Dr inż. Barbara Sokołowska IBPRS

Transkrypt

1 Dr inż. Barbara Sokołowska IBPRS

2 Praca w systemie jakości /akredytacji od 1996 Współpraca z PCA od 2000 Współpraca z firmami szkoleniowymi: Omex, CE2, GFW, biomerieux, Argenta, Merck 2005 Sympozjum Klubu POLLAB, Referat: Porównania międzylaboratoryjne jako element zapewnienia jakości w badaniach mikrobiologicznych żywności (dot. walidacji metod oznaczania/wykrywania patogenów) Przewodnik sterowania jakością badań, walidacji i szacowania niepewności mikrobiologicznych metod badania żywności. Wyd. Argenta Sp. z o.o., Warszawa, trzy częściowy cykl artykułów: Statystyka w mikrobiologii żywności, Laboratoria Aparatura Badania LAB Walidacja metod mikrobiologicznych badania żywności. Wyd. Argenta Sp. z o.o., Warszawa, 2007

3 Niechęć laboratoriów do badania próbek naturalnie zanieczyszczonych na etapie walidacji/potwierdzenia Dobór matryc Dobór szczepów Dobór poziomu kontaminacji Nieznajomość norm/opisów metod badawczych Niechęć do współpracy z pożywkarniami/ lekceważenie znaczenia jakości i możliwości analitycznych pożywek Zbytnie skupienie się na niepewności wyników

4 Badano świeży ser, mięso i suszony proszek jajeczny, na 4 różnych poziomach kontaminacji: próbki negatywne, nie zawierające S. aureus niski poziom 10 3 jtk S. aureus średni poziom od 10 4 do 10 5 jtk S. aureus wysoki poziom od 10 5 do 10 6 jtk S. aureus RM około 5000 jtk S. aureus przygotowany przez RIVM (Holenderski Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego). Dodatkowo próbki zawierały taki sam poziom S. epidermidis lub innych koagulazo-ujemnych szczepów Staphylococcus spp. Próbki zawierały naturalną mikroflorę.

5 parametr metoda r R Ogólna liczba drobnoustrojów Liczba gronkowców koagulazo-dodatnich Liczba gronkowców koagulazo-dodatnich Liczba Bacillus cereus Liczba Clostridium perfringens PN-EN ISO- 4833:2004 PN-EN ISO :2001 +A1:2004 PN-EN ISO :2001 +A1:2004 PN-EN ISO 7932:2005 PN-EN ISO 7937:2005 0,25 0,45 0,28 0,43 0,22 0,33 0,29 0,42 0,21 0,25 0,26 0,65 0,29 0,72

6 Badano świeży ser, mięso i suszony proszek jajeczny, o różnym poziomie zanieczyszczenia: 0 jtk L. monocytogenes w 25g 5-10 jtk L. monocytogenes w 25g jtk L. monocytogenes w 25g Każda badana próbka zawierała naturalną mikroflorę oraz dodatkowo jtk L. innocua w 25 g

7 Parametr Wartości średnie Specyficzność 97,4% Czułość 85,2% Powtarzalność 88,7% Odtwarzalność 84,4%

8 Selektywność to zdolność metody alternatywnej do wykrycia drobnoustroju docelowego spośród szerokiej gamy szczepów Nieselektywność to brak zakłóceń ze strony odpowiednich szczepów nie będących docelowymi w metodzie alternatywnej Badania selektywności i nieselektywności wykonuje się dla czystych szczepów bez dodatku próbek żywności

9 Należy wyselekcjonować co najmniej 50 szczepów z próbek żywności (30 w przypadku Salmonella) Wykonać badania metodą alternatywną przy poziomie zanieczyszczenia razy większym niż minimalny względny poziom wykrywalności metodą alternatywną Należy wyselekcjonować co najmniej 30 szczepów powodujących zakłócenia ze szczepem docelowym i naturalnie występujących w materiałach żywnościowych włączonych w proces walidacji Wykonać badania metodą alternatywną przy poziomie podobnym do największego oczekiwanego w użytych do walidacji kategoriach żywności; do hodowli można stosować pożywkę nieselektywną

10 Badać próbki naturalnie zanieczyszczone ewentualnie kontaminować na poziomie naturalnego zanieczyszczenia (najlepiej przez dodatek próbki naturalnie zanieczyszczonej)

11 Walidacja/potwierdzenie to proces zakończony wystawieniem dokumentu potwierdzającego przydatność metody do danego/konkretnego zastosowania Walidacja/potwierdzenie to także proces ciągły do laboratorium trafiają różne, nieznane próbki zmienia się personel niektóre metodyki wymagają stałego stosowania szczepów odniesienia (np. w wykrywaniu Campylobacter) lub walidacji (w badaniach kosmetyków)

12 Metoda znormalizowana IFU No 12 Wymaga stosowania szczepów odniesienia Alicyclobacillus acidoterrestris (psujący soki) i Alicyclobacillus acidocaldarius (niepsujący) w każdej serii badań Plusy stosowania Łatwe wykrycie efektu hamowania przez nową matrycę (np. potwierdzenie wykonano pierwotnie dla zagęszczonego soku jabłkowego a do laboratorium trafia zagęszczony sok wiśniowy) Minusy Koszty

13 Metoda znormalizowana PN-EN ISO 6579:2003 Stosunek masy próbki do pożywki namnażającej - zwp 1:10 ale w przypadku hamowania stosować większe rozcieńczenia nawet 1:1000 (wg. PN-EN ISO :2005) P Uwaga: odczyn ph produktów żywnościowych kwaśnych i ukwaszanych jest bardziej stabilny jeżeli stosowana jest zwp o podwójnym stężeniu składników Plusy stosowania szczepów odniesienia w serii badań Łatwe wykrycie efektu hamowania przez nową matrycę (np. potwierdzenie wykonano pierwotnie dla soków: marchwiowych, jabłkowych i z buraków a do laboratorium trafiają owoce goji lub zagęszczony sok z aronii) Minusy Koszty Możliwość zanieczyszczenia krzyżowego

14 PRZYKŁADY

15 Metoda znormalizowana PN-ISO 15214:2004 p. 9.3 Uwaga: Z powodu możliwości wzrostu na pożywce MRS drobnoustrojów innych niż bakterie fermentacji mlekowej, dla niektórych produktów może być konieczne potwierdzenie kolonii prostymi metodami: barwienie metodą Grama lub test na wytwarzanie katalazy bakterie fermentacji mlekowej są katalazo-ujemne drożdże są katalazo-dodatnie p Jeżeli zachodzi ryzyko silnego zanieczyszczenia produktu drożdżami należy dodać do pożywki kwas sorbowy

16 Metoda znormalizowana PN-EN ISO : A1:2004 p Uwaga 1: niektóre szczepy będące w stanie stresu wykazują bardzo słabą strefę (lub jej nie wykazują), zwłaszcza szczepy poddane stresującemu działaniu kwasu p Uwaga 2: Niektóre szczepy L. monocytogenes charakteryzują się słabą aktywnością PIPLC. Takie szczepy wykrywane są, gdy całkowity okres inkubacji jest dłuższy niż wskazano, na przykład 4 dni. Niektóre z tych szczepów mogą być chorobotwórcze

17 Metoda znormalizowana PN-ISO 7889: Ap1:2007 Nadaje się do jogurtów tradycyjnych zawierających tylko Lactobacillus delbrücki subsp. bulgaricus i Streptococcus salivarus subsp. thermophilus Pożywki kmrs i M17 nie są selektywne i rosną na nich inne bakterie fermentacji mlekowej np.: Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus Lactobacillus delbrücki subsp. bulgaricus nie rośnie na M17 Konieczne jest wykonywanie preparatów mikroskopowych dla rozróżnienia pałeczek od paciorkowców

18 Metoda znormalizowana PN-ISO :2009 Zakres: Do oznaczania liczby drożdży osmofilnych i pleśni kserofilnych Przykłady żywności: - suszone owoce, ciastka, dżemy - suszone mięsa i solone ryby - ziarno zboża i produkty zbożowe, mąki - orzechy, przyprawy i zioła

19 Zarówno pożywki jak i rozcieńczalniki stosowane w oznaczaniu liczby drożdży osmofilnych i pleśni kserofilnych powinny mieć obniżoną a w Wg PN-ISO :2009 zaleca się stosować rozcieńczalnik zawierający glicerol lub D- glukozę w ilości 20% 35% (stężenie masowe) Jako baza 0,1% woda peptonowa (z wyjątkiem przypadków określonego przygotowania próbki) Możliwy dodatek Tween 80

20 Dichloran (2,6-dichloro-4-nitroanilina) Glicerol (18% objętościowo, 22% masowo) Chloramfenikol Opcjonalnie Drugi antybiotyk: chlorowodorek chlorotetracykliny Sole mineralne: w celu wykształcenia wszystkich cech morfologicznych

21 Posiew powierzchniowy Jeżeli spodziewamy się obecności Xeromyces bisporus czas inkubacji wydłużamy do 10 dni Wzrost w zakresie a w 0,96-0,61 z optimum 0,85 X. bisporus izolowano z lukrecji, suszonych śliwek, tytoniu, suszonych daktyli, czekolady, sosu czekoladowego, ciast zawierających suszone owoce, pomadek, słodyczy z galaretką

22 Szczepy do oznaczania żyzności Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 Eurotium rubrum ATCC Wallemia sebi ATCC Aspergillus restrictus ATCC Pożywka referencyjna zwalidowana Sabouraud

23 Klienci porównują ceny analiz Klienci oczekują, że znakiem akredytacji potwierdzono prawidłowość wykonywania badania Laboratoria podejmują się badań i wydają opinie na tematy na których się nie znają Auditorzy podejmują się ocen badań na których się nie znają