aktualności biomérieux Diagnostyka bliska pacjentom czerwiec 2010 Diagnostyka źródłem dobrego zdrowia

Transkrypt

1 53 czerwiec 2010 aktualności biomérieux Diagnostyka bliska pacjentom Diagnostyka źródłem dobrego zdrowia

2 Spis treści 2 od wydawcy 3 Test VIDAS HIV-DUO ULTRA w diagnozowaniu zakażenia HIV 7 StandLab IQs trzyletnie doświadczenia w grupie użytkowników analizatorów KONELAB 11 Automatyczny analizator moczu w laboratorium mikrobiologicznym 12 Porównanie wybranych metod identyfikacji bakterii beztlenowych doświadczenia własne 14 Zalecenia Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST 17 KOMUNIKAT NR 1 biomérieux SA Aktualizacja automatycznych systemów do identyfikacji i oznaczania lekowrażliwości Vitek2 oraz Vitek2 compact według wytycznych EUCAST 18 Biofilm bakteryjny trudności diagnostyczne i kliniczne 22 Działalność biomérieux Polska w zakresie profilaktyki HIV/AIDS w Polsce 23 Działalność szkoleniowa biomérieux Polska wydawca: biomérieux Polska Sp. z o.o. Osoba odpowiedzialna: Elżbieta Wójcik Osoby biorące udział w przygotowaniu nr 53: Marcin Iszkuło Piotr Czajka Ireneusz Popławski Mirosław Kachalik Piotr Szczegłow Aneta Tarnowska (korekta) od wydawcy Szanowni Państwo, Przedstawiamy kolejny numer Aktualności biomérieux. Mam nadzieję, że będzie równie interesujący jak poprzednie numery naszego pisma. Chciałabym zwrócić Państwa uwagę na diagnostykę zakażeń wirusem HIV w artykule Pani dr A. Olczak. Temat bardzo istotny, a dla nas szczególnie, ponieważ nasza firma włącza się w działanie na rzecz profilaktyki HIV/AIDS w Polsce. Przedstawiamy również nowe zalecenia Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST, które będą obowiązywały w Polsce od 1. stycznia 2011 roku. Zostały one przedstawione przez Panią dr D. Żabicką. Zamieszczamy także komunikat na temat przystosowania systemów firmy biomérieux w tym Vitek 2 compact i Vitek 2 do zaleceń EUCAST. Będziemy informowali Państwa o działaniach naszej firmy w przygotowaniu do wdrożenia zaleceń EUCAST. Bardzo ciekawe jest opracowanie dotyczące trzyletniego doświadczenia firmy StandLab w dziedzinie kontroli jakości z użytkownikami analizatorów Konelab. Analiza parametrów biochemicznych i zmiany w kontroli jakości użytkowników systemów Konelab stanowią bardzo ciekawą lekturę i pokazują, jaką wagę przywiązujemy do kontroli jakości w pracy każdego laboratorium. Nowy temat, który pojawia się na łamach naszego pisma, to biofilm bakteryjny, gdzie występuje i jakie trudności napotykamy w jego diagnostyce. W tym numerze Aktualności przekazujemy informacje na temat naszych produktów stosowanych w diagnostyce zakażeń HIV i mikrobiologicznej diagnostyce moczu. Więcej informacji znajdą Państwo na naszej stronie internetowej Zapraszam również do korzystania z biblioteki technicznej produktów (Technical Library) dostępnej dla Państwa na naszej stronie. Adres redakcji i wydawcy: biomérieux Polska Warszawa, ul. Żeromskiego 17 tel. (22) fax (22) opracowanie graficzne i druk: Agencja Wydawnicza SOWA Życzę miłej lektury. Dr Elżbieta Wójcik Dyrektor Generalny biomérieux Polska

3 wirusologia Test VIDAS HIV DUO ULTRA w diagnozowaniu zakażenia HIV dr n. med. Anita Olczak Klinika i Katedra Chorób Zakaźnych i Hepatologii CM UMK w Bydgoszczy Na przełomie 1980 i 1981 roku w Los Angeles, Nowym Yorku i San Francisco opisano przypadki zachorowań związane ze skrajnym upośledzeniem odporności. Obserwowane schorzenie w 1982 roku nazwano zespołem nabytego niedoboru odporności (AIDS skrót od angielskich słów Aquired ImmunoDeficiency Syndrome). Czynnik etiologiczny choroby wyizolowano w 1983 roku i ostatecznie nadano mu nazwę HIV (Human Immunodeficiency Virus). Znane są dwa ludzkie wirusy upośledzenia odporności: HIV-1 i wyizolowany w roku 1985 HIV-2. W późniejszym okresie scharakteryzowano również liczne odmiany genotypowe HIV-1. Genotypy oznaczone kolejnymi literami od A do K należą do grupy podtypów M (Major). Dodatkowo wyodrębniono podtyp O (Outlier), który wykazuje jedynie 50% homologię z genotypami należącymi do podtypu M oraz podtyp N (New). Ponadto odkryto wiele rekombinantów stanowiących mozaikę różnych wariantów genetycznych. Zakażenia HIV-2 występują przede wszystkim w Afryce, ale coraz częściej ten typ infekcji rozpoznaje w różnych regionach świata. W skali globalnej dominuje HIV-1 C, ale w Europie występują głównie podtypy A i B. Różnorodność wariantów genetycznych zmusza do ulepszania technik diagnostycznych. W roku 2009 liczba zakażonych HIV na świecie przekroczyła 40 milionów. W Polsce od wdrożenia badań w marcu 1985 roku do 30. listopada 2009 zakażenie HIV potwierdzono u osób. W omawianym okresie rozpoznano 2305 przypadków AIDS. Przenoszenie wirusa następuje w drodze kontaktów heteroseksualnych, homoseksualnych, poprzez zakażoną krew oraz z matki na dziecko w czasie ciąży, porodu oraz karmienia piersią. W polskich warunkach w początkowym okresie dominowały zakażenia wśród osób przyjmujących dożylne środki odurzające, obecnie narkomani stanowią mniej niż 50% chorych, a 2,4% stanowią dzieci zakażone wertykalnie. Dane szacunkowe wskazują że rzeczywista liczba osób żyjących z HIV w Polsce jest znacznie wyższa, a chorobę najczęściej rozpoznaje się w zaawansowanym okresie AIDS. Problem jest istotny, ponieważ wczesne wykrycie zakażenia HIV poprawia odległe rokowanie, a u kobiety w ciąży daje szansę na wdrożenie profilaktyki farmakologicznej i znaczące obniżenie ryzyka transmisji. Wczesne wykrywanie zakażeń odgrywa istotną rolę w ograniczaniu rozmiarów epidemii. W okresie ostatnich 15. lat wprowadzono metody leczenia skutecznie hamujące replikację wirusa i stwarzające warunki odbudowy układu immunologicznego. Współczesna terapia antyretrowirusowa spowodowała wydłużenie i poprawę jakości życia osób zakażonych HIV. W krajach, w których leczenie jest dostępne odnotowano zmniejszenie zachorowań na AIDS oraz zmniejszenie śmiertelności z tego powodu. Przy obecnym stanie wiedzy testowanie kobiet w ciąży należy do rutynowych badań prenatalnych. W Polsce badania te są rekomendowane przez Polskie Towarzystwo Naukowe AIDS oraz przez Polskie Towarzystwo Ginekologiczne. Naturalny przebieg zakażenia HIV W przebiegu zakażenia HIV wyróżnia się trzy zasadnicze etapy: ostre (pierwotne zakażenie HIV), okres klinicznie bezobjawowy AIDS. Pierwotne zakażenie HIV obejmujące okres od ekspozycji do wytworzenia przeciwciał charakteryzuje się gwałtowną replikacją wirusa czemu w większości przypadków towarzyszą różnorodne objawy kliniczne i zawsze duża zakaźność. Bogata symptomatologia oraz podobieństwo do innych ostrych chorób wirusowych powodują, że choroba jest rzadko brana pod uwagę w diagnostyce różnicowej. Zespół tych objawów nazywany ostrą chorobą retrowirusową pojawia się najczęściej w drugim tygodniu po ekspozycji i ustępuje w okresie serokonwersji. Z uwagi na podobieństwo kliniczne ostre zakażenie HIV często przebiega jako zespół mononukleozo-podobny z gorączką, powiększeniem węzłów chłonnych i zapaleniem gardła. W badaniach laboratoryjnych podobnie jak w zakażeniach wirusem EBV lub CMV stwierdza się obecność limfocytów atypowych i nie stwierdza się przeciwciał anty-hiv. Gorączka utrzymująca się przez 3-4 tygodnie jest najczęstszym objawem pierwotnego zakażenia, dlatego też w diagnostyce stanów gorączkowych badania w kierunku zakażenia HIV powinny być wykonywane rutynowo. Obecność antygenu p24 przy jednoczesnym braku przeciwciał anty-hiv nasuwa podejrzenie zakażenia pierwotnego, a metodą potwierdzającą rozpoznanie jest wykazanie obecności materiału genetycznego wirusa. Choroba ma charakter samoograniczający, objawy ustępują bez leczenia i rozpoczyna się wieloletni 3

4 4 okres bezobjawowy. W praktyce oznacza to, że chory pozostanie nieświadomy zakażenia HIV przez wiele lat. AIDS rozwija się najczęściej po kilkunastu latach. Wczesne rozpoznanie zakażenia ma zasadnicze znaczenie dla osoby dotkniętej chorobą jak i dla szeroko pojętego zdrowia publicznego. Według danych szacunkowych w Polsce jedynie co trzecia osoba zakażona HIV jest tego świadoma. Wieloletnie przekonanie, że choroba dotyczy jedynie wąskiego marginesu społecznego powoduje, że wielu pacjentów nie dostrzega istniejącego ryzyka. Metody diagnostyczne pozwalające na rozpoznanie zakażenia zarówno w fazie ostrej jak przewlekłej są szczególnie przydatne w badaniach przesiewowych, a zwłaszcza u kobiet w ciąży, osób po ekspozycji na materiał zakaźny oraz w diagnostyce stanów gorączkowych i szeroko pojętej diagnostyce zakażenia pierwotnego. Diagnostyka zakażenia HIV W laboratoryjnym rozpoznawaniu zakażenia HIV zasadnicze znaczenie mają badania przesiewowe. W 1985 roku FDA (Federal Drug Administration) zatwierdziła pierwszy test wykrywający przeciwciała anty-hiv. Od tego czasu testy diagnostyczne były wielokrotnie modyfikowane w celu poprawy ich czułości i swoistości. Obecnie stosowane testy cechują się 99,5% swoistością co w praktyce oznacza, że jedna na 200 negatywnych próbek może dać wynik fałszywie dodatni. Najczęściej zjawisko fałszywie dodatnich wyników występuje w stanach pobudzenia układu immunologicznego, chorobach o podłożu autoimmunologicznym, w innych zakażeniach wirusowych, niektórych nowotworach, u pacjentów dializowanych oraz w ciąży. Każdy wynik dodatni wymaga weryfikacji, a pacjent otrzymuje wynik ostateczny. Współczesna diagnostyka zakażenia HIV jest nie tylko jedną z najbardziej złożonych, ale również najskuteczniejszych w wirusologii klinicznej. W naturalnym przebiegu choroby laboratoryjne markery infekcji pojawiają się we krwi w pewnym chronologicznym porządku. Wielkość okna diagnostycznego, czyli czasu jaki upływa od zakażenia do pojawienia się laboratoryjnych dowodów obecności patogenu jest związana z rodzajem wykonywanych testów. Najwcześniejszym wykładnikiem jest HIV RNA, który staje się wykrywalny pomiędzy 11. a 12. dniem zakażenia, nieco później bo już pomiędzy 12. a 13. dniem można wykazać obecność należącego do białek nukleokapsydu antygenu p24 HIV-1. Produkcja swoistych przeciwciał rozpoczyna się już w drugim tygodniu infekcji, ale wieloletnie badania obserwacyjne wykazały, że u 60-65% pacjentów obecność swoistych przeciwciał wykrywa się w 4. tygodniu, u 80% w 6. tygodniu i u 95% w 12. tygodniu infekcji. Metody diagnostyczne wykrywające antygen p24 lub materiał genetyczny wirusa dają możliwość skrócenia okna diagnostycznego do 1-2 tygodni. Wraz z rozwojem odpowiedzi immunologicznej obniża się stężenie HIV RNA oraz Ag p24 HIV-1 i w rzadkich przypadkach może wystąpić drugie okno diagnostyczne. Obecnie w większości krajów w badaniach przesiewowych wykorzystuje się testy należące do IV generacji. Wykazują one nie tylko wyższą w porównaniu z testami niższych generacji swoistość diagnostyczną, ale zawierają także przeciwciała umożliwiające wykrycie antygenu p24 HIV-1. Najnowszy wariant VIDAS HIV DUO Ultra dodatkowo informuje o przyczynie wyniku dodatniego. W tym teście otrzymujemy dwa wyniki: jeden odnoszący się do przeciwciał i drugi dotyczący antygenu. Test VIDAS HIV DUO Ultra jest automatycznym, jakościowym testem przesiewowym opartym na równoczesnym wykrywaniu przeciwciał anty-hiv-1 grupy M oraz O, wszystkich typów immunoglobulin anty- HIV-2 oraz antygenu p24 HIV-1 z zastosowaniem metody enzymoimmnofluorescyjnej (ELFA). W części wykrywającej przeciwciała wykorzystuje się syntetyczne peptydy gp41 i gp36. W celu wykrycia antygenu p24 wykorzystano monoklonalne przeciwciała anty-p-24. Podczas inkubacji antygen p24 jest uwalniany w wyniku lizy cząstek wirusa i wychwytywany przez monoklonalne przeciwciała. Kompleksy Ag p24/anty-p24 przyłączają się do znakowanego nośnika i są odczytywane automatycznie. Wynik uzyskuje się w ciągu 100 minut. W badaniach porównujących testy IV generacji potwierdzono znamienne statystycznie skrócenie okna diagnostycznego, jak również wyższą czułość tych testów w porównaniu z testami wykrywającymi jedynie pojedynczy marker zakażenia. W zakresie wykrywania przeciwciał w porównaniu z testami III generacji zakażenie rozpoznawano o średnio 8,1 dnia wcześniej. Ze względu na rangę problemu o wyborze metod diagnozowania i interpretacji wyników powinien decydować lekarz. Zgodnie z obowiązującymi zasadami każdy dodatni wynik testu przesiewowego wymaga weryfikacji. Test VIDAS HIV DUO Ultra ułatwia wybór metody potwierdzenia i usprawnia dalszą diagnostykę. Wynik dodatni wskazujący na obecność przeciwciał może być wyrazem dokonanej serokonwersji, a dalsze badania mają na celu potwierdzenie lub wykluczenie obecności przeciwciał przeciwko poszczególnym antygenom wirusa. Ten algorytm jest znany od dawna i stanowi złoty standard w diagnostyce

5 zakażenia HIV. Podobnie jak testy wykorzystywane w badaniach przesiewowych również testy potwierdzające były wielokrotnie modyfikowane. Najczęściej stosowane są testy typu western blot (WB) zawierające białka antygenowe pochodzenia wirusowego oraz testy LIA (line immunoassay) zawierające antygeny syntetyczne lub białka rekombinowane. W skład antygenów wchodzą białka rdzenia (p18, p24, p55), enzymatyczne (p34, p52, p68) oraz białka otoczki (gp41, gp120, gp160). Najnowsze testy LIA oraz WB zawierają również dodatkowo antygeny otoczki wirusa HIV-2 (gp36, sgp105). Dane co do interpretacji wyniku podaje producent, ale przyjmuje się, że wynik jest dodatni gdy w badanym materiale obecne są przeciwciała reagujące co najmniej z dwoma antygenami różnych regionów. Testy IV generacji, w tym VIDAS HIV DUO Ultra mają szczególne zastosowanie w pierwotnym zakażeniu HIV. W tym okresie choroby tradycyjne metody potwierdzające są nieprzydatne. Nie oznacza to jednak konieczności wykonywania badań molekularnych we wszystkich przypadkach. Ze względu na wysoki koszt uzasadniona jest dalsza diagnostyka u chorych z zespołem objawów sugerujących ostrą chorobę retrowirusową oraz u kobiet w ciąży. W pozostałych przypadkach zaleca się kontrolne badania po 2-4 tygodniach, lub wykonanie testów wykrywających tylko Ag p24 HIV-1. Doświadczenia własne W ostatnim czasie w naszej klinice, w której rutynowo stosujemy w badaniach przesiewowych VIDAS HIV DUO Ultra pierwotne zakażenie HIV zostało rozpoznane u trzech pacjentów diagnozowanych z powodu stanów gorączkowych oraz u pacjenta po ekspozycji zawodowej. Ten ostatni przypadek zasługuje na szczególną uwagę. W dniu ekspozycji u pracownika służby zdrowia wykonuje się rutynowo badania w celu ustalenia statusu serologicznego: anty-hiv, anty-hcv, anty-hbc, HBsAg. Test HIV DUO Ultra wykazał obecność Ag p24 i brak przeciwciał, zarówno w tym teście jak w teście III generacji. Zakażenie HIV zostało potwierdzone obecnością HIV RNA. Przypadek ten zwraca uwagę na znaczenie okna diagnostycznego. Gdyby wykonano test III generacji, zakażenie HIV zostałoby rozpoznane w czasie profilaktyki poekspozycyjnej lub po jej zakończeniu i jako drogę zakażenia należałoby uznać ekspozycję zawodową. Prawo pracownika do roszczeń jak również uznanie choroby zawodowej byłoby uzasadnione. Ogromne znaczenie ma wczesne rozpoznawanie zakażenia HIV w ciąży. Ryzyko zakażenia dziecka jest proporcjonalne do wysokości wiremii u matki, a ta jest bardzo wysoka przed wytworzeniem przeciwciał. W wielu krajach, w tym również w Polsce rekomenduje się, wykonywanie przesiewowych testów u wszystkich kobiet we wczesnym okresie ciąży. Test na HIV powinien być powtarzany, jeśli rodzice podejmują w czasie ciąży ryzykowne zachowania, albo gdy w czasie ciąży rozpoznaje się inne choroby przenoszone drogą płciową. Co trzecia kobieta zakażona HIV może urodzić zakażone dziecko. Zastosowanie leków w czasie ciąży, porodu oraz przez noworodka daje możliwość zmniejszenia prawdopodobieństwa zakażenia dziecka do poniżej 1%, stąd tak ważne jest wykonywanie badań u kobiet, a zwłaszcza ich wczesne wykrywanie. Reasumując test VIDAS HIV DUO Ultra dzięki wysokiej czułości i oddzielnym wynikom dla przeciwciał i antygenu stanowi cenne narzędzie diagnostyczne i powinien być rutynowo stosowany w badaniach przesiewowych. 5

6 od badań przesiewowych do testów genetycznych Immunochromatograficzne testy przesiewowe Automatyczne testy 4. generacji Vidas HIV DUO Quick & Ultra Amplfikacja i pomiar ilościowy Real-Time wiremii HIV-1

7 chemia kliniczna StandLab IQs trzyletnie doświadczenia w grupie użytkowników analizatorów KONELAB mgr Mirosław Firlej StandLab, Bystra Krakowska Na początku lutego 2010 roku minęła czwarta rocznica funkcjonowania StandLab. Jego najważniejszymi celami przy powstaniu były uproszczenie i ujednolicenie analiz kontrolnych w laboratoriach medycznych oraz harmonizacja wyników badań. Dzięki technologii internetowej możliwe stało się szybkie porównanie własnych wyników ze średnią uzyskaną w grupie stosującej takie same materiały kontrolne. Obecnie z programu aktywnie korzysta około 400. laboratoriów. Mają do dyspozycji około 300. testów zgrupowanych w 12. działach. W zależności od potrzeb można wybierać wśród 60. jednostek analitycznych i 400. metod wprowadzonych do systemu. Obecnie użytkownicy dodają do bazy po około 260 tysięcy wyników każdego miesiąca. Od początku działalności przeanalizowano ponad 5,5 miliona kontroli. W 2007 roku StandLab rozpoczął współpracę z biomérieux Polska Sp. z o. o. Objęła ona użytkowników analizatorów KONELAB. Z uwagi na dużą grupę użytkowników uzyskane dane mogły w znaczący sposób ułatwić nadzór nad wynikami badań otrzymanych z urządzeń wstawionych do laboratoriów. Początkowo korzystało z programu 60. użytkowników, w 2009 liczba ta wzrosła do 77. Odpowiednio zwiększyła się też liczba danych przesłanych do systemu. (Rys.1) W ramach nadzoru wyznaczono osoby, które interweniowały w przypadku pogarszania się jakości wyników kontrolnych. Z uwagi na swoje duże doświadczenie w zakresie obsługi analizatorów KONELAB potrafiły one pomóc w zakresie aplikacyjnym. Wyniki przedstawione w tym artykule są w dużej mierze zasługą tych osób. Rys. 1. Liczba oznaczeń wprowadzonych do programu liczba oznaczeń Użytkownicy wykonujący oznaczenia na analizatorach KONELAB na ogół wykorzystują odczynniki i materiały kontrolne firm biomérieux oraz Thermo Fisher Scientific. Zauważa się systematyczny wzrost udziału materiałów kontrolnych Thermo Fisher Scientific. (Rys. 2) Do końca 2009 roku w bazie danych StandLab zarejestrowano 12 serii Lyotrol N, 9 Lyotrol P, 6 Zymotrol z firmy biomérieux. Użytkownicy korzystali ponadto z 6. serii Nortrolu, 5. Abtrolu oraz 4. CKMB z firmy Thermo Fisher Scientific. W użyciu były również materiały kontrolne innych firm, ale ich udział w ogólnej liczbie oznaczeń nie przekraczał 10%. W 2009 roku spadł do 6,2%. Rys. 2. Udział materiałów kontrolnych w wykonywanych oznaczeniach 100% 80% 60% 40% 20% 0% inne biomérieux Thermo Po okresie trzech lat korzystania z systemu można już dokładniej przyjrzeć się, w jaki sposób ścisła analiza wyników kontroli laboratoryjnej przez dostawcę sprzętu i odczynników wpływa na jakość w laboratoriach. W analizach wykorzystano dane uzyskane z systemu StandLab IQs z lat Do zestawień wykorzystano wartości obciążenia - Δ[%] i nieprecyzyjności CV [%] uzyskane z miesięcznych zestawień całej grupy klientów. W celu uwiarygodnienia statystyki do obliczeń wykorzystywano wyłącznie dane od tych użytkowników, którzy w danym miesiącu dokonali przynajmniej 14. wpisów kontrolnych dla danego testu. Wartości Δ% i CV wyliczone z mniej niż 14. oznaczeń w miesiącu zostały pominięte w poniższym opracowaniu. Przy obliczeniach średnich błędów obciążenia uwzględniano znak ujemny przy wartościach mających znaczenie przy określeniu obciążenia ujemnego (zaniżanie wyników) lub dodatniego (zawyżanie). Do obliczeń wykorzystywano tabele przestawne programu EXCEL. Przeprowadzono porównania wartości obciążenia i błędu nieprecyzyjności w kolejnych latach analiz. 7

8 8 Z uwagi na większą czytelność wykresów zestawiono wyniki łącząc parametry w trzy grupy: substraty, enzymy i elektrolity. W grupie substratów przeanalizowano 11 parametrów (rys. 3): albuminę, bilirubinę całkowitą, cholesterol, glukozę, cholesterol-hdl, kreatyninę, cholesterol-ldl, triglicerydy, białko całkowite, kwas moczowy i mocznik. W 2007 roku w całej analizowanej grupie błąd obciążenia przekraczał 2%, w pięciu parametrach wartość ta oscylowała lub nawet przekraczała 4%. Średnie wartości obciążenia były wartościami dodatnimi. Najniższą wartość osiągnęła albumina 1,82%, najwyższą cholesterol-ldl 6,13%. Do roku 2009 nastąpiła poprawa we wszystkich analizowanych testach. W całej grupie maksymalny błąd obciążenia był w obszarze ±2% z czego w 8. na 11. parametrów osiągnęły wartość poniżej ±1%. W pięciu parametrach średnie wartości przyjęły znak ujemny, lecz jak wspomniano powyżej, jego wartość jest niewielka. Rys. 3. Średnia wartość obciążenia [%] dla substartów ALB BIL-T CHOLGLU HDL-bezp KREA LDL TG T-PROT UA UREA 2009 Analizując błędy nieprecyzyjności w grupie substratów widać większą stabilność tego parametru w czasie. (rys. 4) W sześciu przypadkach wartości CV oscylowały wokół tej samej wartości przez cały analizowany okres. W pozostałych przypadkach o znacznej poprawie można mówić w przypadkach kreatyniny i cholesterolu-ldl. Relatywnie znaczny spadek nastąpił również w albuminie. W 2007 roku dwa z analizowanych parametrów (kreatynina, cholesterol-ldl) cechowały się nieprecyzyjnością przekraczającą 4%. W 2009 roku wartości te spadły odpowiednio do 2,91 i 3,47%. Rys. 4. Średnia wartość nieprecyzyjności [%] dla substartów 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 ALB BIL-T CHOLGLU HDL-bezp KREA LDL TG T-PROT UA UREA 2009 Porównując oba parametry jakościowe równocześnie widać, że największa poprawa nastąpiła w przypadku kreatyniny i cholesterolu-ldl. Z uwagi na powszechność oznaczenia kreatyniny oraz znaczenie diagnostyczne zbadano możliwe przyczyny korzystnych zmian w tym oznaczeniu. W ciągu minionych trzech lat wzrosła popularność metody enzymatycznej w oznaczaniu kreatyniny. Porównując strukturę w liczbie wykonywanych oznaczeń w zależności od metody (rys. 5) widać, że udział metody enzymatycznej wzrósł do prawie 50%. Należałoby się zastanowić czy zmiana metody z Jaffe na enzymatyczną mogła przyczynić się do znacznej poprawy wskaźników obciążenia i nieprecyzyjności. Rys. 5. Struktura oznaczeń kreatyniny wg metod 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Jaffe Enzymatyczna PAP Na rys. 6 porównano zmianę obciążenia dla każdej z metod. Widać, że w obu nastąpiła poprawa. W metodzie Jaffe efekt był bardziej widoczny. W tym przypadku błąd zmniejszył się z 3,97% w 2007 do 0,23% w 2009 roku. Ogółem można zatem stwierdzić, że poprawa w zakresie obciążenia nie jest efektem zmiany metody, tylko zmian w zakresie obsługi aplikacyjnej i serwisowej urządzeń. Rys. 6. Wartość obciążenia [%] dla dwóch metod kreatyniny 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Enzymatyczna PAP Jaffe 2009 Inaczej sytuacja wygląda w przypadku analizy nieprecyzyjności. (rys. 7) W tym przypadku widać, że metodę enzymatyczną cechuje prawie dwukrotnie lepsza precyzja w porównaniu z tradycyjną metodą pikrynianową. W ciągu trzech lat CV w tej metodzie oscylowało w okolicy 2%, podczas gdy metoda Jaf-

9 fe go nawet po poprawie nie osiąga wartości poniżej 3,6%. Poprawa w zakresie nieprecyzyjności w kreatyninie jest zatem efektem większego udziału metody enzymatycznej, w mniejszym stopniu również poprawą w tego parametru w metodzie Jaffe. Rys. 7. Wartość nieprecyzyjności [%] dla dwóch metod kreatyniny 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Enzymatyczna PAP Jaffe 2009 Rys. 8. Zależność obciążenia [%] od mierzonej wartości dla dwóch metod oznaczeń kreatyniny 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Enzymatyczna PAP µmol/l Jaffe µmol/l Rys. 9. Zależność nieprecyzyjności [%] od mierzonej wartości dla dwóch metod oznaczeń kreatyniny 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Enzymatyczna PAP µmol/l Jaffe µmol/l Można się dalej zastanawiać, czy ta kilkuprocentowa przewaga jakościowa metody enzymatycznej jest wystarczającym powodem do jej wyboru. Wzrost udziału tej metody musi mieć jednak swoje większe uzasadnienie. Na kolejnych wykresach (rys. 8 i 9) przedstawiono średnie parametry błędów obejmujące wyniki z trzech lat, ale w rozbiciu na zakres wartości mierzonego parametru. Pierwszą grupę obejmują materiały kontrolne o wartościach kreatyniny zbliżonych do fizjologicznych ( µmol/l). Drugą grupę stanowiły surowice o wartościach patologicznych ( µmol/l). Z zestawień widać, że metoda enzymatyczna jest znacznie bardziej precyzyjna i mniej obciążona w zakresie wartości niskich i takich, gdzie występuje próg decyzyjny. W tym zakresie zauważa się około trzykrotną różnicę w błędzie obciążenia, a około dwukrotną w nieprecyzyjności. Dla diagnostów są to cechy nie do podważenia, stąd prawdopodobny wzrost popularności tej metody. W grupie enzymów przeanalizowano 10 oznaczeń: ALAT, ALP (DGKC), ALP (IFCC), Amylazę, ASPAT, CK-MB, CK-NAC, GGTP, LDH (mleczan->pirogronian), LDH (pirogronian->mleczan). W roku 2007 wszystkie parametry z wyjątkiem LDH-P były obciążone powyżej 2%. W ALP (DGKC), ALP (IFCC), GGTP, LDH-P wartości tego błędu przekraczały 4%. Średnie obciążenia wszystkich parametrów miało znak dodatni. W 2009 poprawiły się wartości obciążenia wszystkich testów z wyjątkiem LDH-L. W sześciu na 10 badanych testów obciążenie spadło do wartości poniżej ±1%. Nieznacznie poprawiła się wartość obciążenia fosfatazy alkalicznej metodą IFCC Osiągnęła wartość -4,08%. Ujemny znak przed wartością wskazuje na zaniżanie w stosunku do wartości oczekiwanej. Rys. 10. Średnia wartość obciążenia [%] dla enzymów ALAT (GPT) ALP DGKC ALP-IFCC AMYL ASPAT (GOT) CK-MB CK-NAC GGTP LDH-L LDH-P 2009 Analizując błędy nieprecyzyjności dla oznaczeń enzymatycznych (Rys. 11) widać, że podobnie jak w przypadku substratów w większości przypadków współczynniki zmienności prawie nie zmieniły się. W pięciu przypadkach nastąpił niewielki spadek. Znaczna poprawę uzyskano dla fosfatazy alkalicznej metodą DGKC i dehydrogenazy mleczanowej metodą IFCC. W tym drugim przypadku spadek był dość spektakularny i wyniósł 5,8%. Biorąc pod uwagę oba błędy równocześnie można zauważyć, że w tej grupie najlepsze wyniki osiągnięto w GGTP, natomiast najtrudniejszym testem wydaje się Fosfataza alkaliczna metodą IFCC. 9

10 10 Rys. 11. Średnia wartość nieprecyzyjności [%] dla enzymów ALAT (GPT) ALP DGKC ALP-IFCC AMYL ASPAT (GOT) CK-MB CK-NAC 2007 GGTP 2008 LDH-L LDH-P 2009 Na rysunkach nr 12 i 13 zestawiono dane dotyczące elektrolitów. Opracowaniem objęto 7 parametrów: wapń całkowity, chlorki, żelazo, potas, magnez, sód, fosfor. W 2007 roku najniższe średnie obciążenie zaobserwowano w przypadku sodu 1,1%, najwyższe w magnezie 3,53%. Cztery z analizowanych parametrów cechowało obciążenie poniżej 2%, dla trzech wartość ta przekroczyła 3%. W trzecim roku analizy stwierdzono poprawę we wszystkich analizowanych testach. W 6. na 7 przypadków błąd zmieścił się w zakresie ±1%, co jest wynikiem bardzo dobrym. Jedynie w przypadku magnezu nastąpiło zmniejszenie obciążenia do wartości -2,34%. Można to jednak uznać za sukces, gdyż rok wcześniej wartość obciążenia dla tego testu wyniosła 3,97%. Rys. 12. Średnia wartość obciążenia [%] dla elektrolitów Ca Cl Fe K Mg Na P Analizując nieprecyzyjność elektrolitów zauważa się charakterystykę podobną do wcześniej opisywanych testów. W kilku parametrach niewielkie obniżenie (4/7) w pozostałych stabilizacja. Na szczególną uwagę zasługują oznaczenia sodu i potasu, gdzie średni współczynnik zmienności utrzymywany jest w okolicy 1%. Cieszy obniżenie CV dla żelaza, które często uznawane jest przez wielu użytkowników różnych systemów za parametr trudny w oznaczeniach. Na uwagę i dalszą modernizację będzie oczekiwał magnez. Dalszej korekty będzie wymagał jego błąd obciążenia. Współczynnik zmienności najprawdopodobniej pozostanie na zbliżonym poziomie. Magnez jest kłopotliwym parametrem dla wielu producentów odczynników. Wiąże się to z wieloma czynnikami. Jest to wszędobylski pierwiastek, pojawiający się w np. w wodzie. Czasami występuje także jako składnik odczynników do innych testów, o kontaminację wtedy nietrudno. Z tego powodu realna wartość przyjmowanego błędu całkowitego dla tego parametru powinna oscylować pomiędzy 7-8%. Rys. 13. Średnia wartość nieprecyzyjności [%] dla elektrolitów 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Ca Cl Fe K Mg Na P Z powyższego opracowania wynika jednoznacznie, że w ciągu trzech lat nadzoru nad laboratoriami parametry jakościowe wykonywanych oznaczeń znacznie się poprawiły. Dotyczy to w szczególności błędów obciążenia. Miała na to niewątpliwie wpływ praca wsparcia aplikacyjnego ze strony biomérieux Polska, możliwe że również wzrost udziału materiałów kontrolnych i odczynników z Thermo Fisher Scientific. Wartości błędów nieprecyzyjności również w ogromnej mierze uległy poprawie. Wprawdzie zmiany nie były tak spektakularne jak w przypadku błędów obciążenia, ale nieprecyzyjność jest cechą całego układu pomiarowego, na który wpływ wsparcia aplikacyjnego i serwisu nie jest aż tak duży. Warto przy tym zauważyć, że do wyliczenia błędu całkowitego wartość błędu nieprecyzyjności mnożona jest przez 1,65. Zatem każda poprawa precyzji automatycznie obniża błąd całkowity więcej niż wynikałoby to z różnicy współczynników zmienności wyliczonych w różnych okresach. Ustabilizowanie się i ciągły pomiar jakościowy pozwala użytkownikom na prostsze ustalenie własnych norm jakościowych. Bieżące porównywanie się z grupą korzystającą z tych samych urządzeń, materiałów kontrolnych i odczynników ułatwia ocenę realizacji własnych celów jakościowych. Wkrótce program StandLab IQs będzie w sposób ciągły analizował oprócz średniej grupowej również średnie odchylenie standardowe, CV i średni błąd całkowity grupy. Dostępne wyniki porównawcze wraz z ciągłym wsparciem ze strony dostawcy odczynników powinny przyczynić się do ujednolicenia wyników jeszcze bardziej niż do tej pory. Będzie to korzystne nie tylko dla laboratoriów, ale dla pacjentów, którzy coraz częściej przemieszczają się korzystając z usług placówek medycznych rozsianych po całym kraju.

11 UF 500i Automatyczny analizator moczu w laboratorium mikrobiologicznym mgr Piotr Czajka biomérieux Polska, Warszawa Przesiewowe badania moczu to jedne z najczęściej wykonywanych analiz we współczesnych laboratoriach. Aby wyniki były precyzyjne i stanowiły wartościową informację dla klinicystów, muszą spełniać dwa warunki. Pierwszy to precyzyjne wykrycia i zliczenia bakterii oraz elementów upostaciowanych zawartych w próbkach moczu. Drugi warunek to szybkie potwierdzenie, czy u danego pacjenta występuje zakażenie dróg moczowych (UTI UrinyTtrack Infection) czy jego dolegliwości związane są ze schorzeniami nerek. Firma biomérieux Polska wprowadziła do swojej oferty system, który spełnia wymagania nowoczesnej, wiarygodnej i w pełni zautomatyzowanej diagnostyki mikrobiologicznej moczu. Analizator UF-500i to w pełni automatyczny system do badań przesiewowych moczu, wykonujący obiektywną analizę próbek na podstawie ich właściwości chemicznych i fizycznych. Zastosowano w nim zaawansowaną technologię cytometrii przepływowej z hydrodynamicznym ogniskowaniem i specjalne barwniki fluorescencyjne dla bakterii i osadów. System zapewnia powtarzalny pomiar w wysokiej rozdzielczości 3 sygnałów: wielkości, struktury i fluorescencji. Zastosowane najnowsze technologie umożliwią analizatorowi UF 500i szybkie wykonywanie badań moczu przy oczekiwanej przez Diagnostów pełnej standaryzacji. Zapewniona jest ona poprzez redukcję prawdopodobieństwa wystąpienia zanieczyszczenia krzyżowego (cross-contamination) dzięki funkcji zapobiegającej mieszaniu się próbek (anti-carryover) i trybowi analizy sekwencyjnej. Możliwości systemu UF 500i w wykrywaniu niskiego miana bakterii (rzędu 103 CFU/ml) zapewniają dokładność analizy i uniknięcie fałszywie ujemnych wyników. Codzienna kontrola jakości wszystkich głównych parametrów (kontrole patologiczne: wysoka i niska) pozwala na pełen komfort pracy. Łatwe do odczytu, kolorowe skatergramy i czytelna prezentacja wartości liczbowych zapewniają zwięzłą prezentację wyników. Możliwość definiowania przez użytkownika wartości prawidłowych dla kluczowych parametrów pozwala na szybką ocenę wyników. Kolejnym wyróżnikiem jest perspektywa zdefiniowania parametrów, które poprzez oflagowanie będą sygnalizować możliwości zakażenia dróg moczowych. Wystarczy włożyć próbkę i uruchomić wykonywanie analizy. Obsługa jest ograniczona do minimum, a wyniki dla próbki są dostępne już po 1 minucie. Funkcja ciągłego ładowania umożliwia szybką analizę próbek lub przeprowadzanie badań w seriach do 50 próbek w jednym cyklu. Mierzone parametry: erytrocyty, leukocyty, bakterie, nabłonki płaskie, wałeczki szkliste i patologiczne, kryształki, śluz, nabłonki okrągłe, spermatocyty, drożdże, informacja o ładunku jonowym składników moczu, informacje o morfologii krwinek czerwonych, informacje o zakażeniu dróg moczowych Ryc. 1. Obraz wyników czytelne kolorowe skategramy Więcej informacji o produkcie na stronie internetowej 11

12 mikrobiologia Porównanie wybranych metod identyfikacji bakterii beztlenowych - doświadczenia własne mgr Małgorzata Wróblewska Laboratorium Mikrobiologiczne Regionalnego Szpitala Specjalistycznego w Grudziądzu Analiza porównawcza przeprowadzona została w Laboratorium Mikrobiologicznym Regionalnego Szpitala Specjalistycznego w Grudziądzu. Materiały kliniczne pobierane były z miejsc, w których badanie bezwzględnych beztlenowców miało bardzo duże znaczenie tzn. z zamkniętych jam ciała; wymaz z rany (materiał śródoperacyjny), z ropni, punktatów, zakażeń uogólnionych - posiewu krwi, zapaleń otrzewnej, zapaleń wyrostka robaczkowego, zakażeń narządu rodnego, urazów w obrębie jamy brzusznej oraz z wszelkich podejrzanych i nietypowych ran. Celem badania było porównanie możliwości identyfikacyjnych drobnoustrojów beztlenowych przy jednoczesnym użyciu dwóch systemów identyfikacyjnych API 20 A oraz karty identyfikacyjnej systemu Vitek 2 ANC. Laboratorium miało ograniczone możliwości przeprowadzenia analizy mając do dyspozycji 20 sztuk nowo wprowadzanej karty do identyfikacji beztlenowej w systemie automatycznym Vitek 2 oraz w pełni dostępny i od dawna wykorzystywany przez pracownię manualny szereg identyfikacyjny API 20A. Manualny system API 20 A składa się z 20. mikroprobówek zawierających odwodnione substraty. Testy te napełniane były zawiesinami bakteryjnymi. Procesy metaboliczne, zachodzące podczas inkubacji, powodują zmiany kolorów. Interpretacja kodowanego zapisu tych zmian w książce kodów pozwala zidentyfikować drobnoustrój. Automatyczny odczyt karty identyfikacyjnej ANC w automacie Vitek 2 opiera się na odczycie 36. testów biochemicznych oraz interpretacji wyników w oparciu o informatyczny system ekspercki. Pobranie i transport Pobranie i transport do pracowni odbywały się w sposób pozwalający na zabezpieczenie przed szkodliwym działaniem tlenu atmosferycznego poprzez stosowanie podłóż transportowych przeznaczonych do tego celu (system BacTAlert, wymazówki Copan). Posiew materiału Po otrzymaniu materiału przez laboratorium i nadaniu mu kodu niezwłocznie wykonano posiewy na podłoża. Przy posiewie położono duży nacisk na skrócenie do minimum czasu wystawienia materiału na działanie powietrza atmosferycznego. Każdy materiał jednocześnie posiany był na podłoża stałe i płynne zapewniające wzrost bakterii tlenowych i beztlenowych. Zastosowano zarówno podłoża namnażające, jak i wybiórcze w tych sytuacjach, gdy podejrzenie infekcji beztlenowcami mogło przebiegać jako zakażenie mieszane. Inkubacja hodowli prowadzona była od 48 h do 7. dni w pojemnikach 2,5 l z użyciem gotowych zestawów do wytwarzania atmosfery beztlenowej oraz wskaźników uzyskania warunków beztlenowych. Tab. 1. Porównanie informacji o testach identyfikacyjnych 12 Cecha API 20 A Karta ANC 1. ilość badań ilość testów biochemicznych objętość zawiesiny niezbędnej 4,0 ml 3,0 ml do wykonania testu 3. objętość zawiesiny w dołku reakcyjnym 120 µl 30 µl 4. gęstość zawiesiny 3 w skali McFarlanda 2,70-3,30 w skali McFarlanda 5. niezbędne testy zewnętrzne możliwości identyfikacyjne 51 drobnoustroje 63 drobnoustroje 7. czas posiewu na szereg identyfikacyjny zgodny z instrukcją zgodny z instrukcją (kartę) 8. czas odczytu 24 h Około 6 h

13 W celu porównania wykorzystano równą ilość testów identyfikacyjnych, czyli po 20 sztuk. Wyniki badania W laboratorium wyhodowano i zidentyfikowano 18 drobnoustrojów z różnych materiałów klinicznych. Nie udało się zidentyfikować żadnym z testów szczepów beztlenowych z dwóch prób klinicznych. Kartą identyfikacyjną ANC nie zidentyfikowano 4 drobnoustrojów beztlenowych ponieważ 2 z nich zostały określone w systemie Vitek 2 jako mikroorganizm z wzorcem biochemicznym o niskiej reaktywności - należy sprawdzić żywotność, a pozostałe 2 jako wzorzec biochemiczny niereaktywny. Wyhodowano drobnoustroje: Bacteroides fragilis x 5, Bacteroides vulgatus, Clostridium perfringens x 4, Clostridium barati, Peptoniphilus asaccharolyticus x 2, Lactobacillus gasseri, Veillonela spp, Prevotella oralis, Staphylococcus saccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius. Różnice w identyfikacji pomiędzy kartą ANC, a testem API pojawiły się tylko w jednym przypadku materiałem do badania był wymaz z rany pobrany od pacjenta z OIOM-u. Karta ANC zakwalifikowała drobnoustrój jako Prevotella oralis z wysokim prawdopodobieństwem procentowym natomiast test API określił drobnoustrój jako Bacteroides distasonis, ale z niskim 65% podobieństwem. Ponieważ w teście API w testach przeciwnych pojawiła się katalaza z 77% prawdopodobieństwem, bez zastanawiania się określono drobnoustrój jako Prevotella oralis. Wnioski Bardzo dużą zaletą karty ANC jest krótki czas trwania identyfikacji (średnio 6 godzin). Nie stosuje się żadnych dodatkowych generatorów atmosfery beztlenowej. Dużo większa ilość testów biochemicznych w karcie ANC pozwala na dokładniejszą identyfikację drobnoustrojów. Bardzo ważna jest duża gęstość zawiesiny bakteryjnej użyta do inokulacji karty ANC oraz czas wykonania badania, ponieważ wykonane przez laboratorium cztery pierwsze oznaczenia, system zaopatrzył komentarzem - wzorzec biochemiczny niereaktywny oraz mikroorganizm z wzorcem biochemicznym o niskiej reaktywności - należy sprawdzić żywotność. Uwaga ta z pewnością dotyczyła w jednym wypadku inokulacji wykonywanej dłużej niż 0,5 godziny, a w drugim gęstości zawiesiny na pograniczu 2,5 do 2,7. Przy stosowaniu gęstości zawiesiny 3,3 do 4 w skali McFarlanda oraz możliwie najkrótszego czasu do umieszczenia karty w automacie nie zanotowano już żadnych problemów z identyfikacją. Do ostatecznego zidentyfikowania beztlenowców kartą ANC w wykonanych przez laboratorium oznaczeniach system nie sugerował wykonania testów uzupełniających ponieważ osiągnięty procentowy poziom akceptacji był bardzo dobry. Karta ANC jest dobrym produktem dającym prawidłowe wyniki badań w dość krótkim czasie, który jest tak istotny w wielu trudnych sytuacjach klinicznych. Dodatkową zaletą tej karty jest możliwość identyfikacji oprócz bakterii beztlenowych Corynebacterium spp. Karta ANC jest świetnym wyborem wykwalifikowanego personelu laboratorium w złożonych sytuacjach diagnostycznych. Tab. 2. Zestawienie wyników badania API 20 A Karta ANC 1. Ilość wyhodowanych organizmów Ilość niewyhodowanych drobnoustrojów Wyniki identyfikacji porównywalne Wyniki identyfikacji rozbieżne Ilość dodatnich cech biochemicznych 9 20 w przykładowej identyfikacji (Bacteroides fragilis) 6. Czas odczytu (godz.) przykładowej 24 5 identyfikacji (Bacteroides fragilis) 7. Ilość testów biochemicznych rozbieżnych 0 0 w przykładowej identyfikacji (Bacteroides fragilis) 13

14 mikrobiologia Zalecenia Europejskiego Komitetu ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST dr Dorota Żabicka Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów, Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej, Narodowy Instytut Leków, Warszawa 14 Europejski Komitet ds. Oznaczania Lekowrażliwości EUCAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing), jest profesjonalnym, naukowym komitetem, agendą Europejskiego Centrum Profilaktyki i Kontroli Zakażeń - ECDC (ang. European Centre for Disease Prevention and Control). Został założony w 1997 roku przez ESCMID (ang. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) i narodowe, działające w krajach europejskich komitety ustalające kliniczne wartości graniczne (francuski, brytyjski, holenderski, niemiecki, norweski i szwedzki). Decyzje EUCAST są podejmowane przez 11 osobowy Steering Committee, na którego czele stoi przewodniczący Gunnar Kahlmeter. W podejmowaniu decyzji funkcje doradczą pełni komitet, w skład którego wchodzą reprezentanci 32 krajów europejskich, a także reprezentant Międzynarodowego Towarzystwa Chemioterapii ISC (ang. International Society for Chemotherapy) oraz Federacji Europejskich Towarzystw Chemioterapii i Zakażeń FESCI (ang. Federation of European Societies of Chemotherapy and Infection). W strukturze EUCAST powołano także podkomitet ds. oznaczania lekowrażliwości grzybów, podkomitet ds. opracowania zasad interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów i podkomitet ds. oznaczania lekowrażliwości bakterii beztlenowych. Zadania EUCAST to: opracowanie jednolitego, zharmonizowanego, obowiązującego we wszystkich krajach europejskich zestawu wartości granicznych (ang. breakpoints) służących do oznaczania oraz do monitorowania lekowrażliwości drobnoustrojów, opracowanie wytycznych interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów, opracowanie i upowszechnienie serii dokumentów opisujących zharmonizowaną, obowiązującą we wszystkich krajach Unii Europejskiej metodykę oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów in-vitro, promowanie schematów wewnętrznej i zewnętrznej kontroli jakości oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów, współpraca z Europejską Agencją Leków EMA (ang. European Medicines Agency, dawniej EMEA - European Agency for the Evaluation of Medical Products) jako komitet włączony w proces rejestracji nowych leków, uzgadniający wartości graniczne dla nowych leków, współpraca z europejskimi i międzynarodowymi grupami zajmującymi się oznaczaniem lekowrażliwości, monitorowaniem lekowrażliwości drobnoustrojów i epidemiologią oporności na antybiotyki, współpraca w tworzeniu i udział w programach edukacyjnych i warsztatach oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów. W grudniu 2009 roku na stronie internetowej EU- CAST zostały opublikowane kliniczne wartości graniczne i zalecenia interpretacji wyników oznaczania minimalnego stężenia hamującego (MIC) oraz oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzyjno-krążkową. Stworzyło to warunki do stosowania zaleceń EUCAST we wszystkich medycznych laboratoriach mikrobiologicznych w Europie. W Polsce, podobnie jak w wielu innych krajach europejskich, rok 2010 jest rokiem przygotowań do wprowadzenia zaleceń EUCAST do rutynowej pracy laboratoriów mikrobiologicznych. Planowane jest, że od dnia 1 stycznia 2011 roku, ale nie wcześniej, zalecenia EUCAST staną się obowiązujące w Polsce. Proces opracowania jednolitych, zharmonizowanych wartości granicznych oraz wytycznych dotyczących oznaczania i interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów rozpoczęto od zdefiniowania podstawowych pojęć oraz wypracowania metodyki ustalania wartości granicznych. Wprowadzono definicje klinicznych wartości granicznych, stosowanych jako wykładniki możliwości odniesienia sukcesu terapeutycznego (dla lekarzy) oraz epidemiologicznych wartości granicznych (dla mikrobiologów i epidemiologów), służących do monitorowania zmian w oporności populacji danego gatunku drobnoustrojów. Przyjęto następujące definicje klinicznych wartości granicznych: Wrażliwość kliniczna wrażliwość drobnoustroju na standardowe dawki leku wysokie prawdopodobieństwo sukcesu terapeutycznego; Kliniczna średnia wrażliwość szczep w zakresie wartości MIC pomiędzy wrażliwym a opornym, efekt terapeutyczny niepewny, ale może zostać osiągnięty, jeśli zakażenie przebiega w takiej lokalizacji, gdzie lek jest fizycznie zagęszczany (np. drogi moczowe) lub jest możliwość podania wysokich dawek leku; Kliniczna oporność wysokie prawdopodobieństwo niepowodzenia terapeutycznego, nawet w przypadku zastosowania wysokich dawek leku.

15 Kliniczne wartości graniczne są prezentowane w tabelach dla poszczególnych grup drobnoustrojów osobno dla każdej z grup antybiotyków, przy czym w jednej tabeli są prezentowane zarówno wartości graniczne dla metody dyfuzyjno-krążkowej, jak i dla oznaczeń minimalnego stężenia hamującego MIC. Wartości umieszczone w tabelach oznaczają: wrażliwy S x mg/l; oporny R>y mg/l. Szczepy zaliczane do kategorii średnio wrażliwy mają wartości w przedziale I>x, y mg/l. I tak dla pałeczek Enterobacteriaceae wartości graniczne gentamycyny są następujące: wrażliwy MIC 2 µg/ml, średnio wrażliwy MIC>2 µg/ml i 4 µg/ml, a oporny MIC>4 µg/ml. Epidemiologiczne wartości graniczne zostały zaproponowane po zebraniu wyników oznaczania lekowrażliwości z różnych ośrodków zajmujących się monitorowaniem lekowrażliwości drobnoustrojów i analizie rozkładu wartości MIC dla poszczególnych antybiotyków i poszczególnych gatunków drobnoustrojów. Wprowadzono pojęcia: szczep dziki i oporność mikrobiologiczna, które zdefiniowano następująco: Szczep dziki (ang. wild type WT) należący do najbardziej wrażliwej populacji, nieposiadający nabytego drogą transferu horyzontalnego lub mutacji mechanizmu oporności na dany lek; klinicznie może nie odpowiadać na leczenie danym lekiem; jest charakteryzowany przez zastosowanie odpowiedniego, fenotypowego punktu odcięcia wartości MIC dla danego gatunku; Oporność mikrobiologiczna (ang. Non-Wild Type NWT) szczep nie-dziki to szczep posiadający nabyte drogą transferu lub mutacji mechanizmy oporności na dany lek; jest charakteryzowany poprzez zastosowanie odpowiedniego, fenotypowego punktu odcięcia wartości MIC dla danego gatunku; szczep taki w niektórych przypadkach może odpowiadać klinicznie na leczenie danym lekiem. Wartości graniczne dla obu kategorii szczepów są przestawiane następująco: WT z mg/l, NTW>z mg/l. Epidemiologiczne wartości graniczne mogą być używane jako najbardziej wrażliwe mierniki pojawiania się mechanizmów oporności na dany lek. Mają zastosowanie do monitorowania rozwoju oporności w szpitalach, do tworzenia strategii przeciwdziałania rozprzestrzenianiu się mechanizmów oporności oraz do oceny efektywności interwencji mających na celu zapobieżenie rozprzestrzenianiu się mechanizmów oporności. Pojawienie się szczepów z wartościami MIC równymi epidemiologicznym wartościom granicznym stanowi sygnał ostrzegawczy, a informacja o tym powinna być przekazana do zespołu kontroli zakażeń. W procesie ustalania klinicznych wartości granicznych EUCAST zastosował nowatorską, niestosowaną dotychczas metodę wyznaczania klinicznych wartości granicznych w oparciu o farmakokinetykę i farmakodynamikę antybiotyków. Dla każdego z antybiotyków zebrano przejrzystą dokumentację, tworząc tzw. dokumenty RD (ang. rational documents) zawierające informacje o każdym z leków i stanowiące podstawę do określenia wartości granicznych. Dokumenty RD składają się z następujących części: charakterystyka leku, dawki stosowane rutynowo w leczeniu w krajach europejskich, zakresy wartości MIC dla populacji szczepów dzikich, czyli szczepów bez nabytych mechanizmów oporności oraz wartość epidemiologicznych wartości granicznych dla poszczególnych grup drobnoustrojów, zakresy klinicznych wartości granicznych obowiązujące przed harmonizacją przeprowadzoną przez EUCAST, informacje o farmakokinetyce leku, informacje o farmakodynamice leku, symulacje zgodnie z metodą Monte Carlo dla standardowej dawki leku, wykazanie podstaw do ustalenia wartości granicznej w oparciu o wartości Pk/Pd, dane kliniczne i kliniczne wartości graniczne. Na podstawie danych zebranych w dokumentach RD zaproponowano kliniczne wartości graniczne dla poszczególnych antybiotyków i poszczególnych grup drobnoustrojów. Stosując takie podejście skorelowano kliniczne wartości graniczne z dawkowaniem leku stosowanym rutynowo w terapii zakażeń. Kliniczne wartości graniczne proponowane przez EU- CAST będą ulegać zmianie wtedy, gdy pojawią się nowe dane z badań klinicznych wskazujące na potrzebę zmiany dawkowania lub sposobu podawania leków. Dokumenty RD są dostępne na stronie internetowej EUCAST Linki do tych dokumentów znajdują się pod nazwami leków (zaznaczonymi kolorem niebieskim) w tabelach z klinicznymi wartościami granicznymi. Jak już wspomniano wcześniej, wprowadzenie zaleceń EUCAST do rutynowej pracy medycznych laboratoriów mikrobiologicznych w Polsce jest planowane na styczeń 2011 roku. Stosowanie zaleceń EUCAST przez laboratoria w Polsce w 2010 roku nie wydaje się możliwe, albowiem dłuższego czasu wymaga odpowiednie przygotowanie merytoryczne oraz materiałowe laboratoriów do wprowadzenia tych zaleceń. Stosowane dotychczas przez laboratoria mikrobiologiczne Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki publikowane przez Krajowy Ośrodek Referencyjny ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów oraz Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej oparte były o zalecenia amerykańskie publikowane corocznie przez CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standard Institute). Zalecenia EUCAST wprowadzają pewne zmiany metodyki oznaczania lekowrażliwości metodą dyfuzyjnokrążkową oraz zmiany dotyczące wewnętrznej kontroli jakości. Najważniejsze z proponowanych zmian to: oznaczanie wrażliwości metodą dyfuzyjno-krążkową dla wszystkich gatunków drobnoustrojów 15

16 Tab. 1. Zawartości antybiotyków w krążkach do oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów metodą dyfuzyjnokrążkową zaproponowane przez EUCAST (uwzględniono jedynie te, dla których zaproponowano odmienne niż w CLSI ilości antybiotyku w krążku) Antybiotyki Zawartość antybiotyku w krążku EUCAST CLSI piperacylina 30 µg 100 µg piperacylina/tazobaktam 30-6 µg 100/10 cefotaksym 5 µg 30 µg ceftazydym 10 µg 30 µg netilmycyna 10 µg 30 µg nitrofurantoina 100 µg 300 µg penicylina benzylowa (ang. benzylpenicyllin); oznaczanie 1 IU 10 IU u gronkowców i paciorkowców linezolid 10 µg 30 µg ampicylina; oznaczanie u enterokoków, paciorkowców 2 µg 10 µg i Haemophilus spp. gentamicyna; oznaczanie HLAR u enterokoków 30 µg 120 µg wankomycyna; oznaczanie u enterokoków i paciorkowców 5 µg 30 µg fenkosymetylopenicylina (ang. phenoxymethylpenicillin); 10 µg - badania przeglądowe w kierunku BLNAR u H.influenzae 16 wymagających, czyli paciorkowców i pałeczek hemofilnych na podłożu Mueller Hinton Agar z 5% odwłóknioną krwią końska i 20 mg/l -NAD; zmiana niektórych krążków z antybiotykami np. zamiast krążka z piperacyliną 100 µg stosowany jest krążek 30 µg, zamiast krążka ceftazydym 30 µg stosowany jest krążek 10 µg. (pełna lista zmian krążków w tabeli nr 1); stosowanie tych samych szczepów do wewnętrznej kontroli jakości oznaczania lekowrażliwości, zarówno oznaczania MIC i jak i metodą dyfuzyjno-krążkową; są to następujące szczepy: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Haemophilus influenzae NCTC 8468 oraz Streptococcus pneumoniae ATCC Warte podkreślenia jest również to, że kliniczne wartości graniczne MIC proponowane przez EUCAST dla szczepów wrażliwych są w większości przypadków niższe niż kliniczne wartości graniczne zalecane przez CLSI. Zmiana rekomendacji z zaleceń CLSI na rekomendacje EUCAST będzie się wiązać ze zmniejszeniem liczby szczepów wrażliwych na dany lek w analizowanej populacji izolatów danego gatunku drobnoustrojów, a co za tym idzie, nastąpi również zmiana danych epidemiologicznych szpitala. Z tego względu istnieje potrzeba zapoznania lekarzy i szpitalnych zespołów kontroli zakażeń z zaleceniami EU- CAST oraz konsekwencjami ich wprowadzenia dla danych epidemiologicznych i polityki antybiotykowej szpitala. W celu ułatwienia wprowadzenia zaleceń EUCAST do rutynowej pracy laboratoriów mikrobiologicznych i zespołów kontroli zakażeń wszystkie najważniejsze publikacje tzn. opis metodyki oznaczania lekowrażliwości, tabele z wartościami akceptowalnymi dla szczepów kontrolnych, tabele z klinicznymi wartościami granicznymi oraz zaproponowane przez ekspertów zasady interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości będą dostępne w tłumaczeniu na język polski na stronie internetowej Krajowego Ośrodka ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów

17 KOMUNIKAT NR 1 biomérieux SA Aktualizacja automatycznych systemów do identyfikacji i oznaczenia lekowrażliwości Viitek2 oraz Vitek2 compact według wytycznych EUCAST W 2010 r. firma biomérieux wprowadziła oprogramowanie dla systemu Vitek2 - VT oraz dla systemu Vitek2 compact - V2S Obydwie wersje oprogramowania zawierają większość wartości stężeń granicznych (ang. breakpoint) opublikowanych na internetowych stronach EUCAST w listopadzie 2008 r. Jeśli wartości stężeń granicznych EUCAST nie były dostępne, lub gdy zakres VITEK 2 MIC był niewystarczający, wartości stężeń granicznych zostały podane według innych źródeł (np. A-SFM, CLSI, BSAC). Oprogramowanie V2S 4.02 pozwala wyświetlić źródło każdej z podanych wartości stężeń granicznych dla parametrów EUCAST AES. W przypadku systemów z oprogramowaniem VT w celu uzyskania informacji o źródłach, z których pochodzą wartości stężeń granicznych, prosimy o skontaktowanie się z serwisem merytorycznym firmy biomérieux Polska. Firma biomérieux S.A. kontynuuje zaawansowane prace nad oprogramowaniem systemów Vitek 2 i Vitek 2 compact oraz miniapi i ATB. Będziemy Państwa informowali o przygotowaniu firmy biomérieux S.A. do zmian w oprogramowaniu swoich analizatorów zgodnie z zaleceniami EUCAST w kolejnych naszych komunikatach oraz na stronie internetowej Firma biomérieux udostępni w 2011 oprogramowanie V2S 5.03, które będzie zawierać nowe wartości Zaawansowanego Systemu Ekspertowego (Advanced Expert System, AES) ściśle odpowiadające wartościom stężeń granicznych EUCAST. Pozwoli to pracować laboratoriom, które chcą stosować wyłącznie wartości stężeń granicznych według wytycznych EUCAST, bez konieczności wprowadzania swoich wartości stężeń granicznych. Aktualne informacje mogą Państwo znaleźć na stronie internetowej 17

18 mikrobiologia Biofilm bakteryjny trudności diagnostyczne i kliniczne mgr Anna Pietruczuk, mgr Agnieszka Kalicińska Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny 18 Od wielu lat bakterie były postrzegane jako wolnożyjące organizmy żywe w formie planktonowej, tymczasem mogą one przylegać do różnych powierzchni tworząc ściśle powiązane zespoły komórkowe, zwane biofilmami. Poznanie struktury i funkcjonowania biofilmu jest niezbędne do zrozumienia patogenezy wielu przewlekłych, trudnych do leczenia zakażeń. Biofilm jest trójwymiarową, wielowarstwową strukturą, zbudowaną w ok. 15% objętości z agregatów komórek drobnoustrojów i 85% wydzielanej przez nie macierzy pozakomórkowej (ang. matrix), wykazującej zdolność adhezji do powierzchni stałych - organicznych i nieorganicznych. (Costerton et al. 1999). Macierz tworzą wielocukry, białka, enzymy, DNA, glikolipidy bakteryjne oraz elementy środowiska, w którym rozwija się biofilm np. fragmenty tkanek, minerały. W dojrzałej strukturze biofilmu woda stanowi około 60% całkowitej objętości. Kanałami wodnymi drobnoustrojom dostarczane są substancje odżywcze i usuwane zbędne produkty przemiany materii (Trafny E.A. 2000). W biofilmie istnieje również zróżnicowanie na strefy komórek martwych, komórek w stanie anabiozy oraz komórek intensywnie rozwijających się. Biofilmy bakteryjne mogą być tworzone przez bakterie jednego gatunku, a także należące do różnych gatunków. Drobnoustrojami chorobotwórczymi, które najczęściej tworzą biofilm są: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Candida albicans. Do identyfikacji gatunków drobnoustrojów można wykorzystać m. in. automatyczny system Vitek 2 firmy biomériux S.A.. Proces powstawania biofilmu obejmuje kilka etapów. Początkowo dochodzi do dwufazowej adhezji swobodnie pływających form planktonowych bakterii do naturalnego lub sztucznego podłoża. W pierwszej fazie następuje odwracalne wiązanie się komórek z powierzchnią na zasadzie oddziaływań fizycznych, w których biorą udział siły Van der Waalsa, siły grawitacyjne i elektrostatyczne. W kolejnej fazie, w wyniku procesów chemicznych, bakterie kolonizują podłoże w sposób nieodwracalny. Wydzielają do środowiska substancje zewnątrzkomórkowe, głównie wielocukry, które wraz ze śluzem tworzą glikokaliks, nadający komórkom wyjątkową zdolność adhezji. Kolejny etap stanowi przekazywanie przez bakterie sygnałów stymulujących je do namnażania się i tworzenia mikrokolonii. Dojrzały biofilm składa się z mikrokolonii, poprzedzielanych kanałami wodnymi, otoczonych warstwą egzopolisacharydu. Następuje wytworzenie gradientów stężeń związków chemicznych umożliwiających współistnienie bakterii różnych gatunków i będących w różnych stanach metabolicznych. Ostatnim etapem jest opuszczanie biofilmu przez niektóre komórki, które mogą tworzyć kolejne skupiska w nowym miejscu (Kosikowska U. i Malm A. 2004). Istnieje bezpośrednia zależność między dostępnością składników odżywczych i rodzajem drobnoustroju, a efektywnością tworzenia biofilmu. Myszka i wsp. (2005) w swoich badaniach wykazali, że niska dostępność składników odżywczych w środowisku, gdzie wzrasta biofilm, jest induktorem zjawiska powstawania biofilmu na powierzchniach użytkowych. Udowodniono, że komórki tworzące biofilm komunikują się ze sobą za pomocą systemu quorum sensing, regulującego ekspresję genów w zależności od gęstości populacji bakteryjnej. Komórki bakterii Gram-ujemnych wydzielają autoinduktory o niskich masach cząsteczkowych - acylowane laktony homoseryny, rodziny syntaz autoinduktora LuxI oraz rodziny białkowych regulatorów transkrypcyjnych LuxR. Komórki bakterii Gram-dodatnich porozumiewają się za pomocą sygnałów białkowych, wykorzystując dwuskładnikowy system detekcji w odpowiedzi na obecność autoinduktora. Gdy osiągną one wysokie stężenie w środowisku, wówczas mogą łączyć się z aktywatorami transkrypcji, prowadząc do represji lub aktywacji odpowiednich genów. Osiągając gęstość progową, są w stanie sterować ekspresją genów. Pozwala to zminimalizować własną immunogenność, przez opóźnienie wytwarzania czynników zjadliwości i ochronę przed reakcją układu immunologicznego gospodarza (Stańkowska D. i wsp. 2005). Biofilmy bakteryjne występują zarówno na powierzchniach biotycznych, jak i abiotycznych. W środowisku naturalnym bakterie tworzą śliski nalot na powierzchniach skał w strumieniach, występują jako śluz pokrywający po kilku dniach wewnętrzną powierzchnię wazonu z kwiatami, mogą znajdować się w paszy. Tworzący się biofilm stanowi problem w zakładach przemysłowych i farmaceutycznych, osadzając się na powierzchniach urządzeń produkcyjnych, w rurach wodociągowych, w systemach kli-

19 matyzacyjnych, przemysłowych wymiennikach ciepła, obniżając efektywność ich pracy. Biofilmy bakteryjne stanowią duży problem kliniczny. Mogą być jedną z przyczyn zakażeń u pacjentów, u których w celach diagnostycznych, czy terapeutycznych stosuje się cewniki, wenflony, dreny, zespolenia naczyniowe lub stałe wszczepy implanty z tworzyw sztucznych, endoprotezy stawowe czy kostne (Czaczyk K. 2004). Biofilmy w organizmie człowieka mogą powstawać na powierzchni błon śluzowych, głównie układu oddechowego, moczowo-płciowego i pokarmowego, a także na powierzchniach zębów tworząc płytkę nazębną. Odgrywają istotną rolę w patogenezie różnych przewlekłych stanów zapalnych, między innymi takich jak: zapalenie płuc u chorych na mukowiscydozę (CF), zapalenie wsierdzia, wysiękowe zapalenie ucha środkowego, zapalenie kości. Istnieje coraz więcej dowodów, że biofilmy bakteryjne stanowią poważny problem w niektórych typach przewlekłego zapalenia zatok przynosowych (PZZP), co może tłumaczyć trudności w leczeniu tych schorzeń oraz nawracające infekcje. Głównym drobnoustrojem izolowanym od chorych z PZZP jest Pseudomonas aeruginosa, często izolowano również Staphylococcus aureus (Palmer J.N. i Górski N.P. 2007). Gronkowiec złocisty jest również głównym czynnikiem pierwotnego zapalenia stawów oraz kości u chorych każdej grupy wiekowej, z wyjątkiem noworodków (Mandal S. i wsp. 2002). Biofilmy stanowią bardzo duży problem u chorych na mukowiscydozę, u których często dochodzi do przewlekłych i nawracających zakażeń dolnych dróg oddechowych. We wczesnych etapach choroby, drogi oddechowe chorych kolonizowane są przez Staphylococcus aureus i Haemophilus influenzae, następnie dochodzi do zakażeń Pseudomonas aeruginosa, a także Stenotrophomonas maltophilia. Organizm chorego produkuje nadmiernie lepki i gęsty śluz, który zalega w oskrzelach i jest podłożem dla rozwoju bakterii. Eradykacja biofilmu z dróg oddechowych chorego jest niemal niemożliwa i zazwyczaj skazany jest on na długotrwałą antybiotykoterapię. Opracowanie dostępnych, czułych i odtwarzalnych metod do oceny powstawania biofilmu jest niezbędne do określenia dawek antybiotyków i środków przeciwdrobnoustrojowych koniecznych do całkowitej eradykacji biofilmu. Obecnie do badań biofilmu najpowszechniej stosowane są metody pośrednie z użyciem 96-dołkowych płytek titracyjnych i barwienia fioletem krystalicznym lub safraniną, oparte na zasadzie pomiarów spektrofotometrycznych. Fiolet krystaliczny przyłącza się do ujemnie naładowanych cząsteczek, jak kwasy nukleinowe i kwaśne polisacharydy, dzięki czemu jest pomocny w oznaczaniu całej masy biofilmu (Burmølle M. i wsp. 2006, Burton E. i wsp. 2007). W metodzie tej dochodzi do wybarwienia zarówno żywych, jak i martwych komórek, a także substancji pozakomórkowej. Metodą umożliwiającą oznaczenie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojwe żywych komórek wchodzących w skład biofilmu jest metoda z użyciem MTT (bromku 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliowego). Substancja ta w komórkach jest redukowana do purpurowo-fioletowych kryształów formazanu (Walencka E. i wsp. 2006). Żywe komórki biofilmu można również oznaczać używając do barwienia TTC (chlorek 2, 3, 5-trifenylotetrazoliowy). Na skutek enzymatycznego rozkładu związku przez żywe komórki bakteryjne powstają kryształy formazanu, które powodują różowe zabarwienie (Gabrielson J. i wsp. 2002). Większość zakażeń i chorób bakteryjnych może być skutecznie leczona przy pomocy terapii antybiotykowych. Jednak istnieją dwa istotne aspekty, które należy wziąć pod uwagę podczas terapii. Pierwszym problemem jest wzrastająca oporność bakterii na stosowane chemioterapeutyki, głównie w przypadku szczepów szpitalnych, które często charak- 19

20 20 teryzują się wielolekoopornością. Drugi istotny aspekt to występowanie biofilmu bakteryjnego. Drobnoustroje żyjące w biofilmie wykazują inne wzory ekspresji genów, niż występujące w formie planktonowej. Oznacza to, że bakterie tworzące biofilm charakteryzują się znaczną odmiennością fenotypową w porównaniu z formą planktonową, wykazując inną oporność na antybiotyki i środki przeciwbakteryjne oraz mechanizmy obronne gospodarza (Palmer J.N. i Górski N.P. 2007). Charakterystyczną cechą biofilmów jest ich wysoka oporność na większość stosowanych antybiotyków. Bakterie w formie biofilmu mogą wykazywać nawet do 1000 razy większą oporność na te same antybiotyki, w porównaniu do formy planktonowej (Davey i O Toole 2000), co sugeruje zmienioną aktywność metaboliczną komórek w biofilmie (Resch A. i wsp. 2005). Oporność bakterii w formie planktonowej łatwo oznaczyć przy zastosowaniu klasycznych metod mikrobiologicznych, a także dzięki nowoczesnym i zautomatyzowanym systemom. W przypadku bakterii występujących w formie biofilmu oznaczenie stopnia wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe jest utrudnione. Costerton i wsp. (2003) informowali, że szczepy Pseudomonas aeruginosa wyizolowane od pacjentów z CF wykazywały in vitro wrażliwość na kloksacylinę, jednak pulmunolodzy w praktyce nie zaobserwowali znaczącej poprawy u pacjentów pomimo leczenia tym antybiotykiem. Stosowanie substancji przeciwdrobnoustrojowych in vivo nawet w bardzo wysokich stężeniach może tłumić objawy chorobowe w wyniku eliminacji komórek planktonowych lub komórek bakteryjnych znajdujących się w zewnętrznych warstwach biofilmu. Jednak po zaprzestaniu terapii może nastąpić nawrót objawów, ponieważ struktura biofilmu sprzyja przetrwaniu opornych komórek bakteryjnych (Kosikowska U. i Malm A. 2004). Zastosowanie leków w stężeniach podprogowych (sub-mic - minimalne stężenie hamujące) może wpływać na zmianę struktury biofilmów bakteryjnych. Chemioterapeutyki stosowane w tych stężeniach nie zabijają wprawdzie bakterii, ale powodują zmiany morfologiczne w strukturze powierzchniowej komórek, hamują wytwarzanie toksyn i adhezję bakterii do komórek gospodarza. Chociaż eradykacja patogenu osiągana jest wówczas, gdy przez około połowę czasu między kolejnymi dawkami antybiotyku, jego stężenie przewyższa wartość MIC, to często podczas antybiotykoterapii przez większość czasu na drobnoustroje działa lek w stężeniu sub-mic. Wiąże się to m. in. z ograniczoną penetracją niektórych leków do takich środowisk jak kości, płyn mózgowo-rdzeniowy, czy płuca (Braga P.C. i wsp. 2004). Walencka i wsp. (2006) dokonali oznaczenia wartości MIC oksacyliny, wankomycyny, linezolidu i lizostafiny zarówno dla komórek S.aureus w formie planktonowej jak i w postaci biofilmu. Wrażliwość komórek planktonowych oznaczano metodą mikrorozcieńczeń. Do oznaczenia wrażliwości biofilmu na testowane środki przeciwdrobnoustrojowe zastosowano metodę z użyciem MTT. Biofilm wykazywał dużo wyższą oporność na antybiotyki w stosunku do form planktonowych, nawet po trzykrotnym powtórzeniu dawek oksacyliny, wankomycyny i linezolidu. Dodatkowo użycie stężeń podprogowych (sub - MIC) lizostafiny z różnymi stężeniami oksacyliny skutkowało efektywnym zahamowaniem wzrostu biofilmu tworzonego przez szczepy MRSA (metycylinooporne S. aureus) i MSSA (metycylinowrażliwe S aureus). Zastosowanie wartości podprogowych antybiotyków -laktamowych, powoduje powstawanie u szczepów E. coli wydłużonych form komórkowych - filamentów, które wykazują niższą zdolność przylegania do powierzchni w porównaniu z komórkami niepoddawanymi działaniu stężeń podprogowych tych leków (Wojnicz D. 2007). Fonseca i współpracownicy (2004) w swoich badaniach zaobserwowali zmniejszoną adhezję, zmienionych morfologicznie (wydłużonych) komórek P. aeruginosa, do płytek polistyrenowych, po wcześniejszym działaniu na szczep piperacyliną z tazobaktamem w stężeniu równym połowie wartości MIC. W przypadku azytromycyny, jak i klarytromycyny zastosowanie stężeń sub-mic powodowało zmiany w strukturze biofilmu P. aeruginosa, natomiast nie hamowało procesu jego tworzenia. Natomiast ekspozycja na stężenia podprogowe fluorochinolonów (cyprofloksacyny, enoksacyny, norfloksacyny ofloksacyny i pefloksacyny) prowadziła do zmniejszenia liczby komórek P. aeruginosa o powierzchniach hydrofobowych (Wojnicz D. 2007). Wielu autorów zwraca uwagę, że zmiana właściwości hydrofobowych powierzchni bakteryjnych na hydrofilowe, zmniejsza zdolności adhezyjne bakterii do powierzchni abiotycznych. Właściwości te zależą m in. od obecności fimbrii. Zastosowanie stężeń podprogowych chemioterapeutyków może doprowadzić do utraty zdolności syntezy rzęsek i utrudnienia kolonizacji tkanek. Nishimura S. i wsp. (2006) porównali oporność na klarytromycynę (CAM), cefotaksym (CTX), cefmetazol (CMZ), erytromycynę (EM), benzylopencylinę (PCG) i wankomycynę (VCM), komórek planktonowych i biofilmu S. aureus i S. epidermidis wyizolowanych od pacjentów po wstawieniu endoprotezy stawu biodrowego. Wartość MBC (minimalne stężenie bakteriobójcze) oznaczona dla CAM, CTX, EM i PCG, w stosunku do komórek planktonowych była bardzo niska i wynosiła poniżej 0,5 μg/ml. Biofilm gronkowcowy wykazywał wysoką oporność na wszystkie przebadane antybiotyki (MBC od 512 μg/ml do >1024 μg/ml). Lekowrażliwość form planktonowych bakterii można oznaczać m.in. za pomocą krążków z antybiotykami firmy biomériux S.A.. Prawdopodobny mechanizm oporności biofilmu na tradycyjnie stosowane dawki antybiotyków obejmuje: zmiany fenotypowe komórek bakteryjnych

21 w y s t ę p u j ą - cych wewnątrz biofilmu, inaktywację antybiotyków przez zewnątrzkomórkowe polimery lub modyfikacje enzymów oraz ograniczenie przenikania substancji odżywczych powodujące zwolnienie tempa wzrostu (Gilbert i wsp. 1997). Również środki dezynfekcyjne charakteryzują się dużo niższą skutecznością działania w stosunku do biofilmów, w porównaniu do aktywności wobec bakterii w formie planktonowej. Niższa skuteczność środków dezynfekcyjnych wobec biofilmu m in. P. aeruginosa, może być wynikiem niższego stężenia substancji aktywnych wewnątrz struktury biofilmu oraz zmiany aktywności metabolicznej bakterii tworzących biofilm (Pancer K.W. i wsp. 2004). Yassien i wsp. (2001) wykazali, że działając wybranymi chinolonami na szczep S. epidermidis dochodziło do tworzenia biofilmu o mniejszej gęstości, co ograniczało jego zdolność przylegania do plastikowych powierzchni m.in. cewników naczyniowych. Skutecznym sposobem likwidacji biofilmów wytwarzanych przez szczepy S. aureus i S. epidermidis okazuje się lizostafina. Jest to enzym - glicylo-glicylowa endopeptydaza, wytwarzana m.in. przez S. simulans biovar staphyloliticus ATCC 1362, który ma zdolność lizowania ścian komórkowych praktycznie wszystkich gatunków bakterii z rodzaju Staphylococcus. Umożliwia to wykorzystanie tej substancji do niszczenia gronkowcowych biofilmów wytwarzanych między innymi na powierzchniach implantów. Badania wykazały, że pokrywanie cewników lizostafiną mogłoby zabezpieczać przed rozwojem bakterii na ich powierzchniach. Lizostafina dodatkowo zabija bakterie znajdujące się w roztworze przepływającym przez cewniki. Ograniczeniem w stosowaniu na szeroką skalę tego enzymu jest brak wydajnych technik pozyskiwania substancji i wysoka cena (Szweda P. i wsp. 2005). Prowadzone są badania nad wieloskładnikowymi antybiotykami lub innymi środkami, w celu skuteczniejszego niszczenia drobnoustrojów o różnych strategiach przetrwania, wchodzących w skład biofilmu. Jednym z ważniejszych problemów jest konieczność zastosowania wysokich stężeń substancji przeciwdrobnoustrojowych w celu eradykacji biofilmu, których nie można stosować in vivo. Opracowanie metod umożliwiających odłączenie komórek bakteryjnych od struktury biofilmu i w następnym etapie zastosowanie antybiotyków i przeciwciał w walce z nimi, ułatwiłoby ostateczne zniszczenie drobnoustrojów. Piśmieńnictwo u Autorów 21

22 z życia firmy Działalność biomérieux Polska w zakresie profilaktyki HIV/AIDS w Polsce mgr Marcin Iszkuło biomérieux Polska, Warszawa 22 Każdego roku firma biomérieux aktywnie uczestniczy w inicjatywach związanych z profilaktyką zakażeń wirusem HIV, które najczęściej wykraczają poza zagadnienia branży diagnostyki laboratoryjnej. Coroczną tradycją, w której biomérieux bierze udział jest grudniowa konferencja Człowiek żyjący z HIV w rodzinie i społeczeństwie" organizowana przez Polską Fundację Pomocy Humanitarnej Res Humanae w Warszawie. Konferencja ta skupia zainteresowanie wszystkich środowisk zaangażowanych w tematykę HIV/AIDS czyli organizacji pozarządowych, fundacji, samorządów, środowisk medycznych i firm związanych z opieką zdrowotną. Tematy konferencji to między innymi prawodawstwo związane z HIV/AIDS, nowe i istniejące problemy społeczne dotyczące osób zakażonych wirusem HIV, różne drogi prowadzenia działań profilaktycznych i wiele innych. Jeden z najważniejszych podmiotów biorących udział w konferencji to Krajowe Centrum ds. AIDS, które jako agenda rządowa, prowadzi między innymi szeroko zakrojone działania profilaktyczne. Jedną z wielu form aktywności Krajowego Centrum ds. AIDS jest nadzór nad Punktami Konsultacyjno-Diagnostycznymi (PKD) w całej Polsce, które umożliwiają bezpłatne i anonimowe wykonanie testu wraz z poradnictwem przed i po testowym. Mamy przyjemność współpracować z niemal wszystkimi Punktami Konsultacyjno-Diagnostycznymi (ponad 20 miejsc w Polsce), gdzie dostarczamy testy do wykonywania badań w kierunku HIV. Firma biomérieux brała również udział w konferencji Działania samorządów w zakresie profilaktyki HIV/AIDS, która odbyła się w Kościerzynie w lipcu ubiegłego roku. Dzięki temu mieliśmy okazję poznać potrzeby i problemy osób na co dzień pracujących jako konsultanci w PKD. Mając świadomość działania na rzecz dobra publicznego i konieczności propagowania idei jak najpowszechniejszych badań przesiewowych wsparliśmy również specjalne akcje takie jak Warszawskie dni testowania na HIV organizowane przez Społeczny Komitet AIDS oraz analogiczną akcje przeprowadzaną w Toruniu. Problemy związane z zakażeniami wirusem HIV to nie tylko problemy medyczne i diagnostyczne, ale również wiele spraw społecznych, często trudnych do rozwiązania. W większości przypadków jest to powiązane z problemami finansowymi dlatego firma biomérieux co roku wspiera finansowo organizację wieczerzy wigilijnej dla osób zakażonych wirusem HIV skupionych wokół Zjednoczenia Pozytywni w Tęczy. Zdecydowaliśmy również o przekazaniu środków finansowych na rzecz Stowarzyszenia Unison z Wrocławia oraz Stowarzyszenia Pomoc Socjalna z Warszawy, które zgodnie ze swoimi założeniami statutowymi działają na rzecz profilaktyki HIV/AIDS oraz na rzecz osób żyjących z zakażeniem wirusem HIV. Zgodnie z filozofią biomérieux w Polsce i na całym świecie również w tym roku weźmiemy udział w szeregu inicjatyw, o których poinformujemy w kolejnym roku.

23 z życia firmy Działalność szkoleniowa biomérieux Polska mgr Małgorzata Bilbin biomérieux Polska, Warszawa Firma biomérieux Polska już drugi rok organizuje szkolenia edukacyjne, które skierowane są do pracowników laboratoriów diagnostycznych. Tematyka szkoleń jest bardzo szeroka i ustalana m.in. na podstawie sugestii uzyskanych od naszych klientów. Wykłady są prowadzone przez specjalistów w danej dziedzinie. Niejednokrotnie program szkolenia uwzględnia część praktyczną, podczas której uczestnicy mogą samodzielnie wykonać oznaczenia. Szkolenia odbywają się w siedzibie firmy w Warszawie i cieszą się dużym zainteresowaniem, o czym świadczy liczba uczestników, którzy dotychczas wzięli w nich udział. Szkolenia dedykowane diagnostom laboratoryjnym zgłaszane są do Krajowej Izby Diagnostów Laboratoryjnych w celu przyznania punktów edukacyjnych. Każdy uczestnik szkolenia otrzymuje materiały oraz certyfikat ukończenia szkolenia. Do tej pory zorganizowaliśmy szkolenia na następujące tematy: Walidacja metod mikrobiologicznych i szacowanie niepewności wyników, Przygotowywanie i kontrola pożywek mikrobiologicznych zgodnie z wymaganiami ISO11133, Doskonalenie kompetencji technicznych w laboratorium mikrobiologii żywności, Kontrola mikrobiologiczna w przemyśle kosmetycznym, System API złoty standard w identyfikacji drobnoustrojów Etest metoda oznaczania MIC i wykrywania mechanizmów oporności. Inną formą naszej aktywności szkoleniowej są dodatkowe szkolenia z obsługi aparatury. Propozycję tę kierujemy szczególnie do personelu, który nie brał udziału w pierwszym szkoleniu instalacyjnym oraz do nowych pracowników laboratorium. Każdy uczestnik szkolenia otrzymuje certyfikat oraz komplet materiałów edukacyjnych skierowanych do diagnostów i klinicystów. Materiały prezentują nowe parametry diagnostyczne, opisują wskazania kliniczne do wykonania badania oraz są pomocne w interpretacji wyników. Zapraszamy do skorzystania z naszej oferty szkoleniowej. Informacje na temat planowanych szkoleń znajdą Państwo na naszej stronie w zakładce: Nowości i wydarzenia. 23