(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/28 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposób wykrywania i diagnozowania raka z zastosowaniem starterów i sond do specyficznego wykrywania markera MAGE-A3 (30) Pierwszeństwo: GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/14 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/11 (73) Uprawniony z patentu: GlaxoSmithKline Biologicals SA, Rixensart, BE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 THIERRY COCHE, Rixensart, BE OLIVIER GRUSELLE, Rixensart, BE GABRIELE ANNE-MARIE BEER, Penzberg, DE DENNIS SALONGA, Los Angeles, US CRAIG LAWRENCE STEPHENS, Los Angeles, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Agnieszka Marszałek SULIMA-GRABOWSKA-SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-2899/VAL EP B Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu diagnostycznego do wykrywania MAGE-A3. TŁO WYNALAZKU [0002] Rodzinę genów MAGE (antygen czerniaka) początkowo zidentyfikowano przez ich rozpoznanie z cytolitycznych limfocytów pochodzących z limfocytów krwi pacjentów z rakiem (Van der Bruggen i in. 1991). Rodzina genów MAGE obecnie zawiera ponad 20 członków i jest złożona z genów MAGE A, B, C i D (Scanlan i in., (2002) Immunol Rev. 188:22-32; Chomez i in., (2001) Cancer Res. 61(14): ). Są one skupione na chromosomie X (Lucas i in., 1998 Cancer Res. 58: ; Lucas i in., 1999 Cancer Res 59: ; Lucas i in., 2000 Int J Cancer 87:55-60; Lurquin i in., 1997 Genomics 46: ; Muscatelli i in., 1995 Proc Natl Acad Sci USA 92: ; Pold i in., 1999 Genomics 59: ; Rogner i in Genomics 29: ) i dotychczas nie zidentyfikowano ich funkcji (Ohman i in Exp Cell Res. 265(2):185-94). Geny MAGE są wysoce homologiczne, a w szczególności członkowie rodziny MAGE-A wykazują pomiędzy 60-98% homologii. Geny MAGE nie są eksprymowane we wszystkich prawidłowych komórkach za wyjątkiem ekspresji w spermatogoniach i łożysku (Haas i in Am J Reprod Immunol Microbiol 18:47-51; Takahashi i in Cancer Res 55: ). [0003] Ponowna aktywacja ekspresji genu MAGE w raku wynika z nieprawidłowej demetylacji promotora (De Smeet i in Proc Natl Acad Sci USA 93(14): ; De Smeet i in Mol Cell Biol. 19(11): ). 12 genów MAGE-A jest w zmiennym stopniu nadeksprymowanych w poniższych rakach: rak z nabłonka przejściowego, rak przełyku, czerniak, rak pęcherza i niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) (Scanlan i in Immunol Rev. 188:22-32). Nadekspresja i specyficzność ekspresji MAGE w tkankach rakowatych doprowadziła do zastosowania białka MAGE-A3 jako antygenu w szczepionkach przeciwrakowych (Scanlan i in Immunol Rev. 188:22-32). Jednakże ze względu na szeroki zakres ekspresji stwierdzany u pacjentów z rakiem poziom ekspresji MAGE- A3 musi być precyzyjnie wyznaczany u każdego pacjenta w celu skierowania szczepienia w kierunku pacjentów eksprymujących to białko. MAGE-A3 jest często nazywane zamiennie MAGE-3; przy czym obydwa te określenia są tutaj stosowane. Czerniak [0004] U pacjentów, u których występuje złośliwy czerniak z odległymi przerzutami (stadium IV według klasyfikacji American Joint Committee on Cancer (AJCC), mediana czasu

3 przeżycia wynosi jeden rok, ze współczynnikiem przeżycia długoterminowego wynoszącym tylko 5%. Nawet w przypadku standardowej chemioterapi dla czerniaków w stadium IV wskaźniki odpowiedzi terapeutycznej wynoszą tylko 8-25%, ale bez wpływu na ogólne przeżycie. U pacjentów z przerzutami regionalnymi (stadium III), mediana czasu przeżycia wynosi dwa do trzech lat z bardzo niskim prawdopodobieństwem przeżycia długoterminowego, nawet po odpowiednim chirurgicznym zwalczeniu guza pierwotnego i przerzutów regionalnych (Balch i in., 1992 Semin Surg Oncol. 8(6):400-14). U większości pacjentów z czerniakiem w stadium I do III, guz usuwany jest chirurgicznie, ale u pacjentów tych pozostaje znaczne ryzyko nawrotu. Zatem nadal istnieje potrzeba zapobiegania postępowi czerniaka oraz uzyskania ulepszonych schematów leczenia przerzutowego czerniaka oraz leczenia wspomagającego dla pacjentów z usuniętym guzem pierwotnym. Rak płuca [0005] Istnieją dwa typy raka płuca: niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) i drobnokomórkowy rak płuca (SCLC). Nazwy te w prosty sposób opisują typ komórek stwierdzanych w tych nowotworach. NSCLC obejmuje raka płaskokomórkowego, raka gruczołowego i raka wielkokomórkowego i stanowi około 80% raków płuc. NSCLC jest trudny do wyleczenia, a zgodnie z tendencją dostępne terapie są przeznaczone do przedłużania życia tak bardzo jak jest to możliwe oraz łagodzenia objawów choroby. NSCLC jest najpowszechniejszym typem raka płuca i jest trudno wyleczalny. Wśród wszystkich pacjentów NSCLC około 25% ma chorobę lokoregionalną podczas diagnozy i nadal można ich poddać wycięciu chirurgicznemu (stadia IB, IIA lub IIB według klasyfikacji AJCC). Jednakże u ponad 50% z tych pacjentów nastąpi nawrót choroby w ciągu dwóch lat po całkowitym wycięciu chirurgicznym. Zatem istnieje potrzeba dostarczenia lepszego leczenia tych pacjentów. Ekspresja MAGE-A3 [0006] Dotychczas w kilku metodach usiłowano dokonać pomiaru ekspresji genów MAGE-A3 zarówno w liniach komórkowych, jak i próbkach guza. Zastosowano półilościową RT-PCR (De Plaen i in Immunogenetics 40(5):360-9), inne techniki oparte na PCR, a także mikromacierze o niskiej gęstości (Zammatteo i in Clinical Chemistry 48(1) 25-34). Jednakże w wielu z tych badań głównym problemem była bardzo wysoka homologia między członkami rodziny MAGE powodująca wyniki fałszywie pozytywne. Dla dużych prób Fazy II i III konieczny jest ilościowy wysokowydajny test, zdolny do specyficznej identyfikacji próbek eksprymujących MAGE-A3 oraz zmniejszający prawdopodobieństwo fałszywie pozytywnego oznaczenia próbek. [0007] Inna trudność wynika ze stosowania tkanki nowotworowej utrwalonej w formalinie

4 i zatopionej w parafinie (FFPE), co jest typową metodą konserwacji tkanki nowotworowej w ośrodkach klinicznych. Utrwalanie w formalinie zmienia strukturę cząsteczek RNA w tkance powodując sieciowanie, a także częściową degradację. Częściowa degradacja prowadzi do utworzenia krótszych fragmentów RNA wielkości par zasad. Te zmiany strukturalne RNA sprawiają, że zastosowanie RNA ekstrahowanego z tkanki FFPE jest trudne w konwencjonalnych technikach diagnostycznych. Krótki opis rysunków [0008] Figura 1: Specyficzność starterów do RT-PCR TaqMan dla MAGE-A3 względem członków rodziny MAGE-A. Figura 2: Specyficzność sondy wiążącej się z mniejszą bruzdą (MGB) do TaqMan RT- PCR względem ekspresji MAGE-A3. Figura 3: Badanie specyficzności starterów dla MAGE-A3 w obecności plazmidów MAGE-A3 i MAGE-6. Figura 4: Ekspresja MAGE-A3 w nowotworze mierzona metodą ilościowej TaqMan PCR. Figura 5: Badanie ekspresji MAGE-A3. Figura 6a: Specyficzność starterów dla MAGE-A3 zaprojektowanych do stosowania na tkance FFPE. Figura 6b: Liniowość badania dla starterów przy różnych ilościach RNA. Figura 7: Porównanie między testem na próbkach zamrożonych w RNAlater i PCR na tkance FFPE. Figura 8: Względne porównanie testów MAGE-A3 na próbkach zamrożonych w RNAlater i FFPE. Figura 9: Sekwencja nukleotydowa kodująca białko fuzyjne fragmentu lipoproteiny D, fragmentu Mage3 i ogon histydynowy oraz odpowiadająca jej sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO: 35 i 36). Figura 10: Białko fuzyjne NS1-MAGE3 i ogon histydynowy (SEQ ID NO: 37) Figura 11: DNA kodujący białko fuzyjne NS1-MAGE3-His (SEQ ID NO: 38) Figura 12: Białko fuzyjne CLYTA-MAGE3-Histydyna (SEQ ID NO: 39) Figura 13: DNA dla białka fuzyjnego CLYTA-MAGE3-His (SEQ ID NO: 40) Figura 14: Uliniowienie sekwencji rodziny genów MAGE-A do zaprojektowania starterów i sond do RT-PCR dla MAGE-A3 Figura 15: Uliniowienie sekwencji MAGE-A3 i MAGE-A6 w celu zidentyfikowania regionów zawierających docelowe sekwencje (tekst w ramce)

5 Figura 16: Klasy w półilościowej MAGE-A3 RT-PCR: przykład jak można przypisać pięć klas do półilościowego testu MAGE-A3 RT-PCR. Figura 17: Graficzne porównanie wartości Ct dla plazmidów MAGE-A przy użyciu 20, 2, 0,2 i 0,02 pg DNA. Figura 18: Graficzne porównanie wartości Delta Ct w stosunku do MAGE-A3 dla innych plazmidów MAGE-A przy użyciu 20, 2, 0,2 i 0,02 pg DNA. Figura 19: Liniowość dla RNA z FFPE heteroprzeszczepu GERL - 2-krotne seryjne rozcieńczenia od 100 do 0,1 ng wprowadzonego RNA Figura 20: przedstawia wykres Delta Ct między MAGE-A3 i β-aktyną w funkcji log (podstawa 2) ilości wprowadzonego RNA. Opis Tabeli i Sekwencji [0009] Tabela 1: Startery oligonukleotydowe zastosowane do półilościowej MAGE RT-PCR. Tabela 2: Startery oligonukleotydowe zastosowane do ilościowej TaqMan RT-PCR. Tabela 3: Porównanie półilościowej MAGE-A3 PCR względem ilościowej TaqMan RT-PCR. Tabela 4: Porównanie wartości Ct i Delta Ct z zastosowaniem mieszaniny do PCR 1 i mieszaniny do PCR 2. Tabela 5: Startery oligonukleotydowe zastosowane w ilościowej MGB TaqMan RT- PCR na zamrożonej tkance. Tabela 6: Klasy w półilościowej MAGE-A3 RT-PCR: przykład jak można przypisać pięć klas do półilościowego testu MAGE-A3 RT-PCR (dotyczy Figury 16). Tabela 7: Sekwencje starterów i sond do COBAS TaqMan dla MAGE-A3. Tabela 8: Sekwencje starterów i sond do COBAS TaqMan dla beta-aktyny. Tabela 9: Zweryfikowany zakres CT dla COBAS TaqMan dla próbki i kontroli Tabela 10: Profil cykli termicznych COBAS TaqMan - profil termiczny PCR dla doświadczenia dotyczącego wyłączności względem MAGE-A3 Tabela 11: Profil termiczny RT-PCR dla doświadczeń dotyczących liniowości i wydajności RT-PCR, czułości analitycznej (granica wykrywalności), korelacji metody i powtarzalności Tabela 12: Wartości Ct dla plazmidów MAGE-A przy użyciu 20, 2, 0,2 i 0,02 pg DNA Tabela 13: Wartości Delta Ct w stosunku do MAGE-A3 dla innych plazmidów MAGE- A przy użyciu 20, 2, 0,2 i 0,02 pg DNA Tabela 14: Weryfikacja doświadczenia dotyczącego wyłączności względem MAGE-A3 Tabela 15 i Tabela 16: Szczegóły doświadczenia dotyczącego wyłączności względem

6 MAGE-A3 Tabela 17: Liniowość Ct oraz Delta Ct dla MAGE-A3 i β-aktyny dla 10 powtórzeń na 11 poziomach Tabela 18: Wydajność amplifikacji MAGE-A3 i β-aktyny metodą RT-PCR Tabela 19: Weryfikacja doświadczenia dotyczącego liniowości/wydajności RT-PCR Tabele 20, 21 i 22: Szczegóły doświadczenia dotyczącego liniowości/wydajności RT- PCR Tabela 23: Częstość trafień Ct dla MAGE-A3, N = 24 dla każdych warunków Tabela 24: Procentowa częstość trafień Ct dla MAGE-A3, N = 24 dla każdych warunków Tabela 25: Częstość trafień Ct dla β-aktyny, N = 24 dla każdych warunków Tabela 26: Procentowa częstość trafień Ct dla β-aktyny, N = 24 dla każdych warunków Tabela 27: Ct kontroli FAM dla genu MAGE Tabela 28: Ct kontroli HEX dla β-aktyny Tabela 29; Tabela 30; oraz Tabela 31: Szczegóły doświadczenia dotyczącego granicy wykrywalności Tabela 32: Zestawienie próbek do walidacji krzyżowej Tabela 33: Procentowa zgodność wyników pozytywnych i negatywnych z testem porównawczym dla testów COBAS i prototypowego Tabela 34: Procentowa zgodność wyników pozytywnych i negatywnych z testem porównawczym dla testów COBAS i prototypowego z zastosowaniem testu na zamrożonych próbkach w celu oznaczenia niezgodnych wyników Tabela 35: Ct kontroli doświadczalnej dla genu MAGE Tabela 36: Ct kontroli doświadczalnej dla genu β-aktyny Tabele 37, 38 i 39: Szczegóły doświadczenia dotyczącego korelacji metody/walidacji krzyżowej Tabela 40: Seria 1 - wartość progowa ekspresji MAGE-A3 z kontroli RNA GERL Tabela 41: Seria 1 - wartości ekspresji MAGE-A3 dla próbek dla powtarzalności Tabela 42: Seria 2 - wartość progowa ekspresji MAGE-A3 z kontroli RNA GERL Tabela 43: Seria 2 - wartości ekspresji MAGE-A3 dla próbek dla powtarzalności Tabela 44: Weryfikacja powtarzalności Tabele 45, 46 i 47: Szczegóły doświadczenia dotyczącego powtarzalności SEQ ID NO: 1 - MAGE3-E2F (starter do półilościowego testu MAGE3) (Tabela 1) SEQ ID NO: 2 - MAGE3-E3R (starter do półilościowego testu MAGE3) (Tabela 1) SEQ ID NO: 3 - E3 MAGE3 TMF (starter w przód dla egzonu 3 MAGE-A3) (Tabela 2)

7 SEQ ID NO: 4 - E3 MAGE3 TMR (starter w tył dla egzonu 3 MAGE-A3; starter ten jest odwrotny i komplementarny do rozpoznawanej przez niego sekwencji egzonu MAGE-A3) (Tabela 2) SEQ ID NO: 5-13 MAGE3 TMF (starter w przód dla intronu 3 MAGE-A3) (Tabela 2) SEQ ID NO: 6-13 MAGE3 TMR (starter w tył dla intronu 3 MAGE-A3; starter ten jest odwrotny i komplementarny do rozpoznawanej przez niego sekwencji intronu MAGE-A3) (Tabela 2) SEQ ID NO: 7 - MAGEA3-775F (starter w przód dla MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 8 - MAGEA3-849R (starter w tył dla MAGE-A3; starter ten jest odwrotny i komplementarny do rozpoznawanej przez niego sekwencji MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 9 - MAGEA3e-950F (starter w przód dla MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 10 - MAGEA3e-1037R (starter w tył dla MAGE-A3; starter ten jest odwrotny i komplementarny do rozpoznawanej przez niego sekwencji MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 11 - MAGEA3f-623F (starter w przód dla MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 12 - MAGEA3f-697R (starter w tył dla MAGE-A3; starter ten jest odwrotny i komplementarny do rozpoznawanej przez niego sekwencji MAGE-A3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 13 - E3 MAGE3 TMP (sonda dla egzonu 3 MAGE3) (Tabela 2) SEQ ID NO: 14 - I3 MAGE-A3 TMP (sonda dla intronu 3 MAGE3) (Tabela 2) SEQ ID NO: 15 - MAGEA3-801 Tmc (sonda dla MAGE3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 16 - MAGEA3e-1000Tmc (sonda dla MAGE3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 17 - MAGEA3f-651Tm (sonda dla MAGE3) (Tabela 5) SEQ ID NO: 18 - B-aktyna-E4F (starter dla β-aktyny) (Tabela 1) SEQ ID NO: 19 - B-aktyna-E6R (starter dla β-aktyny) (Tabela 1) SEQ ID NO: 20 - B-aktyna-TMF (starter dla β-aktyny) (Tabela 2) SEQ ID NO: 21 - B-aktyna-TMR (starter dla β-aktyny) (Tabela 2) SEQ ID NO: 22 - B-aktyna TMP (sonda dla β-aktyny) (Tabela 2) SEQ ID NO 23 - SEQ ID NO: 29: peptydy immunologiczne MAGE3 SEQ ID NO: 30 - SEQ ID NO: 34: dodatkowe oligonukleotydy SEQ ID NO: 35 - sekwencja nukleotydowa białka fuzyjnego fragment lipoproteiny D - fragment MAGE3 - ogon histydynowy (Figura 9) SEQ ID NO: 36 - sekwencja aminokwasowa SEQ ID NO: 35 (Figura 9) SEQ ID NO: 37 - sekwencja aminokwasowa białka fuzyjnego NS1- MAGE3 - ogon histydynowy (Figura 10)

8 SEQ ID NO: 38 - sekwencja nukleotydowa kodująca SEQ ID NO: 37 (Figura 11) SEQ ID NO: 39 - sekwencja aminokwasowa białka fuzyjnego CLYTA-MAGE3- Histydyna (Figura 12) SEQ ID NO: 40 - sekwencja nukleotydowa kodująca białko fuzyjne CLYTA-MAGE3- histydyna (Figura 13) SEQ ID NO: 41 - fragment MAGE 1 (Figura 14) SEQ ID NO: 42 - fragment MAGE 2 (Figura 14) SEQ ID NO: 43 - fragment MAGE 4a (Figura 14) SEQ ID NO: 44 - fragment MAGE 7 (Figura 14) SEQ ID NO: 45 - fragment MAGE 8 (Figura 14) SEQ ID NO: 46 - fragment MAGE 10 (Figura 14) SEQ ID NO: 47 - fragment MAGE 11 (Figura 14) SEQ ID NO: 48 - fragment MAGE 12 (Figura 14) SEQ ID NO: 49 - fragment MAGE-A6 (Figura 14) SEQ ID NO: 50 - fragment MAGE-A3 (Figura 14) SEQ ID NO: 51 - fragment MAGE-A3 (Figura 15) SEQ ID NO: 52 - fragment MAGE-A6 (Figura 15) SEQ ID NO: 53 - sekwencja syntetycznej sondy dla MAGE-A3 MAGEA3F-646MOD (Tabela 7) SEQ ID NO: 54 - sekwencja sondy MAGEA3F-646MOD z niemodyfikowanymi nukleotydami SEQ ID NO: 55 - sekwencja startera dla β-aktyny RGI BACT F2 (Tabela 8) SEQ ID NO: 56 - sekwencja startera dla β-aktyny RGI BACT R2 (Tabela 8) SEQ ID NO: 57 - sekwencja sondy dla β-aktyny HW RGIBACT H (Tabela 8) STRESZCZENIE WYNALAZKU [0010] Twórcy niniejszego wynalazku opracowali test do identyfikacji pacjentów z tkanką nowotworową eksprymującą MAGE-A3, którzy tym samym skorzystają z immunoterapii specyficznej względem MAGE-A3. [0011] W jednej postaci dostarcza się zestaw starterów składający się z poniższej pary starterów: a) SEQ ID NO: 11 i 12. [0012] W kolejnym aspekcie niniejszego wynalazku dostarcza się sondę składającą się z sekwencji nukleotydowej którejkolwiek z SEQ ID NO: 17, mającej fluorescencyjny barwnik reporterowy na 5' końcu oraz niefluorescencyjny wygaszacz na 3' końcu, lub SEQ ID NO: 53.

9 [0013] W kolejnej postaci dostarcza się zestaw zawierający: (i) starter składający się z SEQ ID NO: 11 (ii) starter składający się z SEQ ID NO: 12 oraz (iii) sondę składającą się z SEQ ID NO: 17 mającą 6-karboksyfluoresceinę na 5' końcu oraz niefluorescencyjny wygaszacz na 3' końcu. [0014] W kolejnej postaci dostarcza się zestaw zawierający (1) starter składający się z SEQ ID: 11; starter składający się z SEQ ID NO: 12 oraz sondę składającą się z SEQ ID NO: 53 [0015] W kolejnej postaci niniejszego wynalazku dostarcza się sposób określania obecności lub braku MAGE-A3 w tkance nowotworowej utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE) obejmujący etap kontaktowania wyizolowanej sekwencji nukleotydowej uzyskanej lub pochodzącej z próbki tkanki nowotworowej FFPE z zestawem starterów składającym się z SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 oraz sondą według zastrzeżenia 2. [0016] W kolejnym aspekcie dostarcza się sposób diagnozowania pacjenta obejmujący etap kontaktowania wyizolowanej sekwencji nukleotydowej uzyskanej lub pochodzącej z próbki tkanki nowotworowej FFPE z zestawem starterów składającym się z SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 oraz sondą według zastrzeżenia 2 i oceny czy MAGE-A3 jest eksprymowany w tej próbce. [0017] Sposób może obejmować ponadto etap amplifikacji sekwencji nukleotydowej i wykrywania w próbce zamplifikowanej sekwencji nukleotydowej. [0018] Sposób może obejmować ponadto etap określania czy wyizolowana sekwencja nukleotydowa hybrydyzuje ze starterem lub sondą w ostrych warunkach, a tym samym wykrywania czy tkanka nowotworowa jest pozytywna względem MAGE-A3. W jednej postaci sposób może obejmować ponadto etap stosowania hybrydyzacji in situ w celu wykrycia czy sekwencja nukleotydowa hybrydyzuje z co najmniej jednym starterem lub sondą. SZCZEGÓŁOWY OPIS [0019] Stosowane tutaj określenie sekwencja docelowa oznacza region sekwencji kwasu nukleinowego MAGE-A3 (jakkolwiek DNA lub RNA, np. genomowego DNA, informacyjnego RNA lub ich namnożonych wersji) względem którego sekwencja sondy lub startera wykazuje częściową (tj. z pewnym stopniem niedopasowania) lub całkowitą identyczność; jakkolwiek starter w tył jest odwrotny i komplementarny (lub, jak powyżej, wykazuje pewien stopień niedopasowania) do rozpoznawanej przez niego sekwencji. Sekwencja docelowa ogólnie dotyczy regionu sekwencji MAGE-A3, który różni się co najmniej jednym nukleotydem od innej lub od wszystkich innych sekwencji nukleotydowych MAGE- A. Jednakże, w pewnych postaciach niniejszego wynalazku sekwencja docelowa może, dla

10 jednego lub większej liczby starterów i sondy, być identyczna pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi MAGE-A, pod warunkiem, że co najmniej jeden lub dwa stosowane startery i sonda rozpoznają sekwencję docelową, która różni się pomiędzy genami, które mają być rozróżnione. [0020] Zatem, w jednej postaci specyficzny starter lub sonda będzie wiązać docelową sekwencję MAGE-A3 bez niedopasowań oraz wiązać równoważny region dodatkowej sekwencji MAGE-A, przykładowo sekwencję MAGE-6, z niedopasowaniem jednej lub większej liczby par zasad. [0021] Sekwencją docelową starterów lub sondy według niniejszego wynalazku może być sekwencja obejmująca większość różnic (niedopasowań) pomiędzy dwoma genami, tak aby umożliwić wykrycie MAGE-A3 z bardzo wysoką specyficznością. [0022] W jednej postaci niniejszego wynalazku sekwencje docelowe są w regionach wyróżnionych jako tekst w ramce na Figurze 15. [0023] Dogodnie starter lub sonda mogą być identyczne co najmniej w 95% z sekwencją docelową na długości startera lub sondy, odpowiednio identyczne w ponad 95%, tak jak w 96%, 97%, 98%, 99%, a najkorzystniej wykazują 100% identyczności na swojej długości względem docelowej sekwencji MAGE-A3. Startery lub sondy według wynalazku mogą być identyczne z sekwencją docelową we wszystkich pozycjach nukleotydowych startera lub sondy, lub mogą zawierać 1, 2 lub większą liczbę niedopasowań przykładowo zależnie od długości sondy, temperatury, warunków reakcji i wymagań testu. Zakładając, że, oczywiście, starter w tył spełnia te warunki względem regionu, który jest odwrotny i komplementarny do sekwencji startera. [0024] Dogodnie każdy nukeotyd startera lub sondy może tworzyć wiązanie wodorowe ze swoim odpowiednim nukleotydem docelowym. [0025] Korzystnie komplementarność startera lub sondy z sekwencją docelową ocenia się przez stopień parowania zasad A:T i C:G, takiego że nukleotyd adenina (A) paruje się z tyminą (T) oraz takiego że nukleotyd guanina (G) paruje się z cytozyną (C) lub na odwrót. W postaci RNA T można zastąpić U (uracylem). [0026] Gdy, przykładowo, w uniwersalnych sondach stosuje się inozynę, wtedy komplementarność można także ocenić przez stopień oddziaływań inozyna (sonda) - docelowy nukleotyd. [0027] Zgodnie z tym, niniejszy wynalazek dostarcza starter składający się z sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO , jak przedstawiono w Tabeli 1 i 2. Określenie starter stosuje się tutaj w znaczeniu jakiejkolwiek jednoniciowej sekwencji oligonukleotydowej, która może być stosowana jako starter, przykładowo w technologii PCR. Zatem starter

11 według wynalazku dotyczy jednoniciowej sekwencji oligonukleotydowej, która może działać jako punt inicjacji syntezy produktu wydłużania startera, który jest zasadniczo identyczny (w przypadku startera w przód) z kopiowaną nicią kwasu nukleinowego lub zasadniczo odwrotny i komplementarny (w przypadku startera w tył) do niej. Projekt (długość i specyficzna sekwencja) startera będzie zależeć od charakteu celów DNA i/lub RNA oraz warunków, w których stosowany jest starter (takich jak temperatura i siła jonowa). [0028] Stosowane tutaj określenie ostre warunki oznacza jakiekolwiek warunki hybrydyzacji, które umożliwiają specyficzne wiązanie starterów z sekwencją nukleotydową w sekwencji nukleotydowej MAGE-A3, ale nie z jakimikolwiek innymi sekwencjami nukleotydowymi MAGE. Specyficzne wiązanie lub specyficzna hybrydyzacja sondy z regionem sekwencji nukleotydowej MAGE-A3 oznacza, że starter lub sonda tworzy dupleks (dwuniciową sekwencję nukleotydową) z częścią tego regionu lub z całym tym regionem w stosowanych warunkach doświadczalnych oraz, że w tych warunkach starter lub sonda nie tworzy dupleksu z innymi regionami sekwencji nukleotydowej obecnej w analizowanej próbce. Należy rozumieć, że startery i sondy według niniejszego wynalazku zaprojektowane do specyficznej hybrydyzacji w regionie sekwencji nukleotydowej MAGE- A3 mogą w całości znajdować się w tym regionie lub mogą w dużym stopniu pokrywać się z tym regionem (tj. tworzyć dupleks z nukleotydami na zewnątrz, a także wewnątrz tego regionu). [0029] Dogodnie specyficzna hybrydyzacja sondy z docelowym regionem kwasu nukleinowego występuje w ostrych warunkach hybrydyzacji, takich jak 3X SSC, 0,1% SDS, w 50 C. Specjalista wie jak zmieniać parametry temperatury, długość sondy i stężenie soli tak aby można było uzyskać specyficzną hybrydyzację. Warunki hybrydyzacji i przemywania są dobrze znane i opisane przykładowo w Sambrook, i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wydanie drugie, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), w szczególności Rozdział 11 tamże. [0030] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto zestaw starterów składający się z poniższej pary starterów: Zestaw 5: SEQ ID NO: 11 i [0031] Niniejszy wynalazek dostarcza ponadto sondę zawierającą sekwencję nukleotydową którejkolwiek z SEQ ID NO: 17, mającą fluorescencyjny barwnik reporterowy na 5' końcu oraz niefluorescencyjny wygaszacz na 3' końcu, lub SEQ ID NO: 53. Określenie sonda jest tutaj stosowane w znaczeniu jakiejkolwiek jednoniciowej sekwencji oligonukleotydowej zdolnej do wiązania kwasu nukleinowego oraz nadającej się do stosowania

12 jako sonda, przykładowo w technologii PCR. [0032] W jednej postaci wynalazku, w której sonda ma być stosowana w sposobie w połączeniu z parą starterów, para starterów powinna umożliwić amplifikację części lub całego fragmentu polinukleotydu MAGE-A3, z którym sondy są zdolne wiązać się oraz na którym sondy są unieruchomione na stałym nośniku. [0033] Starter i/lub sonda mogą dodatkowo zawierać marker, umożliwiając wykrycie sondy. Przykłady możliwych do stosowania markerów obejmują: markery fluorescencyjne, przykładowo 6-karboksyfluoresceinę (6FAM ), NED (Applera Corporation), HEX lub VIC (Applied Biosystems); markery TAMRA (Applied Biosystems, CA, USA); markery chemiluminescencyjne, [0034] przykładowo sondy rutenowe; oraz znaczniki radioaktywne, przykładowo tryt w postaci trytowanej tymidyny. Jako znacznik radioaktywny można także stosować 32 -fosfor. [0035] W jednej postaci niniejszego wynalazku sonda może zawierać fluorescencyjny barwnik reporterowy na swoim 5'-końcu oraz barwnik wygaszający na swoim 3'-końcu. Fluorescencyjny barwnik reporterowy może obejmować 6-karboksyfluoresceinę (6FAM), a barwnik wygaszający może obejmować niefluorescencyjny wygaszacz (NFQ). Ewentualnie, do sondy można dołączyć białko wiążące się z mniejszą bruzdą (MGB ; Applied Biosystems, CA, USA), przykładowo do 3'-końca sondy. [0036] W jednej postaci można stosować sondę MGB Eclipse (Epoch Biosciences, WA, USA). Sondy MGB Eclipse zawierają wygaszacz Eclipse Dark Quencher oraz ugrupowanie MGB umiejscowione na 5'-końcu sondy. Fluorescencyjny barwnik reporterowy jest zlokalizowany na 3'-końcu sondy. [0037] W jednej postaci sekwencje startera i sondy według niniejszego wynalazku mogą zawierać lub obejmować naturalnie występujące struktury nukleotydów lub zasady, przykładowo adeninę (A), cytozynę (C), guaninę (G), tyminę (T) i uracyl (U). [0038] W kolejnej postaci do sekwencji sondy mogą być włączone syntetyczne lub zmodyfikowane analogi struktur nukleotydów lub zasad. Określenie syntetyczny lub zmodyfikowany oznacza nie występującą naturalnie strukturę nukleotydu lub zasadę. Takie syntetyczne lub zmodyfikowane zasady mogą zastępować 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub wszystkie zasady w sekwencji sondy. W jednej postaci cytozyna może być zastąpiona 5-metylo-dC, a tymina może być zastąpiona 5-propynylo-dU. Do sekwencji można także włączyć wygaszacz BHQ2. [0039] Niniejszy wynalazek dodatkowo dostarcza zestaw opisany w zastrzeżeniu 3 albo 4. [0040] Sekwencje MAGE-A3 i MAGE-A6 są wysoce homologiczne i wykazują 98% uliniowienie ich nukleotydów i 95% uliniowienie ich sekwencji białkowych. W celu specy-

13 ficznego zidentyfikowania sekwencji MAGE-A3 konieczne jest zidentyfikowanie starterów i sond zdolnych do rozróżniania MAGE-A3 i MAGE-A6. [0041] W jednej postaci niniejszy wynalazek dostarcza zestaw starterów i/lub sond, które specyficznie hybrydyzują z docelową sekwencją MAGE-A3 w ostrych warunkach, przy czym co najmniej jedna z sekwencji docelowych startera lub sondy różni się co najmniej jednym nukleotydem w porównaniu z równoważnym regionem wszystkich innych sekwencji nukleotydowych MAGE A oraz przy czym zestaw jest zdolny do rozróżniania MAGE-A3 i MAGE-A6. [0042] W jednej postaci niniejszy wynalazek dostarcza zestaw starterów i/lub sond, które specyficznie hybrydyzują z docelową sekwencją MAGE-A3 w ostrych warunkach, przy czym co najmniej jedna z sekwencji docelowych startera lub sondy różni się co najmniej jednym nukleotydem w porównaniu z równoważnym regionem sekwencji nukleotydowej MAGE A6 oraz przy czym zestaw jest zdolny do rozróżniania MAGE-A3 i MAGE-A6. [0043] W jednej postaci sekwencja docelowa co najmniej jednego startera lub sondy może się różnić jednym nukleotydem w sekwencji docelowej MAGE-A3, w porównaniu z równoważnym regionem MAGE-A6. W kolejnej postaci sekwencja docelowa co najmniej jednego startera lub sondy może się różnić dwoma nukleotydami w porównaniu z równoważnym regionem MAGE-A6. [0044] W jednej postaci zestaw zawierający dwa startery i jedną sondę może wykazywać poniższe różnice w sekwencjach docelowych dla starterów i sondy: (i) sekwencja docelowa jednego z dwóch starterów lub sond różni się jednym nukleotydem pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; (ii) sekwencja docelowa starterów lub sondy niewspomnianych w części (i), różni się jednym nukleotydem pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; oraz (iii) sekwencja docelowa pozostałego startera lub sondy jest identyczna dla MAGE-A3 i MAGE-A6; [0045] Przykładowo, w jednej postaci zestaw zawierający starter A, starter B i sondę C może obejmować poniższe różnice w sekwencjach docelowych: (i) sekwencja docelowa startera A różni się jednym nukleotydem pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; (ii) sekwencja docelowa startera B różni się dwoma nukleotydami pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; oraz (iii) sekwencja docelowa sondy C jest identyczna dla MAGE-A3 i MAGE-A6. [0046] Przykładowo, w jednej postaci zestaw zawierający starter A, starter B i sondę C może obejmować poniższe różnice w sekwencjach docelowych:

14 (i) sekwencja docelowa startera A różni się dwoma nukleotydami pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; (ii) sekwencja docelowa startera B jest identyczna dla MAGE-A3 i MAGE-A6; oraz (iii) sekwencja docelowa sondy C różni się jednym nukleotydem pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; [0047] Przykładowo, w jednej postaci zestaw zawierający starter A, starter B i sondę C może obejmować poniższe różnice w sekwencjach docelowych: (i) sekwencja docelowa startera A jest identyczna dla MAGE-A3 i MAGE-A6; (ii) sekwencja docelowa startera B różni się jednym nukleotydem pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; oraz (iii) sekwencja docelowa sondy C różni się dwoma nukleotydami pomiędzy MAGE-A3 i MAGE-A6; [0048] W jednej postaci zestaw może zawierać: parę starterów składającą się z SEQ ID NO: 11 i 12 oraz sondę składającą się z SEQ ID NO: 17. [0049] W kolejnej postaci niniejszego wynalazku dostarcza się sposób określania obecności lub braku MAGE-A3 w tkance nowotworowej utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE), obejmujący etap kontaktowania sekwencji nukleotydowej uzyskanej lub pochodzącej z próbki tkanki nowotworowej FFPE z zestawem starterów składającym się z SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 oraz sondą według zastrzeżenia 2. Określenie tkanka nowotworowa pozytywna względem MAGE-A3 oznacza jakikolwiek nowotwór lub komórki nowotworowe eksprymujące antygen MAGE-A3, które wyizolowano od pacjenta. Opisany tutaj sposób można stosować do określania czy próbka biologiczna zawiera lub składa się z tkanki nowotworowej pozytywnej względem MAGE-A3. [0050] Określenie próbka biologiczna oznacza tkankę lub komórki od pacjenta, które zostały usunięte lub wyizolowane od pacjenta. [0051] Dodatkowo dostarcza się sposób diagnozowania pacjenta obejmujący etap kontaktowania sekwencji nukleotydowej uzyskanej lub pochodzącej z próbki tkanki nowotworowej FFPE z zestawem starterów składającym się z SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 oraz sondą według zastrzeżenia 2 i oceny czy MAGE-A3 jest eksprymowany w tej próbce. [0052] W jednej postaci sekwencja nukleotydowa jest lub została wyizolowana z próbki biologicznej. [0053] Określenie uzyskana lub pochodząca z w stosowanym tutaj znaczeniu stosuje się tutaj łącznie. Oznacza to, że określenie to obejmuje jakąkolwiek sekwencję nukleotydową bezpośrednio wyizolowaną z próbki nowotworowej lub jakąkolwiek sekwencję nukleotydową pochodzącą z próbki przykładowo przez zastosowanie odwrotnej transkrypcji w celu

15 wytworzenia mrna lub cdna. [0054] Sposób według niniejszego wynalazku może obejmować ponadto amplifikację sekwencji nukleotydowej i wykrywanie w próbce zamplifikowanej sekwencji nukleotydowej. Alternatywnie lub dodatkowo sposób według niniejszego wynalazku może obejmować ponadto kontaktowanie wyizolowanej i zamplifikowanej sekwencji nukleotydowej z jedną lub większą liczbą opisanych tutaj sond. [0055] W jednej postaci sekwencja nukleotydowa jest wyizolowana lub oczyszczona z próbki nowotworu. W RT-PCR, zanieczyszczenie genomowym DNA może prowadzić do wyników fałszywie pozytywnych. W jednej postaci genomowy DNA usuwa się lub zasadniczo usuwa z próbki badanej lub uwzględnianej w sposobach według niniejszego wynalazku. [0056] Sposoby według niniejszego wynalazku są odpowiednie do wykrywania tkanki nowotworowej pozytywnej względem MAGE-A3. W jednej postaci niniejszego wynalazku tkankę pozytywną względem MAGE-A3 można wykrywać z zastosowaniem hybrydyzacji in situ. Określenie hybrydyzacja in situ oznacza reakcję hybrydyzacji przeprowadzaną z zastosowaniem startera lub sondy według niniejszego wynalazku na nienaruszonych chromosomach, komórkach lub tkankach wyizolowanych od pacjenta w celu bezpośredniego uwidocznienia morfologicznego umieszczenia specyficznych sekwencji DNA lub RNA. [0057] Hybrydyzację polinukleotydów można przeprowadzić z zastosowaniem dowolnego odpowiedniego sposobu hybrydyzacji i sytemu wykrywania. Przykłady systemów hybrydyzacji obejmują konwencjonalny dot blot, Southern blot i metody sandwich. Przykładowo, odpowiedni sposób może obejmować podejście odwrotnej hybrydyzacji, w którym sondy specyficzne względem typu unieruchamia się na stałym nośniku w znanych odmiennych lokalizacjach (punkty, linie lub inne figury) i zamplifikowane kwasy polinukleinowe znakuje się w celu wykrycia tworzenia hybryd. Sekwencje kwasu nukleinowego specyficzne względem MAGE-A3, przykładowo sondę lub starter jak tutaj opisano, można wyznakować biotyną i hybrydę można wykryć przez sprzężenie biotyny-streptawidyny z nieradioaktywnym układem wywołującym barwę. Jednak, można także zastosować inne systemy odwrotnej hybrydyzacji, przykładowo jak przedstawiono w publikacji Gravitt i in., (Journal of Clinical Microbiology, 1998, 36(10): ), której treść wprowadza się tutaj jako pozycję literaturową. Standardowe warunki hybrydyzacji i przemywania opisano w Kleter i in., Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37(8): oraz zostaną one zoptymalizowane w danych warunkach w celu utrzymania specyficzności i czułości wymaganej przez długość i sekwencję sony (sond) i startera (starterów).

16 [0058] W jednej postaci sposób według niniejszego wynalazku może obejmować stosowanie: a) pary starterów składającej się z SEQ ID NO: 11 i 12 oraz sondy składającej się z SEQ ID NO: 17; [0059] Do izolacji RNA lub DNA z próbki dostępne są dobrze znane procedury ekstrakcji i oczyszczania (np. w Sambrook i in., 1989). RNA lub DNA można stosować bezpośrednio po ekstrakcji z próbki lub korzystniej po etapie amplifikacji polinukleotydu (np. PCR). W specyficznych przypadkach, takich jak w testach odwrotnej hybrydyzacji, przed amplifikacją konieczna może być odwrotna transkrypcja RNA na cdna. W obydwu ostatnich przypadkach zamplifikowany polinukleotyd jest uzyskany z próbki. [0060] Zatem niniejszy wynalazek dostarcza sposób przeszukiwania, w zastosowaniach klinicznych, próbek tkanki od pacjenta będącego człowiekiem na obecność lub brak ekspresji MAGE-A3. Takie próbki mogą obejmować, przykładowo, materiał z biopsji gruboigłowej, próbki wycięte chirurgicznie lub tkankę węzła chłonnego. Przykładowo, sposoby te obejmują uzyskanie bioptatu, który ewentualnie frakcjonuje się przez pocięcie na skrawki z zastosowaniem kriostatu w celu wzbogacenia w komórki nowotworowe do około 80% całkowitej populacji komórek. W pewnych postaciach kwasy nukleinowe można ekstrahować z tych próbek z zastosowaniem technik dobrze znanych w dziedzinie. W innych postaciach kwasy nukleinowe wyekstrahowane z próbki tkanki można amplifikować z zastosowaniem technik dobrze znanych w dziedzinie. Poziom ekspresji MAGE-A3 można wykryć i porównać ze statystycznie istotnymi grupami i/lub grupami kontrolnymi pacjentów negatywnych względem MAGE-A3. [0061] W jednej postaci sposób diagnostyczny obejmuje określanie czy osobnik eksprymuje produkt genu MAGE-A3, przykładowo przez wykrycie poziomu odpowiedniego mrna i/lub białka produktu genu. Przykładowo z zastosowaniem takich technik jak analiza Northern blot, reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR), półilościowa RT-PCR, ilościowa RT-PCR, TaqMan PCR, hybrydyzacja in situ, immunoprecypitacja, analiza Western blot lub immunohistochemiczna. Według takiego sposobu, od osobnika można uzyskać komórki lub tkanki i poziom mrna i/lub białka można porównać z poziomem w tkance nieeksprymującej MAGE-A3. Technologia TaqMan PCR [0062] Polimeraza DNA Taq posiada aktywność 5'-3' egzonukleazy. W teście Taqman PCR stosuje się tą aktywność egzonukleazową do rozszczepiania podwójnie znakowanych sąd zhybrydyzowanych z sekwencjami docelowymi podczas amplifikacji metodą PCR. [0063] W skrócie, RNA ekstrahuje się z próbki oraz syntetyzuje się cdna (odwrotna tran-

17 skrypcja). Następnie cdna dodaje się do mieszaniny reakcyjnej do PCR zawierającej standardowe składniki do PCR (patrz przykładowo składniki dostarczane przez Roche (CA, USA) do Taqman PCR. Mieszanina reakcyjna dodatkowo zawiera sondę, która hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową matrycy pomiędzy dwoma starterami (tj. w obrębie sekwencji amplifikowanej w reakcji PCR, amplikonu ). Sonda zawiera fluorescencyjny barwnik reporterowy na 5'-końcu oraz barwnik wygaszający na 3'-końcu. Wygaszacz jest w stanie stłumić fluorescencję reportera, ale tylko gdy obydwa barwniki są blisko siebie: zachodzi to dla nienaruszonych sond. [0064] Podczas i po amplifikacji sonda jest degradowana przez polimerazę DNA Taq i jakakolwiek fluorescencja jest wykrywana. [0065] Do pomiarów ilościowych stosuje się taką liczbę cykli PCR, dla której fluorescencja osiąga wartość progową 10-krotnie wyższą niż odchylenie standardowe emisji linii podstawowej. Ta liczba cykli, nazywana progową liczbą cykli (Ct) jest odwrotnie proporcjonalna do wyjściowej ilości docelowego cdna i umożliwia pomiar ilości cdna. Zasadniczo, im więcej docelowego RNA jest obecne w próbce tym niższą uzyskuje się liczbę Ct. [0066] Pomiary uzyskane dla wartości Ct porównuje się z tymi uzyskanymi dla genu konstytutywnego. Pozwala to na dowolne błędy dotyczące ilości całkowitego RNA dodanego do każdej reakcji odwrotnej transkrypcji (w oparciu o absorbancję przy danej długości fali) oraz jego jakości (tj. degradacji): z których żadna nie jest wiarygodnym parametrem do zmierzenia wyjściowego materiału. Tak więc, transkrypty genu konstytutywnego oznacza się ilościowo jako endogenną kontrolę. Beta-aktyna jest jednym z najczęściej stosowanych niespecyficznych genów konstytutywnych, jednakże można zastosować inne. [0067] W niniejszym opisie i poniższych zastrzeżeniach, o ile kontekst nie wymaga inaczej, słowo zawierać oraz jego odmiany takie jak zawiera i zawierający należy rozumieć jako sugerujący włączenie wskazanej liczby lub etapu, lub grupy wspomnianych liczb lub etapów, ale nie wykluczenie jakiejkolwiek innej liczby lub etapu, lub grupy liczb lub etapów. [0068] Wynalazek będzie dalej opisany przez odniesienie do poniższych, nieograniczających przykładów, w których RT-PCR oznacza reakcję łańcuchową polimerazy z odwrotną transkrypcją. PRZYKŁADY Przykład 1 Półilościowa PCR - Zamrożone próbki tkanek Startery: SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 Ekstrakcja RNA: metoda oczyszczania RNA z zastosowaniem ciekłego azotu

18 [0069] Niewielki fragment tkanki szybko zamrożono w ciekłym azocie, a następnie umieszczono w moździerzu w celu mechanicznego rozdrobnienia tłuczkiem. 100 mg powstałego proszku dodano do 100 ul odczynnika do izolacji TriPure i RNA wyekstrahowano według instrukcji producenta (Qiagen, Venlo, Holandia). Stężenie RNA wyznaczono na podstawie wartości gęstości optycznej przy 260 nm. Półilościowa MAGE-A3 RT-PCR [0070] Półilościową RT-PCR przeprowadzono w sposób opisany przez De Plaen i in. (Immunogenetics 40:360, 1994). Syntezę cdna z 2 µg całkowitego RNA przeprowadzono w 20 µl mieszaniny zawierającej 1x bufor dla pierwszej nici, każdy z dntp w stężeniu 0,5 mm, 10 mm ditiotreitol, 20 U inhibitora rrnazy, 2 µm oligo(dt)15 i 200 U odwrotnej transkryptazy M-MLV przez 1 h 30 min w 42 C. 50 ng cdna zamplifikowano metodą PCR w 25 µl mieszaniny zawierającej startery specyficzne względem MAGE-A3 (SEQ ID NO: 1 i 2). Porcję 10 µl z każdej reakcji poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i uwidoczniono z zastosowaniem fluorescencji bromku etydyny. Wielkości amplikonów wynosiły odpowiednio 725 pz i 805 pz gdy zamplifikowano odpowiednio mrna i genomowy DNA (gdna). Kontrole pozytywne do półilościowej MAGE-A3 RT-PCR: [0071] Do tych doświadczeń wprowadzono trzy kontrole pozytywne: (i) Sklonowany fragment genomowego DNA MAGE-A3 dodano do każdej mieszaniny reakcyjnej do PCR. Uzyskuje się fragment wielkości 805 pz (o 80 pz większy niż fragment uzyskany z cdna) i jest zawsze obecny przy braku hamowania PCR. Pełni rolę kontroli pozytywnej do sprawdzenia wydajności PCR w próbkach negatywnych względem MAGE-A3; (ii) Dla każdego testu MAGE-A3, syntezę cdna przeprowadzono równolegle na próbkach nowotworu oraz na RNA wyekstrahowanym z linii komórek czerniaka Gerl MZ Aby próbki nowotworu zostały uznane za pozytywne muszą uzyskać sygnał wynoszący 1% poziomu dla linii komórkowej Gerl MZ cdna (iii) PCR dla beta-aktyny (Tabela 1) przeprowadzono na każdej próbce w celu wykrycia próbek z silnie zdegradowanym RNA. Jeżeli sygnał dla beta-aktyny uzyskany dla próbki nowotworu negatywnej względem MAGE-A3 był słabszy niż sygnał uzyskany dla MZ-2-3.0, liczbę cykli dostosowywano dla próbki klinicznej tak aby intensywność amplikonu beta-aktyny osiągnęła wymagany poziom. Kontrole negatywne do półilościowej MAGE-A3 RT-PCR: [0072] Do tych doświadczeń wprowadzono trzy kontrole negatywne:

19 (i) RNA wyekstrahowany z hodowli komórek LB 23-1/2, znanej jako negatywna względem MAGE-A3; (ii) kontrola z wodą w reakcji RT; oraz (iii) kontrola z wodą w etapach PCR. Interpretacja danych [0073] 50 ng próbkę mrna z próbki nowotworu uznawano za pozytywną względem MAGE-A3 gdy ilość amplikonu 725 pz była równa lub wyższa niż ilość amplikonu uzyskanego z użyciem 0,5 ng RNA z RNA linii komórkowej Gerl MZ (tj. równoważności 0,1% RNA Gerl; patrz kontrole pozytywne). Ilości oszacowano na podstawie fluorescencji bromku etydyny. Dodano kontrole pozytywne i negatywne. [0074] Klasy w półilościowej MAGE-A3 RT-PCR: do półilościowego testu MAGE-A3 RT-PCR przypisano pięć standardowych klas (De Plaen i in., 1994). Są to miary subiektywne i oznaczono je od ekspresji najniższej do najwyższej jako -, -/+, +, ++, +++. Przykład jak te klasy mogą zostać przypisane przedstawiono na Figurze 16: na tej figurze klasy przypisano na podstawie prążka wytworzonego dla kontroli pozytywnej jak przedstawiono w Tabeli 6, poniżej: Tabela 6 RNA kontroli pozytywnej ,5 Klasa / Przykład 2: Ilościowa Taqman RT-PCR w czasie rzeczywistym - zamrożone próbki tkanek Ilościowa Taqman RT-PCR w czasie rzeczywistym: [0075] Startery: SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4; Sonda: SEQ ID NO: 13 (egzon) Startery: SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6; Sonda: SEQ ID NO: 14 (intron) Półilościowa PCR (do badań porównawczych): [0076] Startery: SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 Materiały i Metody Pacjenci i pobieranie próbek [0077] Bioptaty guzów niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) w stadium IB i II uzyskano chirurgicznie. Pacjentów zakwalifikowano do dwóch prób klinicznych, GSK /004 (MAGE3-AS02B-004) i Epidemio-MAGE3-153; pacjenci podpisali świadomą zgodę i wytłumaczono im charakter i możliwe konsekwencje badań. Bezpośrednio po wycięciu chirurgicznym bioptaty zanurzono w roztworze stabilizującym RNA (RNA-later,

20 Ambion, Cambridge, UK) i przechowywano w -20 C. RNAlater jest odczynnikiem do przechowywania tkanek, który stabilizuje i chroni komórkowy RNA w nienaruszonych, nie zamrożonych próbkach tkanek. RNAlater eliminuje potrzebę natychmiastowego zamrażania tkanek w ciekłym azocie. Ekstrakcja RNA: Metoda oczyszczania RNA z zastosowaniem młynka miksującego [0078] Tkankę nowotworową usunięto z RNALater i dodano do odczynnika do izolacji TriPure (Roche, Vilvoorde, Belgia). Następnie tkankę dodano do młynka miksującego zawierającego wolframowe kulki. Po rozbiciu w młynku miksującym całkowity komórkowy RNA wyekstrahowano z maksymalnie 100 mg tkanki z użyciem odczynnika TriPure według instrukcji producenta (Qiagen, Venlo, Holandia). Stężenie RNA wyznaczono na podstawie wartości gęstości optycznej przy 260 nm. Test TaqMan RT-PCR MAGE-A3 - zamrożona tkanka. [0079] cdna odpowiadający 50 ng całkowitego RNA zamplifikowano metodą PCR w 25 µl mieszaniny zawierającej bufor TaqMan, 5 mm MgCl 2, 0,4 mm dutp, każdy z nukleotydów w stężeniu 0,2 mm, 0,625 U polimerazy DNA Ampli Taq Gold, 0,05 U UNG, każdy ze starterów oligonukleotydowych w stężeniu 0,2 µm oraz 0,2 µm sondę TaqMan. Zastosowano specyficzne startery oligonukleotydowe i sondy (Tabela 2; SEQ ID 3, 4 i 13 oraz SEQ ID 5, 6 i 14). Sondy były wyznakowane barwnikami FAM, NED i VIC (Applied Biosystems, CA, USA) i zawierały ugrupowanie wiążące się z mniejszą bruzdą (MGB ; także z Applied Biosystems, CA, USA). Dalsze doświadczenia obecnie prowadzi się z zastosowaniem barwnika FAM zamiast NED dla sond specyficznych względem MAGE. [0080] Egzon MAGE-A3 i geny beta-aktyny zamplifikowano metodą ilościowej PCR stosując chemię TaqMan przy użyciu układu 7700 lub 7900 (PE Applied Biosystems, Warrington, UK). Amplifikację metodą PCR przeprowadzono także w intronie genu MAGE- A3 w celu sprawdzenia braku zanieczyszczenia genomowym DNA. Profil amplifikacji był następujący: 1 cykl 2 min w 50 C, 1 cykl 12 min w 95 C i 35 cykli po 15 s w 95 C i 1 min w 60 C. Sygnał fluorescencyjny wytwarzany przez degradację sondy TaqMan wykrywano w czasie rzeczywistym podczas wszystkich etapów wydłużania. Weryfikacja testu Taqman RT-PCR do wyznaczania specyficzności względem MAGE-A3 [0081] Startery: SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4; Sonda: SEQ ID NO: 13 (egzon) - Taqman RT-PCR Startery: SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 (półilościowa PCR - do badań porównawczych)

21 Plazmidy i linie komórkowe [0082] Zastosowane plazmidy zawierały pełnej długości cdna genów MAGE-A1 (MAGE-1; nr dostępu Genbank NM_004988), MAGE-A2 (MAGE-2; nr dostępu Genbank L18920), MAGE-A3 (MAGE-A3; nr dostępu Genbank NM_005362), MAGE-A4 (MAGE-4; nr dostępu Genbank ), MAGE-A6 (MAGE-6; nr dostępu Genbank NM_005363), MAGE-A8 (MAGE-8; nr dostępu Genbank NM_005364), MAGE-A9 (MAGE-9; nr dostępu Genbank NM_005365), MAGE-A10 (MAGE-10; nr dostępu Genbank NM_021048), MAGE-A11 (MAGE-11; nr dostępu Genbank NM_005366) i MAGE- A12 (MAGE-12; nr dostępu Genbank NM_005367). Linie komórkowe MZ (pozytywna względem MAGE-A3) i LB 23-1/2 (negatywna względem MAGE-A3) zostały uprzejmie udostępnione przez Profesora Thierry Boon, Ludwig institute, Brussels, Belgia. Specyficzność metody MAGE-A3 TaqMan zbadano z zastosowaniem 1x10 4, 1x10 5 i 1x10 6 kopii plazmidów zawierających pełnej długości cdna genów MAGE-A1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 i 12. [0083] Porównanie sekwencji genów MAGE A (MAGE 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11 i 12) w obszarze dla którego zaprojektowano startery i sondy do PCR dla MAGE-A3 przedstawiono na Figurze 14. Sekwencje starterów w przód i w tył MAGE-A3 podkreślono; sekwencję sondy MAGE-A3 otoczono ramką. Startery w tył są komplementarne do regionu sekwencji, którą rozpoznają, tj. A oznacza T; G oznacza C; T oznacza A; a C oznacza G. [0084] Kontrole pozytywne do MAGE-A3 TaqMan RT-PCR: (i) fragment genomowego DNA MAGE-A3 i (ii) znane ilości RNA wyekstrahowanego z linii komórkowej Gerl MZ (linia komórek czerniaka pozytywna względem MAGE-A3). [0085] Kontrole negatywne do MAGE-A3 TaqMan RT-PCR: (i) RNA wyekstrahowany z hodowli komórek LB 23-1/2, które są znane jako negatywne względem MAGE-A3, (ii) ślepa próba z wodą w reakcji RT i (iii) ślepa próba z wodą w etapach PCR. Przeprowadzono 40 cykli RT-PCR. Kontrola negatywna musi być 35. Niektóre z wyników doświadczeń TaqMan przedstawiono jako 1/Ct. Statystyka: Porównanie dwóch technik PCR [0086] Tablicę wielodzielczą 2 x 2 utworzono w celu porównania wyników z półilościowej RT-PCR (startery SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2) i ilościowej Taqman PCR w czasie rzeczywistym (startery: SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4; sonda: SEQ ID NO: 13), z zastosowaniem opisanych tutaj technik (Tabela 3). Zmienna skali nominalnej była opisana przez dwie wartości: pozytywną i negatywną. Wartości negatywne obejmowały zero i ocenę graniczną; określenie ocena graniczna oznacza ocenę pomiędzy 0,8% a 1,2% Gerl w półilościowej RT-PCR i wszystkie wyniki poniżej 1% w teście TaqMan. Wartości pozytywne

22 sklasyfikowano w oparciu o wzrokową ocenę prążków w żelu w porównaniu z ekspresją beta-aktyny dla metody półilościowej RT-PCR oraz obejmowały one wszystkie wyniki 1% z testu TaqMan. Zgodność pomiędzy tymi dwiema metodami obliczono jako liczbę próbek z wynikami podwójnie negatywnymi i wynikami podwójnie pozytywnymi podzieloną przez całkowitą liczbę próbek. Do porównania proporcji niezgodnych par (negatywna-pozytywna) zastosowano test McNemara. Obliczono przedziały ufności (CI). Optymalizacja ilościowej TaqMan RT-PCR [0087] TaqMan RT-PCR dla MAGE-A3 z użyciem Sybr Green. [0088] Sybr Green jest składnikiem, który nieselektywnie wiąże amplikony bez sondy specyficznej względem sekwencji. RT-PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono na klonach genów z rodziny MAGE-A stosując cztery różne rozcieńczenia klonów MAGE-A (20 pg, 2 pg, 0,2 pg i 0,02 pg) (Figura 1, gdzie wyniki przedstawiono jako 1/CT na osi Y). Wynik pozytywny uzyskano dla MAGE-A3 przy Ct 14 i wartość Ct 16 uzyskano dla MAGE-A6 (przy 20 pg plazmidów). MAGE A4, A8 i A9 wykazały poziom Ct 30, a inne geny MAGE wykazały bardzo ograniczoną ekspresję przy Ct 35 i powyżej. TaqMan RT-PCR dla MAGE-A3 z użyciem sondy specyficznej względem sekwencji. [0089] Z zastosowaniem tych samych starterów MAGE-A3 (SEQ ID 3 i 4), ale z sondą (SEQ ID No 13), zbadano efektywność odróżniania MAGE-A3 od A6 przy użyciu różnych rozcieńczeń odpowiednich klonów członków rodziny MAGE-A (Figura 2). Po pierwsze, zaobserwowano oczekiwany spadek Ct dla MAGE-A3 w każdym z rozcieńczeń. Klon MAGE-A6 nie wykazał wysokiej wartości 1/Ct, gdy zastosowano sondę, co wskazuje na brak reaktywności krzyżowej. [0090] Dodanie 1 x 10 6 plazmidu MAGE-A6 do rozcieńczenia plazmidu MAGE-A3, jak przedstawiono na Figurze 3, nie wywarło żadnego wpływu oraz wynik odzwierciedlał wynik mianowania plazmidu MAGE-A3. Wskazuje to na brak efektu współzawodnictwa MAGE-A6 w obecności MAGE-A3 przy stosowaniu TaqMan PCR. Wyniki Ekspresja MAGE-A3 w nowotworach, porównanie metody półilościowej i ilościowej [0091] Ilościową specyficzną TaqMan PCR dalej weryfikowano względem standardowej półilościowej RT-PCR dla MAGE-A3 (z zastosowaniem starterów SEQ ID No 1 i 2). 71 próbek nowotworów od pacjentów NSCLC zastosowano do bezpośredniego porównania ekspresji MAGE-A3 między metodą ilościową (z użyciem starterów SEQ ID NO: 3 i 4 oraz sondy SEQ ID NO: 13) i półilościową (z użyciem starterów SEQ ID NO: 1 i 2). [0092] Wyniki wskazują dobrą zgodność wynoszącą 95,8% (Tabela 3) pomiędzy tymi dwoma metodami z 68/71 próbek zgodnych. Testy metodą ilościowej TaqMan RT-PCR i