Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 3, str

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2008, 39, Nr 3, str TOMASZ DZIECIĄTKOWSKI 1,2, MACIEJ PRZYBYLSKI 1,2, AGNIESZKA TOMASZEWSKA 3,4, TIGRAN TOROSIAN 3, WIESŁAW WIKTOR JĘDRZEJCZAK 3, MIROSŁAW ŁUCZAK 1,2 Porównanie dwóch metod ilościowego monitorowania zakaŝenia wirusem cytomegalii u pacjenta po allogenicznym przeszczepieniu szpiku z powodu ostrej białaczki szpikowej Comparison of two qualitative methods used for monitoring of cytomegalovirus infection in a patient after unrelated bone marrow transplantation due to acute myeloid leukaemia 1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak 2 Zakład Mikrobiologii, Samodzielny Publiczny Centralny Szpital Kliniczny Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Mirosław Łuczak 3 Klinika Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych, Warszawski Uniwersytet Medyczny Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak 4 Klinika Transplantacji Komórek Krwiotwórczych, IHiT w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. BoŜena Mariańska STRESZCZENIE Objawowe zakaŝenia wywoływane przez CMV dotyczą głównie dzieci i osób z niedoborami immunologicznymi, u których przebieg infekcji jest często zagraŝający Ŝyciu. Celem pracy było porównanie dwóch komercyjnych metod biologii molekularnej uŝywanych do ilościowego oznaczania DNA cytomegalowirusa w próbkach surowicy pochodzących od pacjenta poddanego allogenicznemu przeszczepieniu szpiku z powodu ostrej białaczki szpikowej. Uzyskane wyniki wskazują, Ŝe celowe jest zastosowanie techniki real-time PCR w rutynowej diagnostyce zakaŝeń CMV. Jej czułość i specyficzność znacząco ułatwiają wykrywanie infekcji o niskim poziomie wiremii oraz pozwalają na monitorowanie skuteczności leczenia przeciwwirusowego. SŁOWA KLUCZOWE: Ludzki herpeswirus typu 5 Przeszczepienie allogenicznego szpiku Ostra białaczka szpikowa Real-time PCR SUMMARY Detection of human cytomegalovirus (CMV, HHV-5) DNA in clinical specimens is considered a base method in current diagnosis of HHV-5 disease. The present study compared two quantitative methods used for diagnosing cytomegalovirus infection in plasma samples of a 28-year-old man with acute myeloid leukemia after unrelated bone marrow transplantation. Specimens were tested for the presence of HHV-5 DNA using the real-time PCR CMV Quant Kit and also with CMV Monitor Test, based on PCR/hybridization/colorimetric detection of the product. Results from samples containing a low cytomegalovirus load were more accurate with the LightCycler system than those obtained with the COBAS Amplicor instrument, which underestimated the vi-

2 486 T. DZIECIĄTKOWSKI i wsp. ral load of samples containing low DNA copy numbers. These findings underline the value of novel real-time PCR methods used in the detection of HHV-5 in clinical specimens and monitoring of antiviral therapy. KEY WORDS: Human herpesvirus 5 Allogeneic bone marrow transplantation Acute myeloid leukaemia Real-time PCR ZakaŜenia ludzkim herpeswirusem typu 5 (Human Herpesvirus 5; HHV-5 znanym powszechnie pod nazwą CMV) są niezwykle często spotykane w populacji (1, 2). Z tego teŝ powodu zakaŝenia nim stanowią istotny problem dla pacjentów z niedoborami immunologicznymi (2). Do najczęściej obserwowanych objawów klinicznych wynikających z pierwotnego zakaŝenia lub teŝ reaktywacji endogennego HHV-5 zaliczane są: cytomegalowirusowe zapalenie płuc, zespół mielosupresyjny, nasilenie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) oraz ułatwianie wtórnych zakaŝeń bakteryjnych i grzybiczych (2). Zabieg przeszczepienia allogenicznych komórek krwiotwórczych jest terapią z wyboru w przypadku wielu chorób rozrostowych układu krwiotwórczego, chorób limfoproliferacyjnych czy zespołów niewydolności szpiku (3). Jednymi z najpowaŝniejszych powikłań zabiegów przeszczepiania komórek krwiotwórczych są oportunistyczne zakaŝenia wirusowe (4) oraz grzybicze (5). W prezentowanej pracy przedstawiamy porównanie metod zastosowanych w monitorowaniu potransplantacyjnego zakaŝenia wirusem cytomegalii u pacjenta z ostrą białaczką szpikową poddanego przeszczepieniu komórek krwiotwórczych uzyskanych ze szpiku dawcy niespokrewnionego. OPIS PRZYPADKU U 28-letniego męŝczyzny na podstawie badania cytologicznego, cytochemicznego i immunofenotypowego komórek szpiku w dniu rozpoznano ostrą białaczkę szpikową typ M4 wg klasyfikacji FAB. Zastosowano chemioterapię indukcyjną zgodnie z protokołem PALG (wg. schematu DA7: daunorubicyna + arabinozyd cytozyny), uzyskując całkowitą remisję choroby (CR ). Następnie kontynuowano chemioterapię zgodnie ze standardami leczenia ostrych białaczek (3 cykle leczenia konsolidującego: jeden cykl HAM i w celu intensyfikacji terapii dwukrotnie: HD-ARA-C oraz 1 cykl leczenia podtrzymującego). Ze względu na brak zgodnego spokrewnionego dawcy komórek krwiotwórczych pacjent został zakwalifikowany do przeszczepienia szpiku od dawcy niespokrewnionego. Badanie immunologiczne biorcy przed przeszczepieniem wykazało IgG anty-hhv-5 dodatnie, IgM ujemne, natomiast u dawcy: IgG i IgM anty-hhv-5 ujemne. Po kondycjonowaniu wg schematu BuCy4 + ATG-Fresenius w dniu pacjentowi przeszczepiono w sumie: komórki NC /kg m.c., w tym CD /kg m.c. Jako profilaktykę choroby przeszczep przeciw gospodarzowi stosowano cyklosporynę A od dnia 1 oraz metotreksat w dniach +1, +3, +6. Okres okołoprzeszczepowy był powikłany zakaŝeniem przewodu pokarmowego Clostridium difficile i Candida glabrata. Regeneracja układu krwio-

3 Porównanie dwóch metod zakaŝenia wywoływane przez CMV 487 twórczego przebiegała następująco: WBC > /L, w tym ANC > /L osiągnięto w +18 dniu po przeszczepieniu, PLT > /L w +26 dniu, a PLT > /L w +31 dniu po przeszczepieniu. Pacjent został wypisany do domu w +32 dobie po zabiegu przeszczepienia szpiku. Przez cały okres hospitalizacji w rutynowo wykonywanych badaniach PCR w kierunku wirusa cytomegalii uzyskiwano wyniki ujemne. Jako profilaktykę przeciwwirusową stosowano acyklowir (6). W +49 dobie po przeszczepieniu z powodu objawów ostrej choroby przeszczep przeciw gospodarzowi III pacjent został ponownie hospitalizowany. Zgodnie ze standardami EBMT zastosowano leczenie metylprednizolonem w dawce 2 mg/kg m.c. uzyskując ustąpienie objawów GvHD. W kolejnych dobach hospitalizacji u chorego pojawił się suchy nieefektywny kaszel. W badaniu tomografii komputerowej narządów klatki piersiowej stwierdzono w dolnych polach obu płuc zagęszczenia miąŝszowe o charakterze śródmiąŝszowym ( ), a w kolejnym badaniu o typie szkła mlecznego mogące odpowiadać etiologii cytomegalowirusowej. Do dnia badania PCR w kierunku HHV-5 były ujemne, natomiast wynik dodatni uzyskano po raz pierwszy w dniu Ze względu na współistniejące zapalenie płuc zastosowano leczenie jak w chorobie cytomegalowirusowej za pomocą gancycklowiru w dawce 5 mg/kg m.c. co 12 godz. i.v. oraz IVIG w dawce 0,4 g/kg m.c./24 h w sumie 90 g przez cały okres hospitalizacji (6). Z powodu objawów mielotoksyczności (cięŝka pancytopenia) w dniu gancyklowir zastąpiono foskarnetem (6). W dniu uzyskano negatywizację wyników badania PCR w kierunku cytomegalowirusa. Po poprawie parametrów morfologii krwi obwodowej i normalizacji obrazu narządów klatki piersiowej w badaniu tomografii komputerowej, pacjenta wypisano do domu w stanie ogólnym dobrym w +112 dobie po transplantacji. W dniu Ryc. 1. Zmiany w obrazie klinicznym u pacjenta po zabiegu allogenicznego przeszczepienia szpiku Fig. 1. Changes in a patient clinical status over the time after allobmt

4 488 T. DZIECIĄTKOWSKI i wsp. w rutynowo wykonywanych badaniach kontrolnych ponownie stwierdzono reaktywację zakaŝenia cytomegalowirusem dodatni wynik PCR w kierunku HHV-5 bez manifestacji klinicznej. Zastosowano leczenie wyprzedzające foskarnetem (6) uzyskując negatywizację wyników badań po 10 dniach terapii. Zmiany zachodzące w obrazie klinicznym u pacjenta po zabiegu allogenicznego przeszczepienia szpiku w okresie okołoprzeszczepowym ukazuje rycina 1 (Rycina 1). MATERIAŁY I METODY Do badań wirusologicznych w kierunku HHV-5 otrzymywano surowicę krwi w odstępach tygodniowych, poczynając od drugiego dnia po przeszczepieniu. Wyniki były ujemne, aŝ do 61 dnia po przeszczepieniu, gdy metodą PCR otrzymano pierwszy wynik dodatni. Wykrywalny poziom wirusa utrzymywał się do 91 dnia oraz od 123 do 130 dnia po przeszczepieniu. Do reakcji PCR w kierunku identyfikacji HHV-5 uŝywano po 10 µl całkowitego DNA wyizolowanego przy uŝyciu zestawu High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche), zgodnie z procedurą dostarczoną przez producenta. Obecność wirusa oraz ilość jego kopii/ml krwi w próbkach dodatnich określano za pomocą techniki real-time PCR na aparacie LightCycler 2.0 z uŝyciem nowego testu CMV Quant Kit (Roche) oraz dodatkowo zestawem CMV Monitor Test (Roche) na aparacie COBAS Amplicor. Wszystkie oznaczenia prowadzono w dwukrotnych, niezaleŝnych powtórzeniach. WYNIKI I OMÓWIENIE W wyniku amplifikacji DNA izolowanego z surowicy krwi metodą PCR stwierdzono obecność produktów specyficznych dla HHV-5 w próbkach od 61 do 91 oraz od 123 do 130 dnia po przeszczepieniu. Wyniki ilościowe uzyskane za pomocą testów real-time PCR wskazywały na powolne namnaŝanie się wirusa i wzrost jego miana, a następnie na spadek liczby kopii wywołany prawdopodobnie zastosowaniem skutecznej terapii przeciwwirusowej (Tabela 1). Podobne rezultaty otrzymano metodą Tabela 1. Porównanie oznaczeń ilości kopii wirusowego DNA wykonanych za pomocą aparatów LightCycler 2.0 i COBAS Amplicor Table 1. Comparison of HHV-5 viral load changes measured with LightCycler 2.0 and COBAS Amplicor instruments Doba po przeszczepie/liczba kopi wirusa na ml krwi COBAS Amplicor (CMV Monitor Test ) LightCycler 2.0 (CMV Quant Kit )

5 Porównanie dwóch metod zakaŝenia wywoływane przez CMV CMV Monitor, choć w tym przypadku czułość testu była mniejsza, zwłaszcza przy niskim poziomie wiremii (Tabela 1). Dane te są zgodne ze światowym piśmiennictwem, które uznaje przedział od 50 do 90 dnia po transplantacji za okres największego zagroŝenia reaktywacją herpeswirusa typu 5 (6, 7). Uzyskane wyniki wskazują, iŝ obie uŝyte metody ilościowego oznaczania poziomu HHV-5 mają zbliŝoną wartość diagnostyczną. JednakŜe istotną przewagą real-time PCR jest jej znacznie mniejsza czasochłonność, podatność na błędy laboratoryjne oraz koszt wykonania pojedynczego oznaczenia. Diagnostyka z uŝyciem CMV Quant Kit, poczynając od momentu izolacji DNA do uzyskania wyniku, trwa około 3 godzin, gdy podobne badanie wykorzystujące aparat COBAS Amplicor i test CMV Monitor zajmuje ponad dzień roboczy. Badania nad zastosowaniem techniki real-time PCR w diagnostyce zakaŝeń HHV- 5 prowadzone były od dawna, takŝe i w Polsce. Wykazano w nich uŝyteczność tej techniki, zarówno w badaniu przesiewowym pacjentów hematologicznych (8), jak i u biorców przeszczepów komórek krwiotwórczych (9, 10). Pewnym ograniczeniem dotychczas wykonanych badań krajowych było uŝycie testów zaprojektowanych indywidualnie w laboratoriach, zamiast zestawów komercyjnych o pełnej certyfikacji i walidacji zewnętrznej. Ze względu na wysoką częstotliwość występowania reaktywacji latentnego HHV- 5 u pacjentów poddanych immunosupresji niezbędne jest stosowanie w rutynowej diagnostyce poprzeszczepowej technik biologii molekularnej. Wykorzystanie w badaniach laboratoryjnych techniki real-time PCR gwarantuje wykrycie nawet niewielkiej wiremii (7), co umoŝliwia wczesne zastosowanie odpowiedniego leczenia przeciwwirusowego. Jednak decyzja o wdroŝeniu terapii anty-hhv-5 powinna być kaŝdorazowo podejmowana indywidualnie, zarówno w oparciu o uzyskane dane laboratoryjne, jak i na podstawie objawów klinicznych występujących u chorego w trakcie wykrywalnej wiremii. Skuteczność leczenia przeciwko herpeswirusom zaleŝy głównie od nasilenia replikacji wirusa we krwi (11) i znacząco spada wraz z upływem czasu od początku zakaŝenia. Wstępne leczenie gancyklowirem powinno trwać minimum 2 tygodnie, dopiero po tym czasie moŝna rozwaŝać oporność wirusa na stosowany preparat i uŝy-

6 490 T. DZIECIĄTKOWSKI i wsp. cie foskarnetu (12). Niezbędne jest więc opracowanie i wdroŝenie skutecznej metody, która umoŝliwi wykrywanie zmutowanych szczepów cytomegalowirusa wykazujących zmniejszoną wraŝliwość na stosowane rutynowo analogi nukleozydów. WNIOSKI 1. Ilościowe badanie DNA HHV-5 jest bardzo przydatne w monitorowaniu i ocenie skuteczności terapii przeciwwirusowej u biorców alogenicznych przeszczepów komórek krwiotwórczych. 2. Obie porównywane metody słuŝące do ilościowego określania ilości kopii cytomegalowirusa w surowicy krwi mają zbliŝoną wartość diagnostyczną, choć technika real-time PCR charakteryzuje się większą czułością przy niskim poziomie wiremii. 3. Zastosowanie techniki real-time PCR w rutynowym badaniu HHV-5 u biorców komórek krwiotwórczych umoŝliwia istotne skrócenie czasu oczekiwania na wynik oraz ogranicza ryzyko wystąpienia błędów laboratoryjnych. PIŚMIENNICTWO 1. Davison A, Eberle R, Hayward GS et al: Rozdział: Herpesviruses; w Virus taxonomy - classification and nomenclature of viruses. Eighth report of ICTV. Red. Faquet CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA. Wyd: Elsevier Academic Press, San Diego 2005; Boeckh M, Nichols WG: Immunosuppressive effects of beta-herpesviruses. Herpes 2003; 10: Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M at al: Allogeneic and autologous transplantation for haematological disaeses, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37: Parody R, Martino R, Rovira M et al: Severe infections after unrelated donor allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in adults: comparison of cord blood transplantation with peripheral blood and bone marrow transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: Saavedra S, Jarque I, Sanz GF et al: Infectious complications in patients undergoing unrelated donor bone marrow transplantation: experience from a single institution. Clin Microbiol Infect 2002; 8: Ljungman P, Reusser P, de la Camara R et al: Management of CMV infections: recommendations from the infectious diseases working party of the EBMT. Bone Marrow Transplant 2004; 33: Emery VC: Investigation of CMV disease in immunocompromised patients. J Clin Pathol 2001; 54: Grabarczyk P, Brojer E, Nasiłowska B: Ilościowe badanie DNA CMV techniką real-time PCR: standaryzacja metody i wstępne wyniki u chorych hematologicznych. Acta Haemat Pol 2003; 34: Grabarczyk P, Brojer E, Nasiłowska B i wsp. UŜyteczność ilościowego badania techniką realtime PCR do wykrywania i monitorowania zakaŝenia cytomegalowirusem po przeszczepieniu allogenicznych komórek krwiotwórczych. Pol Merk Lek 2006; 123: Chabros Ł, Przybylski M, Dzieciątkowski T i wsp.: Modyfikacja i optymalizacja metod PCR do wykrywania regionu MIE ludzkiego herpeswirusa typu 5. Med Dośw Mikrobiol 2008; 60:

7 Porównanie dwóch metod zakaŝenia wywoływane przez CMV Garrigue I, Boucher S, Couzi L et al: Whole blood real-time quantitative PCR for cytomegalovirus infection follow-up in transplant recipients. J Clin Virol 2006; 36: Niederwieser D: Rozdział: Chronic disorders; w Haemopoetic stem cell transplantation. The EBMT Handbook Red. Apperley J, Carreras E, Gluckman E, Gratwohl A, Masszi T. Wyd: Forum Service Editore, Genoa 2004; Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: dr n. wet. Tomasz Dzieciatkowski Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Chałubińskiego Warszawa fax: dzieciatkowski@wp.pl