - polskiego lekarza i filozofa nauki, Ludwika Flecka, który w 1935 r. wskazał, że zmiany myślenia prowadzą do zmienionych faktów naukowych, a całkowicie nowe fakty mogą być odkryte tylko dzięki nowemu myśleniu. 5) To właśnie nowe myślenie zapoczątkowało proces przekształcania historii farmacji w społeczną historię potrzeb lekowych pacjentów oraz wchłaniania jej przez historię medycyny. Publikacje z zakresu nowej społecznej historii farmacji są liczne i cechuje je wysoki poziom naukowy, a ukazują się na łamach najbardziej prestiżowych międzynarodowych czasopism biomedycznych i lekarskich. Niekiedy ich tematem jest dawne aptekarstwo, jednak ujęcie tematu nie przypomina prac historyczno-farmaceutycznych powstających w krajach Zachodnich w okresie międzywojennym, po II wojnie światowej, czy jeszcze w latach siedemdziesiątych XX w. 6) Trudno nie zauważyć, że proces zanikania odrębności historii farmacji od historii medycyny jest też wynikiem reformy programów nauczania na studiach farmaceutycznych. Obecnie liczba godzin dydaktycznych przeznaczonych na historię farmacji różni się w poszczególnych krajach. Np. w USA jest to zwykle 60 godzin, w Niemczech są to 24 godziny zajęć obowiązkowych zakończonych egzaminem, w Polsce 15 godzin zakończonych zaliczeniem, a z kolei w Zjednoczonym Królestwie (Anglia) historia farmacji jest nauczana fakultatywnie lub w ramach kształcenia podyplomowego. Dokonane w ostatniej dekadzie w większości państw europejskich zmniejszenie wymiaru godzinowego 3) Por.: Medicine and Modernity. Public Health and Medical Care in Nineteenth- and Twentieth-Century Germany. Eds. Manfred Berg, Geoffrey Cocks, Washington, Cambridge University Press, 1997; Western Medicine. Ed. Irvine Loudon, Oxford New York: Oxford University Press 1997 s. v-vi. 4) Por.: Paul S. Maxim, Qualitative methods in the Social Sciences. Oxford New York ) Nancy Krieger, Theories for Social Epidemiology in the 21st Century: an Ecosocial Perspective. International Journal of Epidemiology 2001 s ) Por. np.: Hilary Marland, The Medical Activities of Mid-Nineth-Century Chemists and Druggists, with Special Reference to Wakefeld and Huddersfield. Medical History 1987 s Farmaceutyczny 5

6 nauczania historii farmacji okazało się nieodwracalnym ciosem w zakłady historii farmacji, powodując redukcję zatrudnienia i z konieczności połączenie z innymi zakładami, najczęściej historii medycyny. Jedyny w Europie Instytut Historii Farmacji istnieje w Niemczech. 7) 3. Nowa społeczna historia farmacji Nr 3 / 2008 Biorąc pod uwagę złożoność i interdyscyplinarny charakter współczesnej biomedycyny oraz jej ścisłe powiązanie z farmacją, proces poszerzania perspektywy badawczej historii farmacji oraz jej stopniowej integracji z historią medycyny był nieunikniony. Nowy nurt, historii farmacji zintegrowanej z historią medycyny, jest reprezentowany przez kilka syntez dziejów medycyny i farmacji w XX w. oraz przez liczne artykuły. Przykładem syntezy sytuującej rozległą problematykę medycyny i farmacji w XX w. w kontekście społecznym, politycznym, demograficznym, obyczajowym, filozoficznym i geograficznym jest Przewodnik po medycynie w XX wieku, obszerna praca zbiorowa zredagowana przez Rogera Cooter a i Johna Pickstone a. 8) Napisanie czterdziestu sześciu rozdziałów powierzono przedstawicielom najbardziej renomowanych uniwersytetów angielskich, amerykańskich, holenderskich, niemieckich, francuskich i australijskich. Jak zaznaczyli we wstępie redaktorzy dzieła: Medycyna jest przede wszystkim wiedzą o ciele w chorobie i zdrowiu, lecz wiedza medyczna nie istnieje niezależnie od społecznego, politycznego i kulturowego kontekstów, w których jest wytwarzana i stosowana. 9) Dostrzegli, że historia medycyny w XX w. jest w rzeczy samej historią potęgi, lecz nie nauki, ale lekarzy i w coraz większym stopniu pacjentów, oraz, że medycyną rządzą takie instytucje i organizacje jak: kościoły, stowarzyszenia charytatywne, towarzystwa ubezpieczeniowe, firmy farmaceutyczne, a w jeszcze większym stopniu przemysłowcy, ekonomiści i politycy. Książka została zatem podzielona na trzy części zatytułowane: Potęga (o systemach polityczno-gospodarczych organizujących systemy opieki zdrowotnej w wybranych państwach Europy Zachodniej, USA i ZSRR), Ciała (w znaczeniu ciała ludzkiego, ale także struktur organizacyjnych i koncepcji medycznych; ciała, które może być zdrowe, płodne, seksualne, niepełnosprawne, genetyczne, poddawane eksperymentom, analizowane etc., bo współczesna medycyna dezintegruje ciało ludzkie) i Doświadczenia (o doświadczanych przez współczesne społeczeństwa miejscach, swoistych wrotach, dostępu do medycyny, takich jak np. media i gabinety lekarskie, a także o doświadczeniach najsłabszych pacjentów, jak dzieci, pacjenci reanimowani, zarażeni HIV/ AIDS i chorzy na nowotwory). W rozdziałach stale przewija się problematyka leków, ich produkcji i gospodarki, lecz w nowatorskim ujęciu. Zgodnie z obecnym trendem, dzieło nie poszukuje wybitnych odkrywców, ale skupia się na rozpoznawaniu relatywizmu osiągnięć nauk medycznych i farmaceutycznych oraz złożoności problemów opieki zdrowotnej doświadczanych przez współczesne społeczeństwa. 10) Inny charakter ma synteza dokonana przez James a Le Fanu, autora poczytnej cotygodniowej kolumny medycznej w brytyjskich Daily Telegraph i Sunday Telegraph, zatytułowana Wzlot i upadek nowoczesnej medycyny. 11) W książce, która może odgrywać rolę przystępnego podręcznika najnowszej historii medycyny i farmacji, autor najpierw przedstawił dwanaście przełomowych momentów w ich dziejach począwszy od II wojny światowej. Cztery z tych przełomów dokonały się za sprawą nowo odkrytych leków (penicyliny, kortizonu, streptomycyny i chlorpromazyny), a dla czterech innych kluczowe znaczenie miały nowe możliwości farmakoterapii (przeszczep nerki, zapobieganie udarom mózgu, leczenie nowotworów dzieci, terapia wrzodu żołądka). Następnie przedstawił nadzieje i rozczarowania, jakie w drugiej połowie XX w. wzbudziły postępy nauk farmaceutycznych i technologii medycznych oraz inżynieria genetyczna i terapia genowa. Historia medycyny została ściśle połączona z historią farmacji, a żywy tok narracji i eksponowane przez autora kontrowersje etyczne oraz następstwa społeczne osiągnięć naukowych sprawiły, że wyposażona w liczne przypisy książka stała się międzynarodowym bestsellerem okrzykniętym przez tak znane czasopisma jak Observer czy Spectator fascynującym dziełem pozwalającym zrozumieć, jak medycyna pozwala pokonać choroby i starość. 12) Kolejnym przykładem pracy reprezentatywnej dla nowej społecznej historii medycyny i farmacji jest monografia Pościg za zapomnieniem. Globalna historia narkotyków autorstwa Richarda Davenport-Hines a. 13) Obszerna i oparta na rzetelnej podstawie źródłowej i literaturowej praca wyjaśnia, jak doszło do tego, że przetwory maku i konopii indyjskich oraz ich pochodne syntetyczne przestały być stosowane jako leki i stały się nielegalnie rozprowadzanymi i masowo przyjmowanymi narkotykami. Licząca 466 stron i ilustrowana fotografiami (dokumentującymi np. legalną sprzedaż opium w Birmie w 1900 r., dzieci bawiące się niedopałkami papierosów z marihuaną w Filadelfii w latach oraz młodych ludzi bawiących się w narkotycznym transie we współczesnej amerykańskiej dyskotece). Książka ta ma również cechy bestselleru, bo nawiązuje do sytuacji dobrze czytelnikom znanych oraz ujawnia lekomanię i narkomanię tak wybitnych twórców kultury jak: m.in. architekt Christopher Wren, pisarz Charles Dickens, twórca psychoanalizy Zygmunt Freud, królowa Wiktoria, Marylin 7) Informacje różnych uczelni europejskich dostępne on-line. 8) Companion to Medicine in the Twentieth Century. Eds. Roger Cooter, John Pickstone. London, Routledge ) Roger Cooter, John Pickstone, Introduction. [W:] Companion to Medicine, s. xiv. Cytowane zdanie brzmi następująco: Much of medicine is knowledge about the body in sickness and health, but medical knowledge does not exist independently of the social, political and cultural contexts in which it is produced and used. 10) Tamże, s. v-vii. 11) James Le Fanu, The Rise and Fall of Modern Medicine. London, Abacus ) Fragmenty recenzji przytoczono na okładce książki. 13) Richard Davenport-Hines, The Pursuit of Oblivion. A Global History of Narcotics London, Weidenfeld-Nicolson Farmaceutyczny

7 Nr 3 / 2008 Monroe, czy Mick Jagger. Autor nie gloryfikował narkomanii, ani jej nie potępił, lecz przyjął rolę świadka narodzin i rozwoju pewnego zjawiska społecznego. Ostatnim wreszcie przykładem syntez reprezentatywnych dla omawianego nurtu badań może być książka Chemia seksualna: historia pigułki antykoncepcyjnej napisana przez Larę V. Marks a wydana przez oficynę Yale University. 14) Tematykę historii doustnych środków antykoncepcyjnych podjęło wcześniej kilku badaczy, ale oryginalność pracy Lary V. Marks wynika przede wszystkim z dwóch faktów: wskazała wpływ niemieckich naukowców, którzy w okresie międzywojennym wyemigrowali do USA, na odkrycie doustnej antykoncepcji, a ponadto udokumentowała wątpliwe etycznie eksperymenty z pierwszymi pigułkami antykoncepcyjnymi wykonywane na chorych umysłowo pacjentkach w szpitalu psychiatrycznym w Massachusetts oraz na najuboższych mieszkankach kontrolowanej przez Amerykanów wyspie Porto Rico. 15) 4. Zmedykalizowana historia farmacji Poza obszar tradycyjnie pojmowanej historii farmacji wykracza szereg artykułów przedstawiających dzieje leków i innych produktów farmaceutycznych w ujęciu zmedykalizowanym. Do interesujących i godnych omówienia publikacji z tego zakresu należy artykuł Iain a Chalmers a Porównując podobnie jak z podobnie jak : historyczne kamienie milowe w ewolucji metod doboru pozbawionych błędu grup porównawczych w eksperymentach terapeutycznych zamieszczony w 2001 r. na łamach International Journal o Epidemiology. 16) Artykuł ma charakter komplementarny wobec wcześniejszych publikacji historycznych dążących do wyjaśnienia ewolucji badań klinicznych, a zwłaszcza rozwoju stosowanych w nich metod ilościowych, początków myślenia kategoriami prawdopodobieństwa, zastosowania metod statystycznych i teorii statystyki oraz socjologii, etyki i polityki badań klinicznych. Prace nad dziejami badań klinicznych obejmują okres od 1662 r., kiedy flamandzki lekarz, Jan Baptysta Van Helmont po raz pierwszy zauważył, że niekiedy lekarze nieumyślnie szkodzą pacjentom i że ponoszą odpowiedzialność za wybór terapii bezpiecznej dla pacjenta. 17) Innym przykładem medykalizacji historii farmacji może być artykuł Viviane Quirke Wdrażając teorię do praktyki: James Black, teoria receptoru i rozwój betablokerów w ICI, zamieszczony w 2006 r. w czasopiśmie Medical History. 18) Jest to praca z zakresu dziejów leku, a więc obszaru tradycyjnie przypisywanego historii farmacji, jednak wysoce specjalistyczna problematyka naukowa została usytuowana w szerokim kontekście społecznym i ekonomicznym. W końcu lat osiemdziesiątych XX w. produkcja betablokerów dostarczała 75% dochodów brytyjskiego przemysłu farmaceutycznego i stanowiła 36% wartości światowego rynku dwudziestu najlepiej sprzedających się leków. 19) Historię farmacji biomedycznej reprezentuje też np. książka Otto Magnusa pt. Rudolf Magnus, fizjolog i farmakolog, ) W pracy wykazano, że współczesna biomedycyna wyodrębniała się w ścisłym związku z farmakologią i fizjologią, a z kolei te dwie dyscypliny nauki były kształtowane przez stopniowo udoskonalane eksperymenty na zwierzętach. 5. Inne nowe pola badawcze Wśród innych nowych, czy może szczególnie intensywnie rozwijających się pól badawczych historii farmacji znalazła się ewolucja przepisów prawnych dotyczących produktów leczniczych dostępnych na receptę i w sprzedaży odręcznej w XX w., 21) a także porównywanie historii prawa farmaceutycznego w różnych krajach. 22) W pracach historyczno-farmaceutycznych pojawiają się nowe terminy: farmakopolityka, czyli całokształt przepisów dotyczących rynku farmaceutycznego, i kultura terapeutyczna, przez co rozumie się kompleksowe związki zachodzące między państwem (w tym wszelkimi agendami legislacyjnymi mającymi wpływ na prawo farmaceutyczne, przemysłem farmaceutycznym, poszczególnymi zawodami medycznymi a stowarzyszeniami pacjentów. 23) Eksploracja dziejów kultury terapeutycznej stała się nowym zadaniem badawczym historyków farmacji. W tym nurcie badawczym zawiera się m.in. problematyka dziejów międzynarodowego nadzoru nad narkotykami i historii nar- 14) Lara V. Marks, Sexual Chemistry: a History of the Contraceptive Pill. New Haven London, Yale University Press, ) Book Review. Medical History 2005 s ) Iain Chalmers, Comparing like with like: some historical milestones in the evolution of methods to create unbiased comparison groups in therapeutic experiments. International Journal of Epidemiology 2001 s ) Tamże, s ) Viviane Quirke, Putting Theory into Practice: James Black, Receptor Theory and the Development of the Beta-Blockers at ICI, Medical History 2006 s ICI to skrót od Imperial Chemical Industries (w wolnym tłumaczeniu - Imperialny Przemysł Chemiczny). 19) Tamże, s ) Otto Magnus, Rudolf Magnus, physiologist and pharmacologist, Amsterdam Dordrecht, Kluwer Academic Publishers ) Np.: W. Steven Pray, A History o Nonprescription Product Regulation. New York London Oxford, Pharmaceutical Products Press ) Np.: Arthur A. Daemmrich, Pharmacopolitics: drug regulation in the United States and Germany. Chapel Hill London, University of North Carolina Press, ) Np.: David R. Bewley-Taylor, The United States and international drug control, London New York, Pinter, 1999; William B. McAllister, Drug diplomacy in the twentieth century: an international history. London New York, Routledge, 2000; David F. Musto, Pamela Korsmeyer, The Quest for Drug Control: Politics and Federal Policy in a Period of Increasing Substance Abuse. New Haven London, Yale University Press, Farmaceutyczny 7

8 kotyków halucynogennych. 24) W tym nurcie mieszczą się też liczne prace dotyczące historii przemysłu farmaceutycznego jako jednego z najpotężniejszych czynników kształtujących współczesne systemy opieki zdrowotnej. 25) Kolejnym nowym polem badawczym, które wyodrębnione zostało w ciągu ostatnich kilkunastu lat, są dzieje farmacji klinicznej, najczęściej analizowane w USA ojczyźnie tej jednej z najmłodszych subdyscyplin farmacji. 26) Warto podkreślić, że wiele artykułów historyczno-farmaceutycznych ukazało się na łamach międzynarodowych czasopism specjalizujących się w farmakoterapii, farmacji klinicznej, etnofarmakologii, opiece farmaceutycznej, czy zarządzaniu gospodarką lekiem. Artykuły te w większości dotyczą dziejów farmacji w XIX i XX w. Liczną grupę artykułów historyczno-farmaceutycznych stanowią prace zamieszczone na łamach międzynarodowych czasopism z zakresu historii medycyny, takich jak: Medical History, Social History of Medicine, Vesalius, czy Gesnerus. 6. Internetowe źródła historyczne i zasoby literaturowe W ostatnich latach upowszechnienie internetu w istotny sposób przeobraziło warsztat badawczy historyków. W sieci znalazło się wiele manuskryptów i starodruków, z których najbardziej znanym polskim dziełem botaniczno-farmaceutycznym jest Zielnik Szymona Syreniusza. W pracach naukowych można wykorzystywać nie tylko zasoby biblioteczne dostępne on line, ale także współczesne odpowiedniki korespondencji, relacji i wspomnień, jakimi są e, blogi i serwisy informacyjne dostępne dzięki internetowi. Podobny problem mieli od dawna historycy przywołujący w pracach listy przechowywane w jednym egzemplarzu w zbiorach rodzinnych, które z jednej strony trudno jest precyzyjnie opisać jako źródło historyczne, a z drugiej, trudno jest jednoznacznie ustalić dostęp do nich, co byłoby użyteczne dla następnych badaczy. Dla informatyków istotna jest data, którą opatrzona jest strona internetowa zawierająca dany dokument, ale historykom to nie wystarcza, bo jest im potrzebna wiedza, kiedy konkretny dokument powstał. Inny problem to korespondencja elektroniczna, która nie jest przecież archiwizowana w ogólnie dostępnych zbiorach. Nr 3 / 2008 W ciągu ostatnich kilkunastu lat wypracowano jednak pewne konwencjonalne zasady korzystania z internetu w pracach historycznych. I tak, stosuje się nawiasy < > wskazujące, że między nimi znajduje się adres elektroniczny, który ponadto zwykle jest zapisem ciągłym podkreślonym automatycznie linią, co pozwala go łatwo zidentyfikować. Adresy internetowe jednak często są zmieniane i poszerzane, co sprawia, że kolejni badacze nie są w stanie do nich dotrzeć. Problem ten nie został dotąd rozwiązany. W internecie znajduje się anglojęzyczna instrukcja, jak cytować internetowe źródła w pracach historycznych i humanistycznych. Jest dostępna na stronie: < W oparciu o ten przewodnik, chciałabym podać dwa przykłady cytowania materiałów internetowychw przypisach. 1) Strona www (World Wide Web): Limb, Peter. Alliance Strengthened or Diminished?: Relationship between Labour&African Nationalist/Liberation Movements in Southern Africa. < limb-1.html>. Maj ) Marciniak, Jan <jamarcin@amu.edu.pl>. Kongres historyków farmacji w Sewilli. Prywatny do Nowak, Marii. 25 września 2007 r. Zasadą naczelną jest podanie, przez analogię do tradycyjnego opisu bibliograficznego, autora, tytułu dokumentu, jego miejsca internetowego i daty powstania. 27) 7. Tradycyjne obszary zainteresowań badawczych Powyżej zarysowane nowe pola badawcze historii farmacji nie oznaczają zaniechania tradycyjnych obszarów zainteresowań, którymi pozostają nadal: dzieje zielarstwa, 28) dzieje leków i placebo, 29) historia toksykologii (w tym wiedzy 24) Np.: Stephen Snelders, Charles Kaplan, LSD Therapy in Dutch Psychiatry: Changing Socio-Political Settings and Medical Sets. Medical History 2002, 46, ; H. B. Spear, Heroin Addiction Care and Control: the British system London, Drugscope, ) Np.: Edgar Jones, The Business of Medicine: the Extraordinary History of Glaxo, a Baby Food Producer, which became one of the world s most successsful pharmaceutical companies. London, Profile Books, 2001.Lesley Richmond, Julie Stevenson, Alison Turton (eds.), The pharmaceutical industry: a Guide to Historical Records. Aldeshot, Ashgate, ) Np.: D.C. McLeod, Contribution of the Annals of Pharmacotherapy to the Development of Clinical Pharmacy. Ann Pharmacother 2006, 40 (1), ss ; D. B. Worthen, Edward G. Spease : Father of Hospital Pharmacy Standards. J Am Pharm Assoc 2006, 46 (3), ss ) Page, Melvin E. <pagem@mtb.und.ac.za>. A Brief Citation Guide for Internet Sources in History and the Humanities (Version 2.1) < 17 stycznia ) Np.: David E. Allen, Gabrielle Hatfield, Medicinal Plants in Folk Tradition: an Ethnobotany of Britain and Ireland. Portland, OR, and Cambridge, Timber Press, 2004; Minta Collins, Medieval herbals: the illustrative traditions. London, British Library and University of Toronto Press, 2000; Gabrielle Hatfield, Memory, wisdom and healing: the history o domestic plant medicine. Thrupp, Sutton Publishing, D. E. Allen zbierał materiały źródłowe do książki przez 17 lat. 29) Np.: Dylan Evans, Placebo: the belief effect. London, Harper-Collins, Farmaceutyczny

9 Nr 3 / 2008 o toksycznych właściwościach metali ciężkich), 30) związki farmacji z etnografią i antropologią, 31) historia aptekarstw, 32) związki farmacji ze sztuką i muzyką. 33) Analiza internetowych zasobów bibliotecznych wskazuje, że zainteresowanie autorów, wydawców i czytelników tematyką historyczno-farmaceutyczną w krajach zachodnich jest duże, a ukazujące się drukiem prace mają charakter interdyscyplinarny, bogate tło społeczne oraz doskonałą podstawę źródłową oraz literaturową. Prace te nigdy nie są jedynie faktografią. Z zamieszczanych we wszystkich artykułach i wydawnictwach zwartych podziękowań wynika, że przed drukiem były one referowane w częściach lub całości na różnych seminariach i konferencjach, a także poddawane wstępnym ocenom współpracowników i osób specjalizujących się w danej problematyce. Taki sposób postępowania zapewnia publikacjom wysoki poziom i chroni je przed krytycznymi uwagami recenzentów. Przesyłane do druku w renomowanych czasopismach artykuły są anonimowo recenzowane przez co najmniej dwie osoby, których uwagi pozwalają autorom na dokonanie uzupełnień i poprawek oraz zapewniają publikacjom wysoki poziom naukowy. 8. Historia farmacji w Polsce W panoramie dorobku historii farmacji nie powinno zabraknąć krótkiej oceny jej stanu w Polsce. Dokonana w 2000 r. redukcja godzin dydaktycznych, podobnie jak znaczne zmniejszenie pensum na kierowanie pracami magisterskimi, sprawiła, że zatrudnienie w jednym ośrodku akademickim dwóch historyków farmacji stało się niemożliwe, a więc zachowanie pokoleniowej ciągłości między nimi jest trudne. Jest więc prawdopodobne, że w przyszłości historia farmacji będzie nauczana wyłącznie przez osoby pozbawione specjalistycznego przygotowania, co będzie miało wpływ na treści programowe i atrakcyjność przedmiotu dla studentów. Kryzys personalny w gronie historyków farmacji ujawnia się podczas międzynarodowych kongresów naukowych, na które przyjeżdża wielu farmaceutów - miłośników tej dziedziny oraz humanistów szukających nowej i atrakcyjnej problematyki badawczej, ale coraz mniej samodzielnych pracowników naukowych specjalizujących się od lat w historii farmacji. Optymizmem napawa fakt, że w Polsce po 2000 r. cztery osoby uzyskały habilitację z historii farmacji, a inne doktoryzowały się; że wydanych zostało kilka wartościowych prac naukowych i popularnonaukowych z dziedziny historii farmacji. Warto podkreślić żywą działalność Sekcji Historii Farmacji Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego. Dorobek organizowanych przez Sekcję sympozjów jest gromadzony i wydawany drukiem w postaci pamiętników. Niepokoi jednak brak polskiego czasopisma, w którym prace historyczno-farmaceutyczne ukazywałyby się dopiero po kompetentnych i krytycznych recenzjach, będących jedynym sprawdzonym narzędziem zapewniania publikacjom wysokiego poziomu naukowego oraz ochrony przed nierzetelnością naukową i plagiatami. W Polsce takich mechanizmów w odniesieniu do historii farmacji niestety już nie ma. 9. Wnioski W ostatnich dekadach XX w. w krajach zachodnich zapoczątkowana została ewolucja historii farmacji, dziedziny historii od dwustu lat wiernie towarzyszącej przemianom zawodu farmaceutycznego i nauk farmaceutycznych. W pracach historycznych farmacja jest coraz częściej przedstawiana jako dział biomedycyny o szerokim kontekście społecznym. Umedycznienie farmacji przyczyniło się do poszerzenia tradycyjnych pól badawczych o nowe, wymagające coraz bardziej specjalistycznej wiedzy z zakresu historii powszechnej, socjologii, demografii, a także chemii, genetyki, biochemii, toksykologii etc. Historia farmacji staje się dyscypliną coraz trudniejszą, ale w interdyscyplinarnym ujęciu przyciągającą coraz więcej czytelników. Osią prac historyczno-farmaceutycznych stają się pytania: jak?, dlaczego? oraz czy tak samo jest gdzie indziej?, a nie: kto?, co?, kiedy? i gdzie?. Przygotowywanie prac historycznych wymaga w coraz większym stopniu erudycji i myślenia analitycznego, a nie tylko umiejętności docierania do źródeł i gromadzenia faktów. Należy jednak zaznaczyć, że obok nowych kierunków i pól badawczych nadal istnieją tradycyjne obszary zainteresowań historyków farmacji, jak np. dzieje aptekarstwa, związki farmacji ze sztuką. Zmniejszenie wymiaru czasowego dydaktyki historii farmacji, co w Polsce w 2000 r. zostało przeprowadzone radykalniej niż w wielu innych krajach, przyczyniło się do ograniczenia liczby osób profesjonalnie specjalizujących się w zakresie historii farmacji i może mieć niekorzystny wpływ na dalszy rozwój dyscypliny. Zamieszczanie prac historyczno-farmaceutycznych przez czasopisma biomedyczne, lekarskie i farmaceutyczne jest tendencją zauważalną na całym świecie, także w Polsce, i godną pozytywnej oceny z uwagi na szerokie rozpowszechnianie wiedzy. Z drugiej jednak strony, brak w naszym kraju czasopisma (lub działu czasopisma) systematycznie zamieszczającego artykuły z zakresu historii farmacji recenzowane przez osoby kompetentne w tym zakresie jest zjawiskiem niepokojącym. 30) Np.: Peter C. English, Old Paint: a Medical History o Childhood Lead-paint Poisoning in the United States to New Brunswick London, Rutgers University Press, 2001; R. Ian McCallum, Antimony in Medical History: an Account of the Medical Uses of Antimony and Its Compounds Since Early Times to the Present. Bishop Auckland and Edinburgh, Pentland Press, 1999; Katherine D. Watson, Medical and Chemical Expertise in English Trials for Criminal Poisoning, Medical History 2006, 50, s ) Np.: Ann Anderson, Snake oil, hustlers and hambones: the American medicine show. Jefferson, NC, McFarland&Co, ) Np.: Sue Minter, The Apothecaries Garden: a New History of the Chelsea Physic Garden. Thrupp Stroud, Sutton Publishing, ) Np.: Doris Zaugg, Musik und Pharmazie: Apotheker und Arzneimittel in der Oper. Lieberfeld, SGGP/SSHP, Farmaceutyczny 9

10 GLIKOZYDAZY LIZOSOMALNE KRWI CHORYCH NA SKLERODERMĘ SERUM LYSOSOMAL GLYCOSIDASES IN PATIENS WITH SYSTEMIC SCLEROSIS Mgr Kornelia Kuźnik-Trocha 1, Prof. Krystyna Olczyk 1, Dr Katarzyna Komosińska-Vassev 1, Dr Katarzyna Winsz-Szczotka 1, Prof. Eugeniusz Kucharz 2 1 Katedra i Zakład Chemii Klinicznej i Diagnostyki Laboratoryjnej, Wydział Farmaceutyczny z Odziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 Katedra i Klinka Chorób Wewnętrznych i Reumatologii Szpital Kliniczny nr 7, Górnośląskie Centrum Medyczne, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Kierownik Katedry: Prof. dr hab. n. med. Krystyna Olczyk Streszczenie Skleroderma (SSc) jest chorobą tkanki łącznej, dotyczącą głównie kobiet, charakteryzującą się zaburzeniami immunologicznymi, uszkodzeniem naczyń krwionośnych oraz nadmiernym odkładaniem się w tkankach składników macierzy pozakomórkowej, w tym proteoglikanów (PGs) oraz ich heteropolisachrydowych składowych glikozoaminoglikanów (GAGs). Nie wiadomo jednakże, czy wzrost zawartości PGs/GAGs w tkankach w przebiegu sklerodermy, jest przejawem jedynie nadmiernej biosyntezy tych makrocząsteczek, czy też stanowi wyraz upośledzonej ich degradacji. Stąd też, celem niniejszej pracy była ocena aktywności wybranych glikozydaz lizosomalnych, uczestniczących w rozpadzie glikozoaminoglikanowych składników PGs, w surowicy kobiet z SSc. Aktywność N-acetylo- -β-d-glukozaminidazy, β-galaktozydazy, β-glukozydazy i α-mannozydazy oznaczano w surowicy krwi 30 kobiet chorych na sklerodermę, jak i w surowicy krwi 10 kobiet zdrowych. W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono wzrost aktywności niemal wszystkich oznaczanych enzymów lizosomalnych (z wyjątkiem β- -galaktozydazy) w surowicy chorych z SSc. Uzyskane wyniki sugerują zwiększony udział enzymów lizosomalnych w kształtowaniu metabolizmu składników macierzy pozakomórkowej, w przebiegu sklerodermy. Abstract Systemic sclerosis (SSc) is a connective tissue disease, more frequently occurring in women, characterized by immunological disturbances, vascular damage and the excessive tissue deposition of extracellular matrix components, particularly proteoglycans (PGs) and their heteropolysaccharide components glycosaminoglycans (GAGs). It has not been determined whether PGs/ GAGs content increase is caused by overproduction or enhanced degradation of these macromolecules. We determined the serum activity of lysosomal glycosidases contributing to degradation of glycosaminoglycan components of PGs. Activity of the lysosomal enzymes: N- -acetyl-β-d-glucosaminidase, β-galactosidase, β-glucosidase and α-mannosidase was determined in the blood serum of 30 female with systemic sclerosis and of 10 healthy controls. The activity of all investigated serum enzymes involved in GAGs degradation was found to be markedly increased in investigated subjects with SSc, except for β-galactosidase, which was not significantly modified. The results obtained in our study suggest increased participation of serum lysosomal enzymes in the extracellular matrix component metabolism during systemic sclerosis. Key words: systemic sclerosis, lisosomal glycosidases Słowa kluczowe: skleroderma, glikozydazy lizosomalne 10 Farmaceutyczny

11 Nr 3 / 2008 Wstęp Skleroderma (systemic sclerosis SSc) jest chorobą tkanki łącznej, o charakterze postępującym, toczącą się w obrębie skóry, tkanki podskórnej, układu kostno-stawowego oraz narządów wewnętrznych [1,2]. Schorzenie to występuje głównie u kobiet. Cechuje się zaburzeniami immunologicznymi, uszkodzeniem śródbłonka naczyń krwionośnych oraz nadmierną biosyntezą składników macierzy pozakomórkowej przez pobudzone fibroblasty [1,2,3]. Wspomniane zaburzenia wynikają ze złożonych interakcji pomiędzy komórkami śródbłonka, limfocytami i makrofagami, które to interakcje zachodzą poprzez szereg mediatorów cytokin, chemokin i czynników wzrostowych, odgrywających istotną rolę w procesie włóknienia, m.in. poprzez pobudzenie proliferacji fibroblastów i syntezy składników macierzy [1,2,4,5,6]. Wzmożona biosynteza komponentów macierzy pozakomórkowej kolagenu, fibronektyny czy proteoglikanów (PGs), prowadzi do odkładania się tych makrocząsteczek w tkankach [1,2]. Zmiany metabolizmu PGs w przebiegu sklerodermy, dotyczą w szczególności ich heteropolisachrydowych składowych, tj. glikozoaminoglikanów (GAGs). Nie wiadomo jednakże, czy towarzysząca SSc kumulacja PGs/GAGs jest przejawem jedynie nasilonej biosyntezy tych związków, czy też stanowi wyraz upośledzonej ich degradacji. Rozpad PGs/GAGs zachodzi zarówno w przestrzeni pozakomórkowej, jak i we wnętrzu komórki. Wspomniana, pozakomórkowa degradacja, zachodzi na drodze enzymatycznej, przy udziale swoistych endoglikozydaz oraz metaloproteinaz (MMP), jak i przy udziale czynników niespecyficznych, tj. reaktywnych form tlenu (RFT) [1,7,8,9]. Choć wiadomo, że w przebiegu sklerodermy dochodzi do wzmożonego wytwarzania reaktywnych form tlenu degradujących m.in. omawiane składniki macierzy w przestrzeni pozakomórkowej [9], to nie jest dokładnie poznana rola enzymów lizosomalnych w wewnątrzkomórkowej degradacji PGs/GAGs, w przebiegu SSc. Stąd też, przedmiotem niniejszej pracy była ocena aktywności wybranych enzymów lizosomalnych, tj. N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, β-galaktozydazy, β-glukozydazy i α-mannozydazy, we krwi kobiet z SSc. Materiał i metody badań Materiał do badań stanowiła surowica krwi 30 kobiet chorych na sklerodermę, hospitalizowanych w I Katedrze i Klinice Dermatologii, Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. Rozpoznanie choroby ustalono w oparciu o kryteria Amerykańskiego Towarzystwa Reumatologicznego [10]. Do badań zakwalifikowano chore we wczesnym okresie uogólnionej postaci choroby do 3 lat od wystąpienia stwardnień skóry. U każdej chorej wykonano następujące badania laboratoryjne: OB, badanie morfologiczne krwi, proteinogram, stężenie CRP w surowicy, obecność przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) i przeciwciał przeciwko topoizomerazie I (anty Scl-70) oraz badanie ogólne moczu, a ponadto przeprowadzono badania specjalistyczne, pozwalające na ocenę zmian w poszczególnych narządach wewnętrznych, tj. scyntygrafię przełyku, badanie spirometryczne płuc i RTG klatki piersiowej oraz EKG i echokardiografię serca. Materiał referencyjny do badań stanowiła surowica krwi 10 zdrowych kobiet, poddających się okresowym badaniom kontrolnym w Przychodni Miejskiej w Sosnowcu. W surowicy krwi wszystkich kobiet oznaczono aktywność: N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, β-galaktozydazy, β-glukozydazy i α-mannozydazy metodą Barrett`a i Heath`a [11]. W zastosowanej metodzie, wykorzystano zdolność wymienionych wyżej enzymów lizosomalnych do rozkładania syntetycznych substratów, tj. odpo-wiednio, 2-nitrofenolo-N-acetylo-β-D-glukozoaminidu dla N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, p-nitrofenolo-β-galaktopiranozydu dla β-galaktozydazy, p-nitrofenolo-β-glukopiranozydu dla β-glukozydazy oraz p-nitrofenylo-α-mannopiranozydu dla α-mannozydazy. Miarą aktywności badanych glikozydaz był przyrost stężenia p-nitrofenolu uwolnionego z substratu, mierzony spektrofotometrycznie przy długości fali 410 nm. Otrzymane wyniki poddano opracowaniu statystycznemu, przy pomocy komputerowego pakietu STATISTICA v.5.1., obejmującemu: wyznaczenie średnich wartości oraz odchyleń standardowych dla danej cechy, sprawdzenie normalności rozkładu danej cechy testem Shapiro Wilka, sprawdzenie równości wariancji testem Snedecora Fishera oraz określenie istotności różnic średnich wartości danej cechy dla grupy kontrolnej i grupy badanej, testem t-studenta. Wyniki W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, iż aktywność trzech spośród czterech ocenianych enzymów lizosomalnych w surowicy badanych chorych ulega istotnym zmianom. Wyrazem tych zmian jest obserwowany wzrost surowiczej aktywności N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, β-glukozydazy oraz α-mannozydazy, w porównaniu z aktywnością tych enzymów, wykazaną w grupie kontrolnej (p<0,05). W przeciwieństwie do tendencji zmian wspomnianych glikozydaz, aktywność β-galaktozydazy w surowicy krwi pacjentek z SSc, była porównywalna z aktywnością tego enzymu we krwi kobiet zdrowych. Największą różnicę w aktywności badanych enzymów, pomiędzy grupą badaną a kontrolną, zaobserwowano w przypadku N-acetylo-β-D-glukozaminidazy. Wartości aktywności N-acetyloβ-D-glukozaminidazy, β-galaktozydazy, β-glukozydazy i β-mannozydazy, w surowicy krwi osób zdrowych oraz osób chorych na sklerodermę, przedstawiono w tabeli I. Dyskusja Sklerodermę charakteryzuje przewlekły proces zapalny o podłożu autoimmunologicznym, czego wynikiem jest postępujące włóknienie skóry oraz narządów wewnętrznych [1,2,3,4]. Liczne badania sugerują, iż progresja choroby wiąże się z uwalnianiem cytokin przez komórki zapalne nacieków okołonaczyniowych we wczesnych stadiach choroby [1,2,5,6,12,13,14]. Uwolnione cytokiny, a szczególnie interleukiny: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, czynnik martwicy nowotworów α (TNF-α), czynnik wzrostowy pochodzący z płytek (PDGF) oraz transformujący czynnik wzrostowy Farmaceutyczny 11

12 Nr 3 / 2008 Tabela I. Aktywność N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, β-galaktozydazy, β-glukozydazy oraz α-mannozydazy w surowicy krwi chorych na sklerodermę oraz w grupie kontrolnej (średnia ± SD) Oznaczany enzym N-acetylo-β-D-glukozaminidazy (nkat/l) β-galaktozydazy (nkat/l) β-glukozydazy (nkat/l) α-mannozydazy (nkat/l) Grupa kontrolna (n=10) Grupa badana (n=30) 30,82 ± 4,21 46,78 ± 7,16 a 6,84 ± 1,04 6,74 ± 0,84 7,03 ± 1,43 8,03 ± 1,67 a 6,01 ± 1,04 8,62 ± 1,53 a a p<0,05 istotność statystyczna w porównaniu do grupy kontrolnej 12 Farmaceutyczny (TGF-β), biorą udział w dalszym uszkodzeniu i aktywacji śródbłonka, m.in. poprzez zmniejszenie ekspresji syntazy tlenku azotu, wzrost wydzielania endoteliny czy też stymulowanie wytwarzania RFT, posiadających zdolność degradacji składników błony podstawnej naczyń. Ponadto, wspomniane cytokiny pobudzają fibroblasty do syntezy kolagenu oraz innych składników macierzy pozakomórkowej, w tym proteoglikanów i glikozoaminoglikanów [1,2,5,6,13,14,15]. Wykazano, iż wzmożonej biosyntezie PGs/GAGs w przebiegu SSc towarzyszy nasilona pozakomórkowa ich degradacja przy udziale reaktywnych form tlenu [9]. Stymulowany RFT rozpad omawianych cząsteczek jest jedynie fragmentaryczny, bowiem do całkowitej degradacji proteoglikanów dochodzi wyłącznie wewnątrzkomórkowo w przedziale lizosomalnym [7]. Wewnątrzkomórkowa degradacja poprzedzona jest endocytozą niezmienionych PGs lub ich fragmentów [7]. Za przyśpieszoną, wewnątrzkomórkową degradacją wspomnianych makrocząsteczek w przebiegu sklerodermy przemawiają natomiast wyniki niniejszej pracy. Wykazaliśmy bowiem statystycznie istotny wzrost aktywności większości badanych glikozydaz lizosomalnych, tj. N-acetylo-β- -D-glukozaminidazy, β-glukozydazy oraz α-mannozydazy, w surowicy chorych z SSc, w porównaniu do aktywności enzymów we krwi zdrowych kobiet. Nie zaobserwowaliśmy natomiast zmian aktywności β-galaktozydazy w przebiegu omawianego schorzenia. N-acetylo-β-D-glukozaminidaza, której wzrost aktywności w grupie badanej był największy w porównaniu z aktywnością tego enzymu w grupie kontrolnej, jest najaktywniejszym enzymem spośród wszystkich glikozydaz lizosomalnych. W przeciwieństwie do pozostałych hydrolaz lizosomalnych, N-acetylo-β-D-glukozaminidaza występuje w wielu narządach i płynach ustrojowych [16]. Uwalnianie tego enzymu jak i innych glikozydaz lizosomalnych przez komórki może być stymulowane zarówno przez niektóre cytokiny, np. IL-1β [16], jak i poprzez reaktywne formy tlenu, uszkadzające błony lizosomalne [8]. I tak, dane literaturowe wskazują, iż u chorych z SSc dochodzi do nadmiernego wytwarzania RFT [9] oraz do wzrostu stężenia IL-1 w surowicy krwi [12], co przemawia za udziałem obydwu tych mechanizmów w uwalnianiu enzymów lizosomalnych. Ponadto, w przebiegu omawianego schorzenia dochodzi do zaburzenia morfologii i funkcji na- czyń krwionośnych, co może prowadzić do upośledzonego przepływu krwi oraz wzrostu przepuszczalności ściany naczyń [1,2,3,14]. W związku z powyższym, uwolnione z lizosomów zarówno z komórek ściany naczyniowej, jak i komórek innych tkanek i narządów, czy też komórek krwi N-acetylo-β-D-glukozaminidaza i inne egzoglikozydazy mogą przenikać do światła naczyń krwionośnych, czego efektem jest wzrost aktywności tych hydrolaz w surowicy krwi chorych z SSc. Otrzymane w ramach niniejszej pracy wyniki są częściowo zgodne z wynikami Herrmanna i wsp. [17]. Autorzy ci stwierdzili, że we krwi chorych z SSc dochodzi do wzrostu aktywności N-acetylo-β-D-glukozaminidazy i β-galaktozydazy oraz spadku aktywności β-glukuronidazy i α-galaktozydazy, w porównaniu do aktywności tych enzymów we krwi osób zdrowych. Ponadto, wymienieni autorzy nie stwierdzili zmian w aktywności β-glukozydazy w surowicy pacjentów w stosunku do aktywności tego enzymu u osób zdrowych [17]. Odmienny profil aktywności β-glukozydazy i β-galaktozydazy w niniejszej pracy, w stosunku do opisanego przez Herrmanna i wsp. [14] wiąże się prawdopodobnie z różną aktywnością procesu chorobowego badanych osób, różnym okresem trwania choroby, a także innym stopniem zaawansowania włóknienia poszczególnych narządów wewnętrznych. Wnioski W przebiegu sklerodermy dochodzi do statystycznie istotnego wzrostu aktywności N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, β-glukozydazy oraz β-mannozydazy, co wskazuje na udział tych enzymów lizosomalnych w kształtowaniu metabolizmu składników macierzy pozakomórkowej, w przebiegu omawianego schorzenia. Stwierdzenie to może stanowić przesłankę do rozważań, czy różnice w aktywności badanych glikozydaz lizosomalnych, a zwłaszcza N-acetylo-β-D-glukozaminidazy, mogą być wykorzystane w rozpoznawaniu i monitorowaniu przebiegu sklerodermy. Egzoglikozydazy lizosomalne bowiem, z uwagi na fakt, iż należą do czułych wskaźników uszkodzenia tkanek, znalazły już zastosowanie w diagnostyce wielu chorób, w tym np. wątroby i nerek [16,18].

13 Nr 3 / 2008 Piśmiennictwo: 1. Neudecker BA, Stern R, Connolly MK: Aberrant serum hyaluronan and hyaluronidase levels in scleroderma. Br J Dermatol 2004;150: Varga J., Abraham D.: Systemic sclerosis: a prototypic multisystem fibrotic disorder. J Clin Invest 2007; 117: Lis-Święty A i wsp.: Badanie stężenia rozpuszczalnego receptora interleukiny-6 w surowicy chorych na twardzinę układową przed leczeniem i po leczeniu immunosupresyjnym. Post Dermatol Alergol 2006; 2: Domysławska I i wsp.: Współistnienie zespołu twardzinopodobnego i samoistnego włóknienia szpiku u 54-letniej pacjentki. Pol Arch Med Wewn 2007; 117: Scala E i wsp.: Cytokine and chemokine levels in systemic sclerosis: relationship with cutaneous and internal organ involvement. Clin Exp Immunol 2004; 138: Takehara K, Sato S: Lokalized scleroderma is an autoimmune disorder. Rheumatology : Koźma EM i wsp.: Proteoglikany - struktura i funkcje. Postępy Biochem 1997; 43: Komosińska-Vassev K i wsp.: Graves disease-associated changes in the serum lysosomal glycosidases activity and the glycosaminoglycan content. Clin Chim Acta 2003; 331: Olczyk K i wsp.: Free radical activity and antioxidative systems in patiens with systemic sclerosis. Eur J Intern Med 1999; 10: Subcommittee for Scleroderma Criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee. Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum 1980; 23: Barrett AJ, Heath MF: Lysosomal enzymes. In. Dingle JT, editor. Lysosomes: a laboratory handbook. Amsterdam: Elsevier/North Holland Biomedical Press 1977; Lis-Święty A i wsp.: Badanie stężenia rozpuszczalnego receptora czynnika martwicy nowotworów α typu I w surowicy chorych z objawem Raynauda i twardziną układową. Post Dermatol Alergol 2007; 4: Takehara K: Hypothesis: pathogenesis of systemic sclerosis. J Rheumatol 2003; 30: Sapadin AN, Esser AC, Fleischmajer R: Immunopathogenesis of scleroderma--evolving concepts. Mt Sinai J Med 2001; 68: Dziankowska-Bartkowiak B, Dorota Torzecka J, Waszczykowska E: Wpływ zaburzeń angiogenezy i waskulogenezy na rozwój twardziny układowej przegląd piśmiennictwa. Post Dermatol Alergol 2006; 5: Wielgat P i wsp.: Aktywność egzoglikozydaz lizosomalnych w surowicy pacjentów z boreliozowym przewlekłym zapaleniem stawów. Przegl Epidemiol 2004; 58: Herrmann K i wsp.: Acid lysosomal hydrolases in systemic sclerosis and other connective tissue diseases. Br J Dermatol 1982; 106: Borzym-Kluczyk M i wsp.: The activity of N-acetyl-β- -glucosaminidase and its isoenzymes in the renal tissue, serum and urine of patients with renal cancer. Współcz Onkol 2005; 9; 7: Farmaceutyczny 13

14 Elektroniczna baza identyfikacji leków e-tabletki dr farm. Małgorzata Panas, dr farm. Sebastian Polak, Miłosz Polak, mgr farm. Agata Ryszawy Katedra Toksykologii Uniwersytet Jagielloński w Krakowie Collegium Medicum Kierownik Katedry prof. dr hab. J. Brandys Program e-tabletki opiera się na opisie preparatów na podstawie ich postaci, faktury, wymiarów, koloru i nadruków. Ikonografię stanowią dołączone zdjęcia preparatów. Służy wyłącznie do identyfikacji różnych postaci leków, dostępny jest w sieci Internet. e-tabletki składają się z części dla administratora wprowadzającego nowe postacie leku i pozwala na rozbudowę oraz części dla użytkownika, którym w założeniu jest lekarz lub farmaceuta. Wyszukiwanie odbywa się za pomocą opisanych parametrów. Wyniki zgrupowane są według kategorii: wyniki pewne, wyniki prawdopodobne, wyniki mało prawdopodobne. Przydział do kategorii zależy od zgodności parametrów wprowadzonych przez użytkownika z parametrami zapisanymi w bazie. Podział na 3 zakresy wyników jest rezultatem procesu walidacji. Przy prostocie działania programu można założyć bezbłędną identyfikację stałej postaci leku. Elektroniczna baza stałych postaci leku ma prowadzić do szybkiej identyfikacji preparatu, głównie w toksykologii klinicznej. Baza jest łatwa w użyciu; przyjazna dla użytkownika; przeznaczona dla fachowych pracowników; pomocna w szybkiej identyfikacji stałej postaci leku, spełnia standardy światowe. E-tabletki is a fully searchable Internet based database system specialized in different drug formulation identification based on drugs description type of formulation, layer characteristic, seize, colour and printed text. High resolution pictures of every solid drug formulation are included. E-tabletki system is divided to two main parts the administrative and end user both with full graphic interface. The administrative part enables new drugs characterization and the end user part is specialized in drug search with use of mentioned above parameters. The results are categorized to the three main groups according to their probability and compatibility with those parameters. The E-tabletki system is easy to use for both administrator and end user and provides the possibility to fast and reliable drug identification what could be especially useful in clinical toxicology. Developed for needs of health specialists medical doctors and pharmacist, E-tabletki system was designed according to the health information in web standards. Keywords: drug identification, clinical toxicology Słowa kluczowe: elektroniczna baza identyfikacji leków, zastosowanie w toksykologii klinicznej. Rynek farmaceutyczny jest jednym z najprężniej rozwijających się gałęzi gospodarki. Rokrocznie dopuszczane są do sprzedaży nowe preparaty, często leki generyczne, które różnią się wyglądem od podobnych, wcześniej dostępnych preparatów, dlatego coraz ważniejszym zadaniem staje się opracowanie niezawodnego systemu ich identyfikacji. Pierwsza baza danych umożliwiająca identyfikacje tabletek i kapsułek na podstawie kolorowych fotografii, powstała w 1962 r. w USA. Od tego czasu powstało szereg systemów identyfikacyjnych leków [1,2,3,4,5,6], jednak żaden z nich nie zdaje egzaminu w polskich warunkach. Problem dotyczy zwłaszcza toksykologii, gdzie identyfikacja może być 14 Farmaceutyczny wykorzystana do przyspieszenia diagnostyki i wdrożenia właściwego leczenia zatrutego pacjenta. W ciągu wielu lat stworzono szereg programów identyfikacji leków. Elektroniczne identyfikatory stałych postaci leku mogą być osobnymi programami lub częścią złożonych programów medycznych, albo elementem medycznych stron internetowych. Są to programy komercyjne lub ogólnodostępne. Bazy identyfikacji stałych postaci leków zawarte są w dwóch dużych, komercyjnych programach epocrates online, efacts [7,8]. Do chwili podjęcia tego tematu nie istniał w Polsce system identyfikacji nieznanych postaci leku. Pierwszy sto-

15 Nr 3 / 2008 sunkowo prosty program identyfikacji leków Tabletki powstał w Katedrze Toksykologii UJ CM we współpracy z Zakładem Farmakokinetyki UJ CM, a działał w oparciu o program MS Access [2,3,4,5,6]. Modyfikacją dotychczasowego systemu jest program e- -Tabletki. Stary interfejs programu dosyć skomplikowany dla użytkownika, zamieniono na prostszy, bardziej nowoczesny, dostępny za pośrednictwem sieci Internet. Koncepcja programu pozostała taka sama i opiera się na opisie preparatów na podstawie ich postaci, faktury, wymiarów, koloru i nadruków. Sposób ikonografii nie zmienił się znacząco. Zadaniem programu jest wyłącznie identyfikacja różnych postaci leków. Zmodyfikowany program e-tabletki składa się z części administracyjnej dla administratora wprowadzającego nowe postacie leku oraz części do odczytu dla użytkownika, którym w założeniu jest lekarz lub farmaceuta. Wprowadzanie nowego preparatu Wprowadzając nowy preparat z paska zadań należy wybrać Preparaty. Po wykonaniu tej czynności pojawi się szereg pól do wypełniania przez administratora ( rys. 2) Część administracyjna zmodyfikowanego programu e-tabletki Przed rozpoczęciem pracy należy zalogować się do programu. Czynność tę wykonuje się poprzez podanie loginu i hasła, a następnie potwierdzenie poprawności wprowadzonych danych poprzez naciśnięcie Zaloguj.( rys. 1) Rys. 2. Pola programu do wypełnienia przez administratora Rys. 1. Sposób logowania do programu e-tabletki i strona administracyjna programu Po wykonaniu tej procedury pojawia się dział administracyjny, do którego można wprowadzać nowe preparaty jak również dokonywać zmian we wcześniej wprowadzonych parametrach (rys.1). Ten obszar pracy pozwala na rozbudowę i edycję zawartości baz danych, a nie na identyfikację poszczególnych stałych postaci leku. W polu identyfikator preparatu pojawia się automatycznie jego numer i określa którym z kolei jest preparat aktualnie wprowadzany. Następnie wypełnia się poszczególne pola czyli: nazwę preparatu, dawkę preparatu, jego postać wybieraną z listy dostępnej w bazie, oraz fakturę preparatu. W tej kategorii również jest dostępna lista, z pomocą której określa się ten parametr. Ostatnim wprowadzanym elementem jest zdjęcie preparatu. Następną sekwencją niezwykle ważną dla prawidłowej identyfikacji są wymiary (w mm) i kolor postaci leku. Z załączonej listy kolorów wybiera się odpowiednie barwy dla Farmaceutyczny 15

16 wprowadzanej stałej postaci leku. Większość tabletek charakteryzuje identyczny kolor z obu stron, zdarzają się jednak postacie posiadające dwa różne kolory. Często kapsułki mają inny kolor górnej i dolnej części. Przy wprowadzaniu tego parametru ważne jest dokładne zaznaczenie właściwego koloru. Z punktu widzenia identyfikacji bardzo ważne jest prawidłowe odczytanie i wpisanie nadruku charakteryzującym awers/rewers oraz kształt postaci leku. Kształt preparatu wybiera się wśród następujących ( rys. 3). Rys. 3. Kształt preparatu Nr 3 / 2008 W programie istnieje lista producentów z której należy wybrać odpowiedniego producenta danego preparatu. Przy dokonywanej identyfikacji jej potwierdzeniem a zarazem wskazówką może być składnik czynny preparatu. Na załączonej liście składników wyszukuje się odpowiednią substancję czynną/substancje czynne, których nazwy umieszczone są w 3 wersjach językowych łacińskiej; polskiej; angielskiej. Zapis wprowadzanego preparatu odbywa się przez opcję zapisz. Wprowadzający ma do wyboru opcje anuluj albo usuń, jeśli z różnych powodów nie chce zapisać wprowadzanego preparatu. W celu wyjścia z programu wybiera się w menu głównym funkcję Koniec pracy. Elektroniczna baza leków E-Tabletki wersja dla użytkownika Jest ona dostępna dla fachowego personelu medycznego. Wyszukiwanie odbywa się za pomocą takich parametrów jak: postać, faktura, wymiary, barwa, nadruki (awers, rewers) Każdy wpisany parametr zawęża pole poszukiwań. Po wpisaniu maksymalnej liczb danych i wybraniu ikony Szukaj preparatu wyświetlają się wyniki (rys. 4). Program dzieli zasób wyników na 3 kategorie: - wyniki pewne, - wyniki prawdopodobne, - wyniki mało prawdopodobne. Przydział do kategorii zależy od zgodności parametrów wprowadzonych przez użytkownika z parametrami zapisanymi w bazie. Decyzja o wyświetlaniu jedynie wyników pewnych byłaby błędem, ponieważ wpisane przez użytkownika parametry prawdopodobnie będą się różnić od wprowadzonych przez administratora ( rys. 5). Rys.4. Widok ekranu wersji dla użytkownika Większość tabletek w Polsce to białe tabletki bez żadnych nadruków. Jednak część tabletek czy kapsułek posiada charakterystyczny napis czy znak (wprowadzany do opisu), który później ułatwia ich identyfikację. Mniej istotnym elementem dla identyfikacji preparatu jest opakowanie. Ten parametr w identyfikacji stałej postaci leku nie jest szczególnie ważny, ponieważ często przy zatrutej osobie znajduje się tylko rozsypane tabletki. 16 Farmaceutyczny Wyniki wyszukiwania Podział na 3 zakresy wyników jest rezultatem procesu walidacji, głównie dotyczącego kryterium dokładności, czyli zgodności między wynikiem uzyskanym a rzeczywistym. Wynikiem wyszukiwania po wprowadzeniu wyżej wymienionych parametrów jest lista możliwych preparatów ze zdjęciami, co pozwala na porównanie szukanej postaci leku z wzorcami znajdującymi się w bazie e- Tabletki.

17 Nr 3 / 2008 względzie. Elektroniczna baza stałych postaci leku ma na celu pomoc w szybkiej identyfikacji preparatu, zwłaszcza w przypadkach zatruć ostrych nieznanym preparatem. Dzięki prostej obsłudze program może się przyczynić do znacznego skrócenia czasu identyfikacji leku i wdrożenia prawidłowego procesu leczenia pacjenta. Wnioski e-tabletki to baza prosta, maksymalne uproszczona zawierająca opis prowadzący do szybkiej identyfikacji nieznanej postaci leku. W przypadku stałych postaci leku opis oparty jest o wymiary i proste parametry, jakimi są postać leku, kształt, znak firmowy. Jest jedyną bazą dostosowaną do warunków w Polsce, przystosowaną do ciągłego rozbudowywania. Komputerowa baza e-tabletki zawiera szereg nowatorskich elementów: pomoc w szybkiej identyfikacji stałej postaci leku łatwa w użyciu; przyjazna dla użytkownika; przeznaczona dla fachowych pracowników; Rys. 5. Wyniki wyszukiwania Dyskusja Większość amerykańskich baz danych opiera się na identyfikacji stałej postaci leku na podstawie kodów wprowadzonego przez FDA (Food and Drug Administration), zawierających informacje o substancji aktywnej, dawce i producencie. Przy tworzeniu polskiego identyfikatora stałych postaci leku należy mieć na uwadze warunki i rynek farmaceutyczny w Polsce. Program e-tabletki jest przyjazny zarówno w części administracyjnej jak i użytkownika jest też prosty w obsłudze. Przy założeniu jego prostoty i szybkiego oswojenia się z jego działaniem można założyć praktycznie bezbłędną identyfikację stałej postaci leku. Praca z programem jest łatwa i nie wymaga specjalnego technicznego przeszkolenia, a jedynie merytorycznego przygotowania z zakresu farmakologii, toksykologii, technologii postaci leku czyli ogólne z zakresu farmacji. Prostota programu jest jego głównym założeniem, nie tylko przy jego późniejszej obsłudze, ale także przy jego przygotowywaniu. Elektroniczna baza stałych postaci leku ma na celu pomoc w szybkiej identyfikacji preparatu, pod wpływem którego doszło do zatrucia. Dzięki prostej obsłudze program może się przyczynić do znacznego skrócenia czasu identyfikacji leku. W przypadku stałych postaci leku stworzenie takiej bazy jest bez wątpienia koniecznie, a cele takiej pracy i projekt wykonania wystarczająco oczywiste. Program opracowany jest dla fachowego personelu medycznego, gdyby jednak doszło do jego komercjalizacji, tak aby również rodzice mieli do niego swobodny dostęp, uzupełniony o dodatkowe informacje, szczególnie dotyczące pierwszej pomocy, byłyby bardzo dobrze wykorzystany. Program e-tabletki spełnia standardy światowe w tym Wysoki poziom wykształcenia polskiego farmaceuty i lekarza pozwala przesunąć na dalszy plan opis działania poszczególnych leków. Specjalista z dziedziny medycyny potrafi od razu po zidentyfikowaniu leku określić jego zastosowanie i skutki przedawkowania. Demonstracyjna wersja bazy identyfikacyjnej postaci leków e-tabletki dostępna będzie pod adresem internetowym od 2 stycznia 2008 r. PIŚMIENNICTWO: 1. Andrew C.S. i wsp., Ability of Practioners to Identify Solid Oral Dosage Tablets. Am. J. Health-Syst. Pharm., 63, , Pach J., Panas M.: Opracowanie systemu identyfikacji różnych postaci leków. Farm. Pol , 4, Panas M., Jawień W.: Opracowanie systemu identyfikacji różnych postaci leków. XVII Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego, Kraków, września 1998,stresz Panas M., Pach J., Jawień W.: Komputerowy system identyfikacji różnych postaci leków. VII Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego Międzyzdroje, , stresz Panas M., Jawień W.: Zastosowanie systemów identyfikacji różnych postaci leków. Przegl. Lek.,58, Panas M., Jawień W.: Założenia komputerowej bazy danych identyfikacji różnych postaci leków. XVIII Nauk. Zjazd Pol.Tow.Farm.Poznań, wrzesień, 2001, stresz., M. Panas, S. Polak, J. Brandys: Przydatność wybranych baz danych w praktyce medycznej. Przegl. Lek.,59,370, M. Panas, S. Polak: Medyczna baza danych MICROME- DEX- różnice i podobieństwa z wybranymi bazami medycznymi. Farmacja Pol., 58, 787, Farmaceutyczny 17

18 Dostępność farmaceutyczna metotreksatu z układów termowrażliwych otrzymanych na bazie Pluronicu F-127 Pharmaceutical availability of methotrexate from thermosensitive systems prepared on Pluronic F-127 Prof. dr hab. Janusz Pluta, mgr Bożena Karolewicz Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku, Akademia Medyczna im. Piastów Śląskich we Wrocławiu, ul. Szewska 38, Wrocław Kierownik Katedry Prof. dr hab. Janusz Pluta Streszczenie: Celem pracy była ocena dostępności farmaceutycznej metotreksatu z formulacji sporządzonych na bazie termowrażliwego polimeru z zamiarem ich zastosowania w postaci iniekcji do litego guza nowotworowego. Taka forma leku może być podawana jako implant, z którego substancja lecznicza uwalniałaby się powoli w miejscu aplikacji. Wszystkie badane formulacje zawierające metotreksat, sporządzone na bazie Pluronicu F-127, 0,1% chlorku benzalkoniowego z dodatkiem wybranych substancji pomocniczych tj. laktozy, glukozy, mannitolu, chlorku sodu i polioksyetylenoglikoli o różnej masie cząsteczkowej, cechowały się przemianą fazową zol-żel pod wpływem wzrostu temperatury. Zastosowane składowe formulacyjne wpływały na wielkość i charakter zmian temperatury przemiany fazowej zol-żel badanych serii. Wszystkie formulacje posiadały temperaturę przemiany fazowej zol-żel w zakresie temperatury fizjologicznej. Uwalnianie metotreksatu z tych układów jest wynikiem sumowania się równocześnie zachodzącej dyfuzji opartej na prawie Ficka i uwalniania zgodnego z zerowym rzędem reakcji, a wyznaczony czas półuwalniania substancji leczniczej z tych formulacji przemawia za ich wykorzystaniem do konstruowania postaci leku o przedłużonym działaniu. Słowa kluczowe: termowrażliwe nośniki leku, temperatura przejścia fazowego zol-żel, dostępność farmaceutyczna metotreksatu 18 Farmaceutyczny Abstract: The aim of the study was to evaluate the availability of gels obtained on the basis of Pluronic F127 with the purpose of being injected into a tumour. They could be delivered in the form of implants with a sustained release of the active substance at the target site, what would improve the kinetic parameters of the drug, at the same time limiting its undesired effects. The investigated formulations of liquid consistency at room temperature were obtained in sterile conditions on the basis of Pluronic F-127, methotrexate, benzalconium chloride with addition of lactose, glucose, mannitol, glycerol, sodium chloride, polyoxethylene glycol in different concentrations. All the investigated formulations prepared on Pluronic F-127 revealed sol-gel transition temperature in the physiological range. Detailed analysis of functional relationship of the released methotrexate in time characterised two different mechanisms: Fick diffusion and zero order release. The use of Pluronic F-127 with certain additives as a vehicle for active substance allows to prepare systems with various semi-release time. The semi-release time of methotrexate (t0,5) for this formulation supports its usefulness in constructing a prolonged release drug from. Key words: thermosensitive drug carriers, sol-gel transition temperature, pharmaceutical availability of methotrexate

19 Nr 3 / 2008 Wstęp Ze względu na wysoką toksyczność chemioterapia powinna być możliwie w jak największym stopniu selektywna, a jej działanie ograniczone do wybiórczego niszczenia tkanki nowotworowej, przy minimalnym i odwracalnym uszkodzeniu prawidłowych tkanek chorego [1]. Podanie substancji przeciwnowotworowej bezpośrednio do guza wiąże się z większą selektywnością jej działania, lepszą dystrybucją w chorej tkance i ograniczeniem działań niepożądanych [2]. Leki podane miejscowo nie przedostają się do krążenia ogólnego krwi lub przedostają się tylko w niewielkim stopniu. Ich wpływ na tkanki ogranicza się do określonej przestrzeni, w której dany związek został bezpośrednio zastosowany [3,4]. Jest to metoda terapii bardzo przydatna w leczeniu tych nowotworów, których chirurgiczne usunięcie jest ograniczone przez dostęp do guza, nowotworów mających nieregularną morfologię, czy, jak w przypadku guzów mózgu, przy utrudnionym przenikaniu cytostatyku przez barierę krew-mózg [5]. W celu uzyskania stężenia terapeutycznego leku w miejscu zmienionym chorobowo prowadzi się intensywne prace doskonalące podawane miejscowo formy leku. Modyfikacje postaci leku bez ingerencji w strukturę chemiczną substancji leczniczej dają w tym przypadku możliwość otrzymania zamierzonego efektu farmakologicznego i pozwalają sprostać wymaganiom skutecznej terapii [6]. Formułowanie nowych postaci leku do podania pozajelitowego ma na celu opracowanie nośnika zapewniającego nie tylko odpowiedni poziom terapeutyczny substancji i przedłużenie jej działania, ale i wygodę stosowania. Osiągnąć to można w dużej mierze poprzez wykorzystanie nowych substancji pomocniczych, takich jak np. poliestry poprzecznie usieciowane, poliuretany czy polimery wrażliwe na czynniki tj. fizjologiczna temperatura, ph, obecność jonów w płynach organizmu. Wykorzystanie w technologii form pozajelitowych biokompatybilnego polimeru, Pluronicu F- -127, umożliwia uzyskanie nośnika substancji leczniczej aplikowanego w formie roztworu, który w temperaturze fizjologicznej ciała, in situ będzie formował żel [7]. Materiały Pluronic F Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Glukoza jednowodna PhEur - Fluka Chemie, Laktoza PhEur - Fluka Chemie, Mannitol - Riedel-de-Haen, Chlorek benzalkoniowy cz.d.a. - Fluka Chemie, Polioksyetylenoglikol 200, 600, 1500 PhEur - Fluka Chemie, Chlorek sodu PhEur - Fluka Chemie, metotreksat - Sigma-Aldrich Chemie. Metody Płynne formulacje zawierające 14,8% Pluronicu F-127 sporządzano na zimno techniką opisaną przez Schmolka w komorze z nawiewem laminarnym Lamil. Substancje pomocnicze i metotreksat wprowadzano kolejno do rozpuszczonego w wodzie do wstrzykiwań o temperaturze około 15ºC polimeru. Po zmieszaniu gotowe formulacje sączono przez strzykawkowe apirogenne sączki membranowe Arcodisc Syringe Filter do jałowych fiolek ze szkła oranżowego. Po przygotowaniu wszystkie formulacje były przechowywane w lodówce w temperaturze około 4ºC i badane po upływie 72 godzin. Uwalnianie metotreksatu z podłoży charakteryzujących się przemianą fazową zol-żel przy wzrastającej temperaturze prowadzono przez 4 godziny w temperaturze 37 C, w komorach Franza (Hanson Vertical Cell) z błoną półprzepuszczalną Membra-Cel Dialysis Tubing (Serva, Heidelberg) o wielkości porów 3500 Da. Poszczególne frakcje odbierano w odstępach 30 minutowych, a ilość uwolnionej substancji leczniczej oznaczano spektrofotometrycznie z wykorzystaniem UV/VIS spektrofometru Cecil Instruments-Chemist-Handel (M.B.H. Austria). Pomiary wykonano sześciokrotnie i obliczono średni wynik. Dane opracowano w programie komputerowym STATISTICA Version 5, 97, metodą najmniejszych kwadratów przy poziomie ufności p<0.05. Wyniki Badanie dostępności farmaceutycznej metotreksatu z otrzymanych formulacji do wody przeprowadzono w temperaturze 37±0,5ºC w komorach Franz a zgodnie zamieszczonym powyżej opisem. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, iż dodatek substancji pomocniczych do formulacji pozwolił na otrzymanie nośników substancji leczniczej o różnym czasie półuwalniania. Uzyskane średnie wartości oznaczeń wykazały, iż proces uwalniania metotreksatu z formulacji przebiegał z kinetyką I-rzędu, co potwierdzają wielkości współczynników korelacji R dla danych empirycznych w skali półlogarytmicznej. Na podstawie wyznaczonych współczynników kierunkowych linii trendu, odpowiadającym stałym szybkości reakcji uwalniania, obliczono dla poszczególnych serii formulacji okresy półuwalniania. Równania linii trendu i odpowiadające im współczynniki korelacji oraz okresy półuwalniania zestawiono w tabeli I. Wartość współczynników korelacji przy poziomie istotności p<0,05 świadczy o wysokim dopasowaniu danych doświadczalnych do półlogarytmicznej zależności zmian procentu pozostałości metotreksatu w formulacji w funkcji czasu. W celu oceny wpływu procesu dyfuzji na dostępność farmaceutyczną metotreksatu z nośnika przeprowadzono także analizę przebiegu uwalniania w oparciu o półempiryczny model Korsmeyera-Peppasa. Wartość wykładnika dyfuzji n w tym modelu jest wyznacznikiem wpływu dyfuzji na proces uwalniania. Dla n=0,5 uwalnianie leku jest kontrolowane przez proces dyfuzji zgodny z prawem Ficka, dla n=1,0 uwalnianie zachodzi zgodnie z zerowym rzędem reakcji. Wartość wykładnika n w zakresie 0,5<n<1,0 świadczy o tym, iż na uwalnianie substancji leczniczej z nośnika mają wpływ oba wymienione mechanizmy. Wykorzystując algorytm Quasi-Newtona dostępny w programie komputerowym STATISTICA v.5,97 dokonano estymacji nieliniowej metodą najmniejszych kwadratów uzyskanych danych pomiarowych i wyznaczono wykładnik n wskazujący na mechanizm uwalniania substancji z uzyskanych formulacji. Wartość tego współczynnika dla większości badanych układów mieściła się w przedziale 0,5<n<1,0, co świadczy o tym, iż w procesie uwalniania metotreksatu z opracowanych formulacji biorą udział dwa mechanizmy, dyfuzja oparta na prawie Ficka i uwalnianie zgodne z zerowym rzędem reakcji. Farmaceutyczny 19

20 Analizując dane dotyczące kinetyki uwalniania metotreksatu zaobserwowano, iż najszybciej metotreksat uwalniał się z formulacji zawierających dodatek 0,4% chlorku sodu, 1,0% glukozy i 1,0% mannitolu jako substancji pomocniczych. Z układów, do których wprowadzono 0,4% chlorku sodu w czasie 4 godzin uwolniło się 18,7% metotreksatu, podobnie w przypadku dodatku 1,0% glukozy i 1,0% mannitolu uwolniło się odpowiednio 19,3% i 26% substancji. Stwierdzone różnice w uwalnianiu substancji czynnej z tych formulacji można tłumaczyć różnicami w ciśnieniu osmotycznym po obu stronach błony. Nośniki zawierające chlorek sodu i mannitol miały najwyższe, w granicy mosmol/kg, wartości ciśnienia osmotycznego. Najwolniej metotreksat uwalniał się z formulacji zawierających dodatek polioksyetylenoglikoli o niskiej masie cząsteczkowej PEG 200 i PEG 600. W przypadku serii serii zawierającej 0,5% PEG 200 i 0,5% PEG 600 uwolniło się odpowiednio 9,52% i 9,91% substancji. Po dodaniu polioksyetylenoglikoli spadek uwalniania metotreksatu można tłumaczyć dużą lepkością formulacji (lepkość dymnamiczna wyznaczona w temperaturze 37ºC przy 100 obrotach/ minutę została przedstawiona na rycinie 2). W przypadku dodatku polioksyetylenoglikoli szybkość uwalniania metotreksatu była zmienna w czasie, przy czym różnice te były najbardziej widoczne dla formulacji zawierających dodatek polioksyetylenoglikolu 200 i 600. Wnioski 1. W warunkach in vitro dostępność farmaceutyczna metotreksatu z temowrażliwych formulacji jest zróżnicowana i zależna od składu. Nr 3 / Dodatek substancji pomocniczych umożliwił uzyskanie nośników metotreksatu o różnym czasie półuwalniania. 3. Uwalnianie metotreksatu z formulacji jest wynikiem sumowania się równocześnie zachodzącej dyfuzji opartej na prawie Ficka i uwalniania zgodnego z zerowym rzędem reakcji. 4. Zachowanie formulacji w badaniach reologicznych nie znajduje jednoznacznego przełożenia na zdolność uwalniania metotreksatu. Piśmiennictwo 1. Markman M.- Intraperitoneal antineoplastic drug delivery: rationale and results - Lancet Oncol. 2003, 4, Balthasar J. P., Fung H. L.- Pharmacokinetic and pharmacodynamic optimization of intraperitoneal chemotherapy - Life Sci. 1996, 7, Dhanikula A. B., Panchagnula R.- Localized paclitaxel delivery - Int. J. Pharm. 1999, 183, Fung L. K., Saltzman W. M.- Polymeric implants for cancer chemotherapy - Adv. Drug Deliv. Rev. 1997, 26, Huynh G. H., Deen D. F., Szoka F. C.- Barriers to carrier mediated drug and gene delivery to brain tumors - J. Control. Rel. 2006, 110, Chilkoti A., Dreher M. R., Meyer D. E., Raucher D.- Targeted drug delivery by thermally responsive polymers - Adv. Drug Deliv. Rev. 2002, 54, Pluta J., Karolewicz B. - In vitro studies of the properties of thermosensitive systems prepared on Pluronic F-127 as vehicles for methoterxate for delivery to solid tumours -Polim.Med. 2006, 3, Seria Współ. r-pearsona Zależność ln % pozostałości od czasu Równanie linii trendu R 2 T 0,5 [min] Model Korsmeyera-Peppasa Równanie linii trendu ƒ t = at n R 2 NaCl 0,4% -0,9676 y= - 0,0007x + 4,5537 0, ,00 y=0,9704x 0,5466 0,9907 Glukoza 1% -0,9599 y= - 0,0008x + 4,5528 0, ,25 y=0,8926x 0,5702 0,9853 Laktoza 1% -0,9722 y= - 0,0004x + 4,5746 0, ,50 y=0,5510x 0,5629 0,9928 Mannitol 1% -0,9542 y= - 0,0010x + 4,5247 0, ,00 y=1,5967x 0,5155 0,9846 Glicerol 1% -0,9965 y = - 0,0004x +4,5872 0, ,50 y=0,2503x 0,7119 0,9990 PEG 200 0,5% -0,9520 y= - 0,0002x + 4,5636 0, ,00 y=1,1173x 0,3957 0,9886 PEG 200 1% -0,9862 y= - 0,0006x + 4,5778 0, ,24 y=0,4236x 0,6553 0,9912 PEG 600 0,5% -0,9612 y= - 0,0003x + 4,5739 0, ,00 y=0,6201x 0,5146 0,9855 PEG 600 1% -0,9787 y= - 0,0004x + 4,5797 0, ,50 y=0,4195x 0,6154 0,9933 PEG ,5% -0,9917 y= - 0,0004x + 4,5807 0, ,50 y=0,3891x 0,6151 0,9982 PEG % -0,9900 y= - 0,0005x + 4,5714 0, ,00 y=0,5596x 0,6070 0,9983 Tabela I. Równania linii trendu kinetyki uwalniania metotreksatu z serii formulacji zawierających Pluronic F-127, 0,1% chlorku benzalkoniowego, 0,01% metotreksatu z dodatkiem substancji pomocniczych. T 0,5 - czas półuwalniania, ƒ t - ilość uwolnionej substancji w czasie, a - stała dla modelu, t - czas, n - wykładnik dyfuzji, R 2 - współczynnik determinacji. 20 Farmaceutyczny

21 Nr 3 / 2008 Rycina 1. Wyznaczona przy stałej szybkości ścinania (100 obrotów/ minutę) w reometrze Brookfield DV-III temperatura przejścia fazowego zol-żel badanych formulacji zawierających dodatek 1% glukozy, 1% laktozy, 1% glicerolu, 1% mannitolu i 0,4% chlorku sodu. Rycina 2. Wyznaczona przy stałej szybkości ścinania (100 obrotów/ minutę) w reometrze Brookfield DV-III temperatura przejścia fazowego zol-żel badanych formulacji zawierających dodatek PEG o różnej masie cząsteczkowej. Farmaceutyczny 21

22 Derywatyzacja on-line w oznaczaniu ibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS On-line derivatization in GC/MS determination of ibuprofen and naproxen Dr n. farm. Sławomir Kurkiewicz 1, dr hab. n. biol. Krystyna Stępień 1, dr n. biol. Anna Dzierżęga-Lęcznar 1, mgr farm. Wioletta Stefanik 2 1 Katedra Analizy Instrumentalnej, 2 Katedra i Zakład Farmacji Stosowanej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Pracę wykonano w Katedrze Analizy Instrumentalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach Kierownik Katedry: dr hab. n. biol. Krystyna Stępień Streszczenie Oznaczanie poziomu niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ) w płynach ustrojowych ma istotne znaczenie, zarówno ze względów toksykologicznych, jak i farmakokinetycznych. Niezwykle ważna z punktu widzenia ochrony środowiska jest również analiza zawartości NLPZ w wodzie i ściekach. Jedną z metod stosowanych do oznaczania NLPZ w próbkach biologicznych i środowiskowych jest chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas. Technika GC/MS wymaga przeprowadzenia oznaczanych leków w ich lotne pochodne. Najczęściej w tym celu stosuje się derywatyzację do pochodnych sililowych. W prezentowanej pracy zastosowano nową metodę oznaczania ibuprofenu i naproksenu opartą na otrzymywaniu sililopochodnych bezpośrednio w gorącej komorze dozownika chromatografu gazowego (silanizacja on-line ) oraz porównano skuteczność dwóch różnych odczynników silanizujących. N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid okazał się skuteczniejszym niż heksametylodisilazan czynnikiem derywatyzującym w odniesieniu do wybranych NLPZ. Wykazano, że derywatyzacja on-line jest równie wydajna jak klasyczna procedura derywatyzacji poprzedzająca analizę GC/MS. Pozwala natomiast znacznie skrócić czas przygotowania próbki do analizy, jest mniej pracochłonna i bardziej ekonomiczna. Abstract Monitoring of non-steroidal antiinflammatory drugs (NSAIDs) concentrations in body fluids is of importance for both toxicological and pharmacokinetic reasons. Analysis of the drug content in water and wastewater samples is also important for environmental protection. One of the methods used for NSAID determination in biological and environmental samples is gas chromatography coupled with mass spectrometry. The technique requires conversion of the analyzed drugs to their volatile derivatives, most frequently silyl derivatives. In the present study, the new method for determination of ibuprofen and naproxen by on-line derivatization to silyl derivatives directly in the hot injection port of the gas chromatograph was used, and efficiencies of two different derivatization agents were compared. N,O-bis- -(trimethylsilyl)trifluoracetamide was found to be more effective derivatizing agent of selected NSAIDs than hexamethyldisilazane. The results indicate that the efficiency of on-line silylation is comparable to that of conventional derivatization procedure. The derivatization method used allows reducing amount of the sample required for a single analysis, is less laborious and more economical. Key-words: NSAIDs, GC/MS, on-line silylation Słowa kluczowe: NLPZ, GC/MS, silanizacja on-line Wstęp Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) są szeroko stosowane w terapii bólu i stanów zapalnych, a także jako środki przeciwgorączkowe. Leki te uznaje się za stosunkowo bezpieczne, niemniej ich długotrwałe stosowanie, zwłaszcza w wysokich dawkach, może prowadzić do wystąpienia wielu poważnych efektów ubocznych [1, 2]. Ponieważ NLPZ należą do najczęściej konsumowanych leków sprzedawanych bez recepty, ryzyko ich nadużywania lub przypadkowego przedawkowania jest wysokie. Co więcej, często ta sama substancja lecznicza jest składnikiem wielu preparatów, dostępnych w różnych postaciach farmaceutycznych, a współistniejące, choć nie zawsze zdiagnozowane, zabu- 22 Farmaceutyczny rzenia czynności wątroby lub nerek mogą prowadzić do zwiększenia stężenia we krwi aktywnej farmakologicznie frakcji leku. Oznaczanie poziomu NLPZ w płynach ustrojowych ma zatem istotne znaczenie, zarówno ze względów toksykologicznych, jak i farmakokinetycznych. Niezwykle ważna z punktu widzenia ochrony środowiska jest również analiza zawartości NLPZ w wodzie i ściekach [3]. Jedną z metod stosowanych oznaczania NLPZ w próbkach biologicznych i środowiskowych jest chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią mas (GC/MS). Technika ta wymaga wstępnego przeprowadzenia oznaczanych leków w ich mniej polarne, bardziej lotne pochodne. Najczęściej w tym celu stosuje się derywatyzację do pochodnych trimetylosilylowych lub tert-butylodimetylosilylowych [4, 5].

23 Nr 3 / 2008 Celem pracy było opracowanie nowej metody oznaczania wybranych NLPZ, opartej na otrzymywaniu pochodnych trimetylosilylowych bezpośrednio w gorącej komorze dozownika chromatografu gazowego (silanizacja on-line ). Poddano ocenie skuteczność dwóch różnych odczynników silanizujących w odniesieniu do naproksenu i ibuprofenu, a także porównano wydajność derywatyzacji on-line tych leków z wydajnością procedury prowadzonej klasyczną metodą off-line, poprzedzającą analizę GC/MS. Materiały i metody Procedurze silanizacji poddano roztwory wzorcowe zawierające różne stężenia naproksenu i ibuprofenu (Sigma- -Aldrich) w dichlorometanie (Merck), oraz oktadekan (10 µg/ml), Sigma-Aldrich) jako wzorzec wewnętrzny. Jako odczynniki derywatyzujące zastosowano heksametylodisilazan (HMDS, Supelco) i N,O-bis-(trimetylosililo)trifluoroacetamid (BSTFA, Supelco). W celu otrzymania pochodnych sililowych metodą off-line, badane roztwory mieszano z odczynnikami derywatyzującymi w stosunku 1:1 (v/v), a następnie ogrzewano w 70 C przez 30, 60, 120 lub 180 min. Derywatyzację on-line prowadzono w dwóch wariantach. W wariancie I (bez wstępnego mieszania reagentów) do strzykawki o pojemności 5μl pobierano 1μl HMDS lub BSTFA, a następnie 1μl analizowanego roztworu i tak przygotowaną próbkę wprowadzano do dozownika chromatografu gazowego. W wariancie II do fiolki zawierającej 100μl analitu dodawano taką samą objętość HMDS lub BSTFA, dokładnie mieszano i 2μl próbki wprowadzano do portu dozownika w czasie nie dłuższym niż 1min. Analizy GC/MS wykonano stosując chromatograf gazowy HP5890 seria II sprzężony ze spektrometrem mas HP5989A. Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie kapilarnej HP5-MS (30m x 0,25mm x 0,25μm). Temperatura pieca chromatograficznego początkowo wynosiła 40ºC i utrzymywana była przez 1 min, po czym wzrastała do 220ºC z szybkością 20ºC/min, a następnie do 255 C z szybkością 10 C/min. Wykorzystano dozownik typu split/splitless, a jako gaz nośny zastosowano hel o ciśnieniu 15 psi. Temperatura linii transferowej wprowadzającej kolumnę chromatograficzną bezpośrednio do źródła jonów spektrometru mas wynosiła 230ºC. Analizowane związki jonizowano strumieniem elektronów o energii 70eV. Źródło jonów w spektrometrze utrzymywano w temperaturze 200ºC, a kwadrupol w 100ºC. Spektrometr pracował w trybie zbierania pełnego widma (full scan), monitorując masy j.m.a. Do zbierania danych i obróbki widm używano oprogramowania ChemStation G1034C ver.c (Hewlett Packard). Przy interpretacji widm masowych wykorzystano siódme wydanie biblioteki widm masowych Wiley. Wyniki i ich omówienie Niezwykle istotny dla wydajności procesu derywatyzacji NLPZ prowadzonej metodą on-line jest dobór odpowiedniej temperatury dozownika chromatografu gazowego. Jak wynika z ryciny 1, najkorzystniejsza temperatura silanizacji on-line przy użyciu BSTFA mieści się w zakresie C. W wyższych temperaturach ilość otrzymanych Ryc. 1. Wpływ temperatury dozownika na wydajność silanizacji ibuprofenu i naproksenu prowadzonej metodą on- -line w obecności BSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego. Ryc. 2. Rozdział chromatograficzny mieszany ibuprofenu, naproksenu i wzorca wewnętrznego po derywatyzacji on- -line przeprowadzonej przy użyciu BSTFA w zoptymalizowanych warunkach sililopochodnych maleje. Podobną tendencję obserwowano w przypadku zastosowania do silanizacji HMDS. Gdy reakcję derywatyzacji przy użyciu tego reagenta prowadzono w temperaturach wyższych niż 300 C, na chromatogramach pojawiały się dodatkowe produkty pochodzące z termicznej degradacji analizowanych NLPZ. Z powyższych względów do prowadzenia dalszych analiz wybrano temp. 270 C, zapewniającą z jednej strony satysfakcjonującą wydajność procesu derywatyzacji on-line, z drugiej zaś - termiczną stabilność uzyskiwanych pochodnych. Na rycinie 2 pokazano rozdział chromatograficzny silylowych pochodnych ibuprofenu i naproksenu uzyskanych metodą on-line w zoptymalizowanych warunkach. Tożsamość otrzymanych sililopochodnych potwierdzono metodą spektrometrii mas. Jak wynika z ryciny 3, wydajność silanizacji on-line prowadzonej w obecności HMDS zależała od sposobu wprowadzania próbki do komory dozownika i była wyraźnie wyższa po wstępnym wymieszaniu analizowanego roztworu i odczynnika derywatyzującego (wariant II silanizacji on-line, patrz: Materiały i metody). W przypadku BSTFA, fakt wymieszania reagentów poza komorą dozownika pozostawał bez wpływu na wydajność derywatyzacji on-line. Prawdopodobnym źródłem obserwowanych różnic jest wyż- Farmaceutyczny 23

24 Nr 3 / 2008 Ryc. 3. Porównanie wydajności silanizacji NLPZ prowadzonej metodą on-line (wariant I i II, patrz: Materiały i metody) i off-line. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego sza lotność i reaktywość BSTFA w porównaniu z HMDS. Jednak niezależnie od użytego odczynnika derywatyzującego, ilości sililopochodnych powstających bezpośrednio w komorze dozownika chromatografu gazowego i otrzymywanych off-line były porównywalne, co wskazuje, że metoda silanizacji on-line jest równie wydajna jak klasyczna procedura derywatyzacji poprzedzająca analizę GC/MS. Z danych przedstawionych na rycinie 4 wynika, że metoda silanizacji on-line może zostać wykorzystana do oznaczania ibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS. Dla obu odczynników silanizujących osiągnięto satysfakcjonującą korelację liniową krzywych wzorcowych. Zastosowanie BSTFA powodowało zwiększenie czułości metody, zwłaszcza dla naproksenu. Wnioski Uzyskane wyniki wskazują, że BSTFA jest skuteczniejszym czynnikiem silanizującym w odniesieniu do wybranych NLPZ niż HMDS. Sililopochodne ibuprofenu i naproksenu otrzymywane przy użyciu BSTFA charakteryzuje większa stabilność termiczna, a metoda ich oznaczania jest bardziej czuła. Wykazano, że niezależnie od zastosowanego czynnika silanizującego, derywatyzacja prowadzona metodą on-line jest równie wydajna jak tradycyjna procedura 24 Farmaceutyczny Ryc. 4. Krzywe kalibracyjne do oznaczania ibuprofenu i naproksenu techniką GC/MS z zastosowaniem silanizacji on- -line w obecności HMDS i BSTFA. Pola powierzchni pików znormalizowano względem wzorca wewnętrznego derywatyzacji poprzedzająca analizę GC/MS i może zostać wykorzystana do oznaczania NLPZ. Silanizacja on-line pozwala na znaczne skrócenie czasu przygotowania próbki do analizy, jest mniej pracochłonna i bardziej ekonomiczna. Piśmiennictwo 1. Mehanna AS.: NSAIDs: Chemistry and Pharmacological Actions. Am J Pharm Educ 2003; 63: Lisowska B, Rell-Bakalarska M, Rutkowska-Sak L.: Niesteroidowe leki przeciwzapalne blaski i cienie. Reumatologia 2006; 2: Kosjek T, Heath E, Krbavčič A.: Determination of non- -steroidal anti-inflammatory drug (NSAIDs) residues in water samples. Environ Int 2005; 31: Rodríguez I i wsp.:determination of acidic drugs in sewage water by gas chromatography mass spectrometry as tert-butyldimethylsilyl derivatives. J Chromatogr A 2003; 985: Farré M, Petrovic M, Barceló D.: Recently developed GC/MS and LC/MS methods for determining NSA- IDs in water samples. Anal Bioanal Chem 2007; 387:

25 CIEKŁE KRYSZTAŁY W NAUKACH FARMACEUTYCZNYCH LIQUID CRYSTALS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES dr n. farm. Justyna Zalewska-Rejdak, mgr farm. Izabela Winiarek, dr hab. n. fiz. Maria Jastrzębska Katedra i Zakład Biofizyki, Śląski Uniwersytet Medyczny, Sosnowiec Kierownik: dr hab. n. fiz. Barbara Pilawa, prof. nadzw. ŚUM STRESZCZENIE W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie możliwością wykorzystania ciekłokrystalicznego stanu mezomorficznego w przemyśle farmaceutycznym. Dotyczy to zarówno ciekłokrystalicznych substancji czynnych, jak i substancji pomocniczych, które można wykorzystać do opracowania systemów kontrolowanego uwalniania leków. W pracy opisano substancje lecznicze zdolne do generowania stanu ciekłokrystalicznego z uwzględnieniem typu tworzonej mezofazy. Mezomorfizm liotropowy leków ma znaczenie ze względu na silne interakcje tych składników z ciekłokrystalicznymi elementami błon biologicznych. Mezomorfizm termotropowy pozwala natomiast zwiększyć rozpuszczalność aktywnego składnika, jeśli tylko możliwa jest stabilizacja stanu mezomorficznego w temperaturze pokojowej. Z kolei możliwości rozwoju systemów kontrolowanego uwalniania leków z wykorzystaniem liotropowych systemów ciekłokrystalicznych zawdzięcza się ich stabilności i strukturze przyjaznej dla skóry. Słowa kluczowe: farmacja, ciekłe kryształy SUMMARY Recently the idea has developed for application of liquid crystal mesomorphic state in pharmaceutical industry. This applies to both liquid crystal active substances as well as excipients which can be used for development of controlled release of medicines. In the paper, medical substances have been described which are capable of generating liquid crystal state with attention paid to type of generated mesophase. Lyotropic mesomorphism of medicines is of great importance due to strong interaction of those components with liquid crystal elements of biological membranes. Thermotropic mesomorphism allows for increasing solubility of the active component, provided that mesomorphic state can be stabilised in room temperature. Possibilities of development of controlled release systems with the application of lyotropic liquid crystal systems can be owed to their stability and skin-friendly structure. Keywords: pharmacy, liquid crystals WSTĘP Ciekłe kryształy to stan skupienia istniejący pomiędzy fazą ciekłą i krystaliczną, charakteryzujący się właściwościami strukturalnymi, mechanicznymi i optycznymi pośrednimi pomiędzy izotropowymi cieczami a krystalicznymi ciałami stałymi. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie możliwością wykorzystania ciekłokrystalicznego stanu mezomorficznego w przemyśle farmaceutycznym. Dotyczy to zarówno ciekłokrystalicznych substancji czynnych, jak i substancji pomocniczych. CIEKŁE KRYSZTAŁY NIEZWYKŁY STAN MATERII Krystaliczne ciała stałe są charakteryzowane przez dalekosiężne uporządkowanie pozycyjne i orientacyjne w trzech wymiarach, podczas gdy ciecze amorficzne cechuje brak dalekosiężnego uporządkowania w każdym wymiarze. Ciekłe kryształy wykazują właściwości strukturalne, mechaniczne i optyczne pośrednie pomiędzy nimi. Nie są jednakże mieszaniną ciał stałych i cieczy, lecz oddzielnym stanem materii. Ciekłe kryształy to stan skupienia istniejący pomiędzy fazą ciekłą i krystaliczną, charakteryzowany przez częścio- Farmaceutyczny 25

26 wy lub całkowity brak uporządkowania pozycyjnego, przy zachowaniu porządku orientacyjnego składowych cząstek. Takie uporządkowanie orientacyjne może utrzymywać się w stanie stałym, stąd LC mogą wykazywać stabilność mechaniczną jak ciała stałe i płynąć jak ciecze. Z uwagi na sposób otrzymywania, ciekłe kryształy dzieli się na termotropowe (TLC z ang. Thermotropic Liquid Crystals) powstające w wyniku ogrzewania krystalicznego ciała stałego albo w wyniku ochłodzenia izotropowego roztopu mezogenu oraz liotropowe (LLC z ang. Lyotropic Liquid Crystals) powstające po rozpuszczeniu substancji mezogennej (w postaci stałej lub ciekłej) w odpowiednim rozpuszczalniku (głównie w wodzie i innych organicznych rozpuszczalnikach polarnych). Nematyczne ciekłe kryształy są to najprostsze struktury mezomorficzne, formowane przez wydłużone molekuły, gdzie poza równoległością elementów żadne inne uporządkowanie nie występuje. W cholesterolowych ciekłych kryształach równoległe względem siebie cząsteczki leżą płasko w warstwach, a warstwy te są względem siebie skręcone, co daje w efekcie układy spiralne o nadzwyczaj interesujących właściwościach optycznych. Cechą charakterystyczną struktur smektycznych jest to, że równolegle ułożone względem siebie molekuły są dodatkowo rozmieszczone w warstwach tak, że długie osie molekuł są prostopadłe lub ukośne względem płaszczyzn tych warstw. W ciekłych kryształach dyskotycznych oprócz równoległego uporządkowania osi cząsteczek, cząsteczki układają się dodatkowo w kolumny [1,2]. BŁONY BIOLOGICZNE JAKO UKŁADY CIEKŁOKRYSTALICZNE Znaczna część substancji, z których zbudowane są organizmy żywe, posiada strukturę ciekłokrystaliczną. Zalicza się do nich amfifilowe lipidy błon komórkowych, chromosomowe DNA, białka, szczególnie białka cytoszkieletu, mięśniowe, kolagen oraz proteoglikany. Mnogość tych mezofaz wskazuje, że mogą one mieć duże znaczenie dla biologicznych struktur i funkcji na wszystkich poziomach organizacji. Występujące w organizmach żywych ciekłe kryształy mają charakter liotropowy Budowę ciekłokrystaliczną typu liotropowego posiadają błony komórkowe, w których cząstki lipidów pod działaniem wody tworzą struktury lamelarne [3]. CIEKŁOKRYSTALICZNE SUBSTANCJE LECZNICZE Najwięcej uwagi w literaturze poświęca się lekom tworzącym mezofazy liotropowe po rozcieńczeniu w rozpuszczalniku polarnym, głównie w wodzie. Wiedza na temat liotropowego mezomorfizmu leków ma istotne znaczenie dla rozwoju form dozowania ze względu na silnie interakcje tych składników z fosfolipidami. Mezomorfizm termotropowy jest raczej rzadko spotykany wśród farmaceutyków. Niektóre leki, jak np. chlorowodorek nafoksydyny czy sól sodowa fenoprofenu, mogą generować zarówno termotropowe mezofazy smektyczne, jak i mezofazy liotropowe. Każdy z tych składników ma charakter amfifilowy oraz wykazuje właściwości substancji powierzchniowo czynnej, co 26 Farmaceutyczny Nr 3 / 2008 zaspokaja wymagania strukturalne dla tworzenia mezofaz liotropowych, a także zawiera w swojej strukturze układ pierścieniowy typowy element strukturalny mezofaz termotropowych. Ustalono, że 5% wszystkich substancji organicznych wykazuje mezomorfizm termotropowy. W związku z tym, iż przekazywanie energii cieplnej jest nieuniknionym zjawiskiem w wielu procesach produkcji farmaceutycznej, wydaje się możliwe, że mezofazy tworzą się właśnie podczas procesu technologicznego czy przenoszenia substancji. Możliwe jest również, że powstałe mezofazy (jak metastabilne polimorficzne formy leku) nie przekształcają się ponownie do stanu krystalicznego, kiedy energia cieplna przestaje działać. Jeśli mezofaza nie ulega ponownej transformacji do trwałego termodynamicznie stanu krystalicznego, to wzrastająca energia swobodna leku może powodować wzrost szybkości rozpuszczania się i zwiększenie rozpuszczalności leku. Formowanie termotropowych i liotropowych LC jest uzależnione rodzaju procesów technologicznych (suszenie rozpyłowe, topnienie, liofilizacja), a także od przynależności leku do określonej rodziny strukturalnej [1,2]. W pracy dokonano zestawienia substancji leczniczych i pomocniczych zdolnych do generowania stanu ciekłokrystalicznego z uwzględnieniem typu tworzonej mezofazy (Tabela 1). Mezomorfizm liotropowy leków ma znaczenie ze względu na silne interakcje tych składników z ciekłokrystalicznymi elementami błon biologicznych. Mezomorfizm termotropowy pozwala natomiast zwiększyć rozpuszczalność aktywnego składnika, jeśli tylko możliwa jest stabilizacja stanu mezomorficznego w temperaturze pokojowej. Z kolei liotropowe systemy ciekłokrystaliczne dzięki swej stabilności i strukturze przyjaznej dla skóry stwarzają możliwości rozwoju nowoczesnych systemów kontrolowanego uwalniania leków. FORMY CIEKŁOKRYSTALICZNE W TECH- NOLOGII POSTACI LEKÓW Oprócz cząstek leków o właściwościach amfifilowych, tendencję do tworzenia liotropowych ciekłych kryształów przejawiają również amfifilowe substancje pomocnicze obecne w preparatach leczniczych. W szczególności dotyczy to substancji powierzchniowo czynnych, powszechnie stosowanych jako emulgatory w preparatach transdermalnych, które po rozpuszczeniu w określonym rozpuszczalniku asocjują tworząc micele. Wraz ze wzrostem ich stężenia rośnie prawdopodobieństwo interakcji pomiędzy micelami, które prowadzą do utworzenia ciekłego kryształu [5]. Liotropowe ciekłe kryształy (LLC) znajdują zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym, kosmetycznym i chemicznym. Występują w żelach powierzchniowo czynnych, maściach, kremach, rozproszeniach liposomalnych i koloidalnych, systemach transdermalnych oraz w preparatach o przedłużonym uwalnianiu. Przyczyną tak szerokiego wykorzystania tych koloidalnych struktur jest ich podobieństwo do tych w żywych organizmach oraz korzystne właściwości w porównaniu z tradycyjnymi półstałymi formami dozowania leku na skórę. Ich powstawanie tłumaczy się przez przestrzenną organizację niejonowych cząstek surfaktantów, w niższych i wyższych stężeniach. Mezofazy liotropowe powstają z wody i jednego bądź dwóch surfak-

27 Nr 3 / 2008 tantów, w ściśle określonych proporcjach, przy niewielkim nakładzie energii albo w wyniku spontanicznej strukturalnej organizacji, dlatego też ich produkcja jest prosta i energooszczędna. Są termodynamicznie stabilne i mogą być przechowywane przez długi czas w formie niezmienionej, bez rozdziału faz. [6]. Podłoże ciekłokrystaliczne wykazuje interakcje z substancją rozpuszczoną i może wpływać na właściwości jej rozpuszczania, a tym samym na jej gradient w podłożu i w warstwie rogowej naskórka oraz na tempo dyfuzji z podłoża. [Brinon 1999]. Preparaty o strukturze ciekłokrystalicznej wykazują dobrą penetrację, wynikającą z niskiego napięcia powierzchniowego na granicy faz olej/woda i mogą ułatwiać dyfuzję substancji aktywnych biologicznie w głąb skóry albo do krążenia ogólnoustrojowego. Mogą zwiększać rozpuszczalność leków nierozpuszczalnych lub słabo rozpuszczalnych w wodzie. Ponadto stosowanie systemów liotropowych daje możliwość ominięcia tzw. efektu pierwszego przejścia, a co za tym idzie eliminacji działań niepożądanych leku ze strony przewodu pokarmowego i aplikacji farmaceutyków o niskim indeksie terapeutycznym czy krótkim okresie biologicznego półtrwania. Ponieważ lamelarne systemy ciekłokrystaliczne zawierają dużą ilość inkorporowanej wody, skoncentrowanej w warstwach pomiędzy domenami hydrofilowymi, jej parowanie zachodzi w mniejszym stopniu niż w przypadku tradycyjnych kremów w/o. Zawartość wilgoci utrzymuje się przez długi czas, więc transepidermalna utrata wody jest zastępowana przez długotrwającą hydratację, zgodnie z potrzebami skóry. Dodatkowo posiadają atrakcyjny wygląd, idealną konsystencję, a ich aplikacja wywołuje przyjemne dla skóry uczucie [6]. Pierwsze próby wykorzystania układu ciekłokrystalicznego o strukturze liotropowej jako podłoża podjął Wahlgren i wsp. [7]. Badano wówczas właściwości układu lecytyna - woda, stanowiącego ciekły kryształ o strukturze lamelarnej, jako podstawowego podłoża dla maści z hydrokortyzonem. Wyniki przeprowadzonych analiz wykazały dwie cechy istotne dla zastosowania ciekłego kryształu jako podłoża maści. Pierwsza z nich to wysoka rozpuszczalność substancji aktywnej w fazie ciekłokrystalicznej, czterokrotnie wyższa niż w przypadku rozpuszczalności hydrokortyzonu w powszechnie używanym glikolu etylenowym. Druga istotna cecha to duża wartość współczynnika dyfuzji (wyższa niż w przypadku zawiesiny stałego hydrokortyzonu) wynikająca z zastosowania struktury ciekłokrystalicznej jako nośnika.. Preparat okazał się termodynamicznie stabilny [7]. Żele o ciekłokrystalicznej mikrostrukturze sześciennej znalazły zastosowanie w preparatach leczniczych. Dotyczy to zwłaszcza preparatów przeznaczonych do stosowania miejscowego, zawierających substancje lecznicze z grupy niesteroidowych leków przeciwzapalnych. Na rynku niemieckim dostępne są obecnie: Contrheuma Gel Forte N, Trauma-Dolgit Gel i Dolgit Mikrogel. Wysokie stężenie surfaktantu w tych preparatach wpływa na mikrostrukturę lipidów warstwy rogowej naskórka, zwiększając przenikalność aktywnego składnika.. Testy przenikalności przeprowadzone na ludzkim wycinku warstwy rogowej wykazały, że ilość ibuprofenu przenikająca przez strukturę w jednostce czasu jest znacznie wyższa dla komercyjnego preparatu Dolgit Mikrogel, niż dla wodnych i micelarnych roztworów leku. Na rynek niemiecki wprowadzono Bifomyk Gel. Jest to żel powierzchniowo czynny o mikrostrukturze ciekłokrystalicznej zawierający bikonazol substancję o działaniu przeciwgrzybiczym. W terapii przeciwgrzybiczej skóry udoskonalona penetracja substancji czynnej jest wysoce pożądana, ponieważ strzępki grzybni mogą docierać do warstw epidermalnych. To samo dotyczy leków z grupy NLPZ, gdyż muszą one przenikać przez kilka warstw epidermalnych, aby dotrzeć do mięśni i tkanki łącznej i wywołać efekt terapeutyczny. PODSUMOWANIE Strukturalna różnorodność wśród substancji farmaceutycznych sugeruje, że tworzenie ciekłych kryształów może być bardziej rozpowszechnione niż wcześniej uważano. Na podstawie przeanalizowanego piśmiennictwa można sugerować konieczność rozszerzenia badań fizykochemicznych w kierunku występowania stanów ciekłokrystalicznych farmaceutyków. Dodanie tego typu informacji do standardowej charakterystyki substancji farmaceutycznej może być wykorzystane do poprawy niektórych cech preparatu takich jak rozpuszczalność czy biodostępność oraz wzrostu trwałości leku. BIBLIOGRAFIA 1. Bunjes R., Rades T. Thermotropic liquid crystalline drugs. J. Pharm. Pharmacol., 2005; 57(7): Stevenson C.L., Bennet D.B., Lechuga-Ballesteros D. Pharmaceutical Liquid Crystals : The Relevance of Partially Ordered Systems. J. Pharm. Sci. 2005; 94(9): Mae-Wan Ho, Haffegee J., Newton R., Yu-ming Zhou, Bolton J.S., Ross S. Organisms as polyphasic liquid crystals. Bioelectrochem. Bioenerg., 1996; 41: Zhou Ch., Yi Z. Blood-compatibility of polyurethane/liquid crystal composite membranes. Biomaterials 1999; 20(22): Müller-Goymann C.C. Physicochemical characterization of colloidal drug delivery systems such as reverse micelles, vesicles, liquid crystals and nanoparticles for topical administration. Eur. J. Pharm Biopharm. 2004; 58(2): Makai M., Csányi E., Németh Zs., Pálinkás J., Erős I. Structure and drug release of lamellar liquid crystals containing glycerol. Int. J. Pharm. 2003b; 256: Wahlgren S., Lindstrom A.L., Fraberg S.E. Liquid crystals as potential ointment vehicle. J. Pharm. Sci. 1984; 73(10): Nii T., Ishii F. Properties of various phosphatydylocholines as emulsifiers or dispersing agents in microparticle preparations for drug carriers. Colloids. Surf. B. Biointerfaces 2004; 39: Geraghty P.B., Attwood D., Collet J.H., Dandiker Y. The in vitro release of some antimuscarinic drugs from monoolein/water lyotropic liquid crystalline gels. Pharm. Res. 1996; 13(8): Helledi L.S., Schubert L. Release kinetics of acyclovir from suspension of acyclovir incorporated in a cubic phase delivery system. Drug Dev. Ind. Pharm. 2001; 27(10): Shah J.C., Sadhale Y., Chilukuri D.M. Cubic phase gels as drug delivery systems. Adv. Drug Deliv. Rev Apr 25;47(2-3): Farkas E., Zelkó R., Török Gy., Rácz I. Influence of chlorhexidine species on the liquid crystalline structure of vehicle. Int. J. Pharm. 2001; 213(1-2): 1-5 Farmaceutyczny 27

28 Nr 3 / 2008 TYP MEZOFAZY SUBSTANCJA ZASTOSOWANIE Źródło Ciekłe kryształy termotropowe Ciekłe kryształy liotropowe nematyczna cholesteryczna smektyczna metotreksat lek przeciwnowotworowy [1,2] tobramycyna antybiotyk [2] estry cholesterolu systemy kontrolowanego uwalniania [1] biomateriały [4] itrakonazol lek przeciwgrzybiczy [1,2] estry cholesterolu systemy kontrolowanego uwalniania [1] fenoprofen NLPZ [1,2] kalcytonina kromoglikan disodowy nafoksydyna propranolol lek wpływający na układ kostny lek przeciwastmatyczny antyestrogen ß-bloker dyskotyczna kwas foliowy witamina [2] nematyczna lamelarna heksagonalna detirelix kromoglikan disodowy leuprorelina nafarelina neosalwarsan salwarsan fenoprofen diklofenak flurbiprofen ibuprofen ketoprofen pirprofen eter polioksyetyleno-10-oleilowy (Brij 96) lek przeciwnowotworowy lek przeciwastmatyczny lek przeciwnowotworowy [2] [1] [2] chemioterapeutyk [1] NLPZ [1,2] fosfatydylocholina systemy kontrolowanego uwalniania [7,8] monooleinian glicerolu (GMO) [9,10,11] Synperonic A7 [12] nafoksydyna antyestrogen [1] monooleinian glicerolu (GMO) [9,10,11] systemy kontrolowanego uwalniania Synperonic A7 [12] [5] [6] TABELA 1 Ciekłe kryształy w farmacji 28 Farmaceutyczny

29 Charakterystyka wybranych olejów roślinnych pod kątem syntezy sprzężonych dienów kwasu linolowego (SKL) Characteristics of chosen plant oils with respect to the conjugated dienes of linoleic acid (CLA) synthesis Dr inż. Robert Bodkowski 1 Dr inż. Wiesława Walisiewicz-Niedbalska 2 Prof. dr hab. Bożena Patkowska-Sokoła 1 Mgr inż. Krzysztof Różycki 2 1 Instytut Hodowli Zwierząt, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul Chełmońskiego 38c, Wrocław, Polska 2 Instytut Chemii Przemysłowej im. prof. I. Mościckiego ul. Rydygiera 8, Warszawa, Polska Streszczenie Sprzężone dieny kwasu linolowego stanowią grupę związków o wielokierunkowym i korzystnym wpływie na organizm człowieka. Jednym z mechanizmów ich powstawania może być synteza z kwasu linolowego w procesie alkalicznej izomeryzacji. Celem niniejszych badań była ocena różnych olejów roślinnych pod katem ich przydatności jako surowca do syntezy sprzężonych dienów kwasu linolowego c9,t11 i t10,c12. Na podstawie przeprowadzonych analiz składu kwasów tłuszczowych stwierdzono, że najkorzystniejszym z punktu widzenia syntezy izomerów c9,t11 i t10,c12 okazał się olej z pestek winogron. Skład kwasów tłuszczowych tego oleju jest najbardziej zbliżony do składu oleju makowego. Korzystne składy miały również oleje: słonecznikowy, z ostropestu plamistego i olej amaranthusowy (szarłat). Słowa kluczowe: oleje roślinne, skład kwasów tłuszczowych, SKL Summary Conjugated dienes of linoleic acid are a group of compounds of multi-directional and profitable influence on human health. The synthesis from linoleic acid via alkaline isomerization process is one of the mechanisms of their formation. The aim of the present study was an assessment of different plant oils with respect to their usefulness as a substrate to the synthesis of c9,t11 and t10,c12 conjugated dienes of linoleic acid. Basing on conducted chromatographic analysis it was demonstrated that grape seed oil was characterized by the most beneficial fatty acids content as regards the synthesis of c9,t11 and t10,c12 isomers. The fatty acids content of this oil is the most similar to that of poppy seed oil. The profitable content was observed also in the case of sunflower, thistle and amaranthus oils. Key words: plant oils, fatty acids content, CLA WSTĘP Sprzężony kwas linolowy (ang. conjugated linoleic acid CLA) jest wspólnym terminem określającym mieszaninę pozycyjnych (8 i 10, 9 i 11, 10 i 12 lub 11 i 13) oraz geometrycznych (cis i trans) izomerów kwasu oktadekadienowego C18:2. W odróżnieniu od kwasu linolowego 9c,12c- C18;2 w którym wiązania podwójne są w formie izolowanej w izomerach CLA występują one w formie sprzężonej [1]. W produktach naturalnych w grupie izomerów CLA dominują izomery o konfiguracji cis-9, trans-11 oraz w dużo mniejszym stopniu trans-10, cis-12 i to właśnie tym dienom przypisuje się szczególną aktywność biologiczną. Dotychczas najwięcej badań poświęcono antykancerogennemu działaniu sprzężonych dienów kwasu linolowego [2,3]. Dieny te mogą jednak również wykazywać działanie: antymiażdzycowe, hamujące rozwój osteoporozy, immunomodulujące, opóźniające rozwój cukrzycy oraz redukujące tkankę tłuszczową. Podstawowym mechanizmem powstawania CLA jest izomeryzacja kwasu linolowego zachodząca podczas bakteryjnego biouwodornienia w żwaczu zwierząt przeżuwających. Dlatego w stanie naturalnym izomery CLA występują w tłuszczu zwierząt przeżuwających np. w tłuszczu mlecznym i mięsnym. Jednak ich zawartość w tych produktach jest stosunkowo mała od ok. 0,3 do ok. 2,5%. W związku z tym opracowano sposoby ich otrzymywania metodami chemicznymi m.in. przez izomeryzację kwasu linolowego głównego składnika oleju makowego lub safflorowego (krokoszowego). Trudności w pozyskiwaniu oleju makowe- Farmaceutyczny 29

30 go sprawiły, że istnieje konieczność poszukiwania nowych surowców olejowych. Celem niniejszych badań była ocena olejów roślinnych, dostępnych na rynku lub otrzymywanych stosunkowo w prosty sposób, pod kątem ich wykorzystania jako surowca do syntezy biologicznie aktywnych izomerów kwasu linolowego cis-9,trans-11 i trans-10,cis 12. Przebadano oleje roślinne pod katem ich składu kwasów tłuszczowych, a zwłaszcza zawartości kwasu linolowego 9c,12cC18:2, linolenowego 9c,12c,15cC18:3 i kwasów nasyconych. MATERIAŁ I METODY BADAWCZE Materiał doświadczalny stanowiły ogólnie dostępne na rynku oraz pozyskane we własnym zakresie oleje roślinne: niskoerukowy rzepakowy, słonecznikowy, sojowy, lniany, z pestek winogron (z zakupu); bawełniany i kukurydziany (z Instytutu Włókien Naturalnych); z gorczycy, z rzodkwi, z ostropestu, z czarnej porzeczki i szarłatu (uzyskany przez ekstrakcje); makowy (tłoczony z nasion); tungowy (z fabryki farb). Ekstrakcję tłuszczu z nasion przeprowadzono w aparacie Soxleta stosując jako rozpuszczalnik heksan, natomiast tłoczenie wykonano w prasie ślimakowej. Skład kwasów tłuszczowych oznaczano metodą chromatografii gazowej na aparacie Hewlett - Packard II, z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) i kolumną kapilarną CP Sil długości 50m. Estry metylowe otrzymywano zgodnie z AOCS Official Methods 1f-96. Identyfikację jakościową wykonywano przez porównanie czasów retencji składników badanych związków z wzorcami (firmy Supelco). WYNIKI Na ilość syntetyzowanych, w drodze izomeryzacji, sprzężonych dienów kwasu linolowego trans-10,cis-12 oraz cis- -9,trans-11 istotny wpływ ma profil kwasów tłuszczowych substratu wyjściowego. O dużej jego przydatności decyduje przede wszystkim wysoka zawartość kwasu linolowego C18:2 cis-9,trans-12, który jest głównym substratem w procesie syntezy tych izomerów oraz niska kwasu linolenowego C18:3 cis-9,cis-12,cis-15, który również ulega izomeryzacji tworząc izomery położeniowe i geometryczne o nie znanych właściwościach biologicznych. Znaczenie może mieć również wysoka zawartość kwasów tłuszczowych nasyconych, które można stosunkowo łatwo usunąć z końcowego produktu na drodze ekstrakcji z mocznika, zwiększając w ten sposób koncentracje pożądanych izomerów w puli kwasów [4,5]. W tabelach 1 i 2 zestawiono wyniki dotyczące składu kwasów tłuszczowych badanych olejów roślinnych. Najwyższą zawartością kwasu linolowego C18:2 c9c12 charakteryzowały się kolejno oleje: makowy 73%, z pestek winogron 71%, słonecznikowy 60%, z ostropestu 57%, z czarnej porzeczki 46%, z szarłatu 44% i sojowy 40%. Najwięcej kwasów nasyconych miały oleje: bawełniany 26%, z szarłatu 23%, kukurydziany 15,5%, sojowy 14%, z ostropestu 13,6%, makowy 12,5%, słonecznikowy 12% i z pestek winogron 10,5%. Z kolei najniższą zawartość kwasu linolenowego 30 Farmaceutyczny Nr 3 / 2008 c9,c12,c15 C18:3 stwierdzono w olejach: bawełnianym 0,2%, z pestek winogron 0,4%, z ostropestu 0,5%, makowym 0,7%, słonecznikowym 0,9%, kukurydzianym 1,5% i amaranthusowym 2,5%. WNIOSKI Biorąc pod uwagę skład kwasów tłuszczowych z przebadanych olejów roślinnych najwyższą przydatnością do syntezy biologicznie czynnych izomerów kwasu linolowego cis-9, trans-11 i trans-10, cis-12 C18:2 charakteryzują się oleje z pestek winogron i słonecznikowy. Mają one zbliżony skład kwasów tłuszczowych do składu kwasów oleju makowego. Korzystny skład kwasów tłuszczowych mają również oleje: amaranthusowy i z ostropestu plamistego. Olej z ostropestu plamistego pozyskiwany może być przy przerobie nasion na sylimarynę.. Amaranthus (szarłat) uprawiany jest głównie jako roślina na białko pokarmowe, a zawartość oleju amaranthusowego w nasionach jest stosunkowo niska, 7 10%, przez co może być otrzymywany jedynie przez ekstrakcję. Badania wykonano w ramach projektów 3 T09B i 0554/R/2/T02/07/02 finansowanych ze środków Ministerstwa Nauki i Informatyzacji. PIŚMIENNICTWO 1. Eulitz, K., i wsp.: Preparation, separation and confirmation of the eight geometrical cis/trans conjugated linoleic acid isomers 8,10- through 11,13 18:2. Lipids, 1999, 34, Lipkowski, A., i wsp.: In vitro anti-cancer properties of natural vs synthetic conjugated linoleic acid. Animal Science and Reports, 2003, 21, Palomobo, J.D., i wsp.: The antyproliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Lett., 2002, 177, Walisiewicz-Niedbalska W., i wsp.: Study of conjugated linoliec acid of butter fats of sheeps. Archiv für Tierzucht, 2001, 44, Walisiewicz-Niedbalska W., i wsp. The transformation of linoleic acid from poppy seeds oil to its active isomers 9c,11t and 10t,12c, and the comparison of its content with natural preparation from sheep milk. Chemistry for Agriculture, 2006, 7,

31 Nr 3 / 2008 Tabela I. Skład kwasów tłuszczowych wybranych olejów roślinnych (%) Linolenowy C18:3 0,7 0,2 0,9 5,6 7,5 0,4 2,5 Linolowy C18:2 73,1 36,5 60,2 39,8 22,4 71,1 44,3 Kwasy wielonienasycone Nerwonowy C24: Erukowy C22:1 - - ślad - 2,4 - - Eikozenowy C20:1 <0,1 ślad ślad <0,1 1,3 0,2 <0,1 Oleinowy C18:1 12,6 34,5 25,8 38,8 57,2 16,6 28,7 Palmitooleinowy C16:1 0,2 1,1 0,4 ślad 0,2 0,1 0,4 Kwasy mononienasycone Lignocerynowy C24:0 - ślad - - ślad - - Behenowy C22:0 - ślad <0,1 ślad ślad - - Arachidonowy C20:0-0,3 0,2 1,5 0,5 0,1 - Stearynowy C18:0 1,8 2,3 5,2 4,3 2,5 0,2 1,3 Palmitynowy C16:0 10,7 22,3 6,2 8,3 4,2 3,6 21,8 Mirystynowy C14:0 <0,1 1,1 0,1 - <0,1 6,6 - Laurynowy C12: ślad ślad 0,1 - Kwasy nasycone Farmaceutyczny Nazwa kwasu (zwyczajowa) Ilość węgli w łańcuchu makowy bawełniany słonecznikowy sojowy rzepakowy z pestek winogron Amaranthusowy z szarłatu Oleje roślinne/zaw. kwasu % (m/m) 31

32 Nr 3 / 2008 Oleje roślinne/zaw. kwasu % (m/m) lniany tungowy z gorczycy z rzodkwi z czarnej porzeczki kukurydziany z ostropestu Ilość węgli w łańcuchu Nazwa kwasu (zwyczajowa) Kwasy nasycone Laurynowy C12:0 - - ślad Mirystynowy C14:0-0,1 <0,1 <0,1 0,1 0,2 0,1 Palmitynowy C16:0 6 2,8 2,8 5,9 5,9 13,3 5,2 Stearynowy C18:0 3,9 2,3 0,8 1,8 3,7 2 4,7 Arachidonowy C20: ,6 0,7 11,3-2,1 Behenowy C22: ,7 0,4 0,2-1,2 Lignocerynowy C24: ,3 0,5 0,2-0,3 Kwasy mononienasycone 32 Przegląd Farmaceutyczny copyright Naukowy Palmitooleinowy C16: ,2 0,1 0,1 0,1 - Oleinowy C18:1 21,9 6,5 21, ,2 47,8 27,2 Eikozenowy C20:1-0,8 12,2 14,9 0,9 0,3 0,9 Erukowy C22: ,9 15, Nerwonowy C24: ,6 1, Linolowy C18:2 15,6 7,9 9,4 16,3 46, ,1 Linolenowy C18:3 51,7 0,4 8,2 8,3 13,6 1 0,1 Izolinolenowy 1-77, Kwas oktadekatrienowy zawiera trzy podwójne wiązania sprzężone (olej tungowy stosowany jest jako olej schnący) Tabela II. Skład kwasów tłuszczowych wybranych olejów roślinnych (%)

33 BADANIE WPŁYWU WYBRANYCH PARAMETRÓW OZNACZEŃ SIAR- KOWODORU W WĄTROBIE I MÓZGU ŚWIŃ NA UZYSKANE WYNIKI AN EFFECT OF SOME PARAMETERS OF THE DETERMINATION OF THE HYDROGEN SULFIDE IN PIG LIVER AND BRAIN ON THE OBTAINED RESULTS dr Eugeniusz Somogyi, mgr Joanna Piotrowska, prof. dr hab.włodzimierz Rzeszutko Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego Kierownik: prof. dr hab.włodzimierz Rzeszutko Streszczenie W związku z koniecznością oznaczeń endogennego siarkowodoru w tkankach ssaków, gdzie pełni on określone funkcje będące przedmiotem badań, postanowiono przebadać wybrane parametry tych oznaczeń mogące mieć wpływ na uzyskiwane wyniki, a to: czas od pobrania próby do wykonania oznaczenia, wielkość próby także w aspekcie stężenia tkanki w homogenizacie oraz odzysk wprowadzonego zewnętrznego siarkowodoru. Posłużono się zmodyfikowaną metodą błękitu metylenowego do oznaczeń w mózgu i wątrobie świń ze względu na łatwą dostępność materiału. Stwierdzono spadek zawartości siarkowodoru w tkankach w miarę upływu czasu (dni) od pobrania próby do oznaczenia mimo stanu zamrożenia (-10 C). Różne wielkości (dziesiąte części grama) próby jak i różne stężenia tkanki w homogenizatach, utrzymują wyniki w granicach ±10% w stosunku do największych prób (ok. 0,7g - mózg, 0,5g - wątroba). Odzyski wprowadzonych ilości zewnętrznego siarkowodoru na poziomie dziesiątych części mikrograma, okazały się w pełni zadowalające. Słowa kluczowe: siarkowodór, metoda błękitu metylenowego, mózg, wątroba, świnia Abstract As it was necessary to determine endogenous hydrogen sulfide in mammal tissues, where it performs specific functions under investigation, it was decided to examine some parameters of determinations that could have an effect on the obtained results, mainly: time elapsed between sample taking and determination, sample size, also in the aspect of tissue concentration in the homogenizate and recovery of externally introduced hydrogen sulfide. The modified methylene blue method was used in determinations from pig brain and liver due to easy availability of the material. It was found, that the concentration of hydrogen sulfide in tissues decreases in time (days) between sample taking and determination despite of freezing (-10 C). The results remain within ± 10% for samples of various size (tenths of gram) and tissue concentrations in homogenizates compared to those of the largest samples (approx. 0,7g and 0.5g for brain and liver, respectively). The recovery of externally introduced hydrogen sulfide was at the level of tenths of microgram, thus was fully satisfactory. Key words: hydrogen sulfide, methylene blue method, brain, liver, pig Wstęp Produkowany w tkankach ssaków endogenny siarkowodór [1] pełni rolę regulatora w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych [2]. Stwierdzono, że wewnątrzkomórkowe powstawanie siarkowodoru jest modulowane tlenkiem azotu (II), którego z kolei powstawanie stymuluje kwas acetylosalicylowy [3, 4]. W Zakładzie Biologii CMUJ prowadzone są badania mające na celu wywołanie zwiększenia stężenia endogennego siarkowodoru w mózgu, wątrobie i sercu myszy po podaniu kwasu acetylosalicylowego oraz pentacyjanożelazianu (III) sodu będącego z kolei generatorem tlenku azotu (II) [5]. W związku z powyższym, konieczne stało się zastoso- wanie efektywnej metody oznaczania siarkowodoru w tkankach zwierzęcych. Posłużono się zmodyfikowaną metodą opracowaną przez Siegela [6]. Odczynniki, roztwory i aparatura wodorotlenek sodu mol*l -1 roztwór; kwas trichlorooctowy (TCA)- 50% roztwór; kwas solny stężony- 1,2 mol*l -1, 7,2 mol*l -1 roztwory; siarczan (VI) N,N-dimetylop-fenyleno-diaminy- 2*10-2 mol*l -1 roztwór w 7,2 mol*l -1 kwasie solnym; chlorek żelaza (III) -1,2 mol*l -1 roztwór w 1,2 mol*l -1 kwasie solnym; jod- 5*10-2 mol*l -1 roztwór mianowany; tiosiarczan (VI) sodu mol*l -1 roztwór mianowany; skrobia- 1% roztwór; siarczek sodu-10-2 mol*l -1 roz- Farmaceutyczny 33

34 twór mianowany jodometrycznie, 10-3 mol*l -1, 10-4 mol*l -1 roztwory uzyskane przez kolejne rozcieńczanie roztworu mianowanego roztworem wodorotlenku sodu; spektrofotometr Cary 100 firmy Varian Przebieg oznaczenia Pobieraną tkankę homogenizowano z roztworem wodorotlenku sodu w stosunku wagowym: - mózg wątroba 1+3 Pobierano po 2 g homogenizatu do probówek o pojemności 3 ml ze szczelnym korkiem, dodawano po 0,5 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA), wytrząsano i wirowano. Pobierano po 1,5 ml supernatantu do zamykanych kapsułek pojemności 2 ml, w których uprzednio umieszczano po 0,15 ml roztworów siarczanu (VI) N,N-dimetylo-p-fenyleno-diaminy i chlorku żelaza (III). Kapsułki zamykano, mieszano zawartość i pozostawiano na 20 minut w ciemnym miejscu. Po tym czasie zawartość każdej kapsułki wytrząsano przez 1 minutę z 1 ml chloroformu. Mierzono absorbancję warstwy chloroformowej w mikrokuwetach 1 cm przy długości fali 653,5 nm spektrofotometrem Cary 100 firmy Varian. Krzywą wzorcową przygotowywano przez uzupełnienie do 2 ml od 50 do 400 µl co 50 µl 1*10-4 mol/l roztworu siarczku sodu roztworem wodorotlenku sodu. Dalej postępowano jak z próbką badaną. Krzywą wzorcową przedstawia ryc. 1. Ryc. 1 λ= 653,5 nm; ABS= 0, ,02407 * nmol H 2 S; korelacja r = 0,99795 Z przygotowaniem próbek narządów zwierzęcych do analizy związany jest szereg aspektów, które mogą mieć wpływ na wyniki oznaczeń określonych składników tych próbek. Bywa tak, że z różnych względów oznaczenie nie jest możliwe bezpośrednio po pobraniu narządów i czas od pobrania do oznaczenia jak i warunki przechowywania próbki mogą odgrywać istotną rolę. Należy brać również pod uwagę 34 Farmaceutyczny Nr 3 / 2008 wielkość i ilość użytych do eksperymentów zwierząt (we wspomnianych wyżej pracach w Zakładzie Biologii CMUJ używano myszy), co może być ograniczeniem wielkości próbki np. serca czy mózgi myszy. Wielkość próbki można zwiększyć poprzez jej rozcieńczenie, ale to również może mieć wpływ na uzyskiwane wyniki. Biorąc to pod uwagę, postanowiono zbadać wpływ niektórych aspektów związanych z pobraniem próbki na uzyskiwane wyniki, a to: 1.czasu przechowywania homogenizatów tkanek przed oznaczeniem (w stanie zamrożenia w temperaturze 10oC) 2.zmniejszającej się ilości tkanek w określonych ilościach homogenizatów przy stałej ilości odczynników (mniejsze stężenia próbki) oraz przy zmniejszającej się proporcjonalnie ich ilości (stałe stężenie próbki) 3.odzysku wprowadzonego w różnych ilościach zewnętrznego siarkowodoru Do badań użyto mózgu i wątroby świń ze względu na łatwą dostępność. Ad 1. W uzyskanych w sposób zamieszczony w przebiegu oznaczenia homogenizatach tkankowych, oznaczano siarkowodór bezpośrednio po uzyskaniu, po 1 dniu, 2 oraz 3 dniach biorąc każdorazowo do oznaczeń po 10 próbek. Ad 2. a)uzyskane homogenizaty tkankowe (p. przebieg oznaczenia ) pobierano w ilościach 2 g, 1,5 g, 1 g i 0,5 g uzupełniając każdorazowo ich ilość do 2 g roztworem wodorotlenku sodu, otrzymując próbki w stadium przed dodaniem TCA (p. przebieg oznaczenia) oraz b)pobierano do badań po 1 g homogenizatu dodając o połowę mniejsze ilości pozostałych odczynników do stadium wytrząsanie z 1 ml chloroformu (p. przebieg oznaczenia) biorąc każdorazowo po 10 próbek do oznaczeń. Ad 3. Wykonano homogenizaty mózgu z roztworem wodorotlenku sodu w stosunku wagowym 1+1 i wątroby w stosunku wagowym 1+2. Do 1,5 gramowych porcji homogenizatów dodawano takie ilości roztworu siarczku sodu, aby odpowiadały one zawartości siarkowodoru w tych ilościach homogenizatów, trzem czwartym, jednej drugiej i jednej czwartej uzupełniając za każdym razem ilość przygotowanej próbki do 2 ml roztworem wodorotlenku sodu. Każdy wariant oznaczono w ilości 5 próbek. Wyniki oznaczeń przedstawiono w tabelach I, II, III. Wnioski Z uzyskanych wyników można wyciągnąć następujące wnioski: 1. Mimo przechowywania w stanie zamrożenia (-10 C) homogenizatów tkankowych, zawartość siarkowodoru w nich maleje z upływem czasu (dni). Należy zatem wyko-

35 Nr 3 / mózg wątroba 0 0,83-1,33*10-2 1,60 0,8300 ± 0, ,78 6,0 2,27*10-2 2,91 0,7760 ± 0, ,72 13,3 1,65*10-2 2,29 0,7240 ± 0, ,68 18,0 1,70*10-2 2,50 0,6800 ± 0, ,43-2,03*10-2 1,42 1,4290 ± 0, ,40 2,1 2,80*10-2 2,00 1,3960 ± 0, ,36 4,9 2,54*10-2 1,87 1,3570 ± 0, ,35 5,6 2,33*10-2 1,73 1,3511 ± 0,0168 Tabela I Wyniki oznaczeń siarkowodoru w mózgu i wątrobie świń bezpośrednio oraz 1, 2 i 3 dni po pobraniu materiału (objaśnienia w tekście). mózg wątroba a 0,65-1,48*10-2 2,28 0,6480 ± 0,0106 b 0,70-7,7 1,60*10-2 2,29 0,7010 ± 0,0114 c 0,67 +3,1 2,21*10-2 3,30 0,6730 ± 0,0158 d 0,60-7,7 1,70*10-2 2,83 0,6000 ± 0,0122 e 0,69 +6,1 2,37*10-2 3,43 0,6950 ± 0,0169 a 1,94-6,48*10-2 3,34 1,9420 ± 0,0464 b 1,98 +2,1 5,00*10-2 2,53 1,9790 ± 0,0358 c 1,93-0,5 5,17*10-2 2,68 1,9260 ± 0,0370 d 1,80-7,2 9,56*10-2 5,31 1,7990 ± 0,0684 e 1,97 +1,5 4,93*10-2 2,50 1,9650 ± 0,0352 Tabela II Wyniki oznaczeń siarkowodoru w mózgu i wątrobie świń w różnych ilościach materiału pobranego do analizy (objaśnienia w tekście). nywać oznaczenia możliwie w jak najkrótszym czasie od pobrania tkanek. Jeśli zaś muszą być przechowywane, nie powinno się prowadzić oznaczeń różnych próbek w różnym czasie ze względu na brak możliwości porównania wyników. 2. Mniejsze ilości materiału wyjściowego przy stałej, określonej ilości odczynników- mniejsze stężenia próbkijak i mniejsze ilości materiału wyjściowego przy proporcjonalnie mniejszej ilości odczynników- stałe stężenie próbki (obie opcje spowodowane małą ilością tkanki np. mózgu czy serca myszy) nie powodują zmian uzyskiwanych wyników poza przedział ±10% (posługiwano się próbami rzędu dziesiątych części grama tkanki przed homogenizacją). 3. Odzysk wprowadzonego zewnętrznego siarkowodoru w różnej ilości (dziesiąte części mikrograma) do homogenizatów tkanek jest w pełni zadowalający co w połączeniu z wnioskiem z pkt 2 świadczy o braku wpływu wielkości próbki jak i jej stężenia na uzyskiwane wyniki. mózg wątroba x 0, ,37*10-3 1,78 0,4680 ± 0,0104 a 0,08-4,47*10-3 5,59 0,0820 ± 0,0056 b 0,20-8,37*10-3 4,18 0,2020 ± 0,0104 c 0,33-8,37*10-3 2,54 0,3280 ± 0,0104 d 0,43-1,30*10-2 3,03 0,4280 ± 0,0162 ax 0, ,07*10-2 3,84 0,5360 ± 0,0257 bx 0, ,87*10-2 2,79 0,6700 ± 0,0232 cx 0, ,82*10-2 2,30 0,7860 ± 0,0226 dx 0, ,30*10-2 1,46 0,8880 ± 0,0162 x 0, ,07*10-3 2,08 0,3400 ± 0,0088 a 0,09-5,48*10-3 6,09 0,0940 ± 0,0068 b 0,21-5,48*10-3 2,61 0,2060 ± 0,0068 c 0,26-9,57*10-3 3,68 0,2640 ± 0,0111 d 0,34-4,47*10-3 1,32 0,3420 ± 0,0056 ax 0, ,14*10-2 2,65 0,4260 ± 0,0142 bx 0, ,14*10-2 2,07 0,5460 ± 0,0142 cx 0, ,30*10-2 2,10 0,6180 ± 0,0162 dx 0, ,48*10-2 2,12 0,7020 ± 0,0184 Tabela III Wyniki oznaczeń siarkowodoru w mózgu i wątrobie świń po wprowadzeniu różnych ilości zewnętrznego siarkowodoruodzysk (objaśnienia w teście) Tabela I 1- rodzaj materiału 2-czas od pobrania materiału do oznaczenia [dni] 3-oznaczona zawartość siarkowodoru [µg/g tkanki] 4-procentowy spadek zawartości siarkowodoru w stosunku do początkowej zawartości 5-odchylenie standardowe 6-względne odchylenie standardowe [%] 7-przedział ufności przy α = 0,05 Tabela II 1-rodzaj materiału oraz ilość homogenizatu pobranego do analizy [g] a-2,0; b- 1,5; c- 1,0; d- 0,5; e- 1,0 g z połową odczynników 2-oznaczona zawartość siarkowodoru [µg/g tkanki] 3-różnica w stosunku do próby odniesienia- 2g [%] 4-odchylenie standardowe 5-względne odchylenie standardowe [%] 6-przedział ufności przy α = 0,05 Tabela III 1-rodzaj materiału x- dane dotyczące endogennego siarkowodoru a, b, c, d- dane dotyczące ilości zewnętrznego siarkowodoru wprowadzonego do próbek; odpowiednio około ¼, 2/4, ¾ i 4/4 zawartości z pozycji x-2 ax, bx, cx, dx- dane dotyczące zawartości całkowitego siarkowodoru po dodaniu zewnętrznego 2-oznaczona zawartość siarkowodoru [µg] 3-porównanie z wartością x-2 [%] 4-odchylenie standardowe 5-względne odchylenie standardowe [%] 6-przedział ufności przy α = 0,05 Farmaceutyczny 35

36 Piśmiennictwo: 1. Moore P.K., Bhatia M., Moochhala S., Hydrogen sulfide: from the smell of the past to the mediator of the future? Trends Pharmacol Sci. 2003, 24(12), Eto K. i wsp., Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal exctitation. J Neurosci. 2002, 22 (9), Paul-Clark M.J. i wsp., 15-epi-lipoxin A4-mediated induction of nitric oxide explains how aspirin inhibits acute inflammation. J Exp Med. 2004, 200 (1), Nr 3 / Gilroy D.W., New insights into the anti-inflammatory actions of aspirin-induction of nitric oxide through the generation of epi-lipoxins. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2005, 100 Suppl 1, Srebro Z., Somogyi E., Wiliński B., Aspirin augments the concentration of endogenous hydrogen sulfide in mouse brain and liver. Folia Med. Cracov. 2006, XLVII, Siegel L.M., A direct microdetermination for sulfide. Anal Biochem. 1965, 11, Farmaceutyczny

37 Badanie wpływu pochodnej bisperoksowanadu na peroksydację kwasu linolowego in vitro Study on the influence of bisperoxovanadium s derivative on peroxidation of linoleic acid in vitro Dr Maciej Gawlik 1, Mgr Marta Szczebiwilk 1, Dr Małgorzata Bogumiła Gawlik 1, Dr Ryszard Gryboś 2 1 Katedra Toksykologii, Wydział Farmaceutyczny, Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2 Zakład Chemii Nieorganicznej, Wydział Chemii, Uniwersytet Jagielloński, Kraków Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Jerzy Brandys Streszczenie: Badano bipirydynową pochodną bisperoksowanadu, związku o działaniu przeciwcukrzycowym i przeciwnowotworowym. Określano wpływ badanego kompleksu na peroksydację kwasu linolowego w czasie wobec H 2 O 2. Dla porównania stosowano jony miedzi (II). Nie stwierdzono cech pro-oksydacyjnych badanego kompleksu z wyjątkiem najwyższego (0,2 mm) z trzech zastosowanych stężeń w obecności H 2 O 2. Może to wskazywać na zmianę aktywności oksydacyjnej kompleksu w zależności od stężenia i potencjału utleniającego środowiska. Słowa kluczowe: bisperoksowanad, kwas linolowy, peroksydacja lipidów Abstract: The bipirydyne derivative of bisperoxovanadium, anti- -diabetes and anti-neoplastic agent, was studied on. The influence of the complex on peroxidation of linoleic acid was assessed in the presence of H 2 O 2. Copper ions (II) were used for comparison. The pro-oxidative properties of the complex were no observed in exception of the sample with the highest concentration (0.2 mm) in the presence of H 2 O 2. From the observation it seems possible that the oxidative activity of the complex could be changed with the changes in concentration and pro- -oxidative potential of the reaction environment. Key words: bisperoxovanadium, linoleic acid, lipid peroxidation Wstęp Wanad, podobnie jak inne metale przejściowe, w postaci jonowej ma zdolność do nasilania procesów oksydacyjnych w organizmie na drodze reakcji Fentona [1]. Wykorzystanie tego rzadkiego metalu w celach terapeutycznych musi zatem uwzględniać niedopuszczenie do niekorzystnych skutków dla równowagi pro-/antyoksydacyjnej. Wydaje się, że taką możliwość stwarzają związki kompleksowe wanadu, a wśród nich pochodne bisperoksowanadu o stwierdzonych właściwościach insulinomimetycznych w cukrzycy i przeciwnowotworowych [2,3,4]. Spośród wielonienasyconych kwasów tłuszczowych zawartych w strukturach błonowych jak i we frakcji LDL, kwas linolowy występuje w największej ilości [5]. Ze względu na dogodny pomiar spektrofotometryczy powstających w wyniku peroksydacji tego kwasu skoniugowanych dienów z 1,4-dienów nieskoniugowanych, może on służyć jako model dla oceny działania pro-/antyoksydacyjnego ksenobiotyków. Celem pracy było zbadanie wpływu 2,2 -bipirydynooksodiperoksowanadanu(v) sodu (Na[VO(O 2 ) 2 bpn] 8H 2 O) na peroksydację kwasu linolowego zachodzącą w układzie bez i w obecności nadtlenku wodoru. Wpływ ten porównywano z wpływem jonów miedzi Cu(II) w tych samych warunkach. Materiał i metodyka Zastosowano zmodyfikowaną metodykę opisaną przez Ueda i wsp. [6]. Badania przeprowadzono w układzie reakcyjnym zawierającym 0,1 M bufor fosforanowy (Sigma Aldrich, Niemcy) o ph=7,4, w którym zawieszano kwas linolowy (Sigma Aldrich, Niemcy) rozpuszczony w etanolu. Farmaceutyczny 37

38 Pierwsza seria prób badanych zawierała w swoim składzie kwas linolowy o ostatecznym stężeniu 2,4 mm oraz badaną ośmiowodną sól sodową kompleksu wanadu (bpv) o końcowych stężeniach 0,05; 0,1 i 0,2 mm. Dla porównania zastosowano drugą serię prób, które zawierały w swoim składzie kwas linolowy i CuSO4 o stężeniu 0,1 mm. Próbę kontrolną stanowił układ zawierający tylko kwas linolowy. Na kolejnym etapie eksperymentu przygotowano badane serie mieszanin jak to opisano to powyżej (łącznie z grupą kontrolną), do których jeszcze dodano nadtlenek wodoru (25mM). Otrzymane mieszaniny inkubowano w 37 C przez 4 h. W odstępach czasowych 0, 1, 2, 3, 4 h pobierano 0,5 ml mieszaniny i skoniugowane dieny ekstrahowano cykloheksanem (POCh, Polska) (2 ml) z dodatkiem EDTA-Na (0,5 ml, 2 mm). Absorbancję warstwy organicznej mierzono przy długości fali 234 nm (spektrofotometr UV-VIS, Genesis 2PC, Spectronic, USA). Dla każdej serii oznaczeń przeprowadzono po 5 powtórzeń a uzyskane wyniki opracowywano statystycznie przy użyciu testu t-studenta. Wyniki i ich omówienie Na ryc.1a przedstawiono zmiany absorbancji próby kontrolnej i próbek badanych w czasie 4-ro godzinnej inkubacji w układzie bez dodatku H 2 O 2. W stosunku do próby kontrolnej istotnie statystyczne zmiany (p<0,05) po wszystkich czterech ustalonych czasach inkubacji stwierdzono dla próbek zawierających siarczan miedzi. Dla próbek zawierających kompleks wanadu obserwowano nieznaczny, nieznamienny wzrost absorbancji w stosunku do próby kontrolnej. W układzie z dodatkiem nadtlenku wodoru (ryc.1b) istotność statystyczną (p<0,05) w stosunku do grupy kontrolnej stwierdzono po wszystkich czterech czasach dla próbek zawierających CuSO 4 oraz dla próbek zawierających związek wanadu w stężeniu 0,2 mm po 4 godzinach inkubacji. Dla dwóch pozostałych serii próbek zawierających odpowiednio Nr 3 / ,05 i 0,1 mm kompleksu wanadu przebieg zmian absorbancji był zbliżony do próbek kontrolnych. Łączna inkubacja kwasu linolowego z miedzią i nadtlenkiem wodoru spowodowała istotny wzrost tworzenia skoniugowanych dienów w porównaniu do inkubacji kwasu tylko z miedzią. Podobnie, wzmożona produkcja dienów została zaobserwowana pod wpływem łącznego działania nadtlenku wodoru i związku wanadu o stężeniu 0,2 mm w porównaniu do działania tylko nadtlenku wodoru. Niższe stężenia wanadu, w obecności nadtlenku wodoru nie spowodowały istotnego wpływu na tworzenie się skoniugowanych dienów w porównaniu do działania samego H 2 O 2. Dyskusja Prowadzone wcześniej badania związane z działaniem biologicznym pochodnych bisperoksowanadu wskazują, że może on mieć znaczenie w obniżaniu cukru we krwi w przypadku cukrzycy [8,9]. Jednak działaniu temu może towarzyszyć zaburzenie równowagi pro-/antyoksydacyjnej, którego kierunek jest uwarunkowany przez wiele czynników np. struktura organiczna ligandu kompleksu oraz potencjał oksydacyjno-redukcyjny środowiska działania. Stąd w przedstawionej pracy badano wpływ kompleksu wanadu o wzorze Na[VO(O 2 ) 2 bpy] 8H 2 O na postęp peroksydacji kwasu linolowego mierzonego poziomem sprzężonych dienów wykazujących specyficzne pasmo absorpcji przy λ=234 nm. Badany kompleks wanadu o stężeniu 0,05; 0,1 i 0,2 mm nie wykazał działania utleniającego w stosunku do kwasu linolowego pod nieobecność dodatkowego czynnika utleniającego. Efekt prooksydacyjny ujawniający się w sposób istotny wzrostem powstawania skoniugowanych dienów, zaobserwowano po 4 godzinnej inkubacj z kwasem linolowym, kompleksu wanadu o stężeniu 0,2 mm w obecności utleniacza w postaci H 2 O 2. Uzyskane wyniki badań wska- A B * * * * * * * * Ryc 1. Zmiany absorbancji badanych prób obrazujące tworzenie się dienów skoniugowanych w trakcie inkubacji kwasu linolowego z jonami miedzi (II) i kompleksem wanadu (1A) oraz kwasu linolowego z jonami miedzi (II), kompleksem wanadu i z nadtlenkiem wodoru (1B). * wartość znamienna statystycznie w stosunku do kontroli (p < 0,05) 38 Farmaceutyczny

39 Nr 3 / 2008 zują, że w dalszych badaniach nad działaniem farmakologicznym bipirydynowego kompleksu wanadu bardzo istotna może być wysokość stosowanej dawki. W obecności występujących w organizmie aktywnych form tlenu zbyt wysoka dawka może stać się powodem zwiększenia reakcji peroksydacji lipidów obecnych w komórce. Piśmiennictwo 1. Bartosz G. Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. PWN Warszawa Foot E. Bliss T. Fernandes LC. Da Costa C. Leighton B. The effects of orthovanadate, vanadyl and peroxides of vanadate on glucose metabolism in skeletal muscle preparations in vitro. Mol Cell Biochem 1992, 109, Posner BI., Faure R., Burgess JW., Bevan AP., Lachance D., Zhang-Sun G., Fantus IG., Ng JB., Hall DA.,. Lum BS., Shaver A.: Peroxovanadium compounds. A new class of potent phosphotyrosine phosphatase inhibitors which are insulin mimetics. J. Biol. Chem.1994, 269, Scrivens PJ., Alaoui-Jamali MA., Giannini G., Wang, T/. Loignon M.,. Batist G., Sandor VA.: Cdc25A-inhibitory properties and antineoplastic activity of besperoxovanadium analogues. Mol Cancer Ther 2003, 2, Esterbauer H., Gebicki J., Puhl H., Jurgens G.: The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Rad Biol Med 1992, 13, Ueda J., Anzai K., Niura Y., Ozawa T.: Oxidation of linoleic acid by copper(ii) complexes: effects of ligand. J Inorg Biochem 1999, 76, Krośniak M., Gryboś R., Gawlik M.B.: 15th International Symposium: Molecular and Physiological Aspects of Regulatory Processes of the Organism, Cracow, June 1-2, 2006, Materiały zjazdowe, str Kordowiak AM., Trzos R., Gryboś R.: Insulin-like effects on liver Golgi membrane preparations of bis(oxalato)oxovanadate(iv) complex ion, a new vanadate compound. Horm Metab Res 1997, 29, Krośniak M., Zachwieja Z., Filipek B., Zygmunt M., Gryboś R.: Effect of oxovanadium(iv) complexes on nondiabetic and streptozotocin-diabetic rats. Archiv Pharm 2001, 334, Farmaceutyczny 39

40 BADANIE STANU RÓWNOWAGI KOMPLEKSÓW KWASU MLEKOWE- GO Z EUDRAGITEM E-100 INVESTIGATION OF EQUILIBRIUM IN LACTIC ACID COMPLEXES WITH EUDRAGIT E-100 Dr Katarzyna Małolepsza-Jarmołowska, Prof. dr hab. Janusz Pluta, Prof. dr hab. Aleksander A. Kubis Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku, Akademia Medyczna, Wrocław Kierownik Katedry: Prof. dr hab. Janusz Pluta Streszczenie: Celem pracy były badania równowagi kompleksów kwasu mlekowego z Eudragitem E-100 zastosowanych w wyżej wymienionych postaciach leku. Z przeprowadzonych pomiarów wynika, że stężenie kwasu mlekowego będącego w równowadze z kompleksem, jest zależne od stosunku molowego tego kwasu do polimeru i największą wartość osiąga przy stosunku molowym 4:1, mniejszą przy 2:1, zaś najmniejszą przy 1:1. Jest to zależność wprost proporcjonalna, a zatem stężenie równowagowe kwasu mlekowego wzrasta wraz ze wzrostem stosunku molowego kwasu do polimeru. Dodatek substancji hydrofilizujących wpływa na podwyższenie lub obniżenie stężenia równowagowego kwasu mlekowego w kompleksie kwasu mlekowego z Eudragitem E-100. W większości przypadków największy wpływ na wzrost stężenia kwasu mlekowego, będącego w równowadze z jego kompleksem wywiera dodatek glikolu propylenowego-1,2 w stężeniu 5-25%. Słowa kluczowe: kwas mlekowy, ph pochwy, kompleks, Eudragit E-100 Abstract: The aim of the present study was to investigate the state of equilibrium of lactic acid complexed with Eudragit E-100 used in the above mentioned drug forms. The measurements indicated that the concentration of lactic acid in a state of equilibrium with the complex depends on the acid to polymer molar ratio and reaches the maximum value when the molar ratio is 4:1, being lower at 2:1 ratio and the lowest at 1:1 ratio. This is a directly proportional relationship, thus equilibrium concentration of lactic acid increases with the increase of the acid to polymer molar ratio. The addition of hydrophilizing substances affects the increase or decrease of lactic acid equilibrium concentration in the lactic acid and Eudragit E-100 complex. In the majority of cases, the highest effect on the increase of lactic acid concentration being in equilibrium with its complex was observed following addition of 1,2-propylene glycol in 5-25% concentration. Key words: lactic acid, vaginal ph, complex, Eudragit E Wstęp W dotychczasowych pracach badawczych nad zastosowaniem kwasu mlekowego do celów ginekologicznych przebadano żele, globulki, tabletki przeznaczone do leczenia zaburzeń odczynu środowiska pochwy. Postacie te zostały pozytywnie ocenione pod względem przydatności i skuteczności w leczeniu klinicznym i ambulatoryjnym powyższych schorzeń [1-8]. 40 Farmaceutyczny Celem pracy były badania równowagi kompleksów kwasu mlekowego z Eudragitem E-100 zastosowanych w wyżej wymienionych postaciach leku. 2. Metody eksperymentalne 2.1. Materiały Kwas mlekowy P.Z.F. Cefarm (Wrocław, Polska). Chitozan stopień deacetylacji 93.5% Morski Instytut Rybacki ( Gdynia, Polska ). Glicerol POCH (Gliwice, Polska).

41 Nr 3 / 2008 Glikol propylenowy-1,2 POCH (Gliwice, Polska). Glikol polioksyetylenowy-200, LOBA Chemie, Wien Fishamend (Wien, Austria) Aparatura Naczynie dializacyjne składające się z kompartmentu donorowego i akceptorowego przedzielonych półprzepuszczalną błoną dializacyjną. Wytrząsarka universalna WU-4. ph metr Hanna Instruments 302, elektroda złożona EPS 2ZM. 3. Wyniki badań Na podstawie przeprowadzonych badań procesu ustalania się stanu równowagi w kompleksie kwasu mlekowego z Eudragitem E-100 stwierdzono, że stężenie wolnego kwasu mlekowego rośnie wraz z upływem czasu, po czym osiąga stan równowagi. Z przeprowadzonych pomiarów wynika, że stężenie kwasu mlekowego będącego w równowadze z kompleksem, jest zależne od stosunku molowego tego kwasu do polimeru i największą wartość osiąga przy stosunku molowym 4:1, mniejszą przy 2:1, zaś najmniejszą przy 1:1. Jest to zależność wprost proporcjonalna, a zatem stężenie równowagowe kwasu mlekowego wzrasta wraz ze wzrostem stosunku molowego kwasu do polimeru (tab.i.). Dodatek substancji hydrofilizujących wpływa na podwyższenie lub obniżenie stężenia równowagowego kwasu mlekowego w kompleksie kwasu mlekowego z Eudragitem E-100. Glicerol, glikol propylenowy-1,2 i PEG-200 w poszczególnych, użytych do badań stężeniach wpływają na obniżenie stężenia kwasu mlekowego będącego w stanie równowagi z kompleksem w stosunku do preparatu odniesienia w stosunkach molowych kwasu do polimeru jak 1:1 i 2:1. Wzrost tego stężenia zaobserwowano przy stosunku molowym kwasu do Eudragitu E-100 4:1. W kompleksach w których stosunek molowy kwasu mlekowego do polimeru wynosi 1:1, największy wpływ na obniżenie stężenia równowagowego kwasu zaobserwowano w przypadku dodatku 15% i 25% glicerolu. Dla kompleksów w których stosunek molowy kwasu mlekowego do polimeru wynosi 2:1, największe obniżenie stężenia równowagowego kwasu mlekowego nastąpiło po dodaniu 15% i 25% PEG-200, glikolu propylenowego-1,2 lub glicerolu. W przypadku stosunku molowego 4:1 w kompleksie największy wzrost tego stężenia stwierdzono po dodaniu 5% PEG-200, 5% glikolu propylenowego-1,2 nieco mniejszy przy dodaniu 5% glicerolu. Mniejszy wpływ na wzrost stężenia równowagowego kwasu wywierał 15% dodatek substancji hydrofilizujących, a najmniejszy 25% tych substancji (tab.ii.). 4. Omówienie Wraz ze wzrostem stosunku molowego kwasu mlekowego do Eudragitu E-100 w stanie równowagi dyfuzyjnej wzrasta stężenie wolnego kwasu mlekowego. Z analizy wyników można wnioskować, że w większości przypadków największy wpływ na wzrost stężenia kwasu mlekowego, będącego w równowadze z jego kompleksem wywiera dodatek glikolu propylenowego-1,2 w stężeniu 5-25%. Mniejszy wpływ na stężenie równowagowe kwasu mlekowego wywiera w większości przypadków dodatek 15% substancji hydrofilizujących, najmniejszy 25% dodatek tych substancji. 5. Wnioski 1. Stężenie wolnego kwasu mlekowego wzrasta wraz ze wzrostem stosunku molowego kwasu mlekowego do Eudragitu E Dodatek substancji hydrofilizujących wpływa na stężenie równowagowe wolnego kwasu mlekowego w zależności od stężenia zastosowanych substancji. Piśmiennictwo 1. Kubis A. A., Małolepsza-Jarmołowska K. Studies on gynaecological hydrophiling preparations comprising lactic acid. Part 1: Effects of lactic acid and hydrophiling agents on physical and chemical properties of methylcellulose gels. Pharmazie 1996, 51, Małolepsza-Jarmołowska K., Kubis A. A. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations Part 2: Effects of Eudragit E-100 on properties of methylcellulose gels. Pharmazie 1999, 54, Małolepsza-Jarmołowska K., Kubis A. A. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations Part 3: Effects of chitosan on the properties of methylcellulose gels. Pharmazie 2000, 55, Stosunek kwasu mlekowego do Eudragitu E-100 Czas wytrząsania 30min [%] km Czas wytrząsania 60min [%] km Czas wytrząsania 90min [%] km Czas wytrząsania 120min [%] km Czas wytrząsania 150min [%] km Czas wytrząsania 180min [%] km Czas wytrząsania 360min [%] km 1:1 19,82 25,22 28,82 30,63 28,82 27,02 27,02 2:1 28,82 32,43 34,24 36,93 36,03 34,24 34,24 4:1 36,93 39,63 44,14 45,04 43,24 42,34 42,34 Tab.I. Przebieg ustalania się stanu równowagi w kompleksie kwasu mlekowego z Eudragitem E-100 E-100, w których stosunek molowy tego kwasu do polimeru wynosi 1:1, 2:1, 4:1. Farmaceutyczny 41

42 Stosunek kwasu mlekowego do Eudragitu E-100 Subst. hydr. Czas wytrząsania 30min [%] KM Czas wytrząsania 60min [%] KM Czas wytrząsania 90min [%] KM Czas wytrząsania 120min [%] KM Nr 3 / 2008 Czas wytrząsania 180min [%] KM 1:1 5%P 21,62 27,02 30,63 32,43 28,83 1:1 15%P 16,21 23,42 25,22 27,02 23,42 1:1 25%P 14,41 19,80 23,42 25,22 21,62 1:1 5%GP 21,62 28,83 30,62 34,23 30,62 1:1 15%GP 16,21 21,62 25,22 28,83 25,22 1:1 25%GP 15,31 19,82 23,42 26,12 22,52 1:1 5%G 21,62 24,32 26,12 28,83 25,22 1:1 15%G 10,81 16,21 21,62 23,42 20,72 1:1 25%G 9,01 11,71 19,82 21,62 16,21 2:1 5%P 30,62 34,23 36,03 39,63 36,03 2:1 15%P 27,02 28,82 30,62 32,44 28,82 2:1 25%P 14,41 21,62 27,92 30,62 26,12 2:1 5%GP 30,62 34,23 36,03 39,63 36,03 2:1 15%GP 27,92 27,02 30,62 32,44 28,83 2:1 25%GP 15,31 22,52 27,92 30,62 26,12 2:1 5%G 27,02 30,62 32,44 34,44 32,44 2:1 15%G 9,00 15,31 21,62 30,62 25,22 2:1 25%G 4,50 9,00 16,21 26,12 21,62 4:1 5%P 39,63 41,44 45,04 46,84 21,62 4:1 15%P 32,44 37,83 41,44 42,34 37,84 4:1 25%P 21,62 30,62 36,03 37,44 36,03 4:1 5%GP 39,63 42,34 46,84 47,74 43,24 4:1 15%GP 36,03 39,63 42,34 43,24 39,63 4:1 25%GP 27,92 32,43 37,84 39,63 36,03 4:1 5%G 36,03 39,62 41,44 43,24 39,63 4:1 15%G 16,21 25,22 36,03 37,84 32,44 4:1 25%G 11,89 24,32 30,62 32,44 27,02 Tab.II. Przebieg ustalania się stanu równowagi w kompleksie kwasu mlekowego z Eudragitem E-100, w których stosunek molowy tego kwasu do polimeru wynosi 1:1, 2:1, 4:1 z dodatkiem glikolu polioksyetylenowego-200, glikolu propylenowego- -1,2, glicerolu. 4. Małolepsza-Jarmołowska K., Kubis A. A. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations Part 4: Effects of polyvinyl pyrrolidone K-90 on the properties of methylcellulose gels. Pharmazie 2001, 56, Małolepsza-Jarmołowska K., Kubis A. A., Hirnle L. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations Part 5: The use of Eudragit E-100 as lactic acid carrier in intravaginal tablets. Pharmazie 2003, 58, Małolepsza-Jarmołowska K., Kubis A. A., Hirnle L. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations Part 6: Use of Eudragit E-100 as lactic acid carrier in intravaginal tablets. Pharmazie 2003, 58, Małolepsza-Jarmołowska K. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations Part 7: Use of chitosan as lactic acid carrier in intravaginal tablets ( globuli vaginales). Pharmazie 2006, 61, Małolepsza-Jarmołowska K. Studies on gynaecological hydrophilic lactic acid preparations. Part 8: Use of chitosan as lactic acid carrier in intravaginal tablets. Acta Pol. Pharm. 2007, 64, Zastosowane skróty: Subst. hydr. substancja hydrofilizująca KM kwas mlekowy P Glikol polioksyetylenowy-200 GP Glikol propylenowy-1,2 G Glicerol 42 Farmaceutyczny

43 Badania trwałości podłoży hydrofilowych sporządzonych za pomocą Unguatora oraz metodą tradycyjną. Study of durability for hydrophilic bases prepared with Unguator as well as with traditional method mgr Iwona Piotrowska mgr Monika Wilk Prof. dr hab. Edmund Sieradzki Zakład Farmacji Stosowanej Akademii Medycznej w Warszawie Kierownik zakładu: Prof. dr hab. Edmund Sieradzki Streszczenie Sporządzono podłoża hydrofilowe metodą ręczną i za pomocą Unguatora. Podłoża emulsyjne O/W są szczególnie wrażliwe na wielokrotne zmiany temperatury, dlatego przy ocenie trwałości badanych próbek zastosowano test wahadłowy. Zbadano parametry reologiczne preparatów bezpośrednio po sporządzeniu, jak i po 1 tygodniowym i 1 miesięcznym przechowywaniu w różnych temperaturach. Podłoża sporządzone za pomocą Unguatora charakteryzowały się bardziej płynną konsystencją, co może być przyczyną ich niestabilności. Metoda tradycyjna, za pomocą której wykonano preparaty o tym samym składzie pozwoliła na uzyskanie układu, dla którego wartości parametrów reologicznych zmieniają się nieznacznie w czasie trwania eksperymentu. Słowa kluczowe: podłoża hydrofilowe, stabilność, parametry reologiczne granica pięcia, lepkość. Abstract Hydrophilic bases were prepared with manual method and with Unguator. Emulsive bases O/W are particularly sensitive to multiple changes of temperature, therefore pendulum test was used for durability estimation of tested samples. There was an examination of rheological parameters immediately after preparation as well as after 1 week and 1 month storage in various temperatures. Bases prepared with Unguator were characterized by more liquid consistency, and that could be a reason for instability of those bases. The same composition preparations, prepared with a traditional method, allowed for configuration, where rheological parameters are changing slightly during an experiment. Key words: hydrophilic basaes, stability, rheological parameters yield stress, viscosity. Podłoża hydrofilowe ze względu na różnorodność zastosowanych składników stanowią skomplikowane układy fizyko-chemiczne. Wszystkie składniki w większym lub mniejszym stopniu oddziaływują ze sobą, co bezpośrednio wpływa na wygląd (jakość) danego preparatu, jak również na jego trwałość [1]. Podłoża emulsyjne O/W są szczególnie wrażliwe na wielokrotne zmiany temperatury, które powodują nie tylko zmiany wizualne, takie jak rozkład, zmiana barwy lecz również wpływają na cechy reologiczne preparatów [2,3]. Jednym z istotnych czynników, które mogą decydować o stabilności podłoży jest metoda ich sporządzania. Od lat tego typu maści wykonuje się w moździerzu, uzyskując produkt, którego jakość w dużej mierze zależy od osoby wykonującej preparat. Wprowadzenie urządzenia o nazwie Unguator daje szansę otrzymywania produktu powtarzalnego, o wysokich walorach jakościowych i estetycznych [4]. Zadano sobie pytanie, czy tą metodą można sporządzić trwały układ typu O/W stosowany na skórę. W niniejszej pracy podjęto próbę odpowiedzi na to pytanie. Wg FP VII podczas sporządzania półstałych preparatów do stosowania na skórę należy podjąć odpowiednie działania zapewniające uzyskanie określonych właściwości reologicznych np. odpowiedniej konsystencji czy lepkości strukturalnej [5]. Za pomocą reologii możemy uzyskać obiektywne i powtarzalne wyniki badań [6,7], dlatego też w pracy w celu określenia trwałości podłoży O/W dokonano oceny cech reologicznych [8]. Materiały i metody Odczynniki - kwas stearynowy-merc, alkohol stearylowy- Merc, alkohol cetylowy-loba Feinchemie, glicerol- -ZChG Dąbrowa Górnicza, wosk biały, Nipagina M-Celo Cesar&Lor. Aparatura - ekstensometr z płytką nakrywkową z włókna węglo- Farmaceutyczny 43

44 wego o niskim ciężarze właściwym, reometr cyfrowy typu płytka stożek DV-III, Brookfield, Unguator Gako Germany. Przygotowanie preparatów Sporządzono 4 podłoża hydrofilowe metodą I ręczną (tradycyjną) i II za pomocą Unguatora, których skład podano w tabeli I. Badanie rozciągliwości przeprowadzono za pomocą ekstensometru w temp.20 C [9,10]. Wyznaczenie parametrów lepkościowych przeprowadzono przy użyciu reometru cyfrowego typu płytka stożek firmy Brookfield w temperaturze 37 C [11]. Ocenę trwałości preparatów przeprowadzono bezpośrednio po sporządzeniu/24h/ oraz po 1 tygodniowym i jednomiesięcznym okresie przechowywania w różnych temperaturach. Przy ocenie stabilności układów zastosowano test wahadłowy [4,6]. Wyniki badań i ich omówienie Uzyskane wyniki badań rozciągliwości w postaci obliczonych pól powierzchni pod krzywymi rozciągliwości przedstawiono w tabeli II. Po 1 miesiącu przechowywania w temperaturze pokojowej tylko w nieznacznym stopniu uległa zmianie rozciągliwość podłoża P3 I i P4 II, a pole powierzchni pod krzywą rozciągliwości dla preparatu P1 II zmniejszyło się. W pozostałych preparatach zaobserwowano rozluźnienie struktury żelowej układu, co objawia się zwiększeniem rozciągliwości. Wśród próbek poddanych testowi wahadłowemu tylko podłoże P3 I i P4 II zachowały swoją stabilną strukturę. Reszta układów uległa upłynnieniu, o czym świadczą wyższe parametry rozciągliwości. Wyjątkiem jest preparat P3 II, w którym struktura żelowa upłynniła się. 44 Farmaceutyczny Nr 3 / 2008 Pomiary lepkościowe umożliwiły wyznaczenie parametrów lepkościowych tj. granicę płynięcia τ 0 (tabela III) i lepkość η (tabela IV). Badane preparaty są cieczami nienewtonowskimi, rozrzedzanymi ścinaniem, lepkoplastycznymi tj. posiadającymi granicę płynięcia τ 0. Do wyliczenia tego parametru posłużono się matematycznym modelem Cassona [12]. Po jednomiesięcznym okresie przechowywania próbek w temperaturze pokojowej nastąpił nieznaczny spadek wartości granicy płynięcia dla podłoża P3 I /wyższe wartości τ 0 (15,0 N/m 2 ) uzyskane po 1 dobie przechowywania preparatu są związane z tym, że czas (24h), po którym przeprowadzono badania jest niewystarczający aby w układzie całkowicie wykształciła się struktura żelowa. Wzrost wartości τ 0 jaki zaobserwowano w badanych podłożach P1 I,P3 II i spadek tego parametru jakim cechują się pozostałe próbki świadczą o niestabilności układów. W preparatach przechowywanych w zmiennych temperaturach zaobserwowano podobne zmiany wartości granicy płynięcia, z wyjątkiem próbki P1 I charakteryzującej się niższą wartością tego parametru. Zmienne temperatury, w których przechowywano podłoża P1 II, P2 I wpłynęły na usztywnienie ich struktury żelowej. Wartości lepkości wyznaczone dla próbek P3 I,P3 II zmieniły się w nieznacznym stopniu. W pozostałych preparatach nastąpiło obniżenie lepkości związane z ich upłynnieniem. Najmniejsze zmiany lepkości w wyniku przechowywania preparatów w temperaturze pokojowej zaobserwowano w badaniach podłoża P3 I. Pozostałe próbki nie należą do układów stabilnych, ponieważ w przypadku preparatu P1 I, P1 II na skutek usztywnienia szkieletu żelowego nastąpił wzrost lepkości. Resztę badanych próbek charakteryzuje zmniejszenie tego parametru. Jak wynika z tabeli IV wszystkie podłoża hydrofilowe wykonane metodą I mają wartości lepkości wyższe w porównaniu z preparatami sporządzonymi za pomocą Unguatora. Wnioski 1. Po jednomiesięcznym przechowywaniu parametry reologiczne dla podłoży sporządzonych za pomocą Unguatora ulegają znacznym zmianom, które wpływają na niestabilność tych układów. 2. Podłoże 3wykonane metodą ręczną charakteryzuje się stabilną strukturą. Przeprowadzone badania wykazały, że wartości lepkości i granicy płynięcia zmieniają się w nieznacznym stopniu. 3. Podłoża hydrofilowe sporządzone za pomocą Unguatora charakteryzują się większą płynnością w porównaniu do wykonanych metodą ręczną, co jest związane z niedostatecznym wykształceniem wewnętrznej struktury preparatu. Piśmiennictwo 1. Fabianowski W: Modyfikatory reologii pochodzenia naturalnego. Wiadomości PKT, 2000, vol.4, nr 3/4, 42-43; 2. Aniołowska M., Leszczyńska-Bakal H., Elsner Z.: Badanie wpływu temperatury na trwałość emulsyjnych podłoży maściowych, Farm.Pol.1966, 22, 649; 3. Krówczyński L., Danek A.: Zarys farmacji klinicznej, PZWL,Warszawa 1982, 88-91; 4. Janikowski A., Gadomska-Nowak M., Bułaś L.: Technologia sporządzania czopków i maści z zastosowaniem Unguatora. Część II. Receptura maści, Farm.Pol.2006, 26 nr 13; 5. Farmakopea Polska VII tom I, Polskie Towarzystwo Farmaceutyczne 2006, 842; 6. Gołucki Z., Pawlak E., Rygiel J., Barański A.: Fizykochemiczna trwałość leków. PZWL, Warszawa 1980, 74; 7. Borys J., Piotrowska I., Sieradzki E.: Ocena właściwości reologicznych i dostępności farmaceutycznej maści z ketoprofenem, Farm.Pol., 2006, 9, ; 8. Pawełczyk E., Hermann T.: Podstawy trwałości leków,p- ZWL, Warszawa 1982, 88-91; 9. Samczewska G., Zgoda M.M. Polish j. Cosmetology, 2000, 1, 49; 10. Janicki S., Fiebig A.: Farmacja Stosowana, PZWL, Warszawa 2003, 310; 11. Fergusson J., Kembłowski Z.: Reologia stosowana płynów. Wydawnictwo Marcus s.c. Łódź Górecki M., Zalewska A.: Farm. Pol. 2000,15,

45 Nr 3 / 2008 Składniki Podłoże1 P1 Podłoże 2 P2 Podłoże 3 P3 Podłoże 4 P4 Kwas stearynowy 7, Alkohol cetylowy 1, Alkohol stearylowy Glicerol Laurylosiarczan sodu Wosk biały ,0 Woda destylowana Tabela I. Skład podłoży hydrofilowych Podłoża Podłoże 1 P1 Podłoże 2 P2 Podłoże 3 P3 Podłoże 4 P4 Metoda I II I II I II I II Próbki przechowywane w temperaturze pokojowej ( C) 24h dni miesiąc Próbki poddane testowi wahadłowemu 7 dni miesiąc Tabela II. Porównanie rozciągliwości podłoży hydrofilowych wykonanych metodą I i II w postaci obliczonych pól powierzchni pod krzywymi rozciągliwości P[j.u.] Podłoża Podłoże 1 Podłoże 2 Podłoże 3 Podłoże 4 Metoda I II I II I II I II Próbki przechowywane w temperaturze pokojowej ( C) 24h 14,9 45,5 45,0 19,1 15,0 2,85 16,41 11,1 7 dni 14,4 27,6 29,8 16,6 8,2 8,54 24,6 7,34 1 miesiąc 24,7 27,1 23,7 11,5 7,43 7,01 5,70 4,12 Próbki poddane testowi wahadłowemu 7 dni 15,0 25,9 13,8 40,1 8, ,0 9,9 1 miesiąc 6,85 19,5 34,9 13,0 8,05 10,9 10,4 8,42 Tabela III. Porównanie wartości granicy płynięcia τ 0 [N/m 2 ] podłoży hydrofilowych Nr podłoża Podłoże 1 Podłoże 2 Podłoże 3 Podłoże 4 Metoda I II I II I II I II Próbki przechowywane w temperaturze pokojowej ( C) 24h dni miesiąc Próbki poddane testowi wahadłowemu 7 dni Tabela IV. Porównanie wartości lepkości [mpas] przy szybkości ścinania D 6,4[s -1 ] Farmaceutyczny 45

46 BADANIE PROFILI ROZPUSZCZANIA FORM TABLETOWANYCH PA- RACETAMOLU SKOMBINOWANEGO Z DIKLOFENAKIEM W ROZTWO- RZE 0,1M KWASU SOLNEGO RESEARCH OF DISSOLUTION PROFILES OF PARACETAMOL TABLETS IN COMBINATION WITH DICLOFENAC IN 0.1 M SOLUTION OF HYDROCHLORIC ACID Profesor, kandydat nauk farmaceutycznych N. Wetiutnewa, kandydat nauk farmaceutycznych N. Parszyna, magister farmaceutyki A. Skybiuk Nacjonalna akademia medyczna kształcenia podyplomowego P. Szupika, wydział chemii farmaceutycznej i farmakognozji Kierownik wydziału profesor, doktor nauk farmaceutycznych N. Wetiutnewa Państwowa inspekcja kontroli jakości środków leczniczych miasta Kijowa Naczelnik inspekcji kandydat nauk farmaceutycznych N. Parszyna Celem naszych badań było przeprowadzenie analizy porównalnej profili wydzielania paracetamolu z tabletek, umieszczających paracetamol i diklofenak w jakości substancji aktywnych. Objektami badań zostali tabletki paracetamolu w kombinacji z diklofenakiem czterech producentów. Warunki przeprowadzania testu: 1l 0,1 M roztwór kwasu solnego; obracający się koszyczek. Przy studiowaniu kinetyki wydzielenia paracetamolu z kombinowanych form lekarskich В,С i D dostrzerzono dość wielki rozrzut ilości paracetamolu, wydzielonego w środowisko rozpuszczania (SR) w każdym konkretnym punkcie. Ilość paracetamolu, wydzielonego w roztwór z próbek preparatów А i В w kontrolnym punkcie (45min), odpowiadała wymaganiom FE; z próbek preparatów С i D - nie odpowiadała wymaganiom FE. Profili rozpuszczania badanych preparatôw paracetamolu próbek С, В i D nie są podobne do profilu rozpuszczania próbki А w badanym środowisku rozpuszczania. A więc, dynamika wydzielenia referentnych kombinowanych form tabletowanych paracetamolu różni się od preparatu, wybranego jako komparator, poza faktem, że badane próbki odpowiadali wymaganiom analitycznej dokumentacji normatywnej w części wskaźników rozpuszczania. Oprócz tego, znaczny rozrzut ilości wydzielanego do środowiska rozpuszczania paracetamolu w przypadku tabletek próbek В, С i D może świadczyć o niedotrzymaniu parametrów procesu technologicznego albo brak certyfikacji GMP. Słowa kluczowe: preparat generyczny, Acetaminophen, Diclofenac, test Rozpuszczanie, profil. 46 Farmaceutyczny Our research was aimed at comparative assessment of profiles of paracetamol release from tabs containing paracetamol and diclofenac as reactants. We chose paracetamol tablets in combination with diclofenac from four manufacturers as our research objects. The test was conducted at the following conditions: 1l 0,1 M solution of hydrochloric acid; rotating basket. Study of kinetics of paracetamol release from combined medicinal forms of the manufacturers B, C and D has shown that there was a considerable variation of valuables of amount of paracetamol that passed into dissolution media (DM) in every specific point. Amount of paracetamol that passed into solution from A and B product samples in a check point (45 minutes) met requirements of the EP; released from C, D product sample failed to comply with requirements of EP. Dissolution profiles of C, B and D samples of paracetamol products are not similar to dissolution profile of sample A in the studied dissolution medium. Thus, the dynamics of paracetamol release from reference combined tableted paracetamol differs from comparator product despite the fact that the dissolution indices of the samples investigated met the requirements of analytical regulations. Moreover, significant variation of valuables of paracetamol released in DM for B, C and D samples may indicate non-observance of technological process parameters or absence of GMP certification. Key words: drugs, generic, Acetaminophen, Diclofenac, profile, test Dissolution.

47 Nr 3 / 2008 Ostatnimi latami sporo uwagi przydziela się generycznym środkom lekarskim. Taka uwaga nie jest czymś spontanicznym. Urzędy wszystkich przemysłowo rozwiniętych krajów stale usiłują zahamować albo chociażby nieco obniżyć tempo wzrostu wydatków na ochronę zdrowia. Jednym z zasobów, skutecznie obniżającym wydatki, jest stosowanie w leczeniu środków generycznych wysokiej jakości. Przy dokładnym odtworzeniu technologii produkowania oraz sprawdzania jakości przy pomocy testów famakologicznych i technologicznych preparat generyczny posiada te same właściwości, co oryginalny, ale ma znacznie mniejszą cenę. Jeżeli jednak nie ma takiego systemu weryfikacyjnego, na rynek farmaceutyczny kraju mogą trafić małoskuteczne albo nawet wręcz szkodliwe środki generyczne, co spowoduje wzrost wydatków na leki zamiast ich obniżenia. Do stycznia roku 2006 do zestawu dokumentów obowjązkowych, przedstawianych przez rejestranta generycznych środków lekarskich (nadal SL) w Ukrainie, nie były włączone dane z bioekwiwalentności. W związku z tą okolicznością większość generycznych SL jest zarejestrowana w Ukrainie na podstawie wyników ograniczonych badań klinicznych[1]. Na rynku ukraińskiej farmaceutyki szeroko przedstawione są tabletowane środki lekarskie, do składni których wchodzą jednocześnie paracetamol i inne niesteroidalne przeciwzapalne substancje. Jedną z takich kombinacji są tabletki paracetamolu z diklofenakiem w kształcie sólu potasu lub sodu. Dla przybliżonej oceny ich odnośnej biodostępności i uprzedzenia występowania na rynku farmaceutycznym podróbek dużą rolę odgrywają badania in vitro według testu Rozpuszczanie dla twardych dozowanych form [2,3,4]. Celem naszych badań było przeprowadzenie analizy porównalnej profili wydzielania paracetamolu z tabletek, umieszczających paracetamol i diklofenak w jakości substancji aktywnych. Objektami badań zostali zarejestrowane w Ukrainie tabletki paracetamolu (500 mg) w kombinacji z diklofenakiem (50 mg) czterech producentów (umownie A, B, C, D). Jako komparator (preparat, z jakim porównują się wszystkie inne) zostały wybrane tabletki producenta A. Takiego wyboru dokonaliśmy na podstawie badań farmakopealnych [5]. Jakość badanych serii tabletek odpowiadała wymaganiom aktualnej w Ukrainie analitycznej dokumentacji normatywnej. Warto zauważyć, że wybrane objekty nieco różnili się pomiędzy sobą składnią substancji pomocniczych i technologią wyprodukowania. Test Rozpuszczanie był przeprowadzony na urządzeniu Pharmatest (Niemcy), model PT-DT7, charakterystyki techniczne i użytkownicze którego odpowiadają wymaganiom Państwowej Farmakopei Ukrainy (PFU) [6] i Farmakopei Europejskiej (FE) [7]. Warunki przeprowadzania testu spełniali wymagania PFU: środowisko rozpuszczania (SR) - 0,1 M roztwór kwasu solnego, objętość SR ml, urządzenie obracający się koszyczek, prędkość obracania 100 ob/min. Próbki pobierano za 10, 15, 25, 30, 35, 45, 50 i 60 minut po poczęciu próby. Objętość próbki wynosiła 5 ml. Po pobraniu próbki SR było uzupełniane czystym roztworem odpowiedniej objętości. Dla filtracji objętości, odebranych ze SR, wykorzysrywano filtr papierowy typu taśma niebieska. Określenie ilości wydzielonego do roztworu paracetamolu zostało dokonane metodą spektrometrii absorpcyjnej w zakresie ultrafioletowym. Pomiaru gęstości optycznej dokonano spektrofotometrem Helios gamma&delta, Unicam instruments w kuwecie z grubością warstwy 10 mm przy długości fali 243 nm. Jako kompensacyjny roztwarzacz użyliśmy odpowiednego roztwarzacza. Zgodnie z klasyfikacją biofarmaceutyczną SL, po raz pierwszy wprowadzoną w roku 1995 przez zarząd FDA dla przemysłowości [8], paracetamol odnosi się do grupy 2 substancji (źle rozpuszczane + dobrze wchłaniane). Środki lekarskie drugiej grupy są klasycznymi objektami badań za pomocą testu Rozpuszczanie, ponieważ właśnie dla nich czynnikiem ograniczającym absorpcję preparatu jest prędkość rozpuszczania substancji aktywnej (SA). Brak bioekwiwalentności w tym przypadku kojarzy się z następującymi czynnikami: różne właściwości chemiczne i fizyczne substancji czynnych (SC), różne substancje pomocnicze, technologia wyprodukowania, warunki przechowywania i typ opakowania [9]. Przy studiowaniu kinetyki wydzielenia paracetamolu z kombinowanych form lekarskich В,С i D dostrzerzono dość wielki rozrzut ilości paracetamolu, wydzielonego w SR w każdym konkretnym punkcie. Średnia dewiacja (RSD) dla każdego czasowego punktu wynosi: 6,28%- 27,48% (producent В), 9,5%-16,74% (producent С) i 1,42%-16,35% (producent D); ponadto, znaczenie RSD powyżej 10% odznacza się więcej niż w jednym punkcie poboru. Skutkiem tego nie są wykonane wymagania Wytycznej :2005 [4] co do znaczenia RSD 10% dla wyników we wszystkich punktach poboru oprócz pierwszego. W przypadku próbki tabletek producenta А średnia dewiacja ilości wydzielanego w roztwór paracetamolu dla każdego punktu czasowego jest znacznie niższa i wynosi 1,37%- 4,08%, co odpowiada wymaganiom Wytycznej :2005. Na Rysunku 1 przedstawione są profili wydzielenia paracetamolu z tabletowanych form paracetamolu w kombi- Rysunok 1. Profili wzdzielenia paracetamolu z z tabletek, zawierających kombinację paracetamol (500mg) + diklofenak (50mg) Farmaceutyczny 47

48 Producent Znaczenie współczynnika podobieństwa (f 2 ) Podobieństwo B 36,72 nie C 31,43 nie D 29,35 nie Nr 3 / 2008 Tabele 1. Współczynnik podobieństwa profili rozpuszczania kombinowanych form tabletowanych paracetamolu (producent В, С i D) nacji z diklofenakiem w środowisku roztworu 0,1 M kwasu solnego. Ilość paracetamolu, wydzielonego w roztwór z próbek preparatów А i В w kontrolnym punkcie (45min), odpowiadała wymaganiom PFU i FE. Ilość paracetamolu, wydzielonego w roztwór z próbek preparatów С i D za 45 minut, nie odpowiadała wymaganiom PFU i FE. Zestawienie otrzymanych profili rozpuszczania zostało przeprowadzone za pomocą współczynnika podobieństwa, metoda otrzymania którego w jakości kryterium oceniania podobieństwa profili rozpuszczania in vitro została włączona do kerownictw [4,8]. Współczynnik podobieństwa oblicza się za pomocą formuły[4]: f 2 =50 * log {[ 1+1\n R j T j 2 ] -0,5 *100}, gdzie n ilość odcinków czasu R j i T j zawartość procentowa SL, wydzielonego do środowiska rozpuszczania, w każdym odcinku czasu j. Znaczenie współczynnika podobieństwa mieści się w zakresie od 0 do 100. Im większa różnica pomiędzy profilami rozpuszczania, tym bliżej zera jest znaczenie owego współczynnika. Powszechnie uważano, że profile rozpuszczania są podobne, jeżeli współczynnik podobieństwa wynosi od 50 do 100. Wyniki porównania profili rozpuszczania badanych preparatów z komparatorem przy pomocy współczynnika podobieństwa są spisane w Tabeli 1. Obliczone dane wskazują, że profili rozpuszczania badanych preparatów paracetamolu próbek С, В i D nie są podobne do profilu rozpuszczania próbki А w badanym środowisku rozpuszczania. A więc, dynamika wydzielenia referentnych kombinowanych form tabletowanych paracetamolu różni się od preparatu, wybranego jako komparator, poza faktem, że badane próbki odpowiadały wymaganiom analitycznej dokumentacji normatywnej w części wskaźników rozpuszczania. Oprócz tego, znaczny rozrzut ilości wydzielanego do środowiska rozpuszczania paracetamolu w przypadku tabletek próbek В, С i D może świadczyć o niedotrzymaniu parametrów procesu technologicznego albo brak certyfikacji GMP. 1. Наказ МОЗ України 220 від р. 2. Викулова С. Биоэквивалентность и дженерики созданы друг для друга // Ремедиум С Лутцева А.И., Титова А.В., Боковикова Т.Н. Проблемы оценки качества лекарственных средств по показателю «Растворение» на стадии государственного контроля лекарственных средств // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств С Настанова Настанови з клінічних досліджень. Лікарські засоби. Дослідження біодоступності та біоеквівалентності. Київ: МОЗ України, с. 5. Гуревич К.Г., Мешковский А.П. Определение биоэквивалентности: сравнительный анализ росийских и международных требований // Фарматека С Державна Фармакопея України. 1-е вид. Харків: РІРЕГ, с. 7. European Pharmacopoeia. 4th ed. Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines, c. 8. Guidance for industry. Dissolution testing of immediate release solid oral dosage forms. Office of training and communications. Division of communications management the drug information branch, HFD-210, 5600 Fishers Lane Rockville, MD Guidelines for Good Clinical Practice for Trials on Pharmaceutical Products // WHO Technical Report Series 850. World Health Afion, Geneva, Farmaceutyczny

49 Azotany III i V w wybranych preparatach ziołowych Nitrates and nitrites in the selected herbal preparations Dr n. farm. Barbara Figura, Prof. dr hab. Janusz Pluta Katedra i Zakład Technologii Postaci Leku Akademii Medycznej we Wrocławiu Kierownik: prof. dr hab. Janusz Pluta Azotany i azotyny są bardzo niebezpiecznymi związkami, które poprzez kumulację w organizmie mogą powodować methemoglobinemię, awitaminozę, anemię. Ponadto wykazują mutagenność, embriotoksyczność i teratogenność oraz odpowiadają za powstawanie rakotwórczych nitrozoamin. Celem pracy było określenie poziomu skażenia azotanami III i V wybranych preparatów ziołowych w postaci stałej tabletek, kapsułek, pastylek do ssania i cukierków zawierających sproszkowane zioła lub wyciągi z surowców zielarskich. Oznaczenia przeprowadzono zgodnie z metodyką opisaną w Polskiej Normie PN-92/A W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że azotany V były obecne we wszystkich preparatach badanych serii, a najbardziej zanieczyszczone okazały się tabletki. Najniższy poziom zanieczyszczeń związkami azotu zanotowano w pastylkach do ssania i cukierkach ziołowych. Przebadane preparaty stałe nie stanowią bezpośredniego zagrożenia zdrowotnego dla pacjenta, ale są dodatkowym, ważnym źródłem pobrania związków azotowych. Nitrates and nitrites are extremely dangerous compounds, which, when accumulated in the organism may cause methemoglobinaemia, avitaminosis and anemia. Moreover, they reveal mutagenic, embryotoxic and teratogenic properties as well as they are responsible for production of carcinogenic nitrozoamines. The aim of study was to determine the level of nitrates and nitrites in selected tablets, capsules, lozenges and pastilles (with powdered herbs or herbal s extract). The contents of nitrates and nitrites were assessed according to method presented in the Polish Norm PN-92/A The results are proved the nitrates contingency in all of the tested samples. The highest contamination was found in the tablets and the lowest was detected in the lozenges and herbal pastilles. Tested samples are no dangerous for live and health of patient but are the additional and very important source of nitrates and nitrites. Keywords: nitrate, nitrite, contaminations, plant origin, safety of phytotherapy Słowa kluczowe: azotany, azotyny, zawartość zanieczyszczeń, preparaty ziołowe, bezpieczeństwo fitoterapii Azotany III i V to substancje szeroko rozpowszechnione w środowisku. Są obecne w produktach spożywczych, wodzie do picia oraz w powietrzu. Mechanizm działania toksycznego azotanów V wynika z redukcji ich do azotanów III, które są wielokrotnie bardziej toksyczne. Redukcja ta następuje w przewodzie pokarmowym pod wpływem enzymów wytwarzanych przez bakterie jelitowe. (1) Toksyczne działanie tej grupy związków polega na możliwości wywoływania methemoglobinemii, niedokrwistości, unieczynniania witamin z grupy B oraz witaminy A, upośledzenia wykorzystania białek i tłuszczów, zahamowania przyrostu masy ciała, zaburzenia funkcji tarczycy. Ponadto azotany III i V są prekursorami nitrozoamin, które wykazują działanie rakotwórcze, mutagenne i embriotoksyczne. (2-4) Ponieważ azotany i azotyny dostają się do organizmu zarówno w wyniku procesów fizjologicznych, jak również są dostarczane z zewnątrz, organizm ludzki wykształcił kilka mechanizmów obronnych. Antyoksydanty, jak np. witaminy C, E lub beta-karoten, a także selen, wapń, kobalt i cynk działają ochronnie na organizm przez reagowanie z azotanami III i V, uniemożliwiając powstawanie nitrozwiązków. W rzeczywistości dzienne dawki nitrozwiązków dostarczane do organizmu są na ogół niskie i system obronny organizmu potrafi je zneutralizować. (3,5) Natomiast w przypadku kiedy pojawia się nadmiar związków azotu nie ma możliwości by je unieczynnić. Z tego względu konieczne jest kontrolowanie zawartości azotanów III i V w różnych produktach oraz przestrzeganie dopuszczalnych norm dziennego pobrania. Według zaleceń Komitetu Ekspertów FAO/WHO ds. dodatków do żywności, tolerowane dzienne pobranie ADI przez człowieka dorosłego wynosi 5 mg NaNO 3 /kg masy ciała i 0,2 mg NaNO 2 /kg masy ciała. (6) Należy jednak pa- Farmaceutyczny 49

50 miętać, że istnieją grupy pacjentów niemowlęta, dzieci i osoby starsze które są w sposób szczególny wrażliwe na wystąpienie działań niepożądanych pod wpływem nawet dopuszczalnych dawek azotanów. Problem jest tym bardziej skomplikowany, że brak jest norm podających bezpieczną zawartość azotanów III i V w ziołach leczniczych i innych preparatach ziołowych. Odnośnikiem może być jedynie rozporządzenie Ministerstwa Zdrowia z roku 2003, w którym podano maksymalne poziomy zanieczyszczeń azotanami III i V w wybranych produktach spożywczych. (7) Celem pracy było określenie poziomu skażenia azotanami III i V wybranych preparatów ziołowych w postaci stałej tabletek, kapsułek, pastylek do ssania i cukierków zawierających sproszkowane zioła lub wyciągi z surowców zielarskich. Badaniom poddano 26 preparatów w postaci stałej. Wśród nich znajdowało się 13 rodzajów tabletek, 9 rodzajów kapsułek, dwa rodzaje pastylek do ssania i dwa rodzaje cukierków ziołowych. Wszystkie preparaty zostały zakupione we wrocławskich aptekach. Oznaczenie azotanów III i V wykonano zgodnie z zaleceniami Polskiej Normy (8,9), wykorzystując do prób różną ilość tabletek lub kapsułek, w zależności od spodziewanej zawartości. Zawartość tę wyliczano na podstawie odczytu absorbancji przy pomocy spektrofotometru Cecil CE 5501, przy długości fali 538 nm wobec próby odczynnikowej. Zawartość azotanów V oznaczano po ich uprzedniej redukcji kadmem do azotanów III. Wyniki podane w tabelach I III są średnią z co najmniej trzech równolegle prowadzonych prób. Z przeprowadzonych badań wynika, że azotany V były obecne we wszystkich preparatach, a w wielu z nich wykryto również azotany III. W tabeli I przedstawiono wyniki badań zawartości zawiązków azotowych w tabletkach. Spośród trzynastu rodzajów tabletek poddanych analizie, obecność azotanów III stwierdzono w siedmiu, przy czym w trzech były to ilości znaczne w tabletkach Echinapur 11,60 mg/kg, Gingko intensiv 9,64 mg/kg oraz Echinacea-ratiopharm 7,75 mg/kg. Niemniej jednak biorąc pod uwagę dawkowanie poszczególnych preparatów w postaci tabletek, należy stwierdzić, że do organizmu chorego wraz z lekiem trafi nieznaczna ilość azotanów III, rzędu dziesiętnych części miligrama. Azotany V wykryto we wszystkich analizowanych tabletkach, a ich zawartość wahała się w szerokich granicach, od śladowych ilości w Hyperherba i Nervendragees, poprzez 380 mg NaNO 3 /kg w Immunalu forte, 247 mg/kg w Lymphozilu, aż po 570 mg/kg w tabletkach Echinapur. Echinapur to preparat zawierający koncentrat z jeżówki, który stosuje się w celu podniesienia odporności organizmu. Uwzględniając dawkowanie dla dzieci 1 tabletka 3 razy dziennie wprowadzamy do organizmu chorego ok. 0,6 mg jonu azotanowego (w przeliczeniu na NaNO 3 ). Dla dziecka trzyletniego (o masie ciała 15 kg) taka ilość oznacza 20% ADI (0,2 mg/kg m.c.). Nie jest to mało, zważywszy, że na ADI składają się jony azotanowe przyjęte wraz z pożywieniem i wodą, które stanowią główne źródła podaży. W tabeli II przestawiono wyniki oznaczeń azotanów III i V w kapsułkach. Azotany III były obecne 50 Farmaceutyczny Nr 3 / 2008 w sześciu rodzajach kapsułek spośród dziewięciu badanych, w ilościach od śladowych w badanej serii Nervomixu i Urinalu, do 10 mg/kg w kapsułkach 50 Plus-simplex. Azotany V oznaczono we wszystkich badanych kapsułkach, przy czym najwyższy poziom 31 mg/kg stwierdzono w badanej serii Avioplantu oraz w kapsułkach: 50 Plus-simplex i Nervomix po 27 mg/kg. Nie stanowi to jednak problemu toksykologicznego uwzględniwszy dawkowanie obu preparatów. Za całkowicie bezpieczne należy także uznać przebadane pastylki do ssania i ich odmianę cukierki lecznicze, gdyż poziom azotanów III i V w tych preparatach był poniżej 3 mg/kg w przeliczeniu na NaNO 3 (Tabela III). 1. Azotany V wykryto we wszystkich preparatach badanych serii. 2. Spośród badanych postaci najbardziej zanieczyszczonymi przez związki azotu okazały się tabletki. 3. Najniższy poziom zanieczyszczeń związkami azotu zanotowano w pastylkach do ssania i cukierkach ziołowych. 4. Przebadane preparaty stałe nie stanowią bezpośredniego zagrożenia zdrowotnego dla pacjenta, ale są dodatkowym, ważnym źródłem pobrania związków azotowych. Piśmiennictwo 1. Traczyk I.: Azotany i azotyny występowanie i wpływ na organizm człowieka. Żywność, żywienie, prawo a zdrowie, 2000, 1, Świątkowska A., Murzyński R.: Chorobotwórcze działanie azotanów i azotynów na organizm małego dziecka. Ped. Pol., 1983, 58, 7, Karłowski K., Bojewski J.: N-nitrozoaminy, azotyny i azotany w środkach spożywczych przeznaczonych dla niemowląt i dzieci. Roczn. PZH, 1986, 37, Sharat D. Gangolli, P. von den Brandt, Victor J. Feron, Ch. Janzowsky, Jan H. Koeman, Gerrit J. and other: Nitrate, nitrite and N-nitrosocompounds. European Journal of Pharmacology, Enviromental Toxicology and Pharmacology Section 292, 1994, Ducha B., Hady S.: Trzy przypadki methemoglobinemii e przebiegu zatrucia azotynami. Roczn. PZH, 1992, 43, Gertig H.: Żywność a zdrowie., PZWL, Warszawa, Dziennik Ustaw Rozporządzenie MZiOS, Warszawa, 2003, nr 37, poz Polska Norma PN 92/A-75112: Owoce, warzywa i ich przetwory. Oznaczanie zawartości azotanów i azotynów. Polski Komitet Normalizacji, Miar i Jakości 9. Azotany i azotyny Materiały konferencji Surowce uzupełniające i materiały pomocnicze stosowane w produkcji żywności. Wrocław, 1999, Akademia Ekonomiczna

51 Nr 3 / 2008 azotany III azotany V Nazwa preparatu Numer serii 000 NO 2 NaNO 2 NO 3 NaNO 3 Gingko intensiv P01 6,43±0,21 9,64±0,31 8,25±0,89 11,31±0,73 Echinapur ,73±0,041 11,60±0,21 416,57±1,25 570,70±2,09 Immunal forte E ,02±2,91 380,89±3,33 Lymphozil ,43±9,04 247,18±2,98 Echinacea - Ratiopharm ,17±0,11 7,75±0,22 106,72±0, ,20±0,72 Esberitox N ,82±0,19 131,28±1,21 Tabletki uspokajające / ,68±0,99 40,66±1,36 Rzewex ,68±0,23 24,22±0,22 Syberian ,81±1,89 23,03±1,28 Tabletki na niestrawność / ,72±0, ,21±1,47 Valerin 06AF ,58±0,73 9,01±0,99 Nervendragees D ,13±0,24 2,92±0,27 Hyperherba / ,79±0,33 2,45±0,29 + ilości śladowe Tabela I. Zawartość azotanów III i V w tabletkach (mg/kg) Nazwa preparatu azotany III azotany V Numer 00 serii NO 2 NaNO 2 NO 3 NaNO 3 Avioplant ,63±0,11 2,44±0,21 22,91±1,54 31,39±1,45 Nervomix ,24±1,50 27,73±1,44 Valused ,28±0,10 3,42±0,21 8,20±0, ,24±1,39 Kora dębu 01AF ,10±0,65 9,73±1,63 Skrzyp z witaminami H ,00±0,07 6,0±0,12 8,41±1,07 11,53±1,47 50 Plus-simplex 01AF0206 6,69±0, ,04±0,94 19,89±0, ,26±1,01 Urinal MFG ,63±1,20 13,20±1,55 Deprim forte G Persen forte G ilości śladowe Tabela II. Zawartość azotanów III i V w kapsułkach (mg/kg) azotany III azotany V Rodzaj preparatu Nazwa preparatu Numer Serii NO 2 NaNO 2 NO 3 NaNO 3 Lokomotiv ,50±0,03 0 0,68±0,07 Pastylki do ssania Regulax 42019A + + 1,10±0,22 1,50±0,21 Cukierki + ilości śladowe Cukierki pokrzywowe Cukierki prawoślazowo-tymiankowe Tabela III. Zawartość azotanów III i V w pastylkach i cukierkach (mg/kg) ,41±0,25 3,30±0,36 03AF ,75±0,63 2,40±0,56 Farmaceutyczny 51

52 Analiza pooperacyjnego oznaczania antygenu karcinoembrionalnego CEA u chorych na raka jelita grubego Analysis of postoperative determination of CEA carcinoembryonal antigen in patients with colorectal carcinoma Prof. dr hab. n. med. Ewa Szaflarska-Stojko, dr n. med. Irena Wróblewska-Adamek, mgr Magdalena Wyszyńska, dr n. med. Agata Kabała-Dzik, dr hab. n. med. Rafał Suwiński, mgr Adrian Kurkowski Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Ewa Szaflarska-Stojko Katedra i Zakład Patologii Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej SUM Abstrakt Celem pracy było analiza oznaczania markera nowotworowego CEA w pooperacyjnym monitorowaniu chorych na raka jelita grubego, ocena zależności pomiędzy stężeniem markera CEA w surowicy krwi a liczbą i lokalizacją przerzutów oraz zastosowanym leczeniem. Materiał i metody badań: Przedmiotem badań były dane z kart 46 pacjentów operowanych z powodu raka jelita grubego, prowadzonych w Poradni Onkologicznej w Szpitalu Powiatowym w Zawierciu w latach Wyniki i wnioski: Po przeanalizowaniu danych stwierdzono znaczną rozbieżność między zaleceniami, dotyczącymi oznaczeń stężenia markera CEA u monitorowanych pacjentów a praktyką dotyczącą jego oznaczania. Podane rozbieżności podyktowane są stanem klinicznym pacjentów oraz nie zgłaszaniem się chorych na wizyty kontrolne. Nie stwierdzono korelacji między poziomem stężenia markera CEA, a rodzajem narządu, do którego nastąpił przerzut, jak również ilością przerzutów. Nie stwierdzono także korelacji między zastosowanym leczeniem w postaci cykli chemioterapii, a poziomem stężenia markera. Słowa kluczowe: rak jelita grubego, antygen karcinoembrionalny, czynnik rokowniczy. Abstract The aim of the study was analysis of neoplastic CEA marker determination in postoperative monitoring of patients with colorectal carcinoma, evaluation of dependence degree the marker s concentration in serum, number and localization of metastasis and applies therapy. Material and methods: The study was based on the records of patients from oncological outpatient clinic in the district hospital in Zawiercie who underwent operations because of colorectal carcinoma, in the years Results and conclusions: Following the data analysis, a considerable discrepancy was found between recommendations concerning determination of CEA marker concentration in monitored patients and determination of this marker in practice. The discrepancies mentioned above, result from patients clinical condition and failing to report for check-up visits. there was no correlation found between CEA marker concentration level and the type of an organ to which carcinoma metastasized and the number of metastases. There was no correlation either, between chemotherapy treatment and marker s concentration level. Key words: colorectal carcinoma, carcinoembryonal antigen, prognostic factor. Wstęp Rak jelita grubego zajmuje drugie miejsce (po raku płuc u mężczyzn i sutka u kobiet) pod względem zachorowalności jak i śmiertelności na nowotwory złośliwe zarówno u kobiet jak i u mężczyzn. Dotyczy najczęściej osób w piątej i szóstej dekadzie życia, należy jednak zwrócić uwagę na fakt wzrastającej liczby przypadków tego nowotworu 52 Farmaceutyczny u ludzi młodych [1,2,3,4]. Współczynnik śmiertelności w odniesieniu do raka jelita grubego jest w Polsce znacznie wyższy niż w USA czy Europie Zachodniej, z powodu dużej wykrywalności choroby w wysokim stopniu zaawansowania, co wyraźnie obniża odsetek pięcioletniego przeżycia chorych do 21-29% [1,3,4]. W większości przypadków podłożem do powstawania raka jelita grubego są łagodne gruczolaki, które na drodze

53 Nr 3 / 2008 mutacji genetycznej mogą przekształcić się w raka. Najczęstszą lokalizacją jest odbytnica (45%) oraz esica (30%). U 3-5% rozpoznaje się guzy mnogie. Biorąc pod uwagę klasyfikację patomorfologiczną ok. 95% przypadków raka jelita grubego i odbytnicy to raki gruczołowe, a pozostałe 5% to raki płaskonabłonkowe, mieszane gruczołowo-płaskonabłonkowe, raki niezróżnicowane i niesklasyfikowane. Raki odbytu to z reguły raki płaskonabłonkowe [1,4,5,6]. Biorąc pod uwagę fakt późnego wykrywania zmian nowotworowych w obrębie jelita grubego, znaczenie diagnostyki i określenie grup ryzyka jest bezdyskusyjne. Wśród czynników zwiększających ryzyko wystąpienia raka jelita grubego wyróżnić można czynniki środowiskowe (dieta bogatotłuszczowa, wysokokaloryczna, dym tytoniowy), czynniki wewnętrzne (nowotwory łagodne gruczolaki, zespół Crohna, wrzodziejące zapalenie jelita grubego) oraz czynniki genetyczne (polipowatość rodzinna, wrodzony niepolipowaty rak jelita grubego) [1]. W ramach diagnostyki wykonuje się morfologię krwi, test na obecność krwi utajonej w kale, badanie per rectum, kolonoskopię, ultrasonografię i/lub tomografię komputerową, endoskopię, biopsję aspiracyjną cienkoigłową, rezonans magnetyczny, natomiast najpowszechniejszym badaniem stosowanym w diagnostyce i monitorowaniu chorych po zabiegu operacyjnym jest oznaczanie markerów nowotworowych [2,5,6,7]. Markery raka jelita grubego powinny być oznaczane co najmniej jednokrotnie przed rozpoczęciem leczenia. Po radykalnym leczeniu należy je monitorować przez pierwsze 3 lata co 2-3 miesiące, a po tym okresie co 6 miesięcy. W przypadku stwierdzenia wzrostu miana danego markera, monitorowanie powinno być wykonywane przynajmniej co 2-4 tygodnie. W trakcie chemioterapii oznaczenia powinno dokonywać się przed każdym kursem leczenia i przy zmianie metod leczenia. Należy pamiętać, iż prawidłowe stężenie danego markera nie wyklucza obecności nowotworu oraz, że nawet nieznaczne jego podwyższenie występuje w chorobach nienowotworowych. Spośród wielu markerów raka jelita grubego najlepiej poznanym i szeroko stosowanym w praktyce klinicznej jest antygen karcinoembrionalny CEA [8,9,10]. Po raz pierwszy został on wyizolowany z ekstraktu tkanki nowotworu jelita grubego, ale jest wytwarzany również przez inne nowotwory. Wzrost stężenia CEA występuje również w przebiegu nowotworów trzustki, żołądka, sutka, tarczycy, narządu rodnego, a ponadto można go wykryć w prawidłowych i zmienionych zapalnie tkankach [1]. Lekko podwyższony poziom występuje w ciąży, marskości wątroby, stanach zapalnych wątroby, płuc, jelit [4,9]. Do dnia dzisiejszego jest to jeden z najbardziej wartościowych markerów, a jego stężenie w surowicy ma ogromne znaczenie w rokowaniu co do przebiegu choroby. Rutynowe śledzenie poziomu CEA przez lekarzy stosowane jest w celu wczesnego wykrycia nawrotu choroby [8,11]. Czułość diagnostyczna CEA jest zależna od stopnia zaawansowania nowotworu, a cykliczne oznaczanie CEA monitoruje wczesną, kliniczną odpowiedź na terapię, co pozwala wykryć nawroty i przerzuty po remisji choroby jak również może mieć znaczenie prognostyczne. Zdolność wydzielania antygenu karcinoembrionalnego przez komórki nowotworowe wykorzystuje się także w immunoscyntygrafii, która pozwala na precyzyjne przedoperacyjne zlokalizowanie nowotworu [4,11,12]. Uważa się, że ocena CEA w surowicy krwi nie ma zastosowania w badaniach przesiewowych, co spowodowane jest niską czułością testu w raku jelita grubego oraz znacznym wpływem dymu tytoniowego na jego stężenie [4,9,13,14]. Materiał i metody Analizie poddano karty 46 pacjentów prowadzonych w Poradni Onkologicznej w Szpitalu Powiatowym w Zawierciu w latach Wszyscy pacjenci byli po resekcji raka jelita grubego w różnych oddziałach chirurgicznych na terenie Polski. Dokonując analizy danych uwzględniono następujące parametry: liczbę pacjentów, u których wykonano oznaczenie antygenu karcinoembrionalnego CEA, ilość oznaczeń antygenu CEA u monitorowanych pacjentów, ilość oznaczeń markera CEA u pacjentów z klinicznym rozpoznaniem przerzutów. Podjęto także próbę oceny zależności między stężeniem markera CEA, a stanem klinicznym pacjenta (liczba i lokalizacja przerzutów) oraz zastosowanym leczeniem. Wyniki Spośród grupy 46 analizowanych pacjentów antygen karcinoembrionalny CEA został oznaczony u 34 osób (ryc.1). Brak oznaczenia markera u pozostałych 12 wynikał z ich złego stanu klinicznego oraz nie zgłaszania się na wizyty kontrolne. Spośród 34 osób, u których oznaczano antygen karcinoembrionalny u 14 osób oznaczano go tylko 1 raz, 12 pacjentów miało oznaczany CEA 2 razy, 5 osób 3 razy, 1 osoba miała oznaczany CEA 4 razy, jedna osoba 7 razy i jedna 11 razy (ryc.2). Jednorazowe oznaczenia CEA wynikały ze stanu klinicznego pacjenta (brak oznak wznowy lub przerzutów). Część pacjentów ze względu na zły stan kliniczny była kierowana do ośrodka opieki paliatywnej. Wielokrotne oznaczenia antygenu karcinoembrionalnego wykonywane Rycina 1. Liczba pacjentów, u których wykonano oznaczenia markera CEA Drawing 1. Number of patients with determined CEA marker Farmaceutyczny 53

54 Rycina 2. Liczba oznaczeń CEA u monitorowanych pacjentów Drawing 2. Number of CEA determinations in monitored patients Nr 3 / 2008 Analizując dane podjęto także próbę oceny zależności między stężeniem markera CEA, a stanem klinicznym pacjenta. Zaobserwowano wyraźny wzrost stężenia tego markera u wszystkich pacjentów, u których potwierdzono klinicznie wznowę procesu nowotworowego lub przerzuty do jednego lub wielu narządów. 13 osób stanowiło grupę pacjentów ze stwierdzonymi przerzutami do jednego narządu: wątroby (9 osób) i płuca (2 osoby). U 2 osób rozpoznano przerzuty do otrzewnej. Grupa pacjentów, u których stwierdzono przerzuty do więcej niż jednego narządu (wątroba węzły chłonne, wątroba płuca) liczyła 3 osoby. Nie zauważono korelacji pomiędzy poziomem stężenia analizowanego markera, a rodzajem narządu, do którego nastąpił przerzut oraz ilością przerzutów. Nie wykazano również korelacji pomiędzy poziomem markera CEA, a zastosowanym leczeniem. Obserwowano pacjentów, u których po kolejnych cyklach chemioterapii następował wyraźny spadek poziomu CEA, aż do wartości prawidłowych jak również pacjentów, u których pomimo stosowanego leczenia utrzymywał się nadal wysoki poziom CEA. Istniała również grupa pacjentów, u których w trakcie stosowania kolejnych cykli obserwowano okresowy spadek poziomu antygenu, po czym następował wyraźny wzrost stężenia CEA bez zmian w stanie klinicznym. Rycina 3. Liczba oznaczeń antygenu CEA u pacjentów z klinicznym rozpoznaniem przerzutów Drawing 3. Number of CEA antigen determinations in patients with clinical diagnosis of metastases były u pacjentów, u których czas po wykonanym zabiegu operacyjnym był krótki lub antygen oznaczany był po kolejnych stosowanych cyklach chemioterapii. Część pacjentów, u których nie wykonano oznaczeń CEA nie zgłosiła się na kolejną wizytę lub wizyta nie nastąpiła jeszcze w okresie analizowania karty danego pacjenta. Analizie poddano także liczbę oznaczeń antygenu CEA u pacjentów z rozpoznanymi przerzutami. Spośród 46 monitorowanych pacjentów u 19 osób stwierdzono przerzuty. 8 osób miało oznaczany CEA jednokrotnie, 4 pacjentów dwukrotnie, 2 pacjentów trzykrotnie, 1 pacjent siedmiokrotnie i jeden pacjent jedenastokrotnie. Pozostali z tej grupy nie mieli oznaczanego markera CEA pomimo stwierdzenia przerzutów przy pomocy innych badań diagnostycznych (ryc.3). Tak różna liczba oznaczeń markera CEA u poszczególnych pacjentów wynikała z różnych przyczyn: przekazanie pacjenta do ośrodka opieki paliatywnej, skierowanie do leczenia wspomaganego chemioterapii lub termin następnej wizyty lekarskiej był późniejszy niż czas analizowania danych. Dyskusja Głównym celem monitorowania pacjentów jest wykrycie wznowy procesu nowotworowego i przerzutów we wczesnym stadium zaawansowania [15,16]. Udowodniono, że u połowy chorych poddanych operacji z powodu raka jelita grubego dochodzi do nawrotów, przy czym często są to wznowy miejscowe. Największy procent stanowią wznowy powstające do 3 lat od wycięcia zmiany pierwotnej, dlatego monitorowanie powinno być najbardziej intensywne w tym krytycznym okresie po operacji [2]. Ocena CEA może być istotna przy obserwacji chorych operowanych radykalnie, co pozwala na wykrycie wznowy lub przerzutów około 5 miesięcy wcześniej niż rutynowe badanie kliniczne. Dotyczy to zwłaszcza przerzutów do wątroby [13]. W Klinice Gastroenterologii Instytutu Chirurgii AM w Warszawie prowadzi się planową obserwację wszystkich chorych po operacji raka jelita grubego według schematu, w przebiegu którego przed operacją wykonuje się badania biochemiczne (morfologia, OB, białko z frakcjami, fosfataza zasadowa, transaminazy, CRP, pierwiastki śladowe), wlew kontrastowy, kolonoskopię, CEA, Rtg klatki piersiowej oraz rektoskopię. Po 2-4 tygodniach po operacji powtarza się oznaczenia biochemiczne oraz CEA, następnie, co 3 miesiące przez 2 lata, a później raz w roku. Po upływie 12 miesięcy wykonuje się również wlew kontrastowy, kolonoskopię lub rektoskopię oraz rtg klatki piersiowej. Bada- 54 Farmaceutyczny

55 Nr 3 / 2008 nia wykonuje się powtórnie, gdy występuje wzrost stężenia CEA w surowicy [2,13]. Wykazano, że największą wartość diagnostyczną zaraz obok antygenu karcinoembrionalnego ma antygen CA Według Młynarskiego i wsp. [17] pierwszym etapem pooperacyjnego monitorowania chorych operowanych z powodu raka jelita grubego powinno być łączne oznaczanie CEA, CA 19-9 i TPS. Jeśli u chorych stwierdzono podwyższone stężenie CEA w surowicy krwi to znaczy, że antygen ten jest wystarczającym markerem masy guza do monitorowania przebiegu choroby [17]. Z dostępnego piśmiennictwa wynika, że najlepsze jest łączenie oznaczania markerów nowotworowych w celu bardziej precyzyjnej oceny stopnia zaawansowania choroby, jak również możliwości wykrycia przerzutów lub wznowy. Według Młynarskiego i wsp. [17] nie u wszystkich chorych ze stwierdzoną wznową obserwuje się podwyższenie stężenia CEA w surowicy krwi, ponieważ około 11% osób należy do tzw. nieproducentów CEA. Stworzyło to problem w monitorowaniu tych pacjentów. Spośród markerów nowotworowych obok CEA najbardziej przydatny w monitorowaniu okazał się marker CA Z kolei według Duszy i wsp. [7] dołączenie do oznaczeń CEA antygenu CA 19-9 zwiększyło czułość oznaczeń z 71% do 83,6%. Dalsze obserwacje potwierdziły opinię o niekorzystnym rokowniczo podwyższeniu CA 19-9 bez jednoczesnego wzrostu CEA. Analizując wyniki chorych prowadzonych w Poradni Onkologicznej Szpitala Powiatowego w Zawierciu stwierdzono, że duża grupa pacjentów nie miała oznaczanego antygenu karcinoembrionalnego CEA, zarówno przed jak i po operacji. Przyczyną braku oznaczania antygenu przed operacją był często ciężki stan kliniczny chorych. Pacjenci trafiali do szpitala z objawami niedrożności jelit i wymagali natychmiastowej interwencji chirurgicznej. W czasie zabiegu rozpoznawano u nich raka jelita grubego. Szczególnie dużą wartość diagnostyczną ma oznaczenie markera nowotworowego CEA w przebiegu pooperacyjnym chorych po resekcji jelita grubego z powodu raka. Rozpoznanie nawrotu raka jelita grubego na podstawie wzrastającego poziomu antygenu CEA przewyższa czułość innych metod diagnostycznych, a regularne pooperacyjne monitorowanie poziomu CEA w odstępach trzymiesięcznych pozwala wcześnie wykrywać ewentualne nawroty raka. Brak oznaczeń antygenu CEA u monitorowanych po zabiegu pacjentów wynikała ze stanu klinicznego chorych lub z faktu zaniedbania zgłaszania się na wizyty kontrolne [18]. Autorzy piśmiennictwa zalecają oznaczanie antygenu karcinoembrionalnego CEA nie tylko przed operacją. Tylko niektóre ośrodki w Polsce wykonują oznaczenie poziomu CEA podczas zabiegu operacyjnego. Wykazano, że śródoperacyjne oznaczanie CEA i innych markerów jest mniej znaczące od metod klasycznych. Lorenc i wsp. [19] wykazali korelację pomiędzy stanem węzłów chłonnych wartowniczych, stężeniem markerów nowotworowych, a wynikiem badania histopatologicznego węzłów chłonnych okołojelitowych. Najwyższą skuteczność miało badanie węzłów wartowniczych ok. 81,0%, a wyraźnie niższą antygen CEA, bo ok. 59,3% i TPS 48,1%. W dostępnym piśmiennictwie dotyczącym poziomu stężenia markera CEA u monitorowanych chorych nie znaleziono informacji o zależności pomiędzy wartością jego stężenia a rodzajem narządu, do którego nastąpił przerzut czy też ilością przerzutów. W analizowanym materiale stwierdzono brak takiej zależności. Podobny brak korelacji występuje pomiędzy zastosowanym leczeniem chemioterapeutycznym a poziomem stężenia oznaczanego markera. Również na ten temat nie znaleziono danych w piśmiennictwie. Analiza wyników oznaczeń CEA w zależności od zastosowanego leczenia wykazuje, że poziom tego markera nie zawsze jest jednoznaczny ze stanem klinicznym pacjenta. Tłumaczyć to może niejednakową reakcję pacjenta na zastosowane leczenie, lub obecność pacjentów zaliczanych do tzw. nieproducentów CEA. Jak podaje piśmiennictwo osoby takie stanowią grupę 11% chorych operowanych z powodu raka jelita grubego. Analizując całość zebranego materiału daje się zauważyć konieczność opracowania takiego systemu monitorowania pacjenta, który pozwoliłby na wykrywanie nie tylko wczesnych przerzutów lub wznowy, ale który gwarantowałby jednocześnie ciągłość informacji co do dalszych losów pacjenta po zabiegu operacyjnym. W związku z niekwestionowaną wartością diagnostyczną markeru CEA w monitorowaniu pacjentów, jego oznaczanie powinno stać się standardem postępowania. Wnioski 1. Wykazano znaczną rozbieżność pomiędzy zaleceniami, co do oznaczeń stężenia markera CEA u monitorowanych pacjentów, a oznaczeniami tego markera w praktyce. 2. Wyżej wymienione rozbieżności podyktowane są stanem klinicznym pacjentów oraz nie zgłaszaniem się chorych na wizyty kontrolne. 3. Nie stwierdzono korelacji pomiędzy poziomem stężenia markera CEA, a rodzajem narządu, do którego nastąpił przerzut jak również z ilością przerzutów. 4. Nie stwierdzono korelacji między zastosowanym leczeniem w postaci cykli chemioterapii a poziomem stężenia badanego markera. Piśmiennictwo 1. Kordek R., Jassema J., Krzakowski M., Jeziorski A. Onkologia. Podręcznik dla studentów i lekarzy. Medical Press. Gdańsk 2004; Krasnodębski I.W. Monitorowanie chorych po operacjach z powodu raka jelita grubego. Pol. Tyg. Lek. 1992; 3-4, Lee M.W. Rak jelita grubego. Medycyna po dyplomie 1992; 7, Ławicki S., Moroczko B., Szmitowski M. Markery nowotworowe przydatne w diagnostyce i monitorowaniu raka jelita grubego. Post. Hig. Med. Dosw. 2002; 56(5), Szmeja. J. Monitorowanie chorych po operacjach raka jelita grubego. Za i przeciw. Proktologia 2001; 2(1), 7-19 Farmaceutyczny 55

56 6. Szymendera J., Góźdź S. Rola krążących markerów nowotworowych w diagnostyce i monitorowaniu leczenia chorych na nowotwory. Nowotwory 1995; 45, Dusza D., Kwiatkowska B., Kokocińska D., Zagalski K. Schemat monitorowania przed i pooperacyjnego chorych z gruczolakorakiem jelita grubego. Wybrane zagadnienia z chirurgii. Warszawa 1999, Krasnodębski I.W. Biochemiczne markery nowotworowe: CEA, Ca19-9, kwas sialowy i ferrytyna w raku jelita grubego. Pol. Przeg. Chir. 1996; Kulpa J. Krążące markery nowotworowe w diagnostyce chorób nowotworowych. Terapia 1996; 5, Paduch R., Klatka J. Markery nowotworowe. Onkol. Pol. 2003; 6(2), Rzepko R., Kruszewski J., Klimkowska M., Zawadzka M., Jaskiewicz K. Ekspresja antygenu karcinoembrionlanego CEA w ognisku pierwotnym i w przerzutach do węzłów chłonnych raka jelita grubego. Ann. Acad. Med. Gdan. 2004; 34, Dąbrowska B., Krasnodębski I.W., Tadeusiak W. Kwas sialowy i antygen karcynoembrionalny jako markery raka jelita grubego. Doniesienie wstępne Gastroenterologia 1991; 10(1-2), Bielicki D., Morawiec-Borowiak D., Sulżyc-Bielicka V., Chosia M., Domagała W. Przeciwciała przeciw białku p53 i CEA w surowicy krwi chorych z rakiem jelita grubego. Onkol. Pol. 2000; 3(4), Nr 3 / Piotrowski P. Nowotwory przewodu pokarmowego. Warszawa 1998, Bała D., Jawień A. Oznaczanie stężenia antygenu karcinoembrionalnego w popłuczynach otrzewnowych u chorych na raka jelita grubego. Pol. Merk. Lek. 2002; 76, Bielicki D. Rola antygenu rakowo-płodowego CEA w monitorowaniu terapii raka jelita grubego. Gastroenterologia Polska 2003; 10(2), Młynarski R., Partyka R., Cierpka S. Przydatność oznaczeń CEA, CA 19-9 i TPS w surowicy krwi chorych na nowotwory jelita grubego. Ann. Soc. Doctor. Stud. Acad. Med. Siles. 2002; 28, Pruszyński K., Róg M., Dzienis H., Ładny R. Przydatność kliniczna antygenu rakowo płodowego CEA. Chir. Pol. 1995; 6(3), Lorenc Z., Starzewski J., Kokocińska D., Pająk J., Pawełczyk I., Jachymczyk M. Przydatność śródoperacyjnej identyfikacji węzła wartowniczego z jednoczesnym oznaczaniem markerów TPS i CEA w surowicy krwi do oceny stanu zaawansowania klinicznego raka odbytnicy. Pol. Przeg. Chir. 2003; 75(6), Farmaceutyczny

57 Aktywność biologiczna syntetycznych tiopuryn w hodowlach laboratoryjnych Chlorella vulgaris Biological activity of synthetic purine derivatives in Chlorella vulgaris laboratory cultures Dr n. farm. Jolanta Sochacka 1, Dr n. farm. Alicja Kowalska 2 1 Zakład Chemii Ogólnej i Nieorganicznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Kierownik: Dr hab. n. med. Andrzej Sobczak 2 Katedra i Zakład Chemii Organicznej, Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej, Śląski Uniwersytet Medyczny, Kierownik: Prof. dr hab. n. chem. Andrzej Maślankiewicz STRESZCZENIE Celem pracy była ocena oddziaływania zsyntetyzowanych tiopochodnych puryny 2,6 -dipodstawionych 7- -metylopuryny na wzrost eukariotycznych komórek glonu Chlorella vulgaris (C. vulgaris). Komórki glonu hodowano synchronicznie, w cyklu hodowlanym obejmującym 12-godzinną fazę jasną i 12-godzinną fazę ciemną, w płynnej pożywce Kuehla-Lorenzena oraz na pożywce zestalonej agarem. Prowadzono równolegle hodowle kontrolne, hodowle w obecności badanych substancji i hodowle z 6-Merkaptopuryną i 6-Tioguaniną, wybranymi jako modelowa substancje o działaniu cytotoksycznym. Po zakończeniu cyklu hodowlanego w hodowlach na płynnym podłożu zliczano komórki glonu w komorze Burkera i mierzono absorbancję przy λ=680 nm, a na podłożu agarowym zliczano mikrokolonie komórek podzielonych i niepodzielonych. Wyniki pomiarów absorbancji świadczyły o ilości syntetyzowanych barwników fotosyntetycznych i były miarą ogólnej biologicznej aktywności komórki, natomiast metoda zliczania komórek pozwoliła na określenie zdolności komórek do podziału. Stwierdzono, że badane substancje w różny sposób oddziaływały na wzrost hodowli C. vulgaris, obniżając ich aktywność biologiczną i hamując podziały komórkowe (w odniesieniu do hodowli kontrolnej). Mimo zachowanej w niektórych przypadkach aktywności biologicznej, po przeniesieniu na pożywkę agarową komórki macierzyste nie wytwarzały mikrokolonii komórek podzielonych. Słowa kluczowe: syntetyczne pochodne puryny, 6-Merkaptopuryna, Chlorella vulgaris ABSTRACT In this study, a biological activity of synthesized 2,6-disubtituted 7-methylpurines and 6-Mercaptopurine (6-MP, a reference substance) was tested with unicellular green alga Chlorella vulgaris (C. vulgaris). Algal cells were cultivated during one 24-hr light-dark cycle in a Kuehl-Lorenzen liquid medium and in a solidified medium (on Petri dishes). The general biological activity of the cells was determined by absorbance at λ=680 nm. Growth multiplication factor was estimated by the direct counting of the cells in a liquid medium or with a microcolony method. In a latter method, microcolonies containing undivided cells and containing 2, 4, 8 and 16 aplanospores formed from mother cells were counted in a solid medium. It was found that the tested compounds exhibited a cytotoxic and antiproliferative activity (in relation to the control culture). Key words: purine derivatives, 6-Mercaptopurine, Chlorella vulgaris Farmaceutyczny 57

58 Syntetyczne tiopochodne naturalnych zasad purynowych (guaniny i hipoksantyny), 6-Merkaptopuryna i 6-Tioguanina, stosowane są w leczeniu chorób nowotworowych. Molekularny mechanizm ich działania nie jest ostatecznie wyjaśniony. Wiadomo, że mechanizm hamujący wzrost komórek, który jest efektem antymetabolicznym i odwracalnym [1], związany jest z inhibicją syntezy puryn de novo [2], a mechanizm cytotoksyczności wynika z inkorporacji tiopurynowych nukleotydów do kwasów nukleinowych i hamowania układów enzymatycznych w syntezie i replikacji DNA w fazie S cyklu komórkowego [3]. Antymetabolity purynowe nie wykazują selektywnego działania przeciwnowotworowego i uszkadzają nie tylko szybko proliferujące komórki nowotworowe, ale wykazują także umiarkowaną toksyczność wobec tkanek zdrowych szybko rosnących, w których często występują podziały komórkowe (szpik, gamety, immunokompetentne komórki układu chłonnego) [4]. Aktywność biologiczną otrzymanych pochodnych tiopurynowych oceniano względem jednokomórkowego glonu Chlorella vulgaris (C. vulgaris), który pod względem morfologicznym jest typową komórką eukariotyczną. Jednak w odróżnieniu do większości komórek Eukaryota w których w czasie cyklu komórkowego, ilość składników komórki wzrasta dwukrotnie i komórka dzieli się na dwie komórki potomne, w komórce Chlorella w jednym cyklu komórkowym może mieć miejsce 2, 4 i 8-krotne powielanie składników komórki w wyniku, czego komórka macierzysta dzieli się nawet na 8 komórek potomnych [5]. W cyklu życiowym C. vulgaris, stosując jako kryterium podziału czas syntezy DNA, można wyróżnić fazę G 1, S, G 2 i M. W fazie G 1, trwającej od podziału komórki następuje gromadzenie energii chemicznej, synteza RNA, białek strukturalnych i enzymatycznych oraz węglowodanów (jeżeli komórka znajdzie się w warunkach, w których nie następuje gromadzenie energii faza G 1 przechodzi w fazę G 0 i następuje chwilowe zatrzymanie cyklu komórkowego). W fazie S ma miejsce replikacja DNA i synteza białek jądrowych, a w fazie G 2 ma miejsce naprawa DNA i przygotowanie do podziału mitotycznego. Faza M obejmuje podział jądra komórkowego i cytokinezę oraz ostatecznie podział komórki macierzystej na aplanospory. Rozwój komórek Chlorella po uwolnieniu aplanospor w wyniku rozerwania ściany komórkowej komórki macierzystej, aż do kariokinezy włącznie, uzależniony jest od obecności światła, natomiast cytokineza i uwolnienie aplanospor mogą przebiegać w ciemności. Powstające w ciemności bezpośrednio po podziale młode aplanospory po rozpoczęciu naświetlania stają się aplanosporami aktywnymi fotosyntetycznie, zdolnymi do szybkiego wzrostu. W wyniku intensywnych przemian biochemicznych i morfologicznych przekształcają się w całkowicie dojrzałe do podziału komórki macierzyste [6]. MATERIAŁY I METODY Do badań wytypowano symetryczne siarkowe pochodne puryn: 2,6-dimetylotio-7-metylopurynę 1, 2,6-dietylotio-7- -metylopurynę 2 oraz 2,6-ditiokso-1,2,3,6-tetrahydro-7-metylopurynę 3. Związek o strukturze tionowej 3 otrzymano w reakcji 2,6-dichloro-7-metylopuryny z tiomocznikiem 58 Farmaceutyczny Nr 3 / 2008 w etanolu zgodnie z danymi literaturowymi [7]. Symetryczne pochodne: 2,6-dimetylo 1 oraz 2,6-dietylotio-7-metylopurynę 2 otrzymano poprzez alkilowanie związku 3 za pomocą jodku metylu lub etylu w wodnym 4% roztworze KOH [7]. Jako substancje modelowe o działaniu cytotoksycznym stosowano 6-Merkaptopurynę i 6-Tioguaninę (Sigma Aldrich Co). W badaniach wykorzystano hodowle glonu Chlorella vulgaris (C. vulgaris, Beij, szczep 264, Boehm i Borns 1972/1, Culture Collection of Algal Laboratory, Czechoslovak Academy of Science, Trebon). Hodowle prowadzono w kolbach Erlenmeyera na płynnej pożywce Kühla-Lorenzena [8] wzbogaconej HCO 3 - (3,95 mmol/l) i CO 2 (4% v/v), w jednym cyklu hodowlanym, który obejmował 12- Ryc. 1. Struktury chemiczne badanych substancji -godzinna fazę jasną i 12-godzinną fazę ciemną. W fazie jasnej hodowle były oświetlane lampami jarzeniowymi ( lx). Prowadzono równolegle hodowle kontrolne oraz hodowle z dodatkiem substancji 1, 2, 3 oraz 6-MP i 6-TG dodawanych do hodowli pojedynczo w postaci roztworów w DMSO. Roztwory substancji badanych dodawano do pożywki do osiągnięcia stężeń zbliżonych do wyznaczonych wartości efektywnego stężenia, EC50. Po 12-godzinnej fazie jasnej próbki hodowli przenoszono na pożywkę zestaloną agarem (na szalkach Petriego) i inkubowano w ciemności do zakończenia cyklu hodowlanego. Następnie zliczano pod mikroskopem mikrokolonie komórek niepodzielonych i podzielonych. Po 24-godzinnym cyklu hodowlanym, pobierano z kolb hodowlanych próbki hodowli i mierzono ich absorbancję przy λ=680 nm [9]. W tych samych próbkach hodowli zliczano komórki glonu w komorze Bürkera pod mikroskopem. Współczynnik K A określający ogólną aktywność biologiczną komórek i współczynnik podziału KN obliczano ze wzorów: A 24 N 24 K A = K N = A 0 N 0 gdzie: A 24 i A 0 oznacza absorbancję i N 24 i N 0 oznacza liczbę komórek glonu odpowiednio w czasie t 24 i t 0 WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Wyznaczone wartości EC50 uzyskane dla 2,6-dipodstawionych 7-metylopuryn oraz dla 6-MP i 6-TG zamieszczono w Tabeli 1. Uzyskane wyniki wskazują, że wszystkie

59 Nr 3 / 2008 Ryc. 2. Porównanie współczynników K A i K N wyznaczonych w hodowlach kontrolnych i z dodatkiem badanych substancji. Stężenia wyjściowe 1 : 6-MP i 6-TG 96,0 mg/l, 1 28,0 mg/l, 2 16,0 mg/l, 3 16,0 mg/l. 1 Stężenia wyjściowe podyktowane były uzyskanymi wartościami EC50. Ryc. 3. Mikroskopowy obraz mikrokolonii komórek C. vulgaris wysianych na agar z płynnej pożywki hodowli z 6-MP (96,0 mg/l) i hodowli kontrolnej. Mikrokolonie: 1 komórka niepodzielona z hodowli kontrolnej, 2 komórka niepodzielona z hodowli z 6-MP, 3 komórka podzielona na 4 aplanospory z hodowli kontrolnej. 1, 2 i 3A powiększenie krotne, 3B powiększenie krotne. tych współczynników stwierdzono, że w wyniku ekspozycji na badane substancje w mniejszym stopniu zostaje upośledzona aktywność biologiczną komórek niż ich zdolność do podziału. Obserwacje mikroskopowe hodowli na agarze wykazały, że komórki glonu z hodowli kontrolnych zdolne były do wytwarzania mikrokolonii złożonych z 2, 4 i 8 aplanospor (średnio 4,97 aplanospor). W przypadku hodowli z badanymi substancjami mikrokolonie złożone były głównie z komórek niezdolnych do podziału i w nielicznych przypadkach stwierdzono obecność komórek podzielonych na 2 i 4 aplanospory (średnio 1,84 3,34). Jednocześnie obserwowano wśród komórek niepodzielonych komórki nietypowe ze względu na kształt i wielkość w porównaniu z komórkami niepodzielonymi z hodowli kontrolnej. Można przypuszczać, że mogły to być komórki zdolne do wytwarzania aplanospor, w których badane substancje hamowały podział w premitotycznej fazie G 2 lub na jednym z etapów mitozy. Przykładowy obraz mikroskopowy mikrokolonii uzyskanych na agarze przedstawiono na rycinie 3. badane substancje były toksyczne względem C. vulgaris. Najmniej toksyczna okazała się 6-MP (EC50=105,1 mg/l), a najbardziej toksyczna substancja 2 (EC50=14,2 mg/l). Na rycinie 2 przedstawiono charakterystykę wzrostu hodowli C. vulgaris w postaci współczynników K A i K N, określających odpowiednio ogólną aktywność biologiczną i zdolność komórek do podziału, po zakończonej 24-godzinnej hodowli w pożywce płynnej. Analizując wartości Substancja Zakres stężeń (mg/l) EC50 (mg/l) 6-MP 48,0 144,0 105,1 6-TG 48,0 144,0 75,5 1 18,0 60,0 21,4 2 8,0 20,0 14,2 3 4,0 16,0 22,9 Tabela I. Wyznaczone w hodowlach C. vulgaris wartości efektywnego stężenia EC50 1 2,6-dipodstawionych 7-metylopuryn, 6-MP oraz 6-TG 1 EC50 wartości odpowiadające wyjściowym stężeniom substancji w pożywce hodowli, które wywoływały efekt biologiczny określany jako 50 % inhibicji wzrostu hodowli testowych w odniesieniu do hodowli kontrolnych [...]. WNIOSKI 1. Badane substancje silniej wpływały na zdolność komórek C. vulgaris do podziału niż na ich ogólną aktywność biologiczną (fotosyntetyczną). 2. Wyniki uzyskane z obserwacji komórek C. vulgaris na podłożu agarowym, mogą wskazywać, że badane substancje indukują zatrzymanie cyklu komórkowego na granicy faz G 2 /M lub na jednym z etapów mitozy np. cytokinezy. 3. Modyfikacja struktury 6-MP i 6-TG poprzez dzenie podstawników SMe i SEt zwiększa toksycz- wprowaność substancji 1 i 2 względem C. vulgaris. Farmaceutyczny 59