Wzmocnienie fluorescencji układu fotosyntetycznego LH2 poprzez kontrolę sprzężenia plazmonowego z nanocząstkami plazmonicznymi

Transkrypt

1 Uniwersytet Mikołaja Kopernika Wydział Fizyki Astronomii i Informatyki Stosowanej Instytut Fizyki Łukasz Bujak Wzmocnienie fluorescencji układu fotosyntetycznego LH2 poprzez kontrolę sprzężenia plazmonowego z nanocząstkami plazmonicznymi Rozprawa doktorska napisana pod kierunkiem: dra hab. Sebastiana Maćkowskiego, prof. UMK Wydział Fizyki, Astronomii i Informatyki Stosowanej, Uniwersytet Mikołaja Kopernika Toruń 2013

2

3 Składam serdeczne podziękowania Promotorowi, dr. hab. Sebastianowi Maćkowskiemu, za cenne uwagi oraz wskazówki udzielane podczas pracy nad niniejszą rozprawą. Chciałbym podziękować również członkom Zespołu Optyki Nanostruktur Hybrydowych za wsparcie, motywację oraz miłą atmosferę pracy

4

5 - 3 - Rozprawę tę dedykuję mojej Żonie Agacie

6

7 Praca została zrealizowana w ramach programu WELCOME Hybrid nanostructures as a stepping stone towards efficient artificial photosynthesis finansowanego przez Fundację na rzecz Nauki Polskiej

8

9 SPIS TREŚCI Spis rysunków... 9 Użyte skróty Dorobek naukowy Wprowadzenie Plazmonowe nanocząstki metaliczne Modele powstawania rezonansów plazmonowych Model półklasyczny Model quasi-statyczny teoria Lorda Rayleigha Model Mie Elipsoidalne nanocząstki plazmoniczne Nanocząstki plazmoniczne o kształcie trójkątnym Przykłady pomiarów rezonansów plazmonowych w nanocząstkach metalicznych Wpływ rezonansów plazmonowych nanocząstek metalicznych na fluorofory Przykłady pomiarów wpływu rezonansów plazmonowych nanocząstek metalicznych na fluorofory Układy fotosyntetyczne LH Bakterie purpurowe Pigmenty Karotenoidy Bakteriochlorofile Struktura układu fotosyntetycznego LH Struktura energetyczna oraz transfer energii w układach LH Pomiary transferu energii w reżimie wysokich koncentracji układów fotosyntetycznych LH Pomiary spektroskopowe na poziomie pojedynczych układów fotosyntetycznych LH Pierścień B800 układu fotosyntetycznego LH Pierścień B850 układu fotosyntetycznego LH Materiały i metody pomiarowe Synteza sferycznych nanocząstek złota Synteza złotych nanoprętów

10 Synteza srebrnych nanotrójkątów Otrzymywanie układów fotosyntetycznych LH Przygotowanie nanostruktur hybrydowych Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze sferycznymi nanocząstkami złota Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze złotymi nanoprętami Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze srebrnymi nanotrójkątami Fluorescencyjny mikroskop konfokalny Mapowanie fluorescencji Fluorescencyjny mikroskop szerokiego pola Absorpcyjna spektroskopia UV/VIS Stacjonarna spektroskopia fluorescencyjna Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza Nanostruktury hybrydowe Wpływ karotenoidów na fotostabilność układów fotosyntetycznego LH Wnioski Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze sferycznymi nanocząstkami złota Stacjonarna spektroskopia fluorescencyjna Spektroskopia czasowo-rozdzielcza fluorescencji Wnioski Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze złotymi nanoprętami Mapy intensywności fluorescencji Spektroskopia czasowo-rozdzielcza fluorescencji Wnioski Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze srebrnymi nanotrójkątami Mapy intensywności fluorescencji Wnioski Podsumowanie Bibliografia

11 SPIS RYSUNKÓW Rys. 1. Schematyczny rysunek przedstawiający indukowane światłem wzbudzenie rezonansu plazmonowego w metalicznej nanocząstce Rys. 2. Schematyczny rysunek przedstawiający założenia quasi-statycznego modelu powstawania rezonansu plazmonowego w nanocząstce metalicznej Rys. 3. (a) Widma absorpcji sferycznych nanocząstek złota o średnicy od d= 9 nm do 99 nm. (b) Wykres szerokości pasma plazmonowego w funkcji promienia nanocząstki. (c) Wykres współczynnika ekstynkcji w funkcji objętości nanocząstki. Zaczerpnięto z [30] Rys. 4. (a) Fotografia roztworów koloidalnych złotych nanoprętów o coraz większym stosunku szerokości do długości. (b) Zdjęcie ze skaningowego mikroskopu elektronowego nanoprętów. (c) Widma absorpcji odpowiadające nanoprętom. Zaczerpnięto z [39] Rys. 5. Fotografia mikroskopowa próbki zawierającej złote nanopręty (czerwone punkty) oraz sferyczne nanocząstki złota o średnicy d = 60 nm (zielone punkty) wykonana przy pomocy mikroskopii ciemnego pola (schemat u góry z lewej strony). Dolny prawy: obraz TEM użytych nanoprętów oraz nanocząstek złota. Zaczerpnięto z [40] Rys. 6. (a) Od góry: obrazy SEM nanocząstek, poniżej obraz z mikroskopu ciemnego pola światła rozproszonego na złotych nanocząstkach. (b) Widmo rozproszenia światła białego na nanoprętach. Linie ciągłe to dane eksperymentalne, punkty to wyniki obliczeń teoretycznych. Zaczerpnięto z [41] Rys. 7 (a) Fotografia roztworów koloidalnych srebrnych nanotrójkątów o coraz większej długości boków. (b) Widma absorpcji odpowiadające nanotrójkątom. Zaczerpnięto z [43] Rys. 8. (a) Mapy amplitud spektroskopii strat energii elektronów na pojedynczych nanotrójkątach o długości boków 78 nm. (b) Wyniki symulacji map amplitud spektroskopii strat energii elektronów. Zaczerpnięto z [43] Rys. 9. (a) Uproszczony diagram Jabłońskiego dla fluoroforu w wolnej przestrzeni, oraz (b) dla fluoroforu w obecności nanostruktur metalicznych Rys. 10. Wpływ rezonansu plazmonowego nanocząstek metalicznych na barwniki znajdujące się w odległości, w której może nastąpić nieradiacyjny przekaz energii z fluoroforu do nanocząstki metalicznej na intensywność fluorescencji (a), przebiegi czasowe intensywności fluorescencji (b), oraz fotostabilność fluoroforu (c). Wpływ rezonansu plazmonowego nanocząstek metalicznych na absorpcję barwników znajdujących się w obecności nanocząstki metalicznej na intensywność fluorescencji (d), przebiegi czasowe intensywności fluorescencji (e), oraz fotostabilność fluoroforu (f). Wpływ rezonansu plazmonowego nanocząstek metalicznych na emisję fluorescencji barwników znajdujących się w obecności nanocząstki metalicznej na intensywność fluorescencji (d), przebiegi czasowe intensywności fluorescencji (e), oraz fotostabilność fluoroforu (f). Linia ciągła odnosi się do fluoroforu w wolnej przestrzeni, natomiast linia przerywana odnosi się do fluoroforu w obecności nanocząstek metalicznych Rys. 11. (a) Obliczone wartości wydajności kwantowej fluoroforu (linia niebieska) oraz stosunku stałej wzbudzenia w obecności nanocząstki do stałej wzbudzenia w - 9 -

12 wolnej przestrzeni (linia czerwona) w funkcji odległości między fluoroforem a cząstką. (b) Obliczone wartości wzmocnienia fluorescencji fluoroforu w obecności nanocząstek o rozmiarach d = 20, 60, 80, 100 nm. Długość fali wzbudzającej λ = 650 nm. Zaczerpnięto z [49] Rys. 12. (a) Intensywność fluorescencji z pojedynczej molekuły w funkcji odległości od srebrnej nanocząstki (linia ciągła model wielopolowy, punkty dane eksperymentalne). Natężenie emisji promieniowania pojedynczej molekuły dla odległości : (b) wynik eksperymentu, (c) wartość teoretyczna. Zaczerpnięto z [49] Rys. 13. (a) Przebiegi czasowe intensywności fluorescencji fluoroforu w obecności srebrnych nanocząstek (b) Wzmocnienie fluorescencji fluoroforu oraz zmiana natężenia pola elektrycznego w odległości z = 8 nm od powierzchni metalu w funkcji średnicy nanocząstki. Zaczerpnięto z [52] Rys. 14. (a) Widmo emisji pojedynczego kompleksu PCP (zielona linia) oraz kompleksu PCP na powierzchni SIF (czerwona linia). (b) Rozkład intensywności fluorescencji z pojedynczych kompleksów PCP (zielone) oraz z PCP na powierzchni SIF (czerwone). Zaczerpnięto z [54] Rys. 15. (a) Struktura energetyczna karotenoidów. (b) Struktura chemiczna karotenoidów różnych typów. Zaczerpnięto z [59] Rys. 16. Struktura chemiczna bakteriochlorofilu a. (a) Pierścień bakteriochlorinowy. (b) Reszta fitolowa znajdująca cię w miejscu R pierścienia bakteriochlorinowego. Szare strzałki wskazują momenty dipolowe Q x oraz Q y. Zaczerpnięto z [58] Rys. 17. Struktura układu fotosyntetycznego LH2 z Rps. Acidophila: 9 Car (brązowy), B850 mocno sprzężone 18 BChla (czerwony), B800 słabo sprzężone 9 BChla (ciemno niebieski). (a) Widok z góry układu od peryplazmatycznej powierzchni membrany. (b) Widok z boku kompleksu. Zaczerpnięto z [56]. (c) Odległości pomiędzy molekułami z pierścienia B800 i B850 w Rps. Acidophila. Zaczerpnięto z [59] Rys. 18. Organizacja molekularna aparatów fotosyntetycznych w membranie chromatoforowej bakterii purpurowej z gatunku Rsp. Photometricum. (a) Surowe dane topograficzne z mikroskopu AFM (skala w pełnym kolorze to 3 nm wysokości). (b) Miejsca z kompleksami LH2 i LH1-RC odpowiadające względnej pozycji i orientacji otrzymanych z topografii. Strzałkami oznaczono miejsca występowania cytochromu bc1. (c) Modele kompleksów LH2, LH1-RC oraz cytochromów bc1 odpowiadające względnej pozycji oraz orientacji otrzymanych z map topograficznych. (belka = 5 nm). Zaczerpnięto z [88] Rys. 19. Transfer energii pomiędzy donorem a akceptorem, pomiędzy którymi może dojść do oddziaływania o wielkości Rys. 20. Poglądowa ilustracja przedstawiająca dwie molekuły o rozmiarze d, znajdujące się w odległości z od siebie Rys. 21. Schematyczny diagram reprezentujący przekaz energii wewnątrz układów fotosyntetycznych LH2 oraz LH1-RC oraz pomiędzy nimi. Zaczerpnięto z [99] Rys. 22. (a) Mikroskopowy obraz pojedynczych molekuł LH2 Rps. Acidophila. (b) Widmo wzbudzenia fluorescencji LH2 wysokiej koncentracji. (c) i (d) Widma wzbudzenia fluorescencji pojedynczych molekuł. Zaczerpnięto z [120]. (e)

13 Zależność widma wzbudzenia fluorescencji pojedynczej molekuły LH2 od polaryzacji światła wzbudzającego. Zaczerpnięto z [121] Rys. 23. Zmiany spektralne w absorpcji pigmentów z pierścienia B800. (a) Sekwencja 256 widm wzbudzenia fluorescencji. Intensywność jest powiązana z odcieniem szarości (b) Uśrednione widmo wzbudzenia fluorescencji powstałe z sekwencji widm pokazanych na (a). (c) Intensywność fluorescencji w funkcji czasu dla pasm oznaczonych, jako a i a z (a). (d) Funkcja autokorelacji (szara linia), oraz crosskorelacja (czarna linia) dla pasm oznaczonych, jako a i a. Zaczerpnięto z [118] Rys. 24. (a) Widma wzbudzenia fluorescencji pasma B850 pojedynczego LH2 dla wzajemnie ortogonalnych polaryzacji. Przedstawione są schematycznie najniższe poziomy energetyczne ekscytonu z pasma B850 kompleksu LH2 z Rps. Acidophila dla pigmentów o symetrii kołowej. Szare koła reprezentują początkową populację danego stanu energetycznego. Strzałki wskazują na wzajemną orientację momentów przejścia w płaszczyźnie pierścienia. (b) Widma wzbudzenia fluorescencji pasma B850 trzech różnych molekuł. Widoczne jest wąskie pasmo po czerwonej stronie pasma związanego z liczbą kwantową k as =±1, które odpowiada za liczbę kwantową k as =0. Zaczerpnięto z [98] Rys. 25. (a) Widmo ekstynkcji otrzymanych nanocząstek złota. (b) Obraz SEM otrzymanych sferycznych nanocząstek złota Rys. 26. (a) Widmo ekstynkcji otrzymanych nanoprętów złota. (b) Obraz SEM otrzymanych nanoprętów złota Rys. 27. (a) Widmo ekstynkcji otrzymanych nanotrójkątów złota. (b) Obraz TEM srebrnych nanotrójkątów o rezonansie plazmonowym 825 nm. Zaczerpnięto z [132] Rys. 28. (a) Probówka z odwirowanym roztworem układów fotosyntetycznych, górna warstwa zawiera LH2, dolna LH1-RC. (b) Widma ekstynkcji układów fotosyntetycznych odpowiednio LH2, oraz (c) kompleksów LH1-RC Rys. 29. Schemat nanostruktury hybrydowej złożonej z układów fotosyntetycznych LH2 oraz sferycznych nanocząstek złota odseparowanych warstwą krzemionki Rys. 30. (a) Schemat fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego. (b) Zdjęcie układu pomiarowego wykorzystanego w badaniach Rys. 31. Schemat mikroskopu szerokiego pola Rys. 32. Schemat spektrofotometru UV/VIS Cary 50. Zaczerpnięto z [138] Rys. 33. Mapy intensywności fluorescencji serii malejących koncentracji układów fotosyntetycznych LH2: z bakterii purpurowych Rps. Palustris (a) OD 850 = 1 cm -1, (b) OD 850 = 0,001 cm -1, (c) OD 850 = 0, cm Rys. 34. Przykładowe przebiegi czasowe intensywności fluorescencji z pojedynczej molekuły LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris. (a) Pojedynczy krok gaśnięcia fluorescencji. (b) Gaśnięcie fluorescencji a następnie przejście w stan niestabilnej fluorescencji. (c) Stan niestabilnej fluorescencji. (d) Stabilna fluorescencja z pojedynczym krokiem wygaszenia. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 480 nm Rys. 35. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji otrzymane z pomiarów kinetyki intensywności fluorescencji pojedynczych układów fotosyntetycznych z Rps. Palustris (górny rząd) oraz Rb. Sphaeroides (dolny rząd). Mapy zebrano po

14 czasie t = 2 s (a), (d), t = 10 s (e), t = 20 s (f), t = 300 s (b), oraz t = 600 s (c) ciągłego oświetlania. Wzbudzenie światłem o długości fali λ= 405 nm Rys. 36. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji otrzymane z pomiarów kinetyki intensywności fluorescencji pojedynczych układów fotosyntetycznych z Rps. Palustris (górny rząd) oraz Rb. Sphaeroides (dolny rząd). Mapy zebrano po czasie t = 2 s (a), (d), t = 300 s (b), (e), oraz t = 600 s (c), (f) ciągłego oświetlania. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 480 nm Rys. 37. Liczba pojedynczych kompleksów LH2 zlokalizowanych na mapie intensywności fluorescencji w funkcji czasu. (a) LH2 z Rb. Sphaeroides. (b) LH2 z Rps. Palustris. Czarną linią oznaczono wzbudzenie światłem o długości fali λ=405 nm, natomiast czerwoną światłem o długości fali λ=485 nm Rys. 38. Średnia intensywność fluorescencji kompleksów LH2 na mapie intensywności fluorescencji w funkcji czasu. (a) LH2 z Rb. Sphaeroides. (b) LH2 z Rps. Palustris. Czarną linią oznaczono wzbudzenie światłem o długości fali λ=405 nm, natomiast czerwoną światłem o długości fali λ = 485 nm Rys. 39. (a) Przykładowy rozkład intensywności fluorescencji pojedynczej molekuły. (b) Dopasowanie dwuwymiarowej funkcją Gaussa do punktów pomiarowych. Osie x oraz y odpowiadają przestrzennemu położeniu molekuły, oś z oznacza intensywność sygnału Rys. 40. Histogramy liczby fotonów docierających do kamery z pomiarów pojedynczych układów fotosyntetycznych otrzymanych z (a) Rps. Palustris oraz (b) Rb. Sphaeroides. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 480 nm Rys. 41 Wykres zależności całkowitej intensywności fluorescencji (λ wzb = 485 nm) od absorbancji Rys. 42. Widmo ekstynkcji sferycznych nanocząstek złota (niebieska linia), widmo ekstynkcji układów fotosyntetycznych LH2 (linia czarna), widmo emisji układów fotosyntetycznych LH2 wzbudzonego światłem o długości fali λ = 485 nm (linia czerwona) Rys. 43. Widma emisji fluorescencji LH2 oddalonych od sferycznych nanocząstek złota na odległość z = 4 nm (linia niebieska), z =12 nm (linia czerwona), z = 40 nm (linia zielona). Widmo emisji fluorescencji kompleksów LH2 oznaczono czarną linią. Czarnymi kropkami oznaczono przeskalowane widmo fluorescencji układów fotosyntetycznych. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 485 nm Rys. 44. Odłożone wartości maksimów intensywności fluorescencji LH2 (punkty czarne), oraz kompleksów LH2 oddalonych od sferycznych nanocząstek złota na odległość z = 4 nm (punkty niebieskie), z =12 nm (punkty czerwone), z= 40 nm (punkty zielone) Rys. 45. Przebiegi czasowe intensywności fluorescencji kompleksów LH2 (linia czarna), oraz LH2 oddalonych od sferycznych nanocząstek złota na odległość z = 4 nm (linia niebieska), z =12 nm (linia czerwona) dla wzbudzeń światłem o długościach fali (a) λ=405 nm oraz (b) λ=485 nm Rys. 46. Wyznaczone wartości czasu zaniku fluorescencji LH2 w funkcji odległości od sferycznych nanocząstek złota dla wzbudzeń światłem o długościach fali (a) λ=405 nm oraz (b) λ=485 nm

15 Rys. 47. Wykres wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 w funkcji odległości od sferycznych nanocząstek złota. Linią ciągłą oznaczono wzbudzenie o długości fali λ=480 nm, natomiast linią przerywaną λ=405 nm Rys. 48. Widmo ekstynkcji złotych nanoprętów (niebieska linia), widmo ekstynkcji układów fotosyntetycznych LH2 (linia czarna), widmo emisji układów fotosyntetycznych LH2 (linia czerwona) Rys. 49. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji nanostruktur hybrydowych złożonych z LH2 oraz złotych nanoprętów. Mapy intensywności fluorescencji LH2 wzbudzanych światłem o długości fali λ=556 nm nanostruktur o odległościach pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami przedstawiono na (a) z=30 nm, (c) z=15 nm, (e) z=5 nm. Natomiast dla wzbudzenia światłem o długości fali λ=808 nm (b) z=30 nm, (d) z=15 nm, (f) z=5 nm Rys. 50. Histogramy intensywności fluorescencji z map przedstawionych na Rys. 49. Zielonym kolorem oznaczono histogram z mapy intensywności fluorescencji wzbudzanych światłem o długości fali λ = 556 nm, czerwonym natomiast λ = 808 nm dla odległości pomiędzy kompleksami LH2 a złotymi nanoprętami równymi (a) z = 30nm, (b) z = 15 nm, (c) z= 30 nm Rys. 51. (a) Wykres współczynnika wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 w funkcji odległości kompleksów LH2 od złotych nanoprętów. Linią czerwoną oznaczono wzbudzenie światłem o długości fali λ=556 nm, czarną natomiast λ=808 nm. (b) Wykres zależności stosunku średnich intensywności fluorescencji LH2 map fluorescencji wzbudzanych światłem o długości fali λ=808 nm do map fluorescencji wzbudzanych światłem o długości fali λ=556 nm w funkcji odległości kompleksów LH2 od złotych nanoprętów Rys. 52. Przebiegi czasowe intensywności fluorescencji LH2 znajdujących się w odległości z = 30 nm (zielona linia), z = 10 nm (czerwona linia), z = 5 nm od złotych nanoprętów dla wzbudzenia światłem o długości fali λ = 485 nm Rys. 53 Wartości wyznaczonych czasów zaniku fluorescencji LH2 w funkcji odległości od złotych nanoprętów. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 485 nm Rys. 54. Wykres wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 w funkcji odległości od złotych sferycznych nanocząstek złota (linia przerywana), złotych nanoprętów (linia ciagła) Rys. 55. Widma ekstynkcji układu fotosyntetycznego LH2 (linia niebieska) oraz srebrnych nanotrójkątów o rezonansach plazmonowych λ = 880 nm (linia czerwona), λ = 800 nm (linia zielona), λ = 720 nm (linia czarna). Czarnymi pionowymi liniami zaznaczono długości fali światła użytego do wzbudzenia fluorescencji LH2 (λ = 405 nm, λ = 480 nm, λ = 530 nm, λ = 640 nm) Rys. 56. (a) Mapa intensywności fluorescencji układów fotosyntetycznych, oraz mapy fluorescencji nanostruktur hybrydowych, których składnikiem są srebrne nanotrójkąty o rezonansach plazmonowych (b) 720 nm, (c) 800 nm, (d) 880 nm. Próbki wzbudzano oświetlaczem emitującym światło o długości fali λ= 630 nm Rys. 57. Histogram intensywności fluorescencji otrzymane z map fluorescencji LH2 oraz histogramy intensywności fluorescencji nanostruktur hybrydowych, których składnikiem są srebrne nanotrójkąty o rezonansach plazmonowych (b) 720 nm, (c) 800 nm, (d) 880 nm. Próbki wzbudzano oświetlaczem emitującym światło o długości fali λ= 630 nm

16 Rys. 58. Mapy fluorescencji nanostruktur hybrydowych złożonych ze srebrnych nanotrójkątów z rezonansem plazmonowym na λ = 800 nm oraz układów fotosyntetycznych. Mapy zebrano z tego samego obszaru. Długość fali światła wzbudzającego LH2 zaznaczono na mapach fluorescencji Rys. 59. Przykład mapy fluorescencji dla nanostruktury z nanotrójkątami o rezonansie plazmonowym 880 nm. Różowymi kwadratami oznaczono wybrane obszary, w których nastąpiło wzmocnienie fluorescencji Rys. 60. Histogramy plazmonowego wzmocnienia fluorescencji układów fotosyntetycznych poprzez rezonans plazmonowy w srebrnych nanotrójkątach o rezonansach plazmonowych na długości fali (a) λ=720 nm, (b) λ=800 nm, (c) λ=880 nm Rys. 61. Widma ekstynkcji układu fotosyntetycznego LH2 (linia niebieska) oraz srebrnych nanotrójkątów o rezonansach plazmonowych λ = 880 nm (linia czerwona), λ = 800 nm (linia zielona), λ = 720 nm (linia czarna). Trójkątami oznaczono średnie wzmocnienie intensywności fluorescencji z układów fotosyntetycznych w obecności srebrnych nanotrójkątów w funkcji długości fali światła wzbudzającego. Kod kolorów odpowiada temu zastosowanemu do widm ekstynkcji

17 UŻYTE SKRÓTY wektor pola elektrycznego wektor momentu dipolowego wydajność kwantowa fluoroforu w wolnej przestrzeni wydajność kwantowa fluoroforu w obecności metalu ( ) funkcja polaryzowalności ( ) zespolona funkcja dielektryczna długość fali światła odchylenie standardowe częstość kątowa światła wektor jednostkowy średnia liczba fotonów przenikalność elektryczna próżni ( ) część rzeczywista zespolonej funkcji dielektrycznej ( ) część urojona zespolonej funkcji dielektrycznej funkcja dielektryczna otoczenia nanocząstki nieregularne cylindryczne funkcje Ricatti-Bessela przekrój czynny na absorpcję przekrój czynny na ekstynkcję przekrój czynny na rozpraszanie czas życia emitera w stanie wzbudzonym, czas zaniku fluorescencji regularne cylindryczne funkcje Ricatti-Bessela C stopnie Celsjusza µw mikrowat a półoś elipsoidy A akceptor Å angstrem B800 pierścień 9 bakteriochlorofili a w układzie fotosyntetycznym LH2 B850 pierścień 18 sprzężonych bakteriochlorofili a w układzie fotosyntetycznym LH2 BChla bakteriochlorofil a c prędkość światła w próżni C 6 H 8 O 6 kwas askorbinowy Car karotenoidy C m stężenie molowe cm centymetr cps liczba zliczeń na sekundę CTAB bromek heksadecylotrimetyloamoniowy

18 Cy5 fluorescencyjny barwnik cyjaninowy, czerwony d rozmiar nanocząstek, rozmiar molekuł D donor dm 3 decymetr sześcienny DNA kwas deoksyrybonukleinowy e liczba Eulera EM emisja ev elektronowolt EX wzbudzenie fs femtosekunda H Hamiltonian Im część urojona wyrażenia zespolonego IR podczerwień j. u. jednostki umowne k wektor falowy K Kelwin k i stałe szybkości zaników i wzbudzeń fluorescencji L indeks sumacyjny LDAO N-tlenek N,N-dimetylododecylo aminowy LH2 układ fotosyntetyczny bakterii purpurowych MES kwas 2-(N-morfolino) etanosiarczanowy mg miligram MHz megaherc ml mililitr mm milimol MMP metoda sprzężonych multipoli n współczynnik załamania światła NA apertura numeryczna obiektywu n i urojona część zespolonego współczynnika załamania światła nm nanometr n r rzeczywista część zespolonego współczynnika załamania światła ns nanosekunda OD gęstość optyczna P stan polaryzacji molekuły PCP perydynina-chlorofil-białko, układ fotosyntetyczny z alg PMMA polimetakrylan metylu ps pikosekunda PSSS poli (sodu-p-styrenosulfonian) PVA poli(alkohol winylowy) Q x, Q y momenty dipolowe występujące w BChla r promień

19 Rb. RC Re Rps. Rys. s SEM S i SIF t T Tab. TEM TRIS UV V V WD z μl rhodobacter centrum reakcyjne część rzeczywista wyrażenia zespolonego rhodopseudomonas rysunek sekunda skaningowy mikroskop elektronowy singletowe stany elektronowe warstwa srebrnych wysp czas temperatura tabela transmisyjny mikroskop elektronowy bufor trój(hydroksymetylo) aminometanowy ultrafiolet objętość oddziaływanie pomiędzy molekułami odległość robocza obiektywu odległość pomiędzy składnikami nanostruktur/grubość przekładki krzemionkowej mikrolitr

20

21 DOROBEK NAUKOWY PUBLIKACJE NAUKOWE Plasmon enhancement of fluorescence in single light-harvesting complexes from Amphidinium carterae, Bujak Ł., Piątkowski D., Maćkowski S., Wörmke S., Jung C., Bräuchle C., Agarwal A., Kotov N.A., Schulte T., Hofmann E., Brotosudarmo T.H.P., Scheer H., Govorov A.O., Hiller R.G., Acta Physica Polonica A, vol. 116, S22, 2009 Fluorescence spectroscopy of semiconductor CdTe nanocrystals: preparation effect on photostability, Bujak Ł., Olejnik M., Litvin R., Piątkowski D., Kotov N.A., Maćkowski S., Central European Journal Of Physics, vol. 9, 287, 2011 Fluorescence enhancement of light-harvesting complex 2 from purple bacteria coupled to spherical gold nanoparticles, Bujak Ł., Czechowski N., Piatkowski D., Litvin R., Brotosudarmo T.H.P., Cogdell R.J., Heiss W., Maćkowski S., Applied Physics Letters, vol. 99, , 2011 Spektroskopia Optyczna Nanostruktur Hybrydowych, Maćkowski S., Bujak Ł., Czechowski N., Schmidt M.K., Litvin R., Piatkowski D., Nyga P., Brotosudarmo T.H.P., Monografia Nauka i Przemysł metody spektroskopowe, nowe wyzwania i możliwości, 513, 2011 Plasmonic Molecular Nanohybrids Spectral Dependence of Fluorescence Quenching, Olejnik M., Bujak Ł., Maćkowski S., International Journal of Molecular Sciences, vol. 13(1), 1018, 2012 Confocal microscopy of plasmonic hybrid nanostructures, Bujak Ł., Krajnik B., Olejnik M., Czechowski N., Piatkowski D., Mackowski S., Photonics Letters of Poland, vol. 4(1), 14, 2012 Spectral dependence of fluorescence enhancement in LH2-Au nanoparticle hybrid nanostructures, Bujak Ł., Brotosudarmo T.H.P., Czechowski N., Olejnik M., Ciszak K., Litvin R., Cogdell R., Heiss W., Maćkowski S., Acta Physica Polonica A, vol. 122, 2012 Energy transfer from conjugated polymer to bacterial light-harvesting complex, Buczynska D., Bujak Ł., Loi M.A., Brotosudarmo T.H.P., Cogdell R., Mackowski S., Applied Physics Letters, vol. 101, , 2012 Photoluminescence and positron annihilation lifetime studies on pellets of ZnO nanocrystals, Karbowski A., Fedus K., Patyk J., Bujak Ł., Służewski K., Karwasz G., Nukleonika, vol. 58(1), 2013 New insight into singlet oxygen generation at surface modified nanocrystalline TiO2 the effect of near-infrared irradiation, Buchalska M., Łabuz P., Bujak Ł, Szewczyk G., Sarna T., Maćkowski S., Macyk W., Dalton Transactions, vol. 42(26), 9468,

22 UDZIAŁ W KONFERENCJACH NAUKOWYCH IV Krajowa Konferencja Nanotechnologii - NANO 2010, Poznań, Polska, VII 2010 Plakat konferencyjny pt. Spektroskopia optyczna nanostruktur półprzewodnikowych Second International Conference on Multifunctional, Hybrid and Nanomaterials - Hybrid Materials 2011, Strasbourg, Francja, II 2011 Plakat konferencyjny pt. Control of plasmon coupling in gold nanoparticle light-harvesting complex assemblies Polish Photoscience Seminar, Krutyń, Polska, VI 2011 Wykład konferencyjny pt. Plasmon enhancement of absorption in hybrid light harvesting systems V Kopernikańskie Seminarium Doktoranckie, Toruń, Polska, VI 2011 Wykład konferencyjny pt. Nanostruktury hybrydowe złożone z kompleksów fotosyntetycznych LH2 oraz nanoprętów złota V Krajowa Konferencja Nanotechnologii - NANO 2011, Gdańsk, Polska, VII 2011 Wykład konferencyjny pt. Kontrola sprzężenia plazmonowego w nanoprętach złota z kompleksem fotosyntetycznym LH2 z bakterii purpurowych WELCOME Scientific Meeting on Hybrid Nanostructures, Toruń, Polska, VIII 2011 Wykład konferencyjny pt. Spectral dependence of fluorescence enhancement in LH2 - Au nanoparticle hybrids 12th Conference on Methods and Applications of Fluorescence, Strasbourg, Francja, IX 2011 Plakat konferencyjny pt. Plasmon induced fluorescence enhancement in LH2 complexes E-MRS 2011 Fall Meeting, Warszawa, Polska, IX 2011 Plakat konferencyjny pt. Plasmon induced absorption enhancement in LH2 complexes PhoBiA Annual Nanophotonics International Conference "PANIC", Wrocław, Polska, IV 2012 Wykład konferencyjny pt. Control of plasmon coupling in hybrid nanostructures composed of Au nanoparticles and light harvesting LH2 complex 11th International Conference on Hole Burning, Single Molecule and Related Spectroscopies: Science and Applications, Tybinga, Niemcy, VIII 2012 Plakat konferencyjny pt. Single molecule microscopy studies of photostability of LH2 complexes from different species Near-field Optics, Nanophotonics and Related Techniques, San Sebastian, Hiszpania, IX 2012 Plakat konferencyjny pt. Plasmon induced emission enhancement in LH2 and Ag nanotriangles hybrid nanostructures

23 WPROWADZENIE Plazmony powstają w wyniku kolektywnych oscylacji gazu swobodnych elektronów znajdujących się w obecności nieruchomych dodatnich jonów metalu. Oscylacje gazu elektronowego powstają pod wpływem zewnętrznego pola elektromagnetycznego. Możliwe są dwa rodzaje wzbudzenia plazmonów przez światło. Plazmony w płaskich powierzchniach metalicznych wzbudzane są poprzez powierzchniowy rezonans plazmonowy wzbudzany zewnętrznym polem elektrycznym. Natomiast dla struktur o nanometrowych rozmiarach plazmony wzbudza się poprzez zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonowy, zwany dalej rezonansem plazmonowym. Plazmony silnie rozpraszają i absorbują światło, wzmacniają również lokalne pole elektromagnetyczne [1][2][3]. Kolory roztworów nanostruktur plazmonicznych silnie zależą od geometrii nanocząstek metalicznych, zastosowanego metalu oraz od stałej dielektrycznej otoczenia. Dla najczęściej stosowanych metali szlachetnych rezonans plazmonowy w nanostrukturach przypada w zakresie ultrafioletowym (złoto) oraz widzialnym widma elektromagnetycznego (srebro). Nanocząstki metaliczne ze względu na swoje właściwości optyczne, które są zupełnie odmienne od właściwości materiałów objętościowych, z których są wytworzone, wykorzystywane są przez ludzkość już od czasów antycznych. Pierwszym odnotowanym zastosowaniem nanocząstek plazmonicznych jest wytworzony w IV w. n. e. puchar Likurga [4]. Dzięki zastosowaniu nanostruktur puchar ma ciekawą właściwość: mianowicie, gdy na puchar patrzymy w świetle rozproszonym ma on kolor zielony. Natomiast, jeżeli wewnątrz umieścimy białe światło, a puchar obserwujemy w świetle przechodzącym, jego kolor zmienia się na czerwony. Ze względu na swoje właściwości nanocząstki złota i srebra stosowano w średniowiecznych witrażach kościelnych. Już na początku XX wieku pojawiły się pierwsze próby wyjaśnienia natury plazmonów [5][6][7], jednak dopiero ostatnie postępy w strukturyzacji, manipulacji i obserwacji świata w skali nanometrowej ożywiły badania nad wzbudzeniami plazmonicznymi, które pozwolą na szersze wykorzystanie tego zjawiska. Dzięki zastosowaniu nanocząstek plazmonicznych rozwinęły się techniki obrazowania optycznego pozwalające na przekroczenie limitu dyfrakcyjnego [8][9][10], dzięki czemu powstały nowe dziedziny fizyki takie jak nanofotonika i nanoptyka

24 Ojciec współczesnej fotochemii Giacomo Ciamician już na początku XX w. postulował on, aby wykorzystywać odnawialną energię słoneczną zamiast korzystać z kopalnej energii słonecznej, czyli węgla i ropy naftowej. Przewidział on możliwość produkcji paliw dzięki sztucznej fotosyntezie [11]. Prace nad stworzeniem wydajnej sztucznej fotosyntezy [12][13][14] doprowadziły do powstania sztucznego liścia [15], który przeprowadza elektrolizę wody pod wpływem promieniowania słonecznego. Trwają ożywione badania nad zastosowaniem materiałów plazmonicznych w urządzeniach fotowoltaicznych [16][17]. Bardzo obiecujące są również badania nad możliwością połączenia naturalnych układów fotosyntetycznych z plazmonicznymi nanocząstkami [18][19]. Zaproponowane nanostruktury hybrydowe w przyszłości mogą doprowadzić do zwiększenia wydajności naturalnej fotosyntezy poprzez, np. poszerzenie zakresu spektralnego absorbowanego światła [20][21]. Celem niniejszej rozprawy było zbadanie wpływu wzbudzenia rezonansów plazmonowych w nanocząstkach metalicznych o różnej morfologii na właściwości optyczne układów fotosyntetycznych LH2 z bakterii purpurowej. Zaproponowano nanostruktury hybrydowe złożone z kompleksów fotosyntetycznych LH2 oraz sferycznych nanocząstek złota, złotych nanoprętów i srebrnych nanotrójkątów. Badano zależność wzmocnienia fluorescencji układów fotosyntetycznych od odległości od nanocząstek złota. Odległość pomiędzy składnikami nanostruktur kontrolowano dzięki zastosowaniu przekładek dielektrycznych o grubościach od z = 4 nm do z = 40 nm. Sprawdzano również wpływ spektralnej odległości rezonansu plazmonowego od długości fali emisji kompleksów fotosyntetycznych na intensywność fluorescencji LH2. Rozprawa doktorska składa się z czterech rozdziałów. Rozdział pierwszy obejmuje teoretyczny opis powstania rezonansów plazmonowych w nanostrukturach metalicznych, jak i oddziaływania powstałych rezonansów plazmonowych z fluoroforami znajdującymi się w obecności nanocząstek metalicznych. Zaprezentowano przegląd literaturowy badań doświadczalnych powstawania rezonansów plazmonowych w nanostrukturach plazmonicznych, oraz doświadczeń z zakresu oddziaływania rezonansu plazmonowego z barwnikami. Rozdział drugi stanowi przegląd literaturowy aktualnego stanu wiedzy na temat układów fotosyntetycznych LH2. W rozdziale trzecim przedstawiono metodę syntezy

25 sferycznych nanocząstek złota, złotych nanoprętów oraz srebrnych nanotrójkątów. Przedstawiono również proces otrzymywania układów fotosyntetycznych LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides. Główną częścią pracy było wytworzenie trzech rodzajów nanostruktur hybrydowych i badania ich właściwości optycznych technikami spektroskopii fluorescencyjnej. Zbadano nanostruktury hybrydowe złożone ze sferycznych nanocząstek złota oraz kompleksów LH2 oddzielonych warstwą krzemionki o grubościach z = 4 nm, z = 8 nm, z = 12 nm, z = 16 nm oraz z = 40 nm, złotych nanoprętów oraz układów fotosyntetycznych LH2 oddzielonych warstwą krzemionki o grubościach z = 5 nm, z = 10 nm, z = 15 nm, z = 20 nm oraz z = 30 nm, srebrnych nanotrójkątów wymieszanych z kompleksami LH2. Po opisie metod eksperymentalnych przedstawiono wyniki oraz analizę pomiarów optycznych. Przedstawiono pomiary fotostabilności kompleksów fotosyntetycznych LH2 otrzymanych z bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides Zaprezentowano spektroskopowe pomiary nanostruktur hybrydowych złożonych z kompleksów fotosyntetycznych LH2 oraz nanocząstek złota zarówno sferycznych jak i wydłużonych. Przedstawiono pomiary map intensywności fluorescencji nanostruktur hybrydowych złożonych z układów fotosyntetycznych LH2 oraz złotych nanoprętów jak również kompleksów LH2 oraz srebrnych nanotrójkątów

26

27 ROZDZIAŁ I PLAZMONOWE NANOCZĄSTKI METALICZNE W tym rozdziale przedstawiono zjawisko wzbudzenia plazmonowego w nanocząstkach metalicznych. Zaprezentowano modele teoretyczne powstania rezonansu plazmonowego w nanocząstkach metalicznych. Przedstawiono model półklasyczny, model quasi statyczny oparty na teorii lorda Rayleigha, oraz model oparty na teorii rozpraszania światła Mie. Odpowiednie modele teoretyczne poparto przeglądem literaturowym badań doświadczalnych powstawania rezonansów plazmonowych w nanocząstkach metalicznych. Przedstawiono badania doświadczalne sferycznych nanocząstek metalicznych, wydłużonych nanocząstek metalicznych jak i nanocząstek metalicznych o kształcie nanotrójkątnym. Przedstawiono również teoretyczny opis oddziaływania rezonansów plazmonowych na molekuły fluoroforu znajdujące się w pobliżu nanocząstek metalicznych. Również w tym przypadku rozważania teoretyczne poparto przeglądem literaturowym badań doświadczalnych. Modele powstawania rezonansów plazmonowych Model półklasyczny Wiele właściwości plazmonicznych nanocząstek może być wytłumaczonych w oparciu o półklasyczny model. Ponieważ średnica nanocząstek jest tego samego rzędu, co głębokość penetracji fali elektromagnetycznej w metalu, światło może przeniknąć przez nanocząstkę. Zewnętrzne pole Rys. 1. Schematyczny rysunek przedstawiający elektromagnetyczne wprowadza w indukowane światłem wzbudzenie rezonansu oscylacje gaz elektronowy plazmonowego w metalicznej nanocząstce. [22][23], co jest schematycznie

28 przedstawione na Rys. 1. W związku z tym na powierzchni jednej strony nanocząstki powstaje ładunek ujemny, a z drugiej strony nanocząstka zostaje naładowana dodatnio. W wyniku tego powstaje siła kulombowska, przywracająca równowagę elektryczną w nanocząstce. Jeżeli częstotliwość światła wzbudzającego jest w rezonansie z oscylacjami gazu elektronowego, wtedy nawet małe zmiany pola elektromagnetycznego doprowadzają do dużych oscylacji elektronów. Amplituda drgań zależy tylko od tłumienia, które występuje w wyniku przejść zarówno promienistych jak i bezpromienistych. Częstotliwość rezonansowa gazu elektronowego zależy głównie od wartości powstałej siły. Siła natomiast zmienia się wraz z odległością pomiędzy ładunkami wyindukowanymi na powierzchni, czyli od rozmiaru nanocząstki, oraz polaryzowalności. Na polaryzowalność nanocząstki wpływa wartość funkcji dielektrycznej ośrodka, w którym znajduje się nanocząstka oraz funkcja dielektryczna samej nanocząstki. Przemienne zmiany ładunków na powierzchni cząstki skutecznie tworzą dipol emitujący fale elektromagnetyczne. To proste podejście do opisu nanocząstek metalicznych przypomina opis anteny promieniowania elektromagnetycznego, dlatego plazmoniczne nanocząstki określa się mianem anten optycznych [24][25][26]. Model quasi-statyczny teoria Lorda Rayleigha Prosty quasi-statyczny model powstawania plazmonu w sferycznej cząstce przypisywany jest Lordowi Rayleighowi. Model ten stosuje się dla nanocząstek, których rozmiar jest znacznie mniejszy niż długość fali światła padającego, a więc faza pola elektromagnetycznego jest stała wokół całej nanocząstki [27]. W modelu zaniedbane są efekty związane z samoindukcją pola elektromagnetycznego w sferycznej nanocząstce założenia quasi-statycznego modelu powstawania Rys. 2. Schematyczny rysunek przedstawiający (efekty retardacyjne), natomiast rezonansu plazmonowego w nanocząstce odpowiedź elektromagnetyczna od metalicznej

29 nanocząstki jest zdominowana poprzez mod dipolarny. Dla nanocząstki opisywanej poprzez gaz elektronowy, moment dipolowy odpowiada kolektywnym oscylacjom gazu elektronowego względem nieruchomej sieci jonów [28]. To uproszczenie może być stosowane dla cząstek o rozmiarach mniejszych niż około d = 40 nm. Dużą zaletą takiego prostego elektrostatycznego podejścia do zagadnienia może być jego wykorzystanie do obliczenia odpowiedzi nanocząstki na pole elektryczne. Uproszczony graficzny model takiej sytuacji jest przedstawiony na Rys. 2. Jeżeli zastosowany będzie limit dipolowy, wtedy pole nanocząstkę wyindukuje w niej dipol zgodnie z równaniem padające na sferyczną (1) gdzie wzorem [2]: jest polaryzowalnością. Polaryzowalność dla sferycznej nanocząstki wyraża się ( ) ( ) ( ) (2) gdzie jest objętością nanocząstki, jest częstością kątową światła wzbudzającego, jest funkcją dielektryczną otoczenia nanocząstki, ( ) ( ) ( ) jest zespoloną funkcją dielektryczną materiału, z którego jest wykonana nanocząstka. Przekrój czynny na rozpraszanie, oraz przekrój czynny na absorpcję na nanocząstkach sferycznych w przybliżeniu Rayleigha wyrażamy, jako [29] ( ) ( ) ( ( ) ) ( ) ( ( ) ) ( ) (3)

30 Im[ ( )] = ( ( ) ) ( ), (4) gdzie jest wektorem falowym otoczenia nanocząstki, jest przenikalnością elektryczną próżni. Rezonans plazmonowy w nanocząstce powstaje, gdy spełniony jest warunek Frӧlicha w postaci [28][2][10] ( ). (5) Wyrażając przekrój czynny na ekstynkcję, jako otrzymujemy wyrażenie ( ) ( ) [ ( ) ] ( ) (6) gdzie jest objętością nanocząstki, jest częstością kątową światła wzbudzającego, jest prędkością światła, jest funkcją dielektryczną otoczenia nanocząstki, ( ) ( ) ( ) jest zespoloną funkcją dielektryczną materiału, z którego jest wykonana nanocząstka. Funkcja dielektryczna nanocząstki jest funkcją częstotliwości kątowej padającego światła, natomiast funkcja dielektryczna otoczenia nanocząstki jest od niej niezależna. Rezonans plazmonowy powstaje, gdy spełniony jest warunek Frӧlicha dany równaniem (5). Pole elektryczne na zewnątrz nanocząstki w przybliżeniu dipolowym możemy zapisać, jako sumę pola elektrycznego zewnętrznego pola, oraz pola elektrycznego wyindukowanego wokół dipola elektrycznego [18]: E E 0 ( p ) p ( ) (7)

31 gdzie jest wektorem jednostkowym w kierunku wektora łączącego środek metalicznej nanocząstki z rozpatrywanym punktem w przestrzeni. Jako że, przekrój czynny na rozpraszanie skaluje się jak natomiast przekrój czynny na absorpcję skaluje się jak. Widać stąd, że absorpcja jest silniejsza od rozpraszania dla małych nanocząstek, natomiast dla większych nanocząstek rozpraszanie staje się dominujące [2]. Wyrażenie (6) jest szeroko stosowane do wyjaśnienia widm absorpcji nanocząstek. Warto zauważyć, że w dotychczasowych rozważaniach nigdzie nie założono, że nanocząstki są metaliczne. Wyrażenia na przekroje czynne wyjaśniają zarówno widma nanocząstek metalicznych, jak i widma nanocząstek dielektrycznych. W przypadku nanocząstek złota o rozmiarach mniejszych niż d = 20 nm, teoria Rayleigha wyjaśnia absorpcję zarówno w sposób jakościowy, jak i ilościowy [30][32][31]. Dla większych nanocząstek przybliżenie dipolowe przestaje obowiązywać. Rezonans plazmonowy zaczyna wyraźnie zależeć od rozmiaru nanocząstki, jako że jest funkcją promienia nanocząstki. Im nanocząstka staje się większa, tym ważniejsze stają się mody wyższego rzędu, ponieważ światło nie może spolaryzować cząstki jednorodnie. Przy niższych energiach pojawiają się mody wyższych rzędów, dlatego przy zwiększeniu się rozmiaru nanocząstki obserwuje się przesunięcie rezonansu plazmonowego w stronę podczerwonego zakresu widmowego [29][28][32]. Równocześnie przy przesuwaniu się rezonansu plazmonowego ku czerwieni, szerokość pasma rezonansu plazmonowego rośnie wraz ze wzrostem rozmiaru nanocząstek [28][32][33]. Poszerzenie rezonansu plazmonowego związane jest między innymi z efektami radiacyjnymi, które są zaniedbywane dla mniejszych nanocząstek. Ze względu na większy rozmiar nanocząstek, zewnętrzne pole elektromagnetyczne nie wzbudza plazmonu równomiernie w całej nanocząstce, przez co powstają mody wyższych rzędów występujące przy różnych energiach

32 Model Mie W 1908 roku Mie [6], jako pierwszy przedstawił teorię tłumaczącą czerwony kolor roztworu sferycznych nanocząstek złota. Swoje rozważania oparł na rozwiązaniu równań Maxwella fali świetlnej, oddziałującej na małe sfery. Cząstki te posiadają funkcje dielektryczne takie same jak makroskopowe materiały objętościowe. Rozwiązanie tych równań przy odpowiednich warunkach brzegowych dla sferycznych nanocząstek pozwoliło otrzymać wyrażenia na przekrój czynny na ekstynkcję, oraz na przekrój czynny na rozpraszanie na nanocząstkach postaci [28][29][32] ( )Re( ) (8) ( )( ) (9) natomiast przekrój czynny na absorpcję jest wyrażony, jako ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ), gdzie jest częścią urojoną zespolonego współczynnika załamania światła nanocząstki, jest rzeczywistą częścią współczynnika załamania światła otoczenia nanocząstki, jest wektorem falowym natomiast, gdzie jest promieniem nanocząstki. Funkcje oraz są odpowiednio regularnymi oraz nieregularnymi cylindrycznymi funkcjami Ricatti-Bessela. jest indeksem sumacyjnym po kolejnych momentach oscylacyjnych. Tak, więc odnosi się do momentu dipolowego oscylacji gazu elektronowego, obrazowo przedstawionego na Rys. 1, odpowiada momentowi kwadrupolowemu oscylacji itd. [28][31][34]. W przypadku sferycznych nanocząstek złota o rozmiarach większych niż d = 20 nm, teoria Mie wyjaśnia absorpcję zarówno w sposób jakościowy, jak i ilościowy [30][31][35]

33 Dla nanocząstek, których rozmiar jest znacznie mniejszy, niż długość fali światła wzbudzającego, tylko momenty dipolowe oscylacji gazu elektronowego wnoszą znaczący wkład do przekroju czynnego na ekstynkcję. Wtedy teoria Mie redukuje się do przybliżenia dipolowego Rayleigha w postaci podanej w równaniu (6). Elipsoidalne nanocząstki plazmoniczne Elektrostatyczną teorię rozpraszania światła na małych sferycznych nanocząstkach można łatwo rozszerzyć do opisu rozpraszania na nanocząstkach elipsoidalnych. Cząstki elipsoidalne można scharakteryzować przy pomocy trzech półosi elipsoidy. Jeżeli rozpraszanie rozpatrzymy we współrzędnych eliptycznych [29] otrzymamy wyrażenie na polaryzowalność wzdłuż osi głównych elipsoidy ( ): ( ) ( ( ) ) (10) jest współczynnikiem geometrycznym, zależnym od kształtu nanocząstki, danym wzorem d ( ) ( ) (11) gdzie ( ) ( )( )( ). Współczynniki geometryczne muszą spełniać zależność, więc dla sfery otrzymujemy. Szczególnymi przypadkami elipsoid są sferoidy, których dwie osie są sobie równe. Dla wydłużonych nanocząstek dwie krótsze osie elipsoidy są sobie równe ( ), natomiast dla nanocząstek spłaszczonych dwie dłuższe osie elipsoidy ( ). W obu przypadkach rozwiązanie równania prowadzi do powstania dwóch widmowo rozdzielonych rezonansów plazmonowych, odpowiadających za oscylacje gazu elektronowego wzdłuż półosi dłuższej, jak i półosi krótszej. Rezonans plazmonowy wzdłuż półosi dłuższej jest

34 przesunięty ku czerwieni w porównaniu do rezonansu plazmonowego w sferycznej nanocząstce o podobnej objętości. Jeżeli nanocząstka będzie posiadała duży stosunek długości do szerokości, istnieje możliwość przesunięcia rezonansu plazmonowego związanego z długością nanocząstki aż do podczerwonego zakresu widmowego. Warto jednak zauważyć, że równanie (10) jest stosowalne, o ile dłuższa półoś jest znacznie mniejsza od długości fali wzbudzającej. Nanocząstki plazmoniczne o kształcie trójkątnym Opisu powstawania rezonansów plazmonowych w sferycznych nanocząstkach nie można zastosować do nanotrójkątnych nanocząstek plazmonicznych. W tym przypadku stosuje się metodę przybliżenia dyskretnych dipoli zaproponowaną przez Purcella w pracy [36], a następnie rozwinięta przez Draina w pracy [37]. Metoda ta jest dokładnym rozwiązaniem równań Maxwella, dzięki czemu bardzo dobrze nadaje się do opisu rozpraszania światła na niesferycznych oraz niejednorodnych nanocząstkach. W przypadku tego przybliżenia fala elektromagnetyczna oddziałuje z wieloma wyindukowanymi wewnątrz nanocząstki dipolami. Wyindukowane dipole mogą oddziaływać pomiędzy sobą. Przybliżenie to jest rozszerzeniem teorii Mie oddziaływania sferycznych nanocząstek z falą elektromagnetyczną. W przypadku nanotrójkątów powstanie rezonansu plazmonowego zależne jest od grubości nanotrójkątów, długości boków nanotrójkątów, kształtu wierzchołków nanotrójkątów, oraz rodzaju materiału, z którego stworzone są nanotrójkąty oraz funkcji dielektrycznej otoczenia nanotrójkątów. W nanotrójkątach można wyróżnić rezonanse plazmonowe powstające na wierzchołkach nanotrójkątów, na ich brzegach jak również w części wewnętrznej nanotrójkątów. Dzięki manipulacji rozmiarem oraz kształtem nanotrójkątów możliwe jest strojenie rezonansu plazmonowego związanego z wierzchołkami nanotrójkątów w zakresie długości fal od niebieskiego do podczerwonego zakresu widma elektromagnetycznego

35 Przykłady pomiarów rezonansów plazmonowych w nanocząstkach metalicznych Na Rys. 3 [30] przedstawiono efekt przesunięcia widmowego rezonansu plazmonowego złotych nanocząstek, które jest związane z rozmiarem sferycznych nanocząstek. Wraz ze zwiększeniem rozmiaru nanocząstki zmianie ulega spektralne położenie rezonansu plazmonowego. Im nanocząstka jest większa, tym rezonans plazmonowy z nią powiązany przesuwa się do podczerwonego zakresu widma elektromagnetycznego, co jest przedstawione na Rys. 3(a). Dla nanocząstek, w których można stosować przybliżenie dipolowe można również zauważyć zwężenie szerokości rezonansu plazmonowego, wraz ze wzrostem rozmiaru nanocząstki. Średnia droga swobodna elektronu w złocie wynosi 40±50 nm [38]. Elektrony rozpraszając się na powierzchni nanocząstki w sposób elastyczny, ale całkowicie przypadkowy powodują Rys. 3. (a) Widma absorpcji sferycznych nanocząstek złota o średnicy od d= 9 nm do 99 nm. (b) Wykres szerokości pasma plazmonowego w funkcji promienia nanocząstki. (c) Wykres współczynnika ekstynkcji w funkcji objętości nanocząstki. Zaczerpnięto z [30]

36 zmniejszenie spójności oscylacji plazmonu. Elektrony mogą również zderzać się nieelastycznie z powierzchnią nanocząstki, co doprowadzi do zmiany fazy plazmonu. Im mniejsza jest nanocząstka tym szybciej elektron dociera do powierzchni, co powoduje szybszą stratę spójności oscylacji niż dla większych nanocząstek. Konsekwencją jest poszerzenie się pasma rezonansu plazmonowego wraz ze zmniejszeniem rozmiaru nanocząstki. Natomiast dla nanocząstek większych od d = 24 nm obserwowane poszerzenie rezonansu plazmonowego (Rys. 3(b)) związane jest z tym, że rozmiar nanocząstki przestaje być znacznie mniejszy od długości fali światła wzbudzającego. Powoduje to, że pole elekromagnetyczne nierównomiernie polaryzuje nanocząstkę. Poszerzenie może być również związane z wzbudzeniem rezonansów plazmonowych wyższych rzędów, które występują dla różnych energii. Przedstawiony wykres molowego współczynnika ekstynkcji w funkcji objętości nanocząstki w skali logarytmicznej (Rys. 3(c)) skaluje się liniowo, co jest zgodne z teorią Mie i równaniem (6). Wraz ze wzrostem objętości nanocząstki liniowo rośnie jej przekrój czynny na ekstynkcję. W nanocząstkach wydłużonych, typu nanopręty, widoczny jest nieco inny efekt związany z ich rozmiarem. W tym wypadku rezonans poprzeczny zachowuje się podobnie, jak rezonans nanocząstki sferycznej. Rezonans podłużny jest przesunięty w czerwony zakres widma i jest związany ze zmianą stosunku szerokości do długości nanoprętów. Zachowanie pasma związanego z rezonansami poprzecznymi oraz podłużnymi Rys. 4. (a) Fotografia roztworów koloidalnych złotych nanoprętów o coraz większym stosunku szerokości do długości. (b) Zdjęcie ze skaningowego mikroskopu elektronowego nanoprętów. (c) Widma absorpcji odpowiadające nanoprętom. Zaczerpnięto z [39]

37 przedstawione jest na Rys. 4, który został zaczerpnięty z [39]. Fotografie koloidów zawierających nanopręty przedstawione są na Rys. 4(a). Widoczne jest, że już mała zmiana stosunku szerokości do długości nanoprętów prowadzi do dużej zmiany koloru roztworu. Zmianę tę odzwierciedla przesunięcie położenia maksimum absorpcji nanoprętów odpowiadające położeniu podłużnego rezonansu plazmonowego, widoczne na Rys. 4(c). Zdjęcia odpowiadające nanoprętom w roztworze wykonane skaningowym mikroskopem elektronowym umieszczone są na Rys. 4(b). Również w tym wypadku widoczne jest poszerzenie się rezonansu plazmonowego. Im bardziej rezonans plazmonowy jest przesunięty ku podczerwieni tym jest on coraz szerszy. Podczerwony rezonans plazmonowy jest związany z długością nanoprętów. W związku z tym im nanopręty są dłuższe tym rezonans plazmonowy staje się coraz szerszy ze względu na zmniejszenie Rys. 5. Fotografia mikroskopowa próbki zawierającej złote nanopręty (czerwone punkty) oraz sferyczne nanocząstki złota o średnicy d = 60 nm (zielone punkty) wykonana przy pomocy mikroskopii ciemnego pola (schemat u góry z lewej strony). Dolny prawy: obraz TEM użytych nanoprętów oraz nanocząstek złota. Zaczerpnięto z [40]

38 spójności oscylacji plazmonu wewnątrz nanoprętów. Rezonans plazmonowy występujący w pojedynczych nanocząstkach plazmonicznych można obserwować przy pomocy mikroskopii dalekiego pola z oświetleniem typu ciemnego pola, oraz mikroskopii bliskiego pola. W mikroskopii ciemnego pola badane jest tylko światło rozproszone na nanocząstkach plazmonicznych. Umożliwia to badanie pojedynczych cząstek równomiernie rozłożonych na podłożu. Na Rys. 5 [40] przedstawiony jest obraz z mikroskopu szerokiego pola, który wykorzystuje lampę Rys. 6. (a) Od góry: obrazy SEM nanocząstek, poniżej obraz z mikroskopu ciemnego pola światła rozproszonego na złotych nanocząstkach. (b) Widmo rozproszenia światła białego na nanoprętach. Linie ciągłe to dane eksperymentalne, punkty to wyniki obliczeń teoretycznych. Zaczerpnięto z [41]

39 halogenową jako źródło światła padającego na próbkę. Każdy jasny punkt na obrazie odpowiada światłu rozproszonemu na pojedynczej nanocząstce. W zależności od kształtu oraz rozmiaru, nanocząstki różnie rozpraszają padające światło. Na zamieszczonym obrazie mikroskopowym nanopręty są koloru czerwonego, natomiast sferyczne nanocząstki są koloru zielonego. W prawym dolnym rogu przedstawiony jest również obraz z transmisyjnego mikroskopu elektronowego pokazujący strukturę użytych nanocząstek. Na Rys. 6(a) [41] podobnie jak na rysunku poprzednim, przedstawiony jest obraz z mikroskopu ciemnego pola. Tym razem przedstawione są na nim nanocząstki trójkątne oraz nanopręty o różnym stosunku długości do szerokości oraz odpowiadające im obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego przedstawiające konkretne nanocząstki obserwowane mikroskopem ciemnego pola. Zmierzono także widmo rozproszenia światła na pojedynczych nanocząstkach i przedstawiono je na Rys. 6(b) jako linia ciągła. Widma rozpraszania światła na nanocząstkach zostały porównane z wynikami obliczeń teoretycznych, przedstawionymi, jako punkty. Widmo rozproszenia w przypadku nanoprętów mierzono przy wykorzystaniu światła spolaryzowanego równolegle do ułożenia nanoprętów, w związku z tym widoczny jest tylko jeden rezonans plazmonowy związany z rezonansem podłużnym w nanoprętach. Nanocząstki plazmoniczne o kształcie nanotrójkątów wykazują możliwość strojenia rezonansu plazmonowego poprzez zmianę długości boków. Fotografia koloidalnych roztworów srebrnych nanotrójkątów przedstawiona jest na Rys. 7(a) zaczerpniętym z [42]. (a) (b) Rys. 7 (a) Fotografia roztworów koloidalnych srebrnych nanotrójkątów o coraz większej długości boków. (b) Widma absorpcji odpowiadające nanotrójkątom. Zaczerpnięto z [43]

40 Główny mod rezonansu plazmonowego w nanotrójkątach powstaje na wierzchołkach. Mod ten może być spektralnie zmieniany w zależności od długości boku nanotrójkątów. Zmiana kolorów roztworów związana jest z przesuwaniem się rezonansu plazmonowego wraz ze zwiększeniem się rozmiaru nanocząstki. Z lewej strony fotografii przedstawione są najmniejsze nanotrójkąty natomiast z prawej strony największe. Odpowiadające im widma przedstawione są na Rys. 7(b). Na widmach widoczny jest również mod odpowiadający rezonansowi plazmonowemu powstającemu dla długości fali λ = 365 nm, który jest związany z rezonansem plazmonowym powstającym na powierzchni nanotrójkątów. Jest również widoczny mod związany z powstaniem rezonansu plazmonowego na bokach nanotrójkątów lokalizujący się przy długości fali λ = 440 nm i przesuwa się ku czerwieni wraz ze 1zwiększeniem rozmiaru nanotrójkątów. Dla największych nanotrójkątów może dojść do powstania większej ilości modów rezonansów plazmonowych na bokach, np. ciemnoniebieskie widmo na Rys. 7(b), w którym widoczny jest rezonans plazmonowy na powierzchni nanotrójkątów (λ = 440 nm), dwa mody rezonansów plazmonowych związane (a) (b) Rys. 8. (a) Mapy amplitud spektroskopii strat energii elektronów na pojedynczych nanotrójkątach o długości boków 78 nm. (b) Wyniki symulacji map amplitud spektroskopii strat energii elektronów. Zaczerpnięto z [43]

41 z długością boków nanotrójkątów (λ = 510 nm, λ = 620 nm) oraz rezonans plazmonowy związany z wierzchołkami nanotrójkątów (λ = 1040 nm). W pracy [43] przedstawiono pomiary rezonansów plazmonowych na pojedynczych nanotrójkątach. Długości boków nanotrójkątów wynosiły 78 nm pomiary wykonano metodą spektroskopii strat energii elektronów. Wyniki tych pomiarów przedstawiono na Rys. 8(a). W zależności od energii elektronów użytych w pomiarach widoczne jest powstanie trzech modów rezonansów plazmonowych związanych z wierzchołkami, bokami oraz wnętrzem nanotrójkątów. Przeprowadzono symulację numeryczną powstania rezonansu plazmonowego w badanych nanotrójkątach, wyniki zaprezentowano na Rys. 9(b). Dominującym rezonansem plazmonowym jest rezonans zawiązany z wierzchołkami nanotrójkątów. Wyniki pomiarów na pojedynczych nanotrójkątach są zgodne z pomiarami roztworów koloidalnych. Wpływ rezonansów plazmonowych nanocząstek metalicznych na fluorofory Stany energetyczne fluoroforów przedstawione są na uproszczonym diagramie Jabłońskiego (Rys. 9). W wyniku absorpcji fotonu fluorofor przechodzi do elektronowego stanu wzbudzonego. Przejście to można opisać stałą szybkości wzbudzenia, która jest miarą liczby cząsteczek absorbujących światło w ciągu jednej sekundy. Następnie ma miejsce relaksacja do pierwszego stanu wzbudzonego, z którego następuje zanik promienisty o stałej szybkości szybkości z emisją fotonu, lub zanik bezpromienisty o stałej [44]. Energia fotonu emitowanego przez fluorofor jest mniejsza od energii zaabsorbowanego fotonu. Różnicę między energią zaabsorbowaną a wyemitowaną nazywamy przesunięciem Stokesa. Związek między wzbudzeniem a emisją fotonu można zapisać jako (12) gdzie jest wydajnością kwantową, określającą stosunek stałej szybkości fluorescencji, do sumy stałych szybkości zarówno zaniku promienistego jak i bezpromienistego. Zapisujemy go jako[45]

42 (13) Czas życia emitera w stanie wzbudzonym jest równy odwrotności sumy stałych szybkości zaniku promienistego i bezpromienistego[45] (14) Plazmony, jak zostało pokazane wcześniej, wzmacniają pole elektromagnetyczne wokół struktur metalicznych, w których powstają. Dzięki temu wzmocnieniu fluorofor może, więc oddziaływać z dodatkowym polem elektromagnetycznym. Efektem powstania dodatkowego pola elektromagnetycznego jest wzmocnienie intensywności fluorescencji bez zmiany wydajności kwantowej ( ) lub czasu życia stanu wzbudzonego ( ) molekuły barwnika. Występuje on wtedy, gdy rezonans plazmonowy nanocząstki jest sprzężony tylko z absorpcją fluoroforu. W tym przypadku związek między wzbudzeniem, a emisją możemy zapisać, jako (a) (b) Rys. 9. (a) Uproszczony diagram Jabłońskiego dla fluoroforu w wolnej przestrzeni, oraz (b) dla fluoroforu w obecności nanostruktur metalicznych

43 (15) gdzie jest sumą stałej szybkości wzbudzenia wolnego emitera oraz emitera w obecności struktury metalicznej. Drugi efekt występuje, gdy rezonans plazmonowy nanocząstki jest sprzężony z pierwszym stanem wzbudzonym fluoroforu. W tym wypadku sprzężenie z rezonansem może doprowadzić do zwiększenia szybkości zaniku promienistego. Zanik bezpromienisty ( ) zachodzący dla fluoroforu, odpowiada stratom wewnątrz molekuły fluoroforu. Wartość tych strat prawie nie zmienia się w obecności nanocząstek metalicznych. Przyjmuje się, zatem, że jest to wartość stała. Wydajność kwantową ( ) oraz czas życia emitera ( ) w obecności plazmonicznej nanocząstki możemy zapisać, jako (16) (17) W tym wypadku związek między wzbudzeniem a emisją możemy zapisać, jako (18) Na Rys. 10 zilustrowano możliwy wpływ rezonansu plazmonowego na fluorescencję barwnika znajdującego się w obecności metalicznych nanocząstek. Gdy fluorofor znajduje się w małej odległości do nanocząstki metalicznej następuje bezpromienisty przekaz energii z fluoroforu do nanocząstki metalicznej. Intensywność fluorescencji barwnika w obecności nanocząstki metalicznej jest mniejszy (linia przerywana na Rys. 10(a)) niż dla fluoroforu w wolnej przestrzeni (linia ciągła na Rys. 10(a)) związane jest o ze wzrostem szybkości zaniku bezpromienistego w obecności nanocząstki metalicznej ( ). Zgodnie

44 z równaniem (16) wydajność kwantowa fluoroforu znajdującego się w niewielkiej odległości od nanocząstki metalicznej maleje, co zgodnie z równaniem (17) doprowadza do (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (j) Rys. 10. Wpływ rezonansu plazmonowego nanocząstek metalicznych na barwniki znajdujące się w odległości, w której może nastąpić nieradiacyjny przekaz energii z fluoroforu do nanocząstki metalicznej na intensywność fluorescencji (a), przebiegi czasowe intensywności fluorescencji (b), oraz fotostabilność fluoroforu (c). Wpływ rezonansu plazmonowego nanocząstek metalicznych na absorpcję barwników znajdujących się w obecności nanocząstki metalicznej na intensywność fluorescencji (d), przebiegi czasowe intensywności fluorescencji (e), oraz fotostabilność fluoroforu (f). Wpływ rezonansu plazmonowego nanocząstek metalicznych na emisję fluorescencji barwników znajdujących się w obecności nanocząstki metalicznej na intensywność fluorescencji (d), przebiegi czasowe intensywności fluorescencji (e), oraz fotostabilność fluoroforu (f). Linia ciągła odnosi się do fluoroforu w wolnej przestrzeni, natomiast linia przerywana odnosi się do fluoroforu w obecności nanocząstek metalicznych

45 skrócenia czasu życia emitera, który można wyznaczyć z przebiegu zaniku fluorescencji (linia przerywana na Rys. 10(b)). Obserwuje się również zwiększenie fotostabilności fluoroforu (linia przerywana na Rys. 10(c)). W przypadku, gdy rezonans plazmonowy nanocząstki metalicznej oddziałuje tylko i wyłącznie na absorpcję fluoroforu wzrasta szybkość wzbudzenia fluoroforu. Obserwowany jest wówczas wzrost intensywności fluorescencji barwnika (linia przerywana na Rys. 10(d)) przy jednoczesnym braku zmiany wydajności kwantowej fluoroforu ani czasu życia emitera (Rys. 10(e)). W związku ze zwiększeniem stałej wzbudzenia fluoroforu dochodzi do zwiększenia liczbą aktów absorpcji w barwniku, co doprowadza do spadku fotostabilności barwnika (linia przerywana na Rys. 10(f)). W przypadku, gdy rezonans plazmonowy nanocząstki metalicznej oddziałuje wyłącznie z emisją fluorescencji z fluoroforu obserwuje się wzrost intensywności emisji barwnika (linia przerywana na Rys. 10(g)). Wzrost intensywności fluorescencji związany jest ze wzrostem wydajności kwantowej co wiąże się ze skróceniem czasu życia molekuły w stanie wzbudzonym (linia przerywana na Rys. 10(h)) [46][47][48]. Wzmocnienie intensywności fluorescencji możemy zdefiniować, jako względną wartość intensywności emisji fluoroforu oddziałującego z metaliczną strukturą, do wartości intensywności emisji fluoroforu nieoddziałującego z metalem, co wyrażamy, jako (19) Jeżeli otrzymana wartość jest większa od jedności, wtedy występuje wzmocnienie emisji fluorescencji fluoroforu, natomiast jeżeli wartość wzmocnienia jest poniżej jedności, sytuacja odpowiada gaszeniu fluorescencji w obecności nanocząstki plazmonicznej. Wielkość stałej szybkości wzbudzenia molekuły jest proporcjonalna do p E, gdzie E jest lokalnym polem elektrycznym, a p jest momentem dipolowym molekuły barwnika. Oznacza to, że jeżeli wektor momentu dipolowego jest równoległy do wektora pola elektrycznego, danego wzorem (7), obserwuje się zwiększenie ze wzrostem natężenia pola. Natomiast dla molekuł barwnika, którego wektor momentu dipolowego jest

46 skierowany prostopadle do pola elektrycznego, wzbudzenie fluoroforu nie nastąpi[49][50]. Względną wielkość wzbudzenia fluoroforu w obecności nanocząstki plazmonicznej do molekuły w wolnej przestrzeni można wyrazić równaniem: (20) Pole dane wzorem (7) jest sumą pól elektrycznych wzbudzającego układ i rozproszonego na nanocząstce metalicznej. Dla odległości z, przy których stosowalne jest przybliżenie dipolowe ze wzoru (20), możliwe jest wyznaczenie względnych wartości stałych szybkości zaniku promienistego i bezpromienistego, które wyrażamy wzorami: ( ) ( ) ( ) (21) ( ) ( ) (22) gdzie jest długością fali światła emitowanego przez molekułę, z jest odległością fluoroforu od nanocząstki, natomiast [ ]. Wzory te są prawidłowe przy założeniach, że stała dielektryczna otoczenia metalowej nanocząstki, wydajność kwantowa fluoroforu, moment dipolowy fluoroforu jest równoległy do osi z. Przykłady pomiarów wpływu rezonansów plazmonowych nanocząstek metalicznych na fluorofory Na molekułę znajdującą się w pobliżu nanocząstki plazmonicznej oddziałują dwa zjawiska: wzmocnienie pola elektromagnetycznego oraz nieradiacyjny przekaz energii z fluoroforu do nanocząstki plazmonicznej. Są one między innymi zależne od odległości między fluoroforem a nanocząstką. Zgodnie ze wzorem (7), natężenie pola elektrycznego

47 wokół nanocząstki jest tym większe, im bliżej nanocząstki znajduje się fluorofor, natomiast maleje wraz z oddalaniem się od nanocząstki plazmonicznej. Nieradiacyjny przekaz energii powoduje spadek wartości wydajności kwantowej emisji, co daje w konsekwencji spadek intensywności emisji (18). Przybliżenie dipolowe, dzięki któremu otrzymano równania (21) i (22) nie wyjaśnia niskiej wartości dla małych odległości pomiędzy fluoroforem a metalem. W tym wypadku bliska obecność molekuły powoduje, że pole wewnątrz nanocząstki nie może być traktowane, jako jednorodne. Przybliżenie dipolowe, zatem nie może być stosowane dla małych odległości. Dla nich stosuje się metody sprzężonych multipoli (MMP) [10][29][51]. Na Rys. 11(a) [49] przedstawiono wyniki obliczeń wpływu opisanych powyżej zjawisk na fluorofor. Wydajność kwantowa emisji fluoroforu wynosi, rozmiar złotych nanocząstek zastosowanych w doświadczeniu to d = 80 nm, natomiast długość fali Rys. 11. (a) Obliczone wartości wydajności kwantowej fluoroforu (linia niebieska) oraz stosunku stałej wzbudzenia w obecności nanocząstki do stałej wzbudzenia w wolnej przestrzeni (linia czerwona) w funkcji odległości między fluoroforem a cząstką. (b) Obliczone wartości wzmocnienia fluorescencji fluoroforu w obecności nanocząstek o rozmiarach d = 20, 60, 80, 100 nm. Długość fali wzbudzającej λ = 650 nm. Zaczerpnięto z [49]

48 światła wzbudzającego wynosi λ = 650 nm. Obliczenia wykonano dwiema metodami, linią przerywaną zaznaczone są wyniki obliczeń wykonanych w przybliżeniu dipolowym, natomiast linią ciągłą wyniki obliczeń wykonanych metodą sprzężonych multipoli Przybliżenie dipolowe stosuje się, gdy, oraz gdy pole jest jednorodne w całej objętości pobudzonej nanocząstki złota, co w tym przypadku nie jest spełnione. Nie powinno się, zatem w tym przypadku stosować przybliżenia dipolowego. Wyniki obliczeń przy zastosowaniu przybliżenia dipolowego zaznaczono linia przerywaną. Linią czerwoną zaznaczone są wyniki obliczeń zmiany stosunku stałej szybkości wzbudzenia w obecności nanocząstki do stałej szybkości wzbudzenia w wolnej przestrzeni w funkcji odległości fluoroforu od złotej nanocząstki. Zarówno z obliczeń MMP (linia ciągła) jak i obliczeń w przybliżeniu dipolowym (linia przerywana) wynika, że im nanocząstki znajdują się bliżej fluoroforu, tym stosunek stałych szybkości wzbudzenia jest większy i maleje wraz ze wzrostem odległości. Natomiast wydajność kwantowa fluoroforu (niebieska linia) maleje wraz ze zmniejszaniem odległości pomiędzy fluoroforem a nanocząstką. Sumaryczny wpływobu tych zjawisk jest przedstawiony na Rys. 11(b). Pokazano na nim wyniki obliczeń wzmocnienia fluorescencji z molekuły barwnika w obecności złotych nanocząstek, o różnych rozmiarach (od d = 20 nm do d = 100 nm). Widoczne jest, że dla odległości poniżej z = 5 nm pomiędzy emiterem a nanocząstką, w każdym przypadku dominuje wygaszenie fluorescencji związane ze zmniejszeniem wydajności kwantowej fluoroforu. Dla odległości pomiędzy składnikami. się na maksymalne wzmocnienie fluorescencji z molekuły, Dla odległości, powyżej, wzmocnienie pola elektromagnetycznego wokół anteny optycznej maleje. W związku z tym następuje zmniejszenie wzmocnienia fluorescencji fluoroforu. Największe wzmocnienie fluorescencji następuje dla anteny o rozmiarze d = 100 nm. Warto zauważyć, że dla nanocząstki o rozmiarze d = 20 nm przybliżenie dipolowe daje podobny wynik jak przybliżenie wielopolowe

49 Obliczenia teoretyczne zostały sprawdzone doświadczalnie oraz przedstawione w pracy [49]. Eksperymenty przeprowadzono na pojedynczych molekułach barwnika o nazwie błękit nilowy. Złotą nanocząstkę o średnicy d = 80 nm przytwierdzono do końca zaostrzonego światłowodu. Pozwoliło to na kontrolę odległości między nanocząstką plazmoniczną a molekułą barwnika. Eksperymenty przeprowadzono na molekułach, których moment dipolowy był prostopadły do powierzchni próbki. Na Rys. 12(a) przedstawiono intensywność fluorescencji molekuły w funkcji odległości pomiędzy molekułą a anteną. Dane eksperymentalne przedstawiono, jako czarne punkty, natomiast czerwoną ciągłą linią wynik obliczeń MMP. Wzmocnienie fluorescencji jest największe dla odległości, jest ono około siedmiokrotne w stosunku do przypadku swobodnego fluoroforu. Dla odległości mniejszych widoczne jest wygaszanie fluorescencji. W miarę oddalania się fluoroforu i nanocząstki złota, intensywność emisji spada. Dla odległości intensywność fluorescencji powinna zbliżać się do wartości intensywności emisji Rys. 12. (a) Intensywność fluorescencji z pojedynczej molekuły w funkcji odległości od srebrnej nanocząstki (linia ciągła model wielopolowy, punkty dane eksperymentalne). Natężenie emisji promieniowania pojedynczej molekuły dla odległości : (b) wynik eksperymentu, (c) wartość teoretyczna. Zaczerpnięto z [49]

50 odpowiadającej fluoroforowi w wolnej przestrzeni. Na Rys. 12(b) przedstawiona jest mapa intensywności fluorescencji wokół pojedynczej molekuły, której moment dipolowy jest zorientowany prostopadle do powierzchni próbki. Mapa została zmierzona dla odległości. Mapa intensywności fluorescencji molekuły ma kształt dysku, wewnątrz którego intensywność emisji jest mniejsza niż brzegu. Efekt ten jest związany z wygaszaniem fluorescencji związanym z nieradiacyjnym przekazem energii do nanocząstki. Przeprowadzano również badania wpływu wielkości nanocząstek na wzmocnienie fluorescencji pojedynczej molekuły barwnika cyjanowego Cy5 [52]. W eksperymencie zastosowano srebrne nanocząstki o rozmiarach od d = 5 do 100 nm. Odległość pomiędzy fluoroforem a nanoanteną utrzymano na stałym poziomie, około z = 8 nm, za pomocą fragmentu podwójnej helisy DNA. Na Rys. 13(a) przedstawiono przebiegi czasowe fluorescencji fluoroforu. Swobodny fluorofor już po około t = 2 s, w wyniku blaknięcia, przestaje emitować fotony. Po przyłączeniu fluoroforu do metalicznej nanocząstki o rozmiarze d = 5 nm, fotostabilność fluoroforu poprawia się i blaknięcie następuje dopiero po około t = 17 s. Dla większych nanocząstek fotostabilność dalej rośnie i dla nanocząstek o rozmiarach d = 50 nm i d = 70 nm molekuła emituje przez t = 50 s. Oznacza to 25-cio Rys. 13. (a) Przebiegi czasowe intensywności fluorescencji fluoroforu w obecności srebrnych nanocząstek (b) Wzmocnienie fluorescencji fluoroforu oraz zmiana natężenia pola elektrycznego w odległości z = 8 nm od powierzchni metalu w funkcji średnicy nanocząstki. Zaczerpnięto z [52]

51 krotnie dłuższy czas upływający do momentu wyblaknięcia barwnika. Kiedy średnica nanocząstki rośnie do d = 100 nm, fotostabilność fluoroforu spada do poziomu obserwowanego dla nanocząstki o rozmiarze d = 5 nm. Widoczne na przebiegach czasowych wartości intensywności emisji zebrano na Rys. 13(b) i przedstawiono w formie wzmocnienia fluorescencji pojedynczej molekuły barwnika w funkcji średnicy nanocząstki i oznaczono, jako okręgi. Dla cząstki o rozmiarze d = 5 nm, mimo że nastąpiła znaczna poprawa fotostabilności nie zaobserwowano wzmocnienia fluorescencji. Dla molekuły barwnika umieszczonej w pobliżu nanocząstek o rozmiarze d = 50 nm zaobserwowano około 17-to krotny wzrost intensywności fluorescencji z fluoroforu. Dla większych nanocząstek wzmocnienie fluorescencji zaczyna maleć. Na Rys. 13(b) przedstawiono również wykres wyliczonych intensywności pola elektrycznego w odległości z = 8 nm od powierzchni nanocząstki, które oznaczono, jako koła. Trend wzmocnienia fluorescencji molekuły barwnika jest inny niż trend wzmocnienia pola elektrycznego wokół nanocząstki. Dzieje się tak, ponieważ obliczenia nie uwzględniały wpływu nanoanteny na zanik promienisty i bezpromienisty ze wzbudzonego fluoroforu. Przeprowadzono również badania czasów życia fluorescencji fluoroforu. Dla wolnego fluoroforu Cy5 czas życia fluorescencji wynosi τ = 2.4 ns. W obecności metalicznych nanocząstek o rozmiarze d = 5 nm czas życia fluorescencji skraca się do τ = 1.3 ns. Ulega on dalszemu skróceniu wraz ze wzrostem rozmiaru nanocząstki, aż do τ = 0.38 ns dla nanoanteny o rozmiarze d = 70 nm. Natomiast dla fluoroforu w obecności nanocząstki o średnicy d = 100 nm znowu rośnie do wartości τ = 0.97 ns. Pomiary te wskazują na duży wpływ nanoanteny na zanik promienisty i bezpromienisty ze wzbudzonego fluoroforu. Rezonanse plazmonowe nanocząstek są dosyć szerokie. W związku, z tym, jeżeli fluorofor oddziałujący z nanocząstką charakteryzuje się małym przesunięciem Stokesa, rezonans plazmonowy może oddziaływać zarówno na stałe szybkości wzbudzenia jak i emisji. Dlatego w celu badań wpływu plazmonicznych nanocząstek na samo wzbudzenie fluorescencji, czy też na samą wydajność kwantową emisji fluoroforów, powinno się wybrać fluorofor, dla którego odległość spektralna pomiędzy wzbudzeniem a emisją jest jak największa. Należy również starannie dobrać nanoantenę, aby jej rezonans plazmonowy jak najlepiej sprzęgał się czy to z absorpcją, czy z emisją barwnika. Warto tu zastosować układy fotosyntetyczne, które charakteryzują się dużym przesunięciem Stokesa

52 Przykładowo dla układu perydynina-chlorofil-białko (PCP) odległość spektralna między wzbudzeniem, a emisją może sięgać 300 nm. Jeszcze bardziej obiecującym układem fotosyntetycznym jest układ LH2, dla którego odległość spektralna może sięgać aż 500 nm. Pierwsze eksperymentalne badania ukazujące oddziaływanie układów fotosyntetycznych PCP ze strukturami plazmonicznymi, zostały zaprezentowane w pracy [53]. W tych badaniach strukturą plazmoniczną były srebrne wyspy (SIF). Rezonans plazmonowy srebrnych wysp występuje dla długości fali λ = 450 nm, o szerokości spektralnej około 150 nm, co bardzo dobrze pokrywa się z absorpcją PCP. Badania przeprowadzano z wykorzystaniem wysokich koncentracji PCP, jak i pojedynczych molekuł układów fotosyntetycznych. Układy fotosyntetyczne umieszczono w matrycy polimerowej PVA i rozwirowano na powierzchni srebrnych wysp. Grubość warstwy, która powstała w wyniku rozwirowania wyniosła około 100 nm. Pojedyncze układy fotosyntetyczne, znajdujące się w tej warstwie, były losowo zorientowane względem powierzchni. W związku z tym odległość pigmentów, od powierzchni plazmonicznej wynosiła od z = 0 do 100 nm. Moment dipolowy PCP był ustawiony losowo względem powierzchni próbki. Na Rys. 14(a) przedstawiono widma emisji pojedynczego kompleksu PCP (linia zielona) oraz kompleksu PCP umieszczonego na powierzchni srebrnych wysp (linia czerwona). Widma fluorescencji wykonane na pojedynczych Rys. 14. (a) Widmo emisji pojedynczego kompleksu PCP (zielona linia) oraz kompleksu PCP na powierzchni SIF (czerwona linia). (b) Rozkład intensywności fluorescencji z pojedynczych kompleksów PCP (zielone) oraz z PCP na powierzchni SIF (czerwone). Zaczerpnięto z [54]

53 molekułach PCP, jak i na pojedynczych molekułach PCP w okolicach SIF, mają ten sam kształt, a różnią się jedynie intensywnością fluorescencji. Rozkład intensywności fluorescencji kilkuset pojedynczych molekuł PCP przedstawiony jest na Rys. 14(b). Widoczny jest dużo większy rozrzut intensywności fluorescencji dla molekuł na SIF (czerwony), niż dla próbki referencyjnej (zielony). Znaczna grubość warstwy matrycy polimerowej oraz nierówna powierzchnia SIF nie pozwala na dokładne określenie odległości powierzchni struktury plazmonicznej do fluoroforu. Prowadzi to do powstania dużego rozrzutu statystycznego intensywności fluorescencji z pojedynczych molekuł PCP w obecności SIF (Rys. 14(b) czerwony kolor). Wyniki wskazują na średnio sześciokrotne wzmocnienie fluorescencji z pojedynczego kompleksu fotosyntetycznego. Przeprowadzono również badania czasów życia fluorescencji układów fotosyntetycznych, dla wysokich koncentracji PCP w obecności SIF. Podobnie jak poprzednio, na SIF rozwirowano molekuły układów fotosyntetycznych umieszczone w matrycy polimerowej. Dla samych układów PCP zanik fluorescencji ma charakter funkcji monoeksponencjalnej, a czas życia fluorescencji wynosi. W obecności struktury plazmonicznej, zanik promienisty zmienia charakter na wielowykładniczy. Czas życia krótkiej składowej zaniku promienistego wynosi, natomiast dla długiej składowej wynosi. Pomiary te wskazują na duże zmiany zarówno zaniku promienistego jak i bezpromienistego wzbudzonego układu fotosyntetycznego w obecności SIF. W pracy [54] jako strukturę plazmoniczną zaproponowano srebrne nanodruty. Otrzymane wyniki pokazały około pięciokrotny wzrost intensywności fluorescencji ze struktury hybrydowej, zawierającej układy fotosyntetyczne PCP oraz srebrne nanodruty. W rozdziale opisano teoretyczne podstawy powstawania rezonansów plazmonowych w nanostrukturach plazmonicznych. Przedstawiono modele teoretyczne powstawania rezonansów plazmonowych w nanocząstkach metalicznych o kształtach sferycznych, wydłużonych oraz trójkątnych. Przedstawiono wyniki badań powstawania rezonansów plazmonowych w nanocząstkach sferycznych. Przedstawiono, jak rezonans plazmonowy zależy od materiału, rozmiaru oraz kształtu nanocząstek metalicznych. Przedstawiono podstawy teoretyczne oddziaływań nanocząstek plazmonicznych z fluoroforami. Oddziaływania te mogą powodować wzmocnienie emisji fluorescencji, jeżeli rezonans plazmonowy oddziałuje ze stałą szybkości wzbudzenia, lub stałą szybkości zaniku

54 promienistego fluoroforu. Może również wystąpić gaszenie fluorescencji barwnika, jeżeli nastąpi nieradiacyjny przekaz energii z fluoroforu do nanocząstki metalicznej. Przedstawiono przegląd literaturowy związany z doświadczalnymi implementacjami rozważań teoretycznych oddziaływań pomiędzy nanocząstkami plazmonicznymi a barwnikami. Pokazano, że aby uzyskać największe wzmocnienie fluorescencji barwnika optymalna odległość pomiędzy sferycznymi nanocząstkami złota a fluoroforami wynosi z = 12 nm. Dla odległość pomiędzy barwnikiem a metaliczną nanocząstką większych od kilkunastu nanometrów wzmocnienie fluorescencji barwnika staje się coraz mniejsze ze względu na zbyt małe oddziaływanie pomiędzy składnikami. Jeżeli odległość jest mniejsza od z = 10 nm dużą rolę zaczyna odgrywać nieradiacyjny przekaz energii z fluoroforu do metalicznej nanocząstki i obserwowane jest zmniejszenie wzmocnienia fluorescencji barwnika. Zaprezentowano wyniki doświadczeń, w których strukturą plazmoniczną była warstwa srebrnych wysp natomiast fluoroforem układy fotosyntetyczne PCP. W tym przypadku otrzymano sześciokrotne wzmocnienie fluorescencji układów fotosyntetycznych

55 ROZDZIAŁ II UKŁADY FOTOSYNTETYCZNE LH2 W tym rozdziale przedstawiono podstawowe informacje na temat budowy układów fotosyntetycznych LH2 pochodzących z bakterii purpurowych. Zaprezentowano badania eksperymentalne, które doprowadziły do poznania struktury krystalograficznej tych układów białkowych, oraz zdefiniowania ich poziomów energetycznych. Przedstawiono badania pokazujące możliwe drogi transferu energii zachodzącej wewnątrz układów LH2. Bakterie purpurowe Bakterie purpurowe są organizmami, które potrafią przetrwać niemal w każdych warunkach. Swój metabolizm opierają na procesach heterotroficznych i autotroficznych. Procesy heterotroficzne zachodzą, gdy bakterie rosną w obecności tlenu i przy braku światła, np. siarkowe bakterie purpurowe. Procesy autotroficznie zachodzą, gdy bakterie znajdują się w warunkach beztlenowych z dostępem do światła słonecznego, np. bezsiarkowe bakterie purpurowe [55][56]. Bezsiarkowe bakterie purpurowe występują głównie przy dnach stawów, jezior i strumieni [57]. Światło słoneczne, które do nich dociera pozbawione jest głównie barwy niebieskiej i czerwonej. Spowodowane jest to występowaniem chlorofili zawartych w roślinach zielonych i organizmach, które przeprowadzają fotosyntezę w górnych partiach zbiorników wodnych w warunkach tlenowych [58]. W związku z tym, bakterie purpurowe, dzięki oparciu fotosyntezy na bakteriochlorofilach (Bchl) oraz karotenoidach (Car), wykorzystują do fotosyntezy światło: zielone oraz podczerwone. Bakteriochlorofile są odpowiedzialne za absorpcję światła z bliskiej podczerwieni, natomiast karotenoidy absorbują światło zielone. Bakterie purpurowe przeniesione do warunków tlenowych natychmiast przestają syntetyzować bakteriochlorofil. Przestawiają swój metabolizm z fotosyntezy na odżywianie heterotroficzne i zaczynają asymilować i utleniać te same związki organiczne, które brały udział w procesie fotosyntezy. Wskutek wstrzymania syntezy barwników bakterie stają się bezbarwne i w ciemności zachowują się jak typowe heterotrofy stając się bezwzględnymi aerobami. Po ponownym przeniesieniu do warunków beztlenowych i naświetleniu bakterie

56 te zaczynają syntetyzować bakteriochlorofile i powracają do fototroficznego trybu życia [55][56]. Bakterie purpurowe były przedmiotem szczegółowych badań strukturalnych i spektroskopowych, dlatego są najlepiej zrozumianymi organizmami fotosyntetyzującymi energię poprzez absorpcję światła oraz procesy podstawowego transferu elektronów [59][60]. Pigmenty Częścią składową układów fotosyntetycznych są pigmenty, których główną rolą jest absorpcja światła oraz przekaz energii do centrów reakcyjnych (RC). Bakteriochlorofile i karotenoidy są podstawowymi pigmentami absorbującymi światło w bakteriach purpurowych. Pigmenty są niekowalencyjnie przyłączone do obu wewnętrznych białek membranowych formujących kompleks antenowy. Karotenoidy Karotenoidy należą do organicznych związków chemicznych z grupy węglowodorów nienasyconych [61]. Zbudowane są z jednostek izoprenowych składających się z pięciu atomów węgla, tworzących dłuższe szkielety węglowe. Znajdują się one w każdym znanym organizmie fotosyntetycznym, jak również w wielu organizmach nieprzeprowadzających fotosyntezy [56]. (a) (b) Rys. 15. (a) Struktura energetyczna karotenoidów. (b) Struktura chemiczna karotenoidów różnych typów. Zaczerpnięto z [59]

57 Karotenoidy pełnią przynajmniej pięć różnych funkcji w procesie fotosyntezy [61][62]: pełnią pomocniczą rolę w procesie fotosyntezy. Absorbują światło w pewnych zakresach promieniowania (od fioletu do zieleni), aby następnie przekazywać energię stanu wzbudzonego cząsteczce bakteriochlorofilu [63][64][65][66], pełnią funkcję fotoprotekcji bakteriochlorofili poprzez gaszenie stanu trypletowego bakteriochlorofilu [63][65][67], ochraniają przed procesami fotooksydacji, na które narażone są głównie nienasycone kwasy tłuszczowe lipidów chloroplastowych poprzez wygaszanie stanu singletowego tlenu [63][65][67], dyssypują nadmiar energii [68][69], stabilizują strukturę układów fotosyntetycznych [65][67][68]. Karotenoidy charakteryzują się specyficznymi właściwościami energetycznymi jak i spektroskopowymi. Absorbują światło o długościach fali od λ = 400 do 500 nm, co daje im charakterystyczny pomarańczowy kolor. Przejście ze stanu podstawowego (S 0 ) następuje do drugiego wzbudzonego stanu singletowego (S 2 ), a nie do pierwszego stanu wzbudzonego (S 1 ). Przejście ze stanu S 0 do stanu S 1 jest wzbronione ze względu na symetrię molekuły[69][70][71][72]. Stan S 2 jest zazwyczaj rozszczepiony na kilka stanów wibracyjnych, co jest widoczne na widmach absorpcji, jako trzy rozdzielone pasma absorpcyjne. Czas życia stanu wzbudzonego S 2 jest bardzo krótki, rzędu kilkuset femtosekund [73], po czym ma miejsce konwersja wewnętrzna do stanu S 1. Następnie ze stanu S 1 elektron nieradiacyjnie przechodzi do stanu S 0 z czasem przejścia rzędu kilku pikosekund [74][75]. Bakteriochlorofile Bakteriochlorofile są podstawowymi pigmentami znajdującymi się w bakteriach fotosyntetycznych. Są pochodną chlorofili, będących głównymi pigmentami w roślinach, algach i sinicach [76][77]. Chemiczną strukturę bakteriochlorofili stanowi zmodyfikowany pierścień tetrapirolowy podobny do grupy hemowej hemoglobin i cytochromów zwany pierścieniem bakteriochlorinowym [78]. Bakteriochlorofile absorbują światło o większych

58 (a) (b) Rys. 16. Struktura chemiczna bakteriochlorofilu a. (a) Pierścień bakteriochlorinowy. (b) Reszta fitolowa znajdująca cię w miejscu R pierścienia bakteriochlorinowego. Szare strzałki wskazują momenty dipolowe Q x oraz Q y. Zaczerpnięto z [58]. długościach fali niż chlorofile (zazwyczaj powyżej λ = 700 nm), co pozwala bakteriom przeprowadzać fotosyntezę w świetle czerwonym i bliskiej podczerwieni [79][80]. W układach fotosynetycznych badanych w niniejszej rozprawie występują bakteriochlorofile a (BChla), których struktura przedstawiona jest na Rys. 16. Zaznaczone momenty dipolowe odpowiadają za absorpcję światła o długości fali odpowiednio λ = 590 nm dla momentu dipolowego Q x oraz λ = 790 nm dla momentu dipolowego Q y [58][81]. Struktura układu fotosyntetycznego LH2 Schemat struktury układu fotosyntetycznego LH2 z bakterii purpurowej Rps. Acidophila przedstawiony jest na Rys. 17 [60][82]. Pierwszy krystalograficzny obraz LH2 otrzymano w roku 1995 [85]. Zgodnie z otrzymanym obrazem krystalograficznym, kompleks jest złożony z dziewięciu cylindrycznie ułożonych par β-apoproteinowych zgodnie z symetrią C 9 [83][84][84][85][86]. Każda z apoprotein posiada pojedynczą transmembranę -helisy. Wewnętrzna część kompleksu złożona jest z dziewięciu - apoproteinowych helis, a zewnętrzna część z dziewięciu β-apoproteinowych helis. Z obu stron struktura jest ograniczona poprzez końce N- i C- obu apoprotein, które mogą ze sobą oddziaływać. Większość pigmentów umieszczonych jest w przestrzeniach pomiędzy - i β- apoproteinami. Apoproteiny tworzą pewnego rodzaju rusztowanie, na którym umieszczone

59 są pigmenty [87][58]. Pigmenty znajdujące się pomiędzy helisami można podzielić na 3 grupy. Pierwszą stanowi dziewięć molekuł Car, po jednej dla każdej pary β- apoproteinowych helis. Karotenoidy leżą równolegle do transmembranowych -helis i odpowiadają za absorpcję światła o długościach fali od λ = 450 nm do λ = 550 nm. Energia Rys. 17. Struktura układu fotosyntetycznego LH2 z Rps. Acidophila: 9 Car (brązowy), B850 mocno sprzężone 18 BChla (czerwony), B800 słabo sprzężone 9 BChla (ciemno niebieski). (a) Widok z góry układu od peryplazmatycznej powierzchni membrany. (b) Widok z boku kompleksu. Zaczerpnięto z [56]. (c) Odległości pomiędzy molekułami z pierścienia B800 i B850 w Rps. Acidophila. Zaczerpnięto z [59]

60 zabsorbowanego światła przekazywana jest następnie do bakteriochlorofili. Drugą grupą jest dziewięć molekuł BChla, po jednej dla każdej pary β-apoproteinowych helis, tzw. pierścień B800. Pierścień bakteriochlorinowy tych bakteriochlorofili jest równoległy do powierzchni membrany i prostopadły do transmembranowych -helis. Bakteriochlorofile z tej grupy odpowiadają za absorpcję światła podczerwonego o długości fali λ = 800 nm. Trzecią grupą jest osiemnaście silnie oddziałujących ze sobą molekuł BChla, po dwie dla każdej pary β-apoproteinowych helis, tzw. pierścień B850. Pierścień bakteriochlorinowy tej grupy bakteriochlorofili jest prostopadły do powierzchni membrany i równoległy do transmembranowych -helis. Bakteriochlorofile z tej grupy odpowiadają za absorpcję światła podczerwonego dla długości fali ok. 850 nm. Energia zaabsorbowana w pierścieniu B850 oraz przetransferowana z innych pigmentów do pierścienia B850 jest następnie przekazywana z kompleksu LH2 do układu fotosyntetycznego LH1, wewnątrz którego znajduje się centrum reakcji RC. Na Rys. 18 przedstawiono mapę topograficzną uzyskaną mikroskopem sił atomowych membrany chromatoforowej bakterii purpurowej z gatunku Rsp. (a) (b) (c) Rys. 18. Organizacja molekularna aparatów fotosyntetycznych w membranie chromatoforowej bakterii purpurowej z gatunku Rsp. Photometricum. (a) Surowe dane topograficzne z mikroskopu AFM (skala w pełnym kolorze to 3 nm wysokości). (b) Miejsca z kompleksami LH2 i LH1-RC odpowiadające względnej pozycji i orientacji otrzymanych z topografii. Strzałkami oznaczono miejsca występowania cytochromu bc1. (c) Modele kompleksów LH2, LH1-RC oraz cytochromów bc1 odpowiadające względnej pozycji oraz orientacji otrzymanych z map topograficznych. (belka = 5 nm). Zaczerpnięto z [88]

61 Photometricum, badania zostały opublikowane w pracy [88]. Na surowych danych z mikroskopu sił atomowych (Rys. 18(a)) widoczna jest organizacja molekularna aparatów fotosyntetycznych w membranie chromatoforowej. Widoczne są okręgi, które odpowiadają kompleksom LH2, widać również okręgi większe odpowiadające kompleksom LH1, wewnątrz których znajdują się centra reakcyjne. Występują również miejsca, w których znajdują się cytochromy bc1. Na Rys. 18(b) przedstawiono ten sam fragment mapy topograficznej membrany poddany obróbce cyfrowej. Miejsca z kompleksami LH2 i LH1- RC są dokładniej widoczne oraz odpowiadają względnej pozycji oraz orientacji otrzymanej z surowych map topografii. Strzałkami oznaczono miejsca występowania cytochromu bc1. Na Rys. 18(c) w miejsca występowania kompleksów fotosyntetycznych wprowadzono struktury krystalograficzne kompleksów LH2 z bakterii purpurowych Rps. Acidophila, centrów reakcyjnych z bakterii purpurowych Rb. Sphaeroides oraz cytochromów bc1 z drożdży odpowiadające względnej pozycji oraz orientacji otrzymanych z map topograficznych. Widoczne są transmembranowe helisy oraz pigmenty. Widoczne jest, że na każdy układ fotosyntetyczny LH1-RC przypada wiele kompleksów LH2. Dzięki takiemu rozkładowi kompleksów fotosyntetycznych zwiększa się obszar, w którym fotom może zostać zaabsorbowany, oraz możliwy jest transfer energii pomiędzy układami LH2 zanim energia trafi do kompleksu LH1-RC. Struktura energetyczna oraz transfer energii w układach LH2 W naukach przyrodniczych do wyjaśnienia przekazu energii pomiędzy donorem, a akceptorem A stosuje się przede wszystkim opis Fӧrsterowski, który dobrze opisuje mechanizm przekazu energii pomiędzy słabo oddziałującymi molekułami. W przypadku układów fotosyntetycznych z bakterii purpurowych występuje pierścień silnie oddziałujących bakteriochlorofili a, dlatego potrzebny jest bardziej ogólny opis transferu energii. Na Rys. 19 schematycznie przedstawiony jest transfer energii pomiędzy donorem a akceptorem. Na początku donor jest w stanie wzbudzonym, natomiast akceptor pozostaje w stanie podstawowym, co można zapisać, jako. Transfer energii z do A wystąpi tylko wtedy, gdy molekuły mogą ze sobą oddziaływać. W wyniku oddziaływania pomiędzy molekułami,, energia wzbudzenia może zostać przekazana do akceptora. Po przekazaniu

62 energii z donora do akceptora stan układu można zapisać, jako. Odpowiada to sytuacji, gdy donor jest w stanie podstawowym, a akceptor w stanie wzbudzonym. Jeżeli oddziaływanie pomiędzy molekułami jest względnie słabe, czyli kiedy każdą molekułę można rozpatrywać, jako niezależną, wtedy opis molekuł razem z oddziaływaniem można opisać przy pomocy rachunku zaburzeń. Szybkość transferu energii możemy wtedy wyznaczyć używając złotej reguły Fermiego [58], d ( ) ( ) (23) gdzie oznacza stan początkowy o energii o energii., natomiast oznacza stan końcowy Aby znaleźć wyrażenie na oddziaływanie pomiędzy molekułami trzeba uwzględnić oddziaływania elektrostatyczne oraz momenty dipolowe wyindukowane podczas wzbudzenia pomiędzy akceptorem a donorem. Do obliczeń przyjmuje się zazwyczaj tylko wiodące oddziaływanie elektrostatyczne, czyli oddziaływanie dipol dipol, pomiędzy molekułami donorowymi i akceptorowymi. Takie założenie jest usprawiedliwione, jeżeli rozmiar optycznie aktywnych części donora i akceptora, jest mały w stosunku do Rys. 19. Transfer energii pomiędzy donorem a akceptorem, pomiędzy którymi może dojść do oddziaływania o wielkości V

63 odległości pomiędzy nimi,, co jest przedstawione na Rys. 20. Informacji o rzeczywistych gęstościach stanów można otrzymać z widma emisji donora oraz widma absorpcji akceptora. Załóżmy, że gęstość stanów odzwierciedla obszar pod tymi dwoma widmami, tzw. całka nakrywania. Rozważania te, zarówno przybliżenie dipol-dipol jak i zastosowanie całki nakrywania, prowadzą do równania transferu energii zaproponowanego przez Fӧrstera. Ważną konsekwencją powyższych założeń jest to, że transfer energii między molekułami jest możliwy tylko pomiędzy optycznie dozwolonymi stanami dipolowymi. Powyższe rozważania można zastosować właściwie tylko do pierścienia B800 układu fotosyntetycznego LH2, w którym molekuły BChla są od siebie oddalone na odległość z = 21,3Å (Rys. 17(c)) i można je traktować, jako słaboodziałujące. Oddziaływanie to pomiędzy sąsiednimi BChla wyznaczono na poziomie V~24 cm -1 [89][90][91][92]. W pierścieniu B850 molekuły BChla są bardzo blisko siebie z = 9,5Å (Rys. 17(c)), co wiąże się z silnym oddziaływaniem pomiędzy nimi na poziomie V~300 cm -1 [89]. To silne oddziaływanie między molekułami prowadzi do powstania ekscytonu molekularnego, który rozciąga się na wszystkich molekułach pierścienia B850 [93][94][92]. W celu zrozumienia podstawowych właściwości elektronowych stanów wzbudzonych pierścienia B850 układów fotosyntetycznych LH2 należy rozważyć formalizm ekscytonów molekularnych Frenkla [95][96][97]. W pierwszym przybliżeniu każda z molekuł może być opisana, jako system dwupoziomowy, zawierający stan podstawowy i stan wzbudzony, które oddzielone są od siebie o energię wzbudzenia. Stan reprezentuje molekułę w stanie wzbudzonym, natomiast pozostałe molekuły są w stanie podstawowym. Stany do mają te same z z Rys. 20. Poglądowa ilustracja przedstawiająca dwie molekuły o rozmiarze d, znajdujące się w odległości z od siebie

64 energie wzbudzenia, które są zlokalizowane na pojedynczej molekule. Transfer energii pomiędzy BChla wymaga oddziaływania molekuł między sobą. Oddziaływanie pomiędzy stanami wzbudzonymi BChla,, może być zapisane przy pomocy Hamiltonianu (24) gdzie oznacza elementy macierzowe oddziaływań pomiędzy molekułami oraz w stanie wzbudzonym. Jeżeli hamiltonian przedstawimy w formie macierzy, to pierwszy człon będzie reprezentował diagonalne elementy macierzy, natomiast drugi będzie reprezentował elementy pozadiagonalne. Jako że istnieje oddziaływanie pomiędzy molekułami, to funkcje falowe pojedynczych pigmentów nie są funkcjami własnymi hamiltonianu. Stany wzbudzone są liniową kombinacją zlokalizowanych funkcji falowych, tworzą one tak zwane ekscytony Frenkla [95][96][97] w postaci: ( ) (25) W wyniku oddziaływania pomiędzy molekułami dochodzi do zniesienia degeneracji stanów zlokalizowanych na pojedynczych pigmentach. Dla tego idealnego systemu wszystkie molekuły są opisane równoważnymi funkcjami falowymi, które mają takie same amplitudy na każdym pigmencie. Oznacza to, że ekscyton jest całkowicie zdelokalizowany na wszystkich pigmentach. W przypadku układów fotosyntetycznych LH2 z Rps. Acidophila, które posiadają symetrię C 9, stany energetyczne mogą być skonstruowane z liniowej kombinacji symetrycznych oraz antysymetrycznych funkcji falowych dla dimerów -apoprotein

65 (26) gdzie jest liczbą kwantową ( ), natomiast oznacza czy dana funkcja jest symetryczna czy antysymetryczna [98]. Zgodnie z formalizmem zaproponowanym przez Frenkla ekscyton molekularny LH2 może zostać opisany kombinacją liniową funkcji symetrycznych oraz antysymetrycznych. Pomiary transferu energii w reżimie wysokich koncentracji układów fotosyntetycznych LH2 Transfer energii wewnątrz układów fotosyntetycznych oraz pomiędzy LH2, silnie zależy od tego, jakie pigmenty biorą w nim udział oraz od tego, czy pigmenty są silnie czy Rys. 21. Schematyczny diagram reprezentujący przekaz energii wewnątrz układów fotosyntetycznych LH2 oraz LH1-RC oraz pomiędzy nimi. Zaczerpnięto z [99]

66 słabo sprzężone miedzy sobą. Po zaabsorbowaniu fotonu musza one przekazać energię zanim zostanie ona radiacyjnie wyemitowana poprzez fluorescencję lub nieradiacyjnie poprzez dyssypację energii wzbudzenia w ciepło. W związku, z czym organizacja pigmentów w układach fotosyntetycznych oraz organizacja układów fotosyntetycznych w membranie jest bardzo ważna, co oznacza, że czas przekazu energii pomiędzy pigmentami musi być dużo szybszy od pozostałych procesów dyssypacji energii. Czas przebywania BChla w stanie wzbudzonym jest rzędu nanosekund. W związku, z czym transfer energii od momentu zaabsorbowania energii przez pigmenty do przekazania energii do RC powinno zachodzić w skali czasowej poniżej τ~100 ns. Schematyczny diagram membrany przedstawiony jest na Rys. 21 [99]. Po zaabsorbowaniu fotonu światła poprzez karotenoidy może wystąpić transfer energii do zarówno do pierścienia B800 jak i do pierścienia B850. Około 75% energii zaabsorbowanej w Car przekazywane jest bezpośrednio do pierścienia B850 ze stanu S 2 karotenoidów ze stałą czasową τ~200 fs [94]. Pozostałe 25% energii jest transferowane do molekuły BChla z pierścienia B800 ze stanu S 1 ze stałą czasową τ~3.8 ps oraz ze stanu S 2 ze stałą czasową τ~1.2 ps [94]. Molekuła BChla pierścienia B800 może zaabsorbować foton bądź przyjąć energię przekazaną z Car. Następnie energia zmagazynowana w BChla pierścienia B800 może zostać przetransferowana do kolejnej molekuły BChla z pierścienia B800 ze stałą czasową τ~0.5 ps [100][101][111] lub może zostać przekazana do pierścienia B850 ze stałą czasową τ~0.9 ps [101][102][103][104]. Na pierścieniu B850 dochodzi do delokalizacji ekscytonu molekularnego ze stałą czasową od 50 do 150 fs [110][99]. W membranie zanim energia zostanie przetransferowana do układu fotosyntetycznego ze stałą szybkości od τ = 2 do 4 ps może następować przekaz energii pomiędzy pierścieniami B850 różnych układów fotosyntetycznych [99]. Pierścień B850 może być traktowany, jako pewnego rodzaju rezerwuar energii. Zmagazynowana energia może być przekazana z każdej molekuły BChla pierścienia B850 do sąsiadującego układu fotosyntetycznego. W układach fotosyntetycznych LH2 występuje również transfer energii na poziomie wzbudzonych stanów trypletowych z BChla do Car. Ten typ transferu energii powoduje wygaszanie stanów trypletowych BChla [63][67]. Gdy układy LH2 pozbawione są Car, zbyt silne wzbudzenie BChla doprowadza do powstania stanu trypletowego, w którym molekuła może przebywać nawet do dziesiątek µs. Jest to odpowiednio długi czas, aby po

67 zderzeniu z tlenem powstał jego stan singletowy. Tlen singletowy jest silnym utleniaczem i jest zabójczy dla komórek, w których powstaje [105]. Transfer energii typu tryplet-tryplet w układach LH2 zachodzi poprzez wymianę elektronów. Molekuły biorące udział w transferze energii muszą być w kontakcie van der Waalsa[106]. Warunek ten jest spełniony w kompleksach antenowych, dzięki temu stany trypletowe Car powstają w ciągu kilku ns, chroniąc układy LH2 przed zniszczeniem. Pomiary spektroskopowe na poziomie pojedynczych układów fotosyntetycznych LH2 Pierwsze spektroskopowe badania fluoroforów na poziomie pojedynczych molekuł przeprowadzono w latach osiemdziesiątych XX wieku [107][108][109]. Dzięki tym pionierskim badaniom dzisiaj istnieje możliwość przeprowadzenia pomiarów spektroskopowych na poziomie pojedynczych molekuł [46][10][110]. Dzięki temu, że możemy obserwować pojedynczą molekułę, informacje na temat cząstek, jakie za pomocą tych technik otrzymujemy, są wolne od uśredniania na niejednorodnościach próbek [111][112][113]. Otworzyło to nowe możliwości w badaniach zarówno struktury energetycznej, jak i struktury fizycznej między innymi pojedynczego układu fotosyntetycznego [114][115][116][117][118][119]. Pierścień B800 układu fotosyntetycznego LH2 Spektroskopowe pomiary na poziomie pojedynczych układów fotosyntetycznych LH2 jednoznacznie potwierdziły wcześniejsze przypuszczenia, że pigmenty umieszczone w pierścieniu B800 słabo ze sobą oddziałują [116][120]. Na Rys. 22(b) [120] przedstawione jest widmo wzbudzenia fluorescencji układów fotosyntetycznych w wysokiej koncentracji. Szerokość piku na widmie jest związana z uśrednieniem absorpcji pojedynczych molekuł BChla w pierścieniu B800, związanej z pomiarem wielu układów fotosyntetycznych. Natomiast pomiary widm wzbudzenia fluorescencji pojedynczych układów fotosyntetycznych LH2 (Rys. 22(c) oraz Rys. 22 (d)) pokazują subtelną strukturę związaną z absorpcją światła przez pojedynczą molekułę BChla z pierścienia B800, która słabo oddziałuje z innymi molekułami pasma B800 [115][120]. Przeprowadzono serię pomiarów widm wzbudzenia fluorescencji w funkcji polaryzacji światła wzbudzającego,

68 wyniki przedstawiono na Rys. 22(e) [121]. W wyniku tych badań zaobserwowano, że powstałe piki zmieniają swoje położenie spektralne w zależności od polaryzacji światła wzbudzającego. Takie zachowanie można wytłumaczyć tylko, jeżeli wzbudzenie jest mocno zlokalizowane na pojedynczym BChla. Momenty przejścia związane z pasmami absorpcji Q x oraz Q y w pigmentach są ułożone, podobnie jak i same pigmenty, w strukturze pierścienia, dlatego istnieje możliwość wybierania odpowiedniego BChla przy pomocy polaryzacji światła wzbudzającego [115][122]. Na Rys. 23(a) [118] przedstawione jest 256 widm wzbudzenia fluorescencji pojedynczego kompleksu LH2 mierzonych w czasie jednej godziny. Można zauważyć, że istnieją silne fluktuacje intensywności absorpcji (skala szarości) pojedynczych BChla z pierścienia B800. Fluktuacje te dla trajektorii oznaczonej, jako a i a są ze sobą w antykorelacji, co bardziej szczegółowo zostało przedstawione na Rys. 23(c). Widoczne (a) (e) (b) (c) (d) Rys. 22. (a) Mikroskopowy obraz pojedynczych molekuł LH2 Rps. Acidophila. (b) Widmo wzbudzenia fluorescencji LH2 wysokiej koncentracji. (c) i (d) Widma wzbudzenia fluorescencji pojedynczych molekuł. Zaczerpnięto z [120]. (e) Zależność widma wzbudzenia fluorescencji pojedynczej molekuły LH2 od polaryzacji światła wzbudzającego. Zaczerpnięto z [121]

69 jest, że gdy pasmo oznaczone, jako a ma większą intensywność to pasmo oznaczone, jako a ma mniejszą intensywność. Przebiegi funkcji autokorelacji oraz korelacji wzajemnej przedstawiono na Rys. 23(d). Obie funkcje autokorelacji zarówno dla przebiegu a jak i a mają średnią wartość bliską zeru. Natomiast funkcja korelacji wzajemnej pokazuje wyraźny spadek przy wartości, co oznacza występowanie silnej korelacji obu linii absorpcyjnych, oddzielonych od siebie spektralnie o cm. Podobne zmiany zaobserwowano również dla pary b i b przedstawionej na Rys. 23(a). W trajektorii linii absorpcyjnej oznaczonej jako b Rys. 23(a) zauważono również dużo subtelniejsze zmiany (a) (c) (d) (b) Rys. 23. Zmiany spektralne w absorpcji pigmentów z pierścienia B800. (a) Sekwencja 256 widm wzbudzenia fluorescencji. Intensywność jest powiązana z odcieniem szarości (b) Uśrednione widmo wzbudzenia fluorescencji powstałe z sekwencji widm pokazanych na (a). (c) Intensywność fluorescencji w funkcji czasu dla pasm oznaczonych, jako a i a z (a). (d) Funkcja autokorelacji (szara linia), oraz cross-korelacja (czarna linia) dla pasm oznaczonych, jako a i a. Zaczerpnięto z [118]

70 energetyczne na poziomie cm, które powiązano ze zmianami konformacyjnymi białka [118][122]. Pierścień B850 układu fotosyntetycznego LH2 Pomiędzy molekułami w pierścieniu B850 występuje silne oddziaływanie prowadzące do powstania ekscytonu molekularnego. Stany energetyczne ekscytonu charakteryzują się liczbą kwantową, gdzie oznaczają symetrię odpowiednio symetryczną i antysymetryczną. Ze względu na symetrię kołową tylko stany opisane liczbami kwantowymi posiadają wystarczającą siłę oscylatora, aby można było je zmierzyć. Stany opisane liczbami kwantowymi ze względu na kołową symetrię układu są ortogonalne, co jest zaznaczone odpowiednimi strzałkami na Rys. 24(a) [98]. Przedstawione widma otrzymano przez wzbudzenie wiązkami światła o wzajemnie prostopadłych polaryzacjach. Jeżeli wzbudzenie fluorescencji dokonane było Rys. 24. (a) Widma wzbudzenia fluorescencji pasma B850 pojedynczego LH2 dla wzajemnie ortogonalnych polaryzacji. Przedstawione są schematycznie najniższe poziomy energetyczne ekscytonu z pasma B850 kompleksu LH2 z Rps. Acidophila dla pigmentów o symetrii kołowej. Szare koła reprezentują początkową populację danego stanu energetycznego. Strzałki wskazują na wzajemną orientację momentów przejścia w płaszczyźnie pierścienia. (b) Widma wzbudzenia fluorescencji pasma B850 trzech różnych molekuł. Widoczne jest wąskie pasmo po czerwonej stronie pasma związanego z liczbą kwantową k as =±1, które odpowiada za liczbę kwantową k as =0. Zaczerpnięto z [98]

71 światłem spolaryzowanym prostopadle widoczne jest pasmo wzbudzenia fluorescencji światłem o większych długościach fali, niż gdy ten sam kompleks wzbudzany jest światłem spolaryzowanym prostopadle. W związku, z czym można wnioskować, że dipolowe momenty przejścia pierścienia B850 są do siebie prostopadłe. Na tej podstawie oraz w wyniku tego, że pasma są dobrze widoczne, przypisano je stanom związanym z liczbami kwantowymi [117]. Jeżeli pigmenty pierścienia B850 byłyby ułożone na planie idealnego symetrycznego pierścienia, co sugeruje struktura krystalograficzna [83], elektronowe stany wzbudzone opisane liczbami kwantowymi byłyby stanami zdegenerowanymi o tej samej energii oraz o tej samej intensywności. Natomiast elektronowy stan opisany liczbą kwantową nie byłby w ogóle widoczny. Jednak w badaniach fluorescencji pojedynczych LH2 zaobserwowano zarówno rozszczepienie poziomów energetycznych, jak i różne intensywności fluorescencji z stanów wzbudzonych opisanych liczbami kwantowymi [117][123]. Analiza tych danych doprowadziła do wniosku, że pierścień B850 nie jest idealnie symetryczny, a najbardziej prawdopodobnym zniekształceniem jest zniekształcenie eliptyczne [98][124]. Przeprowadzone kolejne serie badań pokazały, że w czasie rzędu pojedynczych sekund dochodzi do strukturalnych deformacji pojedynczego układu fotosyntetycznego [115][125][126][127][128][122]. Linia absorpcji odpowiedzialna za stan w miarę odstępstw od idealnie symetrycznego kształtu powinna być coraz bardziej widoczna, a ze względu na krótki czas życia tego stanu powinna być wąska. W rzeczywistości takie linie zostały zauważone i są przedstawione na Rys. 24(b), co stanowi silny dowód na to, że uzasadniony jest opis najniższych stanów wzbudzonych pierścienia B850 modelem ekscytonowym [122]. W niniejszym rozdziale przedstawiono podstawowe informacje związane z układami fotosyntetycznymi LH2. Przedstawiono podstawowe informacje na temat bakterii purpurowych. Przedstawiono krótka charakterystykę pigmentów wchodzących w skład układów fotosyntetycznych LH2 tj.: karotenoidów oraz bakteriochlorofili a. Przedstawiono strukturę krystalograficzną kompleksów LH2, z której wynika, że wewnątrz dziewięciu cylindrycznie ułożonych par apoproteinowych znajdują się pigmenty. Pierścień złożony z karotenoidów odpowiedzialny jest za absorpcje światła niebieskiego oraz zielonego, a

72 następnie przekazanie zgromadzonej energii do bakteriochlorofili. Bakteriochlorofile ułożone są w pierścieniu B800, który składa się z dziewięciu słaboodziałujących BChla, oraz w pierścieniu B850 składającym się z osiemnastu silnie sprzężonych BChla. Bakterio chlorofile z pierścienia B800 absorbują światło o długości światła λ = 800 nm, a następnie zgromadzona energię przekazują do pierścienia B850. W pierścieniu B850 może zostać zaabsorbowane światło o długości fali λ = 850 nm a następnie energia zgromadzona w pierścieniu B850 tworzy ekscyton molekularny, który może być następnie przekazywany pomiędzy kompleksami fotosyntetycznymi LH2, aby ostatecznie trafić do kompleksu LH1- RC

73 ROZDZIAŁ IV MATERIAŁY I METODY POMIAROWE W tym rozdziale przedstawiono proces otrzymywania nanocząstek metalicznych. Przedstawiono syntezę sferycznych nanocząstek złota, złotych nanoprętów oraz srebrnych nanotrójkątów. Przedstawiono proces otrzymywania układów fotosyntetycznych LH2 z dwóch gatunków bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides. Opisano również procedurę wytwarzania zaproponowanych nanostruktur hybrydowych złożonych z nanocząstek metalicznych oraz kompleksów LH2. Przedstawiono metody mapowania intensywności fluorescencji przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego oraz mikroskopu szerokiego pola. Przedstawiono techniki pomiarowe użyte w badaniach spektralnych nanostruktur hybrydowych tj., spektroskopia absorpcyjna oraz spektroskopia fluorescencyjna zarówno stacjonarna jak i rozdzielona w czasie. Synteza sferycznych nanocząstek złota Sferyczne nanocząstki złota zostały udostępnione przez profesora Wolfganga Heissa z Uniwersytetu w Linzu w Austrii. Zostały one zsyntezowane metodą zaproponowaną przez Turkevicha [129][130]. Synteza przeprowadzona była w warunkach ciśnienia normalnego. Do 100 ml gotującej się wody dodano 1 ml kwasu tetrachlorowozłotego (a) (b) ) Rys. 25. (a) Widmo ekstynkcji otrzymanych nanocząstek złota. (b) Obraz SEM otrzymanych sferycznych nanocząstek złota

74 (HAuCl 4 ) o stężeniu molowym C m = 50 mmol/dm 3. Następnie do otrzymanego roztworu dodano 5 ml cytrynianu sodu (NaBH 4 ) o stężeniu molowym C m = 10 mmol/dm 3. Po około pięciu minutach mieszania, roztwór zaczął zmieniać barwę od zielononiebieskiej do ciemnopurpurowej. Zmiana koloru była wynikiem wzrostu nanocząstek, który prowadzi do przesunięcia się rezonansu plazmonowego w kierunku czerwonej części pasma widma widzialnego. Tak uzyskany gorący roztwór schładzano do temperatury pokojowej i wykorzystywano do tworzenia nanostruktur hybrydowych. Obraz otrzymanych nanocząstek wykonany skaningowym mikroskopem elektronowym przedstawiono na Rys. 25. Średnica tak przygotowanych nanocząstek wynosiła średnio d = 5 nm, co przełożyło się na wystąpienie rezonansu plazmonowego o długości fali λ = 530 nm. Synteza złotych nanoprętów Złote nanopręty zsyntezowała Maria Olejnik z Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu metodą opartą na zastosowaniu złotych zarodków zaproponowaną przez Jana[131]. Zarodki złotych nanoprętów otrzymano z roztworu zawierającego 4.7 ml heksadecylotrimetyloamoniowy bromek (CTAB, Sigma-Aldrich) o stężeniu molowym C m = 100 mmol/dm 3 wymieszanego z 25 µl kwasu tetrachlorowozłotego (HAuCl 4, Sigma- Aldrich) o stężeniu molowym C m = 50 mmol/dm 3. Następnie do roztworu, który ciągle mieszano, dodano 0.3 ml schłodzonego cytrynianu sodu (NaBH 4, Sigma-Aldrich) o stężeniu molowym C m = 10 mmol/dm 3. W ten sposób uzyskano roztwór o żółtobrązowym (a) (b) ) Rys. 26. (a) Widmo ekstynkcji otrzymanych nanoprętów złota. (b) Obraz SEM otrzymanych nanoprętów złota

75 zabarwieniu, w którym znajdowały się zarodki złota o średnim rozmiarze d = 3.5 nm. Następnym krokiem do uzyskania złotych nanoprętów było przygotowanie roztworu, w którym do 150 ml CTAB o stężeniu molowym C m = 100 mmol/dm 3 dodano 1.5 ml kwasu tetrachlorowozłotego o stężeniu molowym C m = 50 mmol/dm 3. W następnym kroku dodano 1.2 ml kwasu askorbinowego (C 6 H 8 O 6, Sigma-Aldrich) o stężeniu molowym C m = 10 mmol/dm 3. Po dodaniu kwasu askorbinowego, który jest łagodnym reduktorem, roztwór zmienił barwę z ciemnoniebieskiej na bezbarwną. Potem dodano 1.6 ml azotanu srebra (AgNO 3, Sigma-Aldrich) o stężeniu molowym C m = 100 mmol/dm 3. Do otrzymanego roztworu, ciągle mieszając, dodano 360 µl otrzymanych wcześniej złotych zarodków. Po dodaniu zarodków miksturę umieszczono na dwie godziny w łaźni wodnej w celu utrzymania stałej temperatury wynoszącej 28 C. Otrzymane w ten sposób nanopręty zostały oddzielone od nieprzereagowanych składników oraz sferycznych nanocząstek poprzez godzinne odwirowanie z prędkością 9000 obrotów na minutę. Przesącz zebrano, natomiast odwirowane nanopręty rozpuszczono w ultraczystej wodzie (Fluka). Obraz otrzymanych nanoprętów wykonany skaningowym mikroskopem elektronowym przedstawiono na Rys. 26. Nanopręty mają średnią długość 45 nm oraz średnią średnicę 15 nm, co powoduje powstanie dwóch rezonansów plazmonowych. Rezonans plazmonowy związany z szerokością występuje dla długości fali λ = 530 nm, natomiast związany z długością na długości fali λ = 800 nm. Synteza srebrnych nanotrójkątów Srebrne nanotrójkąty zostały udostępnione przez profesora Johna. M. Kelly z Trinity College w Dublinie w Irlandii. Syntezowano je metodą opartą na srebrnych zarodkach zaproponowaną przez Aherne [132]. Zarodki srebrnych nanotrójkątów otrzymuje się z roztworu zawierającego 5 ml wodnego roztworu cytrynianu sodu (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) o stężeniu molowym C m = 2.5 mmol/dm 3, 0.25 ml poli (sodu-p-styrenosulfonian) (PSSS) o stężeniu 500 mg/l oraz 0.3 ml cytrynianu sodu (NaBH 4 ) o stężeniu molowym C m = 10 mmol/dm 3. Następnie, do ciągle mieszanego roztworu, dodano azotan srebra (AgNO 3 ) o stężeniu molowym C m = 0.5 mmol/dm 3 w ilości 2 ml/min. Po zakończeniu reakcji srebrne zarodki przechowywano przez kolejną dobę

76 Następnym krokiem do uzyskania srebrnych nanotrójkątów było połączenie roztworu z otrzymanymi uprzednio zarodkami w 5 ml ultraczystej wody z 75 µl kwasu askorbinowego o stężeniu molowym C m = 10 mmol/dm 3. Następnie do roztworu dodawano 3 ml azotanu srebra o stężeniu molowym C m = 0.5 mmol/dm 3 w tempie 1 ml/min. Podczas dodawania AgNO 3 kolor roztworu się zmienia, co odpowiada przesunięciu rezonansu plazmonowego ku czerwieni związanemu ze zmianą wielkości nanotrójkątów. Po zakończeniu syntezy dodano 0.5 ml cytrynianu sodu o stężeniu molowym C m = 25 mmol/dm 3 w celu ustabilizowania rozmiaru nanocząstek. Przykładowy obraz nanotrójkątów z transmisyjnego mikroskopu elektronowego przedstawiono na Rys. 27(b). Do dalszych badań wykorzystano nanotrójkąty posiadające rezonans plazmonowy dla długości fali λ = 720 nm, λ = 800 nm oraz λ = 880 nm, których widma ekstynkcji przedstawiono na Rys. 27(a). Otrzymywanie układów fotosyntetycznych LH2 Układy fotosyntetyczne LH2 zostały udostępnione przez profesora Richarda Cogdella z Uniwersytetu w Glasgow w Wielkiej Brytanii. Układy użyte w badaniach pochodziły z bakterii purpurowych Rps. Palustris szczep 2.1.6, oraz Rb. Sphaeroides. Bakterie hodowano w warunkach beztlenowych, w obecności światła w roztworze C- bursztynianu[133]. Bakterie były umieszczone w temperaturze 30 C oraz oświetlane lampami fluorescencyjnymi (Osram). Kultury bakterii po osiągnieciu gęstości optycznej (a) (b) Rys. 27. (a) Widmo ekstynkcji otrzymanych nanotrójkątów złota. (b) Obraz TEM srebrnych nanotrójkątów o rezonansie plazmonowym 825 nm. Zaczerpnięto z [132]

77 OD 850 = 0.5 cm -1 rosły przez kolejne 120 godzin. Po tym czasie roztwór z bakteriami odwirowywano przez pół godziny z prędkością 5000 obrotów na minutę, a następnie osad rozpuszczono w buforze kwasu 2-(N-morfolino) etanosiarczanowego (MES, Sigma- Aldrich). Tak przygotowane bakterie następnie zamrożono w temperaturze T = -20 C i przechowywano do dalszego wykorzystania. W celu uzyskania układów fotosyntetycznych należy rozerwać błony komórkowe bakterii. Do roztworu bakterii dodano DNAase oraz MgCl 2, a następnie trzykrotnie rozbijano je prasą francuską pod ciśnieniem 650 atmosfer. Pozostałe błony komórkowe zebrano poprzez dwugodzinne odwirowanie otrzymanego roztworu z prędkością obrotów na minutę w temperaturze 4 C. Osad został rozpuszczony w buforze (a) (b) (c) Rys. 28. (a) Probówka z odwirowanym roztworem układów fotosyntetycznych, górna warstwa zawiera LH2, dolna LH1-RC. (b) Widma ekstynkcji układów fotosyntetycznych odpowiednio LH2, oraz (c) kompleksów LH1-RC

78 trój(hydroksymetylo) aminometanu (TRIS, Fisher Scientific) o stężeniu molowym C m = 20 mmol/dm 3 o ph 8.0. Roztwór został zhomogenizowany, a koncentracja została tak dobrana, aby gęstość optyczna na długości fali λ = 850 nm wynosiła OD 850 = 50. Następnie dodano 1% roztwór N-tlenku N,N-dimetylododecylo aminowego (LDAO, Fluka), który powoduje rozpuszczanie oryginalnych błon komórkowych i zastąpienie ich przez LDAO. Roztwór ten mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej bez dostępu do światła. Następnie, żeby pozbyć się wszystkich nierozpuszczonych błon komórkowych roztwór był odwirowany przez 10 minut przy prędkości obrotów na minutę. Odwirowany roztwór przeniesiono na gradient sacharozy przygotowany w buforze TRIS o stężeniu molowym C m =20 mmol/dm 3 zawierającym 0.1% LDAO. Następnie roztwór był wirowany przez 16 godzin w temperaturze 4 C z prędkością obrotów na minutę. Po wirowaniu w probówce otrzymuje się dwie purpurowe warstwy. Górna zawiera białka LH2, natomiast w dolnej warstwie znajdują się cięższe układy fotosyntetyczne LH1-RC (Rys. 28). Warstwa zawierająca LH2 następnie została zebrana i oczyszczona w kolumnie celulozowej (DE-52, Whatman). Dalszy etap oczyszczania przebiegał w kolumnie chromatograficznej (Resource-Q). Aby uzyskać układy fotosyntetyczne wysokiej czystości, wybierano tylko te frakcje LH2, w których stosunek absorpcji pasma B800 do absorpcji białka wynosił ponad 3. Taki stosunek pasm absorpcji zapewniał, że próbka zawiera niewielką ilość nierekonstytuowanej poliproteiny. Przygotowanie nanostruktur hybrydowych Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze sferycznymi nanocząstkami złota W skład zaproponowanych nanostruktur hybrydowych wchodzą sferyczne nanocząstki złota oraz układy fotosyntetyczne LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris. Rys. 29. Schemat nanostruktury hybrydowej złożonej z układów fotosyntetycznych LH2 oraz sferycznych nanocząstek złota odseparowanych warstwą krzemionki

79 Schemat zaproponowanej nanostruktury przedstawiono na Rys. 29. W celu uzyskania jednorodnej warstwy nanocząstek plazmonicznych, których gęstość optyczna wynosiła OD 540 = 25, zostały one rozwirowane na szklanym substracie z prędkością 3000 obrotów na minutę. Następnie na tak rozwirowane nanocząstki naniesiono krzemionkę, przy wykorzystaniu techniki naparowania próżniowego z wykorzystaniem wiązki elektronowej (Haraeus, Leybold). Warstwy naniesionej krzemionki miały grubości: z = 4 nm, z = 8 nm, z = 12 nm, z = 16 nm oraz z = 40 nm. Tak przygotowane podłoża miały zapewnić minimalną odległość pomiędzy fluoroforami a nanocząstkami plazmonicznymi. Układy fotosyntetyczne o gęstości optycznej OD 850 = 120 zostały umieszczone w matrycy polimerowej z 2% roztworu poli(alkoholu winylowego) (PVA, Sigma-Aldrich). Następnie, na wcześniej przygotowane podłoża, zawierające nanocząstki złota i krzemowe przekładki, nakropiono 50 µl roztworu LH2 w matrycy polimerowej i rozwirowano na powlekarce przez 30 sekund przy prędkości 6600 obrotów na minutę. Badania na tak uzyskanych nanostrukturach hybrydowych zostały przeprowadzone niezwłocznie po ich przygotowaniu. Nanostruktura zawiera nanocząstki metaliczne posiadające rezonans plazmonowy dla długości fali λ = 530 nm, co odpowiada pasmu absorpcji karotenoidów układów fotosyntetycznych LH2. Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze złotymi nanoprętami W skład kolejnych nanostruktur hybrydowych wchodzą nanopręty złota oraz układy fotosyntetyczne LH2, z bakterii purpurowych Rps. Palustris. Podobnie jak w poprzedni zaproponowanej nanostrukturze przygotowano podłoża ze złotych nanoprętów oraz warstwy krzemionki o grubościach: z = 5 nm, z = 10 nm, z = 15 nm, z = 20 nm oraz z = 30 nm. Na tak przygotowane podłoża następnie naniesiono warstwę układów fotosyntetycznych w sposób przedstawiony dla poprzednio zaproponowanych nanostruktur (Rys. 29). Nanostruktura zawiera nanopręty złota, które posiadają dwa rezonanse plazmonowe. Pierwszy związany z szerokością nanoprętów, który występuje dla długości fali λ = 530 nm, co odpowiada pasmu absorpcji karotenoidów układów fotosyntetycznych. Natomiast drugi rezonans plazmonowy związany z długością nanoprętów występuje na długości fali λ = 800 nm, co odpowiada pasmu absorpcji BChla z pasma B800. Ze względu na dużą szerokość spektralną rezonansu plazmonowego związanego z długością

80 nanoprętów, może on wpływać również na pasmo absorpcji oraz emisji z bakteriochlorofili a z pierścienia B850. Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze srebrnymi nanotrójkątami W skład nanostruktur hybrydowych wchodzą srebrne nanotrójkąty oraz układy fotosyntetyczne LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris. W tym wypadku nie kontrolowano odległości pomiędzy układami fotosyntetycznymi a nanocząstkami plazmonicznymi. Do przygotowania nanostruktury hybrydowej użyto układów fotosyntetycznych o gęstości optycznej OD 850 = W tej nanostrukturze wykorzystano układy fotosyntetyczne o niskiej gęstości optycznej LH2, aby zapewnić warunki, w których niewielka ilość układów fotosyntetycznych oddziałuje z pojedynczym nanotrójkątem. Gęstość optyczna nanotrójkątów na długości fali odpowiadającej rezonansowi plazmonowemu była utrzymana na stałym poziomie OD = 1. Mieszankę układów fotosyntetycznych i nanotrójkątów w stosunku 1:1 umieszczano w matrycy polimerowej PVA. Tak przygotowany roztwór nakrapiano na szkiełko nakrywkowe i rozwirowano przy użyciu powlekacza obrotowego z prędkością 6600 obrotów na minutę przez czas 30 sekund. Nanostruktura hybrydowa była niezwłocznie wykorzystana do badań. Zastosowane nanotrójkąty srebrne posiadały rezonanse plazmonowe dla długości fali λ = 720 nm, λ = 800 nm oraz λ = 880 nm, co odpowiada odpowiednio: jak najmniejszemu pokrywaniu się rezonansu plazmonowego nanotrójkątów z układem fotosyntetycznym LH2, pokrywaniu się rezonansu plazmonowego z pasmem B800 oraz częściowemu z pasmem B850, oraz pokrywaniu się rezonansu plazmonowego z pasmem B850 układów fotosyntetycznych. Fluorescencyjny mikroskop konfokalny Do pomiarów fluorescencji nanostruktur hybrydowych zbudowano mikroskop konfokalny, którego zasadę działania przedstawiono na Rys. 30(a). W mikroskopie tym punktowe źródło światła, oświetlony fragment próbki oraz jego obraz leżą dokładnie w ogniskowych soczewek, czyli tak zwanych płaszczyznach konfokalnych. Dodatkowo zastosowanie przesłony w płaszczyźnie konfokalnej obrazu powoduje, że eliminowana jest fluorescencja z obszarów leżących poza ogniskiem obiektywu, oraz światło odbite od

81 elementów optycznych układu. Dzięki temu kontrast i rozdzielczość w mikroskopie konfokalnym są lepsze niż w zwykłym mikroskopie fluorescencyjnym [134][135][46]. Nanostruktury hybrydowe badane mikroskopem konfokalnym wzbudzane były diodowymi laserami półprzewodnikowymi o długościach fali: λ = 405 nm (BDL-405-SMC, Becker & Hickl), λ = 485 nm (BDL-485-SMC, Becker & Hickl), λ = 556 nm (MGL , Spectra Laser), λ = 808 nm (MGL , Spectra Laser). Wiązka światła laserowego była filtrowana filtrem przestrzennym w celu uzyskania Gaussowskiego profilu wiązki. Następnie wiązka ta była odbijana od zwierciadła półprzepuszczalnego i trafiała na obiektyw (LMPlan 50x, Olympus). Obiektyw charakteryzuje się aperturą numeryczną NA = 0.5 oraz odległością roboczą WD = 10.1 mm. Średnica wiązki lasera o długości fali λ = 485 nm w ognisku obiektywu wynosiła około d = 1 µm. Obiektyw można było dowolnie wymieniać z soczewką o ogniskowej 30 mm, która skupiała wiązkę wzbudzającą na próbce. Próbka znajdowała się na stoliku piezoelektrycznym (P-517.3CL Physik Instrumente), pozwalającym na precyzyjny ruch: 100 µm w płaszczyźnie XY z krokiem 1 nm, oraz 20 µm w płaszczyźnie Z, z krokiem 0.1 nm. Światło laserowe skupione na próbce wzbudzało jej fluorescencję, która następnie była zbierana tym samym obiektywem. Światło emitowane z próbki po przejściu przez zwierciadło półprzepuszczalne padało na układ konfokalny, w którym zastosowano przesłonę o średnicy 150 µm, znajdującą się w płaszczyźnie konfokalnej. Po wyjściu z układu konfokalnego równoległa wiązka światła (a) (b) Rys. 30. (a) Schemat fluorescencyjnego mikroskopu konfokalnego. (b) Zdjęcie układu pomiarowego wykorzystanego w badaniach

82 emitowanego z próbki była kierowana do odpowiedniego detektora poprzez system luster. Na Rys. 30(b) przedstawiono zdjęcie układu pomiarowego wykorzystanego do niniejszych badań. Mapowanie fluorescencji Mapowanie fluorescencji polega na pomiarze, punkt po punkcie, intensywności światła emitowanego z nanostruktury hybrydowej. Pojedyncze pomiary mikroskopu konfokalnego zbierane są do macierzy reprezentującej fluorescencję z danej płaszczyzny konfokalnej na próbce [136][137]. Mapy fluorescencji można wykonać dzięki sprzężeniu przesuwu stolika piezoelektrycznego z odczytem liczby zliczeń z fotodiody lawinowej (SPCM-AQRH-14, PerkinElmer). Przestrzenna rozdzielczość układu mapowania fluorescencji wyniosła 1200 nm. Światło docierające do fotodiody zostało odfiltrowane spektralnie poprze użycie filtra górnoprzepustowego (HQ850LP, Chroma) oraz filtra pasmowego (D880/40nm, Chroma). Fluorescencyjny mikroskop szerokiego pola Do badań nanostruktur hybrydowych użyto również mikroskopu szerokiego pola (Eclipse Ti, Nikon), wyposażonego w kamerę EMCCD (ixon Du-888, Andor) o rozdzielczości 1 Mpix. Zastosowana kamera odznacza się bardzo dużą wydajnością kwantową oraz niskimi prądami ciemnymi e-/pix/s przy temperaturze detektora T = -75 C. Dzięki zastosowaniu technologii EMCCD możliwe jest wzmocnienie słabych sygnałów, nawet pojedynczych fotonów, do poziomu w znacznym stopniu wolnego od szumu odczytu. Próbki wzbudzane są oświetlaczami diodowymi (Prizmatix) o długościach fali λ = 405 nm, λ = 480 nm, λ = 540 nm oraz Rys. 31. Schemat mikroskopu szerokiego λ = 640 nm. Aby zawęzić szerokość spektralną pola. użytych oświetlaczy diodowych zastosowano odpowiednie filtry pasmowe (FB405-10, FB480-10, FB540-10, FB640-10, Thorlabs)

83 Zasadę działania mikroskopu szerokiego pola przedstawiono schematycznie na Rys. 31. Światło wzbudzające odbite od lustra dichroicznego (820DCXXR, Chroma) skupiane jest na tylnej płaszczyźnie ogniskowej obiektywu immersyjnego (Plan Apo, 100x Nikon) o wysokiej aperturze numerycznej NA = 1.4 i odległości roboczej WD = 0.13 mm. Wysoka apertura numeryczna obiektywu daje teoretyczną rozdzielczość R = 310 nm dla fluorescencji LH2 przy długości fali λ = 870 nm. Światło wychodzące z obiektywu tworzy równoległą wiązkę gaussowską o średnicy 150 µm. Dzięki temu, iż próbka jest oświetlana w całej średnicy wiązki gaussowskiej, możliwa jest obserwacja fluorescencji z całego wzbudzonego obszaru próbki. Następnie zbierana przez ten sam obiektyw fluorescencja z próbki przechodzi przez lustro dichroiczne i po przejściu przez zestaw filtrów optycznych: górnoprzepustowy (HQ850LP, Chroma) oraz filtr pasmowy (D880/40M, Chroma), trafia do kamery EMCCD. W metodzie tej ze względu na to, że obrazowany jest jednocześnie cały obszar fluorescencji pomiar jest znacznie szybszy niż obrazowanie wykonane przy pomocy mikroskopu konfokalnego. Ze względu na zastosowany obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej rozdzielczość przestrzenna mikroskopu szerokopolowego jest bliska ograniczeniu dyfrakcyjnemu Rayleigha, dla fluorescencji z kompleksów LH2 wynosi R~400 nm. W przypadku mikroskopu szerokiego pola wyposażonego w kamerę EMCCD możliwe jest rejestrowanie kinetyk fluorescencji ze zbieraniem fluorescencji dla pojedynczej klatki w czasie około pół sekundy. Wadą mikroskopii szerokiego pola jest brak możliwości uzyskiwania informacji spektralnych zarówno stacjonarnych jak i czasoworozdzielczych. Absorpcyjna spektroskopia UV/VIS Badania charakteryzacyjne układów fotosyntetycznych oraz metalicznych nanocząstek wykonano przy pomocy spektrofotometru (Cary 50, Varian). Jest to jednowiązkowy spektrometr optyczny oparty na monochromatorze typu Czerny-Turner (Rys. 32). Źródło światła stanowiła impulsowa lampa ksenonowa, emitująca promieniowanie w zakresie od UV do IR. Zakres spektralny urządzenia to nm przy rozdzielczości spektralnej wynoszącej 1.5 nm. [138]

84 Badania UV/VIS roztworów układów fotosyntetycznych, oraz roztworów nanocząstek plazmonicznych przeprowadzono w kuwecie UVette firmy Eppendorf o drodze optycznej L = 10 mm. Roztwory układów fotosyntetycznych są wrażliwe na zmiany ph dlatego rozcieńczano je w buforze trój(hydroksymetylo)aminometan (TRIS, Fisher Scientific). W celu utrzymania sztucznej membrany wokół układu fotosyntetycznego dodano 0.1% środka powierzchniowo czynnego N- Rys. 32. Schemat spektrofotometru UV/VIS tlenku N,N-dimetylododecylo Cary 50. Zaczerpnięto z [138]. aminowego (LDAO, Fluka). Roztwory nanocząstek złota rozcieńczano w wodzie o wysokiej czystości (Fluka). Stacjonarna spektroskopia fluorescencyjna Informacje otrzymane o intensywności fluorescencji otrzymane poprzez mapowanie fluorescencji nie dostarczają informacji na temat właściwości spektralnych badanych próbek, w szczególności nie można sprawdzić czy próbka uległa degradacji. Informacji tych może dostarczyć stacjonarna spektroskopia fluorescencyjna. Jeżeli widmo fluorescencji z układów fotosyntetycznych w obecności nanocząstek metalicznych nie zmienia kształtu oznacza to, że kompleksy pozostały nienaruszone. W przypadku pomiarów emisyjnych nanostruktur hybrydowych wykorzystano mikroskop konfokalny, w którym elementu dyspersyjnym była siatka dyfrakcyjna o 600 rysach na milimetr z rozjaśnieniem na długości fali λ = 500 nm. Siatkę umieszczono w monochromatorze (Shamrock 500, Andor), którego ogniskowa wynosi 50 cm. Widmo rejestrowano na kamerze CCD (idus DV 420A-BV, Andor)

85 Fluorescencyjna spektroskopia czasowo-rozdzielcza Spektroskopia czasowo-rozdzielcza polega na obserwowaniu zmian natężenia fluorescencji w czasie, po krótkim impulsie laserowym wzbudzającym próbkę. Dzięki spektroskopii fluorescencji rozdzielonej w czasie istnieje możliwość otrzymani informacji na temat procesów zachodzących pomiędzy kompleksami LH2 a Do wykonania pomiarów czasów życia fluorescencji zastosowano technikę czasowo skorelowanego zliczania pojedynczych fotonów [139][140]. Szybka fotodioda lawinowa (id100-50, idquantique) jest wyzwalana po otrzymaniu sygnału o pulsie lasera z karty pomiarowej (SPC-150, Becker & Hickl). Częstotliwość wyzwalania impulsu laserowego wynosiła 80 MHz. Rozdzielczość czasowa tego układu wynosiła około 200 ps. Podobnie, jak w przypadku mapowania fluorescencji, światło docierające do fotodiody było filtrowane spektralnie poprzez użycie filtra górnoprzepustowego (HQ850LP, Chroma) oraz filtra pasmowego (D880/40nm, Chroma). Dzięki zastosowanemu układowi konfokalnemu pomiar widma fluorescencji jak i pomiary czasowo-rozdzielcze fluorescencji odbywały się z konkretnych punktów na otrzymanych uprzednio map fluorescencji. W tym rozdziale przedstawiono syntezę sferycznych nanocząstek złota metodą zaproponowaną przez Turkevicha. Otrzymano nanocząstki średnicy d = 5 nm, których rezonans plazmonowy występował dla długości fali λ = 530 nm. Zaprezentowano również syntezę złotych nanoprętów metodą zaproponowaną przez Jana. Długość otrzymanych nanoprętów wyniosła 45 nm natomiast średnica 15 nm, co powoduje powstanie dwóch rezonansów plazmonowych. Rezonans plazmonowy związany z szerokością występuje dla długości fali λ = 530 nm, natomiast związany z długością na długości fali λ = 800 nm. Przedstawiono metodę otrzymywania srebrnych nanotrójkątów zaproponowaną przez Aherne. Otrzymano nanotrójkąty posiadające rezonans plazmonowy dla długości fali λ = 720 nm, λ = 800 nm oraz λ = 880 nm. Przedstawiono proces otrzymywania układów fotosyntetycznych LH2 z dwóch gatunków bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides. Opisano również procedurę wytwarzania zaproponowanych nanostruktur hybrydowych złożonych z nanocząstek metalicznych oraz kompleksów LH2. Zaproponowano nanostrukturę hybrydową złożoną ze sferycznych nanocząstek złota oraz

86 kompleksów LH2 oddzielonych warstwą krzemionki o grubościach z = 4 nm, z = 8 nm, z = 12 nm, z = 16 nm oraz z = 40 nm. Zaproponowano również nanostrukturę złożoną ze złotych nanoprętów oraz układów fotosyntetycznych LH2 oddzielonych warstwą krzemionki o grubościach z = 5 nm, z = 10 nm, z = 15 nm, z = 20 nm oraz z = 30 nm. Przedstawiono nanostrukturę hybrydową złożoną ze srebrnych nanotrójkątów oraz kompleksów LH2 otrzymaną poprzez wymieszanie składników. Przedstawiono metody mapowania intensywności fluorescencji przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego oraz mikroskopu szerokiego pola. Przedstawiono techniki pomiarowe użyte w badaniach spektralnych nanostruktur hybrydowych, tj. spektroskopia absorpcyjna oraz spektroskopia fluorescencyjna zarówno stacjonarna jak i rozdzielona w czasie

87 ROZDZIAŁ V NANOSTRUKTURY HYBRYDOWE W poniższym rozdziale przedstawiono wyniki badań przeprowadzonych na układach fotosyntetycznych LH2 oraz na zaproponowanych wcześniej nanostrukturach hybrydowych. Zaprezentowano pomiary fotostabilności układów fotosyntetycznych z bakterii purpurowych gatunków Rps. Palustris, oraz Rb. Sphaeroides. Przedstawiono wyniki pomiarów map intensywności fluorescencji nanostruktur złożonych z układów fotosyntetycznych LH2 oraz metalicznych nanocząstek. Przedstawiono wyniki pomiarów spektroskopowych nanostruktur hybrydowych złożonych z kompleksów LH2 i sferycznych nanocząstek złota oraz złotych nanoprętów. Wpływ karotenoidów na fotostabilność układów fotosyntetycznego LH2 Przeprowadzono badania fotostabilności układów fotosyntetycznych z bakterii purpurowych Rps. Palustris szczep 2.1.6, oraz Rb. Sphaeroides. Do badań tych wykorzystano mikroskop szerokiego pola. Pomiary przeprowadzono w dwóch reżimach koncentracji układów fotosyntetycznych: pomiary pojedynczych molekuł LH2 oraz pomiary próbek o wysokich koncentracjach. Fluorescencję z próbki wzbudzano oświetlaczami diodowymi emitującymi światło o długościach fali λ = 405 nm oraz (a) (b) (c) Rys. 33. Mapy intensywności fluorescencji serii malejących koncentracji układów fotosyntetycznych LH2: z bakterii purpurowych Rps. Palustris (a) OD 850 = 1 cm -1, (b) OD 850 = 0,001 cm -1, (c) OD 850 = 0, cm

88 λ = 480 nm. Pierwszy oświetlacz wzbudza bezpośrednio pasmo Soret a bakteriochlorofili, natomiast drugi pasmo karotenoidów. Gęstość strumienia energii światła emitowanego z oświetlaczy diodowych ustalono na około Φ = 10 W/cm 2. Pomiary mapowania intensywności fluorescencji przeprowadzono zaczynając od próbki wyjściowej o gęstości optycznej OD 850 = 1 cm -1. Przygotowano serię malejących o rząd wielkości koncentracji układów fotosyntetycznych, gdzie najniższa koncentracja miała gęstość optyczną szacowaną na OD 850 = 0, cm -1. Przygotowane roztwory umieszczano w matrycy polimerowej. Tak otrzymanymi roztworami powlekano nakrywkowe szkiełka mikroskopowe techniką powlekania obrotowego. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji przedstawiono na Rys. 33. Mapa intensywności fluorescencji LH2 przedstawiona na Rys. 33(a) została wykonana dla koncentracji kompleksów LH2 o gęstości optycznej OD 850 = 1 cm -1. Widoczna tutaj jest jednorodna jasna warstwa układów fotosyntetycznych LH2. Ze względu na to, że próbka nie jest oświetlana równomiernie, na mapie fluorescencji widoczny jest również kształt zastosowanego oświetlacza diodowego. Przy zmniejszeniu koncentracji o dwa rzędy wielkości Rys. 33(b) zauważono, że intensywność fluorescencji jest rozłożona nierównomiernie. Widoczne są emitujące skupiska molekuł układów fotosyntetycznych pośród miejsc, z których nie zarejestrowano żadnej fluorescencji. Po kolejnym zmniejszeniu koncentracji układów fotosyntetycznych (Rys. 33(c)), tym razem o trzy rzędy wielkości otrzymano mapy fluorescencji, na których widoczna jest fluorescencja z pojedynczych kompleksów LH2. W celu potwierdzenia faktu, że obserwowane fluorescencja pochodzi rzeczywiście z pojedynczych kompleksów LH2, wykonano kinetyczne pomiary intensywności fluorescencji. Pomiary te polegały na detekcji map intensywności fluorescencji w funkcji czasu. Przebiegi intensywności fluorescencji pojedynczych molekuł zbierano przez pięć minut, a pomiar każdej kolejnej mapy intensywności fluorescencji trwał dwie sekundy. Po otrzymaniu kinetyk map fluorescencji pojedynczych układów LH2 wyznaczano poziom intensywności fluorescencji pojedynczych kompleksów fotosyntetycznych na każdej mapie fluorescencji. Następnie z wyznaczony poziomów intensywności fluorescencji LH2 wykreślono trajektorie czasowe intensywności fluorescencji. Przykładowe trajektorie czasowe intensywności fluorescencji przedstawiono na Rys. 34. Przeważająca część

89 układów fotosyntetycznych po pewnym czasie ulegała fotowybieleniu. Przebieg kinetyczny takiego procesu przedstawiono na Rys. 34(a), gdzie widoczny jest pojedynczy krok spadku intensywności fluorescencji LH2, który nastąpił po czasie t = 120 s. Część kompleksów po pierwotnym spadku intensywności fluorescencji wraca do stanu, w którym następuje niestabilny przebieg intensywności fluorescencji układów LH2. Przebieg intensywności fluorescencji z takiego kompleksu przedstawiony jest na Rys. 34(b). Widoczny jest początkowy spadek intensywności fluorescencji LH2 po czasie t = 120 s, po którym nastąpiła seria wygaszenia i włączenia fluorescencji. Całkowite wygaszenie fluorescencji nastąpiło po czasie t = 230 s oraz t = 250 s. W badaniach zarejestrowano występowanie układów LH2, których na początku pomiaru nie obserwowano, natomiast po pewnym (a) (b) (c) (d) Rys. 34. Przykładowe przebiegi czasowe intensywności fluorescencji z pojedynczej molekuły LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris. (a) Pojedynczy krok gaśnięcia fluorescencji. (b) Gaśnięcie fluorescencji a następnie przejście w stan niestabilnej fluorescencji. (c) Stan niestabilnej fluorescencji. (d) Stabilna fluorescencja z pojedynczym krokiem wygaszenia. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 480 nm

90 czasie włączał się mechanizm mrugania, po sekwencji kilku mrugnięć następowało fotowybielenie kompleksu, co jest przedstawione na Rys. 34(c). Zaobserwowano również, iż część układów fotosyntetycznych LH2 nie wykazywała żadnych istotnych zmian intensywności fluorescencji w czasie pomiaru kinetyki map fluorescencji (Rys. 34(d)). Wyniki pomiarów są zgodne z wynikami przedstawionymi w artykule [114]. Na Rys. 35 przedstawiono przykładowe mapy intensywności fluorescencji otrzymane z kinetyk intensywności fluorescencji układów fotosyntetycznych z bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides. Mapy fluorescencji otrzymano przy użyciu źródła światła wzbudzającego o długości fali λ = 405 nm, co zapewniało bezpośrednie wzbudzenie bakteriochlorofilu układu fotosyntetycznego. W obu przypadkach początkowa liczba pojedynczych kompleksów fotosyntetycznych jest porównywalna (Rys. 35(a)(d)). Ilość kompleksów fotosyntetycznych otrzymanych z Rps. Palustris po pięciu minutach (a) t=2 s (b) t=300 s (c) t=600 s 10 µm 10 µm 10 µm (d) t=2s (e) t=10s (f) t=20s 10 µm 10 µm 10 µm Rys. 35. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji otrzymane z pomiarów kinetyki intensywności fluorescencji pojedynczych układów fotosyntetycznych z Rps. Palustris (górny rząd) oraz Rb. Sphaeroides (dolny rząd). Mapy zebrano po czasie t = 2 s (a), (d), t = 10 s (e), t = 20 s (f), t = 300 s (b), oraz t = 600 s (c) ciągłego oświetlania. Wzbudzenie światłem o długości fali λ= 405 nm

91 ciągłego naświetlania (Rys. 35(b)) była porównywalna do ilości kompleksów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii Rb. Sphaeroides po dziesięciosekundowym naświetlaniu (Rys. 35(e)). Natomiast po kolejnych pięciu minutach ciągłego oświetlania zaobserwowano już tylko pojedyncze kompleksy LH2 z Rps. Palustris (Rys. 35(c)). Natomiast w przypadku kompleksu fotosyntetycznego otrzymanego z Rb. Sphaeroides już po dwudziestu sekundach widoczne są tylko pojedyncze kompleksy fotosyntetyczne (Rys. 35(f)). Pomiary te wskazują na dużo mniejszą fotostabilność układów fotosyntetycznych z Rb. Sphaeroides niż układów fotosyntetycznych z Rps. Palustris wzbudzanych bezpośrednio w pasmo absorpcji BChla. Przeprowadzono badania kinetyki fluorescencji kompleksów LH2 wzbudzanych w pasmo karotenoidów, przy wzbudzeniu światłem o długości fali λ = 480 nm. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji otrzymane z kinetyk intensywności (a) t=2 s (b) t=300 s (c) t=600 s 10 µm 10 µm 10 µm (d) t=2s (e) t=300s (f) t=600s 10 µm 10 µm 10 µm Rys. 36. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji otrzymane z pomiarów kinetyki intensywności fluorescencji pojedynczych układów fotosyntetycznych z Rps. Palustris (górny rząd) oraz Rb. Sphaeroides (dolny rząd). Mapy zebrano po czasie t = 2 s (a), (d), t = 300 s (b), (e), oraz t = 600 s (c), (f) ciągłego oświetlania. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 480 nm

92 fluorescencji układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides przedstawiono na Rys. 36. W tej serii eksperymentów zauważono dużo większą fotostabilność układów fotosyntetycznych w przypadku obu bakterii purpurowych niż w serii pomiarów, w których kompleksy LH2 wzbudzano bezpośrednio w BChla. Po pięciu minutach ciągłego oświetlania niemal połowa układów fotosyntetycznych z bakterii purpurowych Rps. Palustris jest nadal fotostabilna (Rys. 36(b)). W przypadku układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii purpurowych Rb. Sphaeroides jedna dziesiąta kompleksów LH2 jest nadal fotostabilna (Rys. 36(e)). Po dziesięciu minutach ciągłego wzbudzania kompleksów niemal jedna trzecia LH2 z Rps. Palustris jest nadal fotostabilna (Rys. 36(c)). Widoczne są również pojedyncze układy fotosyntetyczne z Rb. Sphaeroides (Rys. 36(f)). W celu zautomatyzowania znajdowania obszarów fluorescencji pojedynczych układów fotosyntetycznych napisano program analizujący mapy intensywności fluorescencji. Analiza polegała na znalezieniu rejonów, w których występowała fluorescencja, o intensywności wyższej niż intensywność sygnału tła. Pierwszym krokiem było przeprowadzenie szybkiej transformaty Fouriera na mapie fluorescencji. Operacja ta powoduje przeniesienie obrazu do dziedziny częstotliwości. Po przejściu do domeny częstotliwości odfiltrowano sygnał o niskich częstotliwościach, który odpowiadał tłu aparaturowemu. Następnie zastosowano odwrotną transformatę Fouriera i powrócono do domeny intensywności fluorescencji. Otrzymany obraz map fluorescencji zawierał tylko mapę intensywności fluorescencji układów fotosyntetycznych wolnych od tła. Na tak otrzymanych punktach intensywności fluorescencji sprawdzano współczynnik kołowości Heywood a, który oblicza się poprzez podzielenie obwodu znalezionego obszaru wzmocnionej intensywności przez obwód koła o takiej samej powierzchni jak znaleziony obszar. Im kształt obszaru fluorescencji jest bardziej zbliżony do kołowego, tym ten współczynnik jest bliższy jedności. Dzięki temu odrzucano obszary o nieregularnych kształtach powiązane z fluorescencją aglomeratów układów fotosyntetycznych. Sprawdzano również, czy odnaleziony obszar fluorescencji pochodzi z obszarów o kształcie kołowym jednak, o rozmiarach znacznie większych niż rozdzielczość mikroskopu. Dzięki temu podobnie jak przy wykorzystaniu współczynnika kołowości

93 eliminowano zlepki układów fotosyntetycznych. Następnie zliczano liczbę otrzymanych obszarów, które odpowiadały fluorescencji z pojedynczych kompleksów LH2. Zestawienie wyników wyznaczenia ilości pojedynczych kompleksów LH2 obserwowanych dla kinetyk intensywności fluorescencji przedstawiono na Rys. 37. Przypadek układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii purpurowych Rb. Sphaeroides (Rys. 37(a)) pokazuje dramatyczne zmiany ilości kompleksów LH2 obserwowanych na mapie intensywności fluorescencji. Przy wzbudzeniu układów fotosyntetycznych bezpośrednio w pasmo bakteriochlorofili już po pierwszych dwóch sekundach fotowybieleniu ulegało 90% układów fotosyntetycznych. Natomiast przy oświetleniu LH2 w pasmo karotenoidów czas, po którym liczba LH2 zmniejsza się do początkowej ilości kompleksów wynosi τ = 180 s. W przypadku LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris (Rys. 37(b)) wzbudzenie układu w pasmo BChla światłem o długości fali λ = 405 nm powoduje stopniowe fotowybielenie układów fotosyntetycznych. Czas, po którym liczba LH2 zmniejsza się do początkowej ilości kompleksów wynosi τ = 200 s. Przy oświetleniu światłem o długości fali λ = 485 nm, który wzbudza bezpośrednio karotenoidy, czas ten zmniejsza się do τ = 200 s. (a) (b) Rys. 37. Liczba pojedynczych kompleksów LH2 zlokalizowanych na mapie intensywności fluorescencji w funkcji czasu. (a) LH2 z Rb. Sphaeroides. (b) LH2 z Rps. Palustris. Czarną linią oznaczono wzbudzenie światłem o długości fali λ=405 nm, natomiast czerwoną światłem o długości fali λ=485 nm

94 W celu porównania wyników pomiarów na pojedynczych układach fotosyntetycznych z wynikami pomiarów wysokich koncentracji LH2 przygotowano próbki, w których kompleksy fotosyntetyczne miały gęstość optyczną OD 850 = 1. Układy fotosyntetyczne umieszczone w matrycy polimerowej nanoszono na szkiełka nakrywkowe techniką powlekania obrotowego. Przeprowadzono pomiary kinetyk map intensywności fluorescencji dla układów fotosyntetycznych o wysokiej koncentracji. Na Rys. 38.przedstawione są średnie intensywności fluorescencji wyznaczone dla całych map intensywności fluorescencji w funkcji czasu. W przypadku układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii purpurowych Rb. Sphaeroides (Rys. 38(a)), podobnie jak dla pojedynczych LH2, widoczne są dramatyczne różnice pomiędzy wzbudzeniami w pasmo karotenoidów a pasmo bakteriochlorofili. Przy oświetleniu LH2 w pasmo karotenoidów czas, po którym średnia intensywność fluorescencji zmniejsza się do początkowej intensywności fluorescencji wynosi τ = 300 s. Natomiast przy wzbudzeniu bezpośrednio w pasmo bakteriochlorofili czas ten skraca się do τ = 7 s. W przypadku LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris (Rys. 38(b)) wzbudzenie układu w pasmo karotenoidów oświetlaczem o długości fali λ = 480 nm powoduje stopniowe fotowybielenie układów fotosyntetycznych. Czas, po którym średnia intensywność fluorescencji zmniejsza się do początkowej intensywności fluorescencji jest dłuższy niż czas pomiaru. Przy oświetleniu (a) (b) Rys. 38. Średnia intensywność fluorescencji kompleksów LH2 na mapie intensywności fluorescencji w funkcji czasu. (a) LH2 z Rb. Sphaeroides. (b) LH2 z Rps. Palustris. Czarną linią oznaczono wzbudzenie światłem o długości fali λ = 405 nm, natomiast czerwoną światłem o długości fali λ = 485 nm

95 oświetlaczem o długości fali λ = 405 nm, który wzbudza bezpośrednio bakteriochlorofile, czas ten skraca się do τ = 80 s. Widoczny jest wyraźny spadek intensywności fluorescencji w pierwszych kilkudziesięciu sekundach od rozpoczęcia pomiaru, co było również obserwowane dla przypadku pojedynczych LH2. Do wcześniej wybranych rozkładów intensywności fluorescencji z pojedynczych kompleksów LH2 dopasowano dwuwymiarowa funkcję Gaussa, opisaną wzorem (27). Dopasowania dokonano przy wykorzystaniu algorytmu Levenberga-Marquardta [141][142]. ( ) ( ( ) ( )( ) ( ) ) (27) gdzie: Przykładowy rozkład intensywności fluorescencji pojedynczego kompleksu LH2 (a) (b) Rys. 39. (a) Przykładowy rozkład intensywności fluorescencji pojedynczej molekuły. (b) Dopasowanie dwuwymiarowej funkcją Gaussa do punktów pomiarowych. Osie x oraz y odpowiadają przestrzennemu położeniu molekuły, oś z oznacza intensywność sygnału

96 przedstawiono na Rys. 39(a). Natomiast na Rys. 39(b) przedstawiono dopasowanie dwuwymiarowej funkcji Gaussa do rozkładu intensywności fluorescencji LH2. Na podstawie dopasowania otrzymano szereg wartości amplitudy (A), poziomu tła (A 0 ) oraz dwóch odchyleń standardowych (σ x i σ y ). Do dalszej analizy molekuły klasyfikowane są na podstawie odchyleń. W mikroskopie szerokiego pola obrazem punktowego źródła światła, jakim jest obrazowana pojedyncza molekuła układu fotosyntetycznego, jest plamka Airy ego. Plamkę tę można dobrze przybliżać dwuwymiarową funkcją Gaussa [143][144]. Wtedy odchylenie standardowe σ takiej funkcji Gaussa wynosi σ A 0,64λ/NA, gdzie λ to długość fali światła emitowanego z obrazowanej molekuły, a NA to apertura numeryczna używanego systemu optycznego. W przypadku wykorzystanego obiektywu NA = 1,4. Maksimum emisji fluorescencji LH2 przypada na λ = 870 nm. Wyliczone w ten sposób odchylenie standardowe wynosi σ A = 398 nm. Na podstawie tej wartości do dalszej analizy dopuszczone zostały kompleksy, których odchylenie standardowe otrzymane z dopasowania dwuwymiarowej funkcji Gaussa wynosi od 300 nm do 700 nm w obu osiach (σ A ± 200 nm). Mapy intensywności fluorescencji wykorzystane do dalszej analizy zostały otrzymane przy wzbudzeniu światłem o długości fali λ = 480 nm. Na podstawie amplitud intensywności fluorescencji otrzymanych z dopasowania dwuwymiarowej funkcji Gaussa wyznaczono ilość fotonów docierających do kamery. Efektywność kwantowa kamery dla długości fali detekcji λ = 870 nm wynosi η = 0.5, (a) (b) Rys. 40. Histogramy liczby fotonów docierających do kamery z pomiarów pojedynczych układów fotosyntetycznych otrzymanych z (a) Rps. Palustris oraz (b) Rb. Sphaeroides. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 480 nm

97 wartość wzmocnienia EMCCD podczas pomiarów ustalona była na 900. Wartość amplitud intensywności fluorescencji podzielono przez efektywność kwantową detektora, wartość wzmocnienia EMCCD, co w wyniku dało liczbę fotonów docierających do detektora. Histogramy tak otrzymanych liczb fotonów docierających do detektora zebrano na Rys. 40. Średnia ilość fotonów emitowanych z układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii Rps. Palustris docierających do kamery wynosi = 53 ± 14 ph s -1. Natomiast średnia liczba fotonów emitowanych z układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii Rb. Sphaeroides docierających do kamery wynosi = 60 ± 15 ph s -1. Różnica liczby fotonów emitowanych z kompleksów otrzymanych bakterii purpurowych Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides wynika z innej wartości wydajności kwantowej fluorescencji LH2 obu gatunków. Zgodnie z danymi literaturowymi wydajność kwantowa układów fotosyntetycznych otrzymanych z Rb. Sphaeroides wynosi = 9.86% [145]. Nie znaleziono w literaturze wartości efektywności kwantowej układów fotosyntetycznych otrzymanych z bakterii Rps. Palustris. Wyznaczenia nieznanej wydajności kwantowej dokonano metodą porównawczą, w której za próbkę wzorcową przyjęto Rb. Sphaeroides. W ogólności wydajność kwantową fluorescencji można zdefiniować, jako stosunek liczby fotonów wyemitowanych do liczby fotonów zaabsorbowanych w próbce. Liczba fotonów zaabsorbowanych jest proporcjonalna do absorbancji próbki, natomiast liczba fotonów wyemitowanych jest proporcjonalna do powierzchni pod krzywymi rozkładu natężeń fluorescencji w widmach emisji próbki i wtedy wydajność kwantową próbki można zapisać, jako: (28) gdzie α jest stałą związaną z efektywnością kwantową detektora, β jest stałą związaną z intensywnością źródła wzbudzenia fluorescencji, jest powierzchnią pod krzywą rozkładu natężenia fluorescencji w widmie emisji próbki (całkowita intensywność fluorescencji), jest absorbancją próbki dla długości fali światła wzbudzającego,

98 jest współczynnikiem załamania światła rozpuszczalnika. Podobne równanie można zapisać dla próbki wzorcowej. Następnie porównując do siebie równanie dla próbki wzorcowej, z równaniem dla nieznanej próbki otrzymujemy zależność: ( ) (29) Jeżeli pomiary próbki wzorcowej oraz próbki nieznanej wykonane są przy użyciu tych samych układów pomiarowych stałe i β są takie same, więc się skracają. Układy fotosyntetyczne znajdują się w tym samym rozpuszczalniku w związku, z czym współczynniki załamania światła się redukują. Wzór na wydajność kwantową nieznanej próbki przyjmuje postać ( ) (30) W celu dokładniejszego wyznaczenia wydajności kwantowej możliwe jest wykreślenie zależności całkowitej intensywności fluorescencji w funkcji absorbancji próbek dla długości fali światła użytego do wzbudzenia próbek. Przy zastosowaniu metody porównawczej należy zadbać, aby badana próbka oraz próbka standardowa absorbowały oraz emitowały światło w tym samym zakresie widmowym. Ponadto należy zadbać, aby absorbancja próbki nie przekraczała wartości 0.1, gdyż wtedy w próbce występuje liniowa zależność natężenia fluorescencji od stężenia, tj. nie występują efekty związane z reabsorpcją w próbce. W przypadku pomiarów układów fotosyntetycznych z obu bakterii purpurowych warunki zostały zachowane. Ostatecznie wzór na wydajność kwantową nieznanej próbki przyjmuje postać ( ) (31)

99 gdzie jest wyznaczaną wydajnością kwantową, jest wydajnością kwantową próbki odniesienia,, są współczynnikiem nachylenia krzywej na wykresie zależności intensywności fluorescencji od absorbancji (Rys. 41) odpowiednio badanej próbki, oraz wzorca. Wyznaczona tą metodą wartość wydajności kwantowej fluorescencji układów fotosyntetycznych LH2 otrzymanych z bakterii Rps. Palustris wynosi = 6,32±0,43%. Na podstawie znanych wydajności kwantowych układów fotosyntetycznych możliwe jest oszacowanie liczby fotonów emitowanych z pojedynczego układu fotosyntetycznego. Liczba fotonów emitowanych z pojedynczego układu fotosyntetycznego można oszacować na podstawie wzoru [146]: (32) gdzie -liczba fotonów emitowanych z pojedynczego kompleksu LH2 w czasie sekundy, liczba fotonów światła wzbudzającego na centymetr kwadratowy w czasie jednej sekundy, przekrój czynny na absorpcję LH2 dla długości fali wzbudzającej. Przy fali wzbudzającej i długości = 480 nm o mocy P = 10.2 W cm -2 s -1 otrzymujemy = 2.5 * ph cm -2 s -1. Efektywności kwantowe wynoszą odpowiednio = 6.32%, = 9.86%. Przekrój czynny na absorpcję dla układów fotosyntetycznych z obu bakterii purpurowych wynosi = * cm 2 [147]. Podstawiając wartości efektywności Rys. 41 Wykres zależności całkowitej intensywności fluorescencji (λ wzb = 485 nm) od absorbancji

100 kwantowych LH2, liczbę fotonów światła wzbudzającego oraz przekrój czynny na absorpcję do równania (32) otrzymujemy, że liczba elektronów emitowana z pojedynczego układu fotosyntetycznego przy zadanych warunkach oświetlenia z bakterii purpurowej Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides wynosi odpowiednio = 80 ph s -1, oraz = 124 ph s -1. Na podstawie oszacowań liczby fotonów emitowanych z pojedynczych układów fotosyntetycznych oszacowano liczbę fotonów docierających do detektora. Molekuły były umieszczone w matrycach polimerowych, które tworzyły granicę dielektryk powietrze. Emisja fluorescencji z molekuł na granicy ośrodków jest kierunkowa i preferowanym kierunkiem rozchodzenia się fotonów jest kierunek w głąb dielektryka [148][149][150][151][152]. Na podstawie pracy [152] przyjęto, że wykorzystując obiektyw o aperturze numerycznej NA = 1.4 efektywna zdolność zbierania fluorescencji wynosi 80% wszystkich wyemitowanych fotonów z LH2. Straty na filtrach optycznych zastosowanych w eksperymencie są rzędu 40%. Biorąc pod uwagę powyższe otrzymano, że ilość fotonów z pojedynczych układów fotosyntetycznych docierających w ciągu sekundy do kamery CCD powinna być na poziomie = 38 ph s -1 dla Rps. Palustris natomiast dla Rb. Sphaeroides = 60 ph s -1. Wyznaczona ilość fotonów docierająca do detektora zgadza się z danymi otrzymanymi w eksperymencie. Wnioski Przeprowadzono badania fotostabilności układów fotosyntetycznych LH2 otrzymanych z dwóch gatunków bakterii purpurowych: Rps. Palustris oraz Rb. Sphaeroides. Pomiary kinetyk intensywności fluorescencji wskazują, że czas spadku intensywności fluorescencji do poziomu początkowej intensywności fluorescencji jest o rząd wielkości szybszy dla kompleksów LH2 z Rb. Sphaeroides niż dla LH2 z Rps. Palustris, przy wzbudzeniu fluorescencji w pasmo bakteriochlorofili (długość fali światła wzbudzającego λ = 405 nm). Natomiast jeżeli LH2 jest wzbudzane w pasmo karotenoidów światłem o długości fali λ = 485 nm obserwowana różnica nie jest aż tak diametralna. Podstawową różnicą pomiędzy badanymi układami fotosyntetycznymi jest rodzaj karotenoidów w nich zawartych. Jak zostało wcześniej przytoczone jedną z funkcji karotenoidów jest fotoprotekcja układów fotosyntetycznych. Polega ona na gaszeniu stanu

101 trypletowego bakteriochlorofili, co zapobiega powstawaniu tlenu singletowego. Jeżeli natomiast w wyniku transferu energii ze stanu trypletowego bakteriochlorofilu do tlenu powstanie tlen w stanie singletowym, karotenoidy powodują efektywne gaszenie stanu singletowego tlenu [65][153][154]. Mieszanina karotenoidów występująca w układach fotosyntetycznych LH2 otrzymanych bakterii purpurowych Rps. Palustris składa się w 73% z rodowibryny, 15% OH-spiriloksantyny, 7% spiriloksantyny, 3% bezwodnej rodowibryny oraz 2% likopenu. Natomiast w układach LH2 otrzymanych z bakterii Rb. Sphaeroides występują tylko dwa rodzaje karotenoidów 90% sferoidyny oraz 10% sferoidenonu [155]. Zastosowana w eksperymencie gęstość strumienia energii oświetlaczy jest około dwieście pięćdziesiąt tysięcy razy większa niż strumień promieniowania światła słonecznego docierającego do powierzchni Ziemi. Może to prowadzić do powstania stanów trypletowych w bakteriochlorofilach. Układy fotosyntetyczne z bakterii Rps. Palustris dzięki występującej w nich mieszaninie karotenoidów dużo wydajniej gaszą stany trypletowe powstałe w bakteriochlorofilach niż LH2 z Rb. Sphaeroides. Wyraźnie widoczne jest to szczególnie przy bezpośrednim wzbudzeniu w pasmo Soret bakteriochlorofili. Fluorescencja LH2 z Rb. Sphaeroides gaśnie w ciągu kilku sekund po ciągłym oświetlaniu, natomiast dla układów fotosyntetycznych z Rps. Palustris fluorescencja widoczna jest nawet po dziesięciu minutach ciągłego oświetlania. Zgodnie z obliczeniami oraz danymi eksperymentalnymi zaobserwowano, że liczba fotonów obserwowanych z pojedynczych układów fotosyntetycznych LH2 jest bliska teoretycznie możliwej liczby obserwowanych fotonów

102 Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze sferycznymi nanocząstkami złota Pierwszą badaną nanostrukturą hybrydową była struktura złożona ze sferycznych nanocząstek złota oraz układów fotosyntetycznych LH2 z bakterii purpurowych Rps. Palustris. Na Rys. 42 przedstawione są widma ekstynkcji składników nanostruktury oraz widmo emisji układu LH2. Ponieważ w nanostrukturze występuje tylko jeden rodzaj emiterów, tzn. LH2, emisja z nanostruktury jest tożsama z emisją z układów fotosyntetycznych. Rezonans plazmonowy złotych nanocząstek występuje dla długości fali λ = 540 nm, co bardzo dobrze odpowiada absorpcji karotenoidów z układu fotosyntetycznego LH2. Rezonans plazmonowy z nanocząstek plazmonicznych nie pokrywa się z emisją z LH2. W związku, z tym rezonans plazmonowy może wpłynąć jedynie na absorpcją układu fotosyntetycznego, bez zmiany zaniku promienistego LH2. Rys. 42. Widmo ekstynkcji sferycznych nanocząstek złota (niebieska linia), widmo ekstynkcji układów fotosyntetycznych LH2 (linia czarna), widmo emisji układów fotosyntetycznych LH2 wzbudzonego światłem o długości fali λ = 485 nm (linia czerwona)

103 Pomiary wykonano wykorzystując mikroskop konfokalny, w którym zamiast obiektywu zastosowano soczewkę skupiającą o ogniskowej 30 mm. Użyto dwóch laserów emitujących światło o długościach fali λ = 405 nm oraz λ = 485 nm. Moc laserów kontrolowano na poziomie P = 200 µw. Odległość spektralna pierwszego lasera od rezonansu plazmonowego jest znaczna w związku, z czym wpływ rezonansu plazmonowego na fluorescencję z nanostruktury powinien być niewielki. Natomiast laser emitujący światło o długości fali λ = 485 nm znajduje się spektralnie blisko rezonansu plazmonowego sferycznych nanocząstek złota w związku, z czym oddziaływanie pomiędzy wyindukowanym dodatkowym polem elektrycznym wokół sferycznych nanocząstek a układem fotosyntetycznym LH2 powinno być znaczne. Wyniki opisane w tym rozdziale zostały opublikowane w pracy [156]. Stacjonarna spektroskopia fluorescencyjna W ramach badań stacjonarnej spektroskopii fluorescencyjnej wykonano pomiary nanostruktur hybrydowych, w których odległość pomiędzy układami LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota wynosiły z = 4 nm, z = 12 nm oraz z = 40 nm. W ramach pomiarów referencyjnych użyto układów fotosyntetycznych LH2 umieszczonych w matrycy polimerowej PVA, którymi powleczono mikroskopowe szkiełka nakrywkowe. Na Rys. 43 przedstawiono zestawienie reprezentatywnych widm fluorescencji odpowiadających średniej wartości fluorescencji z wszystkich dziesięciu pomiarów. Czarną linią zaznaczono widmo fluorescencji z próbki referencyjnej. Liniami zieloną, czerwoną oraz zieloną oznaczono widma emisji fluorescencji nanostruktur, w których odległości pomiędzy sferycznymi nanocząstkami złota a LH2 wynosiły odpowiednio z = 40 nm, z = 12 nm, z = 4 nm. Czarne punkty reprezentują widmo próbki referencyjnej przeskalowane tak, aby maksimum fluorescencji LH2 referencyjnego miało tę samą wartość jak maksimum widma fluorescencji nanostruktury. Widoczne jest to, że niezależnie od grubości przekładki krzemionkowej widma fluorescencji mają ten sam kształt. Widmo emisji fluorescencji z układów fotosyntetycznych umieszczonych w matrycy polimerowej ma dokładnie taki sam kształt jak widmo nanostruktury hybrydowej z przekładką krzemionkową z = 12 nm. Oznacza to, że struktura białkowa układu fotosyntetycznego LH2 umieszczonego w nanostrukturach hybrydowych pozostała nienaruszona

104 Na Rys. 44 zebrano wartości maksimów intensywności widm emisji fluorescencji LH2 na długości fali λ = 870 nm, zmierzonych w różnych miejscach nanostruktur hybrydowych, w których odległości pomiędzy sferycznymi nanocząstkami złota a LH2 wynosiły odpowiednio z = 40 nm, z = 12 nm, z = 4 nm oraz próbki referencyjnej LH2. Pomiary z próbki referencyjnej oznaczono czarnymi punktami. Średnia intensywność fluorescencji w tym przypadku wynosi I = 7,5±2,5*10 4 cps. Widoczny jest rozrzut intensywności fluorescencji, związany z lokalnymi fluktuacjami koncentracji układów fotosyntetycznych LH2 jak również z lokalnymi fluktuacjami w grubości warstwy matrycy polimerowej. Wyniki pomiarów nanostruktury hybrydowej z przekładką krzemionkową o grubości z = 40 nm zaznaczono zielonymi punktami. Średnia intensywność fluorescencji wynosi I = 11±5*10 4 cps. Większy rozrzut intensywności fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturze może być związany z niejednorościami warstwy Rys. 43. Widma emisji fluorescencji LH2 oddalonych od sferycznych nanocząstek złota na odległość z = 4 nm (linia niebieska), z =12 nm (linia czerwona), z = 40 nm (linia zielona). Widmo emisji fluorescencji kompleksów LH2 oznaczono czarną linią. Czarnymi kropkami oznaczono przeskalowane widmo fluorescencji układów fotosyntetycznych. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 485 nm

105 krzemionki. Średnia wartość intensywności fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturze jest większa niż dla próbki referencyjnej, co oznacza, że występuje niewielki efekt wzmocnienia fluorescencji układów fotosyntetycznych poprzez oddalone o z = 40 nm złote nanocząstki. Średnia wartość intensywności fluorescencji z nanostruktury z przekładką dielektryczną grubości z = 12 nm wynosi I = 51±31*10 4 cps. Średnia intensywność fluorescencji jest niemal siedmiokrotnie większa niż dla próbki referencyjnej. Zaobserwowano również największy rozrzut wartości intensywności fluorescencji. Jedna ze zmierzonych wartości jest aż piętnastokrotnie większa od próbki referencyjnej. Najmniej intensywne widmo fluorescencji z tej nanostruktury ma większą intensywność fluorescencji, niż którekolwiek widmo zmierzone dla pozostałych nanostruktur, czy też próbki referencyjnej. Dlatego zarówno rozrzut intensywności, jak i średnia wartość intensywności z nanostruktury nie mogą być powiązane wyłącznie z niejednorościami grubości warstwy krzemionkowej, czy grubości warstwy LH2 umieszczonych w matrycy polimerowej PVA. Przy odległości z = 12 nm oddziaływanie pomiędzy plazmonami a układami fotosyntetycznymi jest największe. Średnia intensywność fluorescencji dla z = 4 Ref Rys. 44. Odłożone wartości maksimów intensywności fluorescencji LH2 (punkty czarne), oraz kompleksów LH2 oddalonych od sferycznych nanocząstek złota na odległość z = 4 nm (punkty niebieskie), z =12 nm (punkty czerwone), z= 40 nm (punkty zielone)

106 nm wynosi I = 16±1*10 4 cps i jest ponad dwukrotnie większa od średniej intensywności dla próbki referencyjnej. W tej nanostrukturze zaobserwowano bardzo mały rozrzut intensywności fluorescencji. Przy odległości z = 4 nm dużą rolę zaczyna ogrywać nieradiacyjny przekaz energii z układów fotosyntetycznych do nanocząstek plazmonicznych. W związku, z czym intensywność fluorescencji maleje w porównaniu do nanostruktury, w której odległość pomiędzy kompleksami LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota wynosi z = 12 nm. Badania nanostruktur hybrydowych potwierdziły, że jest możliwe wzmocnienie intensywności fluorescencji w nanostrukturach hybrydowych złożonych ze sferycznych nanocząstek złota oraz układów fotosyntetycznych LH2. Otrzymano siedmiokrotne wzmocnienie intensywności fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturze, w której odległość pomiędzy LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota wynosi z = 12 nm. Dla odległości mniejszych zaobserwowano efekt częściowego gaszenia fluorescencji układu fotosyntetycznego poprzez nieradiacyjny przekaz energii w układów LH2 do sferycznych nanocząstek złota. Spektroskopia czasowo-rozdzielcza fluorescencji Kolejnymi badaniami wpływu rezonansu plazmonowego sferycznych nanocząstek złota na zanik promienisty z układu fotosyntetycznego były pomiary czasowo-rozdzielcze fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych. Badano nanostruktury hybrydowe z przekładkami dielektrycznymi o grubościach z = 4 nm, z = 8 nm, z = 12 nm, z = 16 nm, z = 24 nm oraz z = 40 nm. Do pomiarów użyto lasera o długości fali λ = 405 nm, który słabo wzbudza rezonans plazmonowy sferycznych nanocząstek złota, natomiast dobrze wzbudza fluorescencję układów fotosyntetycznych LH2. Wykorzystano również laser o długości fali λ = 485 nm, który wzbudza rezonans plazmonowy w nanocząstkach oraz Car z układu fotosyntetycznego LH2. Wyniki badań zostały opublikowane w pracy [157]

107 Na Rys. 45 przedstawione są znormalizowane przebiegi czasowe fluorescencji ze struktury hybrydowej, dla wzbudzeń fluorescencji laserami o długościach fali λ = 405 nm (Rys. 45(a)) oraz λ = 485 nm (Rys. 45(b)). Ze względu na czytelność wybrano przebiegi zaniku intensywności fluorescencji próbki referencyjnej (czarne linie) oraz nanostruktur z przekładkami krzemionkowymi o grubościach z = 4 nm (linie niebieskie) i z = 12 nm (linie czerwone). Przebiegi zaniku intensywności fluorescencji układu fotosyntetycznego LH2 są niemal niezależne od tego czy pomiar przeprowadzono na samych LH2, czy też na układach fotosyntetycznych umieszczonych w obecności sferycznych nanocząstek złota. Oznacza to, że obserwowane wzmocnienie intensywności fluorescencji związane jest jedynie ze wzrostem stałej szybkości wzbudzenia kompleksu LH2, który jest spowodowany wyindukowanym dodatkowym polem elektrycznym powstałym w wyniku wzbudzenia rezonansu plazmonowego sferycznych nanocząstek złota użytych w nanostrukturach. Na podstawie otrzymanych przebiegów zaników intensywności fluorescencji wyznaczono czasy życia fluorescencji LH2 w nanostrukturach hybrydowych. Ze względu na wielowykładniczy charakter zaników fluorescencji czasy życia wyznaczono, jako czas, po którym intensywność fluorescencji spadnie do poziomu początkowej wartości intensywności fluorescencji. Na Rys. 46 w formie graficznej przedstawiono wszystkie wyznaczone czasy zaniku fluorescencji w funkcji odległości pomiędzy LH2 a sferycznymi (a) (b) Rys. 45. Przebiegi czasowe intensywności fluorescencji kompleksów LH2 (linia czarna), oraz LH2 oddalonych od sferycznych nanocząstek złota na odległość z = 4 nm (linia niebieska), z =12 nm (linia czerwona) dla wzbudzeń światłem o długościach fali (a) λ=405 nm oraz (b) λ=485 nm

108 nanocząstkami złota. Wyznaczone czasy życia fluorescencji zarówno dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 405 nm (Rys. 46 (a)) oraz λ = 485 nm (Rys. 46 (a)) widoczny Tab. 1 Średnie czasy życia fluorescencji nanostruktur hybrydowych złożonych z jest rozrzut wartości czasów życia kompleksów LH2 oraz sferycznych fluorescencji, jednak średnia wartość jest nanocząstek złota. porównywalna. Na podstawie wyznaczonych wartości życia fluorescencji wyznaczono średnie czasy życia fluorescencji, które umieszczono w Tab. 1. Średnie czasy życia fluorescencji dla odpowiednich wzbudzeń laserowych różnią się od siebie w granicach błędu pomiarowego, co oznacza, że niezależnie od fizycznej odległości pomiędzy cząstką plazmoniczna a układem fotosyntetycznym LH2, wydajność kwantowa układu fotosyntetycznego pozostaje niezmienna. W celu wyznaczenia całkowitej intensywności fluorescencji z LH2 na długości fali emisji λ = 870 nm wyznaczono całki pod krzywymi przebiegów czasowych intensywności fluorescencji. Następnie z otrzymanych intensywności fluorescencji wyznaczono wzmocnienie intensywności fluorescencji, które otrzymano poprzez podzielenie wszystkich wartości intensywności fluorescencji przez średnią wartość intensywności fluorescencji (a) (b) Ref f Rys. 46. Wyznaczone wartości czasu zaniku fluorescencji LH2 w funkcji odległości od sferycznych nanocząstek złota dla wzbudzeń światłem o długościach fali (a) λ=405 nm oraz (b) λ=485 nm. Ref f

109 z nanostruktury referencyjnej. Zgodnie z wcześniejszymi badaniami przyjęto, że w nanostrukturze hybrydowej, w której odległość pomiędzy LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota wynosi z = 40 nm zachodzi bardzo małe oddziaływanie pomiędzy składnikami, w związku, z czym przyjęto tę nanostrukturę, jako próbkę referencyjną. Wyniki obliczeń zostały przedstawione na Rys. 47, jako funkcję wzmocnienia fluorescencji nanostruktury hybrydowej od grubości przekładki Dla obu wzbudzeń fluorescencji nanostruktury zauważono zależność intensywności fluorescencji w funkcji odległości pomiędzy kompleksami LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota. Na Rys. 47, linią przerywaną, wykreślono zależność wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturach hybrydowych w funkcji odległości pomiędzy LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota. Do wzbudzenia fluorescencji kompleksów LH2 użyto lasera o długości fali λ = 405 nm, który znajduje się w znacznej odległości spektralnej od rezonansu plazmonowego nanocząstek (λ = 530 nm). Rys. 47. Wykres wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 w funkcji odległości od sferycznych nanocząstek złota. Linią ciągłą oznaczono wzbudzenie o długości fali λ=480 nm, natomiast linią przerywaną λ=405 nm

110 Intensywność fluorescencji z kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturze hybrydowej o przekładce krzemionkowej grubości z = 12 nm jest dwukrotnie większa niż dla próbki referencyjnej. Nanostruktura hybrydowa z przekładką o dielektryczną grubości z = 4 nm wykazuje słabe gaszenie fluorescencji. W pozostałych nanostrukturach hybrydowych nie obserwowano, w granicach błędu pomiarowego, efektów związanych z oddziaływaniem układów fotosyntetycznych LH2 ze sferycznymi nanocząstkami złota. Na Rys. 47, linią ciągłą, wykreślono zależność wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturach hybrydowych w funkcji odległości pomiędzy LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota. W tym przypadku do wzbudzenia fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych użyto lasera o długości fali λ = 485 nm, który znajduje się w niewielkiej odległości spektralnej od rezonansu plazmonowego nanocząstek (λ = 530 nm). Zaobserwowano znaczne wzmocnienie fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych. Wzmocnienie to wykazuje silną zależność od odległości pomiędzy układami fotosyntetycznymi LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota. Wzmocnienie intensywności fluorescencji nanostruktury, w której zastosowano przekładkę dielektryczną o grubości z = 24 nm wynosi 2,3±0,2. Przy zbliżaniu nanocząstek plazmonicznych do układów fotosyntetycznych intensywność fluorescencji rośnie i osiąga maksymalną wartość dla nanostruktury o z = 12 nm wynoszącą 5,2±0,4. Przy odległościach pomiędzy LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota mniejszymi niż z = 12 nm dużą rolę zaczyna odgrywać nieradiacyjny przekaz energii z LH2 do sferycznych nanocząstek złota, co objawia się mniejszym wzmocnieniem fluorescencji. Wnioski Przeprowadzono pomiary spektroskopowe nanostruktur hybrydowych złożonych ze sferycznych nanocząstek złota oraz układów fotosyntetycznych LH2, oddzielonych od siebie warstwą krzemionki o grubościach z = 4 nm, z = 8 nm, z = 12 nm, z = 16 nm oraz z = 40 nm. Badania wykazały istnienie silnej zależności intensywności fluorescencji od odległości pomiędzy składnikami nanostruktury. Optymalna odległość pomiędzy nanocząstkami metalicznymi, a układami fotosyntetycznymi w zaproponowanych

111 nanostrukturach wynosi z = 12 nm. Dla odległości mniejszych niż z = 12 nm zaobserwowano, że gaszenie fluorescencji zaczyna dominować nad lokalnym wzmocnieniem pola elektromagnetycznego, co objawia się zmniejszeniem wartości współczynnika wzmocnienia intensywności fluorescencji. Natomiast dla odległości większych niż z = 12 nm współczynnik wzmocnienia intensywności fluorescencji jest mniejszy, ze względu na zbyt małe oddziaływanie pomiędzy układami fotosyntetycznymi a sferycznymi nanocząstkami złota. Wielkość wzmocnienia intensywności w nanostrukturze silnie zależy od spektralnej odległości pomiędzy światłem wzbudzającym a rezonansem plazmonowym nanocząstki metalicznej. Przy optymalnej odległości pomiędzy składnikami nanostruktury maksymalne wzmocnienie intensywności fluorescencji dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 405 nm jest ponad dwukrotnie mniejsze niż dla wzbudzenia bliżej rezonansu plazmonowego nanocząstki. Przy pozostałych odległościach pomiędzy LH2 a sferycznymi nanocząstkami złota, dla wzbudzenia spektralnie daleko od rezonansowego nie zaobserwowano wzmocnienia fluorescencji. Pomiary czasowo-rozdzielcze nie wykazały zmian w wartościach czasów zaniku fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturach hybrydowych. Oznacza to, że wzmocnienie obserwowane na nanostrukturach hybrydowych związane jest jedynie ze lokalnym wzmocnieniem absorpcji w pasmie karotenoidów układów fotosyntetycznych, poprzez sprzężenie z dodatkowym wyindukowanym polem elektrycznym wokół nanocząstek złota. Do wytworzenia nanostruktur hybrydowych zastosowano technikę powlekania obrotowego, dzięki której wytwarzano jednorodne warstwy układów fotosyntetycznych LH2 w matrycy polimerowej. Zauważalny jest jednak czynnik związany z lokalnymi różnicami w koncentracji LH2. Warto zauważyć, że grubość warstwy kompleksów LH2 umieszczonych w matrycy polimerowej wynosi ok ~600 nm. W związku z tym obserwowane zależności są wynikiem uśrednionego oddziaływania, które występuje dla warstwy na granicy polimer-krzemionka jak i dla nieoddziałujących układów fotosyntetycznych znajdujących się daleko od granicy warstw. Niejednorodność

112 intensywności fluorescencji z nanostruktury mogła również być związana ze sposobem naparowania warstwy krzemionki. W wyniku jej naparowania mogły powstać niejednorodności, które były mniejsze niż 2 nm. Rozrzut taki dla grubych warstw krzemionki mógł mieć niewielki wpływ na oddziaływania pomiędzy cząstką plazmoniczną a fluoroforem, natomiast przy nanostrukturach o grubościach warstw krzemionki <10 nm powoduje znaczny wpływ na oddziaływanie pomiędzy składnikami nanostruktury. Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze złotymi nanoprętami Druga badana nanostruktura hybrydowa była złożona ze złotych nanoprętów oraz układów fotosyntetycznych LH2. Na Rys. 48 przedstawione są widma ekstynkcji składników nanostruktury oraz widmo emisji układu LH2. W złotych nanoprętach występują dwa rezonanse plazmonowe. Podłużny rezonans plazmonowy występuje dla długości fali λ = 800 nm. Poprzeczny rezonans plazmonowy występuje dla długości fali Rys. 48. Widmo ekstynkcji złotych nanoprętów (niebieska linia), widmo ekstynkcji układów fotosyntetycznych LH2 (linia czarna), widmo emisji układów fotosyntetycznych LH2 (linia czerwona)

113 λ = 540 nm. Rezonans poprzeczny nanoprętów bardzo dobrze odpowiada absorpcji pasma karotenoidów z układu fotosyntetycznego LH2. Rezonans podłużny natomiast bardzo dobrze sprzęga się z absorpcją pasma związanego z pierścieniem B800 bakteriochlorofili. Ze względu na dużą spektralną szerokość podłużnego rezonansu plazmonowego, możliwe jest również jego oddziaływanie zarówno z absorpcją pasma związanego z pierścieniem B850 jak i z emisją z tego pasma. Badania przeprowadzono na nanostrukturach hybrydowych z przekładkami dielektrycznymi o grubościach z = 5 nm, z = 8 nm, z = 10 nm, z = 15 nm, z = 20 nm oraz z = 40 nm. Mapy intensywności fluorescencji Przeprowadzono pomiary map fluorescencji nanostruktur hybrydowych. Do pomiarów użyto laserów o długościach fali λ = 556 nm, który odpowiadał rezonansowi poprzecznemu złotych nanoprętów, oraz λ = 808 nm, który odpowiadał rezonansowi podłużnemu złotych nanoprętów. Moce laserów w obu przypadkach ustalono na P = 5 µw. Pomiary wykonano przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w obiektyw LMPlan 50x. Mapy zbierano z obszaru o rozmiarze 50x50 µm, z krokiem 0.5 µm. Czas akwizycji na każdym kroku wynosił t = 0.01 s. Na Rys. 49 przedstawiono wybrane reprezentatywne mapy intensywności fluorescencji LH2 umieszczonego w trzech nanostrukturach hybrydowych. Mapy zbierano dokładnie w tym samym miejscu przy pobudzeniu oboma laserami. Mapy intensywności fluorescencji nanostruktur o grubości warstwy dielektrycznej o grubości z = 30 nm (Rys. 49(a) oraz (b)) wykazują znaczną jednorodność intensywności fluorescencji. Występują odosobnione obszary o większej intensywności fluorescencji, które można wiązać z lokalnymi zmianami koncentracji układów fotosyntetycznych w nanostrukturze. Warstwy zachowują swoją jednorodność niezależnie od zastosowanego lasera wzbudzającego. W nanostrukturze, w której odległość pomiędzy składnikami wynosi z = 15 nm, przy wzbudzeniu laserem o długości fali λ = 556 nm (Rys. 49(c)), widoczne są pojedyncze obszary o większej intensywności fluorescencji odpowiadające miejscom, w których nastąpiło oddziaływanie pomiędzy układami fotosyntetycznymi LH2 a

114 nanoprętami. Jednakże średnio intensywność fluorescencji jest o połowę mniejsza niż dla nanostruktury o przekładce dielektrycznej z = 30 nm. Przy wzbudzeniu tego samego z=30 nm λ ex=556 nm (a) z=30 nm λ ex=808 nm (b) z=15 nm λ ex=556 nm (c) z=15 nm λ ex=808 nm (d) z=5 nm λ ex=556 nm (e) z=5 nm λ ex=808 nm (f) Rys. 49. Przykładowe mapy intensywności fluorescencji nanostruktur hybrydowych złożonych z LH2 oraz złotych nanoprętów. Mapy intensywności fluorescencji LH2 wzbudzanych światłem o długości fali λ=556 nm nanostruktur o odległościach pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami przedstawiono na (a) z=30 nm, (c) z=15 nm, (e) z=5 nm. Natomiast dla wzbudzenia światłem o długości fali λ=808 nm (b) z=30 nm, (d) z=15 nm, (f) z=5 nm

115 obszaru laserem o długości fali λ = 808 nm (Rys. 49(d)) zauważalna staje się dużo większa niejednorodność fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturze. Występują obszary, których intensywność fluorescencji jest czterokrotnie większa niż intensywność fluorescencji LH2 umieszczonego w nanostrukturze o przekładce dielektrycznej o grubości z = 30 nm jak i miejsca gdzie jest porównywalna. Największe różnice pomiędzy mapami intensywności fluorescencji otrzymanymi przy wykorzystaniu różnych laserów wzbudzających występują dla nanostruktury o przekładce dielektrycznej z = 5 nm. W przypadku wzbudzenia nanostruktury hybrydowej laserem o długości fali λ = 556 nm (Rys. 49(e)), mapy intensywności fluorescencji stają się coraz bardziej jednorodne i jednocześnie średnia intensywność fluorescencji jest już czterokrotnie mniejsza niż dla (a) (b) (c) Rys. 50. Histogramy intensywności fluorescencji z map przedstawionych na Rys. 49. Zielonym kolorem oznaczono histogram z mapy intensywności fluorescencji wzbudzanych światłem o długości fali λ = 556 nm, czerwonym natomiast λ = 808 nm dla odległości pomiędzy kompleksami LH2 a złotymi nanoprętami równymi (a) z = 30nm, (b) z = 15 nm, (c) z= 30 nm

116 nanostruktury o przekładce dielektrycznej z = 30 nm. Natomiast w przypadku wzbudzenia nanostruktury hybrydowej laserem o długości fali λ = 808 nm (Rys. 49(f)) mapy intensywności fluorescencji stają się jeszcze bardziej niejednorodne przy jednoczesnym wzroście średniej intensywności fluorescencji. Na Rys. 50 przedstawione są histogramy intensywności fluorescencji sporządzone dla map intensywności fluorescencji przedstawionych na Rys. 49. Kolorem zielonym zaznaczone są histogramy dla map intensywności fluorescencji otrzymanych przy wzbudzeniu nanostruktury laserem o długości fali λ = 556 nm, kolorem czerwonym oznaczone są histogramy map otrzymanych poprzez wzbudzenie nanostruktury laserem o długości fali λ = 808 nm. Wraz ze zmniejszaniem odległości pomiędzy składnikami nanostruktury widoczny jest wyraźny wzrost fluorescencji dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 808 nm. Zauważalny jest również wyraźny wzrost rozrzutu intensywności fluorescencji z LH2 umieszczonego w nanostrukturze hybrydowej wraz z zmniejszeniem odległości pomiędzy składnikami. Natomiast dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 556 nm widoczny jest spadek intensywności fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych. W tym wypadku rozrzut intensywności fluorescencji na mapach maleje wraz ze zmniejszeniem odległości pomiędzy składnikami nanostruktury hybrydowej. Wyznaczono średnie intensywności fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach wzbudzanych laserami o długościach fali λ = 556 nm oraz λ = 808 nm. Następnie wyznaczono współczynniki wzmocnienia fluorescencji nanostruktur hybrydowych. Otrzymane średnie intensywności fluorescencji podzielono przez średnią intensywność fluorescencji nanostruktury o przekładce krzemionkowej d = 30 nm. Wyniki obliczeń przedstawiono na Rys. 51(a). Widoczna jest, że zależność wzmocnienia intensywności fluorescencji w funkcji odległości pomiędzy kompleksami LH2 a złotymi nanoprętami ma inny charakter dla różnych wzbudzeń nanostruktur hybrydowych. Przy wzbudzeniu laserem o długości fali λ = 556 nm, który odpowiada poprzecznemu rezonansowi plazmonowemu nanoprętów, wzmocnienie intensywności fluorescencji ma charakter podobny do zaobserwowanego dla nanostruktur, w których skład wchodziły LH2 oraz sferyczne nanocząstki złota. Wraz ze zmniejszaniem się odległości pomiędzy LH

117 a złotymi nanoprętami intensywność fluorescencji rośnie i osiąga maksimum dla nanostruktury o przekładce dielektrycznej z = 10 nm. W tym przypadku współczynnik wzmocnienia fluorescencji wynosi 2.3±0.8. Dla odległości mniejszych niż z = 10 nm następuje częściowy nieradiacyjny przekaz energii do nanocząstek i dla odległości z = 5 nm pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami współczynnik wzmocnienia wynosi już 1.7± 0.6. Natomiast dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 556 nm, który odpowiada podłużnemu rezonansowi plazmonowemu w złotych nanoprętach, zależność wzmocnienia fluorescencji jest zupełnie inna. Widoczny jest wzrost intensywności fluorescencji dla nanostruktury o przekładce dielektrycznej o grubości z = 20 nm, współczynnik wzmocnienia w tym przypadku wynosi 1.2±0.4. Następnie dla odległości pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami mniejszych od z = 20 nm intensywność fluorescencji jest znacznie mniejsza niż dla próbki referencyjnej. Widoczne jest wygaszenie fluorescencji, które jest największe dla przekładki dielektrycznej o grubości z = 5 nm współczynnik wzmocnienia wynosi 0.4±0.3. Za widoczny spadek intensywności fluorescencji odpowiadać może silny przekaz energii z układu fotosyntetycznego LH2 do nanoprętów występujący już dla odległości mniejszych od z = 15 nm. (a) (b) Rys. 51. (a) Wykres współczynnika wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 w funkcji odległości kompleksów LH2 od złotych nanoprętów. Linią czerwoną oznaczono wzbudzenie światłem o długości fali λ=556 nm, czarną natomiast λ=808 nm. (b) Wykres zależności stosunku średnich intensywności fluorescencji LH2 map fluorescencji wzbudzanych światłem o długości fali λ=808 nm do map fluorescencji wzbudzanych światłem o długości fali λ=556 nm w funkcji odległości kompleksów LH2 od złotych nanoprętów

118 Na Rys. 51(b) przedstawiony jest wykres zależności stosunku średnich wartości intensywności otrzymanych z map intensywności fluorescencji nanostruktur hybrydowych złożonych z kompleksów LH2 ze złotymi nanoprętami. Wyznaczono średnie intensywności fluorescencji ze wszystkich otrzymanych map dla danego wzbudzenia i danej nanostruktury hybrydowej. Następnie otrzymane średnie wartości intensywności fluorescencji dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 808 nm dzielono przez średnie intensywności fluorescencji otrzymane dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 556 nm. Dla nanostruktury z przekładką dielektryczna o grubości z = 30 nm wartość średniej intensywności fluorescencji układów LH2 wzbudzanych laserem o długości fali λ = 808 nm jest 5±1 razy większa niż dla wzbudzenia laserem o długości fali λ = 556 nm. Wartość ta jest zgodna ze stosunkiem absorpcji układów fotosyntetycznych LH2 dla długości fali odpowiadających długości fali laserów użytych w eksperymencie. Stosunek intensywności rośnie wraz ze zmniejszaniem odległości pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami i osiąga maksimum dla nanostruktur z przekładką dielektryczną o grubości z = 10 nm wynosząc 24±8. Przy dalszym zbliżaniu składników nanostruktur stosunek ten maleje i dla odległości z = 5 nm wynosi 21±0,7. Wyniki te pokazują, że wzmocnienie czy też wygaszenie intensywności fluorescencji układów LH2 umieszczonych w nanostrukturze hybrydowej silnie zależy od tego czy wzbudzenie odpowiada rezonansowi poprzecznemu czy rezonansowi podłużnemu złotych nanoprętów. Wraz ze zmniejszaniem się odległości pomiędzy składnikami nanostruktury hybrydowej przy wzbudzeniu w rezonans podłużny nanoprętów zauważono wzmocnienie intensywności fluorescencji, natomiast przy wzbudzeniu w rezonans poprzeczny nanoprętów zaobserwowano gaszenie fluorescencji z układów fotosyntetycznych LH2. Spektroskopia czasowo-rozdzielcza fluorescencji Kolejnymi badaniami wpływu rezonansów plazmonowych złotych nanoprętów na zanik promienisty z układu fotosyntetycznego były pomiary czasowo-rozdzielcze fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych. Badano nanostruktury hybrydowe z przekładkami dielektrycznymi o grubościach z = 5 nm, z = 10 nm, z = 15 nm, z = 20 nm oraz z = 30 nm. Do pomiarów użyto lasera pikosekundowego o długości fali λ = 485 nm, który wzbudza poprzeczny rezonans

119 plazmonowy złotych nanoprętów oraz karotenoidy z układu fotosyntetycznego LH2. Moc lasera była ustalono na P = 5 µw. Pomiary wykonano przy wykorzystaniu mikroskopu konfokalnego, wyposażonego w obiektyw LMPlan 50x. Na Rys. 52 przedstawione są znormalizowane przebiegi czasowe fluorescencji LH2 z nanostruktur hybrydowych dla wzbudzenia światłem o długości fali λ = 485 nm. Aby poprawić czytelność rysunku wybrano przebiegi zaniku fluorescencji dla próbek z przekładkami dielektrycznymi o grubościach z = 30 nm, z = 10 nm oraz z = 5 nm. Nanostruktury hybrydowe, w których odległość pomiędzy kompleksami LH2 a złotymi nanoprętami jest równa lub większa od z = 15 nm nie wykazują zmian w mierzonych przebiegach czasowych fluorescencji. Natomiast dla nanostruktur, w których odległość pomiędzy złotymi nanoprętami a układami fotosyntetycznymi LH2 wynosi z = 10 nm oraz z = 5 nm, wykazują znaczne skrócenie czasu zaniku fluorescencji. Oznacza to, że dla odległości mniejszych niż z = 15 nm, występuje znaczne zwiększenie wydajności kwantowej emisji układu fotosyntetycznego, które wynika z oddziaływania emisji kompleksów fotosyntetycznych z rezonansem podłużnym występującym w złotych Rys. 52. Przebiegi czasowe intensywności fluorescencji LH2 znajdujących się w odległości z = 30 nm (zielona linia), z = 10 nm (czerwona linia), z = 5 nm od złotych nanoprętów dla wzbudzenia światłem o długości fali λ = 485 nm

120 nanoprętach. Na podstawie otrzymanych przebiegów zaników intensywności fluorescencji wyznaczono czasy życia fluorescencji LH2 w nanostrukturach hybrydowych. Ze względu na wielowykładniczy charakter zaników fluorescencji Tab. 2 Średnie czasy życia czasy życia wyznaczono, jako czas, po którym fluorescencji nanostruktur intensywność fluorescencji spadnie do poziomu hybrydowych złożonych z LH2 oraz złotych nanoprętów. początkowej wartości intensywności fluorescencji. Na Wzbudzenie λ = 485 nm. Rys. 53 odłożono wartości czasów zaniku fluorescencji LH2 umieszczonych w nanostrukturze hybrydowej w funkcji odległości pomiędzy układami fotosyntetycznymi a złotymi nanoprętami. Wyznaczone czasy zaników fluorescencji LH2 dla nanostruktur hybrydowych o grubości przekładki większej od z = 15 nm wykazują zbliżone wartości. Nanostruktury, w których odległość pomiędzy składnikami jest mniejsza niż z = 15 nm wykazują bardzo silne skrócenie czasu życia fluorescencji związane ze Rys. 53 Wartości wyznaczonych czasów zaniku fluorescencji LH2 w funkcji odległości od złotych nanoprętów. Wzbudzenie światłem o długości fali λ = 485 nm

121 zwiększeniem wydajności kwantowej fluorescencji układów fotosyntetycznych LH2 w obecności złotych nanoprętów. W nanostrukturze, w której zastosowano przekładkę krzemionkową o grubości z = 15 nm widoczny jest znacznie większy rozrzut wyznaczonych czasów zaników fluorescencji niż dla pozostałych nanostruktur. Średnio wartość zaniku fluorescencji jest porównywalna do średnich wartości czasów zaniku fluorescencji dla nanostruktur o grubszych warstwach krzemionki, jednak występują również wartości czasów życia fluorescencji, które są zbliżone do czasów życia fluorescencji otrzymanych dla nanostruktur o przekładkach krzemionkowych cieńszych niż z = 15 nm. Na podstawie otrzymanych wartości czasów zaniku fluorescencji kompleksów LH2 wyznaczono wartość średnią czasów zaniku fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych nanostrukturach hybrydowych. Wyniki zaprezentowano w Tab. 2. Średnie czasy życia fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych, w których odległość od złotych nanoprętów jest równa i wyższa niż z [nm] Rys. 54. Wykres wzmocnienia intensywności fluorescencji LH2 w funkcji odległości od złotych sferycznych nanocząstek złota (linia przerywana), złotych nanoprętów (linia ciagła)

122 z = 15 nm mają niemalże tę samą wartość, która jest są zbliżona do czasu zaniku fluorescencji układów fotosyntetycznych LH2. W celu wyznaczenia całkowitej intensywności fluorescencji z kompleksów LH2 umieszczonych w nanostrukturach hybrydowych na długości fali emisji λ = 870 nm wyznaczono całki pod krzywymi przebiegów czasowych intensywności fluorescencji. Następnie z otrzymanych intensywności fluorescencji wyznaczono wzmocnienie intensywności fluorescencji, które otrzymano poprzez podzielenie wszystkich wartości intensywności fluorescencji przez średnią wartość intensywności fluorescencji LH2 z nanostruktury o grubości warstwy dielektrycznej z = 30 nm. Na Rys. 54 przedstawiono zależność współczynnika wzmocnienia fluorescencji układów fotosyntetycznych LH2 w funkcji odległości od złotych nanoprętów (linia ciągła). Dla nanostruktur z przekładkami z = 15 nm, z = 20 nm nie zauważono zmian w intensywności fluorescencji w stosunku do próbki referencyjnej. Nanostruktura z przekładką dielektryczną z = 10 nm charakteryzuje się prawie trzykrotnym wzmocnieniem fluorescencji w stosunku do struktury referencyjnej. Dla mniejszych odległości pomiędzy składnikami widoczny jest wpływ nieradiacyjnego transferu energii z układów fotosyntetycznych LH2 do złotych nanoprętów objawiający się częściowym gaszeniem fluorescencji LH2. Dla porównania linią przerywaną przedstawiono współczynnik wzmocnienia fluorescencji układów fotosyntetycznych LH2 funkcji odległości od sferycznych nanocząstek złota. Średnie wzmocnienie fluorescencji kompleksów LH2 z nanostruktury, w której użyto złotych nanoprętów dla lasera o długości fali λ = 485 nm dla przekładki dielektrycznej z = 12 nm jest dwukrotnie mniejsze niż w analogicznym przypadku dla nanostruktury, w której zastosowano sferyczne nanocząstki złota Wnioski Przeprowadzono pomiary spektroskopowe nanostruktur hybrydowych złożonych ze złotych nanoprętów oraz układów fotosyntetycznych LH2, oddzielonych od siebie warstwą krzemionki o grubościach z = 5 nm, z = 10 nm, z = 15 nm, z = 20 nm oraz z = 30 nm. Z pomiarów map intensywności fluorescencji wynika, że wzbudzenie laserem o długości fali λ = 808 nm, które odpowiada podłużnemu rezonansowi plazmonowemu złotych

123 nanoprętów, powoduje podobną zależność intensywności fluorescencji od odległości pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami jak w przypadku nanostruktury, w której użyto sferycznych nanocząstek złota. Wraz ze zmniejszaniem się odległości pomiędzy LH2 a złotymi nanoprętami początkowo widoczny jest wzrost fluorescencji, i osiąga maksymalną wartość dla odległości z = 10 nm gdzie średnia intensywność fluorescencji jest dwukrotnie większa niż dla próbki referencyjnej. Dla odległości mniejszych niż z = 10 nm intensywność fluorescencji maleje, co jest związane z nieradiacyjnym przekazem energii z LH2 do złotych nanoprętów. Wzbudzenie fluorescencji kompleksów LH2 umieszczonych w pobliżu złotych nanoprętów bezpośrednio w poprzeczny rezonans plazmonowy nanoprętów światłem o długości fali λ = 556 nm powoduje, że wraz ze zmniejszaniem się odległości pomiędzy kompleksami LH2 a złotymi nanoprętami widoczne jest zmniejszanie się intensywności fluorescencji. Przeprowadzono pomiary zaników intensywności fluorescencji LH2 umieszczonych w obecności złotych nanoprętów. Zaobserwowano silne skrócenie czasu zaniku fluorescencji dla odległości mniejszych niż z = 15 nm. Gdy odległość pomiędzy układami fotosyntetycznymi LH2 a złotymi nanoprętami wynosiła z = 10 nm czas zaniku fluorescencji skrócił się trzykrotnie w stosunku do próbki referencyjnej. Dla odległości z = 5 nm czas zaniku jest dwukrotnie krótszy w stosunku do próbki referencyjnej. Zależność wzmocnienia fluorescencji LH2 wzbudzanej światłem o długości fali λ = 485 nm od odległości od złotych nanoprętów jest niemal analogiczna jak w przypadku zastosowania sferycznych nanocząstek złota przy wzbudzeniu w dużej odległości spektralnej od rezonansu plazmonowego. Za silne krócenie czasu zaniku fluorescencji oraz odmienny charakter zależności wzmocnienia fluorescencji odpowiedzialne jest silne oddziaływanie podłużnego rezonansu plazmonowego nanoprętów ze stałą szybkości zaniku promienistego układów fotosyntetycznych LH

124 Układy fotosyntetyczne LH2 sprzęgnięte ze srebrnymi nanotrójkątami Przeprowadzono badania wpływu odległości spektralnej rezonansu plazmonowego srebrnych nanotrójkątów od zaniku promienistego układów fotosyntetycznych LH2. Badano nanostruktury złożone ze srebrnych nanotrójkątów, których rezonanse plazmonowe występowały na długościach fali λ = 720 nm, λ = 800 nm, λ = 880 nm oraz układów fotosyntetycznych LH2 otrzymanych z Rps. Palustris. W przypadku tej nanostruktury hybrydowej nie zastosowano przekładki dielektrycznej, w związku, z czym brak jest kontroli odległości pomiędzy kompleksami LH2 a srebrnymi nanotrójkątami. Na Rys. 55 przedstawiono widma ekstynkcji srebrnych nanotrójkątów oraz układów fotosyntetycznych LH2. W badaniach wykorzystano nanotrójkąty o rezonansie plazmonowym występującym na długości fali λ = 880 nm, w tym przypadku spodziewane jest silne sprężenie rezonansu plazmonowego z zanikiem promienistym z układu fotosyntetycznego LH2. Użyto również nanotrójkątów, które posiadały rezonans plazmonowy na długości fali λ = 800 nm, w tym przypadku spodziewano się silnego oddziaływania rezonansu plazmonowego na absorpcję Rys. 55. Widma ekstynkcji układu fotosyntetycznego LH2 (linia niebieska) oraz srebrnych nanotrójkątów o rezonansach plazmonowych λ = 880 nm (linia czerwona), λ = 800 nm (linia zielona), λ = 720 nm (linia czarna). Czarnymi pionowymi liniami zaznaczono długości fali światła użytego do wzbudzenia fluorescencji LH2 (λ = 405 nm, λ = 480 nm, λ = 530 nm, λ = 640 nm)

125 pasma związanego z pierścieniem B800 układu fotosyntetycznego LH2, oraz częściowego sprzęgania się z zanikiem promienistym z pasma związanego z pierścieniem B850. Trzeci rodzaj badanych nanotrójkątów posiadał rezonans plazmonowy przypadający na długość fali λ = 720 nm. W tym wypadku spodziewamy się słabego oddziaływania z pasmem absorpcji B800 układów fotosyntetycznych oraz zaniedbywalnego oddziaływania z pasmem absorpcji B850, jak i zaniedbywalnego oddziaływania srebrnych nanotrójkątów na zanik promienisty z układu fotosyntetycznego LH2. Badania nanostruktur hybrydowych złożonych z kompleksów LH2 oraz srebrnych nanotrójkątów przeprowadzono wykorzystując mikroskop szerokiego pola. Mapy intensywności fluorescencji otrzymano wykorzystując obiektyw immersyjny o aperturze numerycznej wynoszącej NA = 1.4. Fluorescencję układów fotosyntetycznych wzbudzano czterema oświetlaczami LED. Oświetlacz emitujący światło o długości fali λ = 405 nm wzbudza pasmo Soret bakteriochlorofili. Oświetlacze emitujące światło o długości fali λ = 485 nm oraz λ = 530 nm wzbudzają pasmo związane z absorpcją karotenoidów. Natomiast oświetlacz emitujący światło o długości fali λ = 640 nm wzbudza niskoenergetyczną część pasma Q x bakteriochlorofili. Gęstość strumienia energii oświetlaczy diodowych ustalono na Φ = 10 W/cm 2. Mapy intensywności fluorescencji Na Rys. 56 przedstawiono przykładowe mapy intensywności fluorescencji. Na Rys. 56(a) przedstawiono mapę intensywności fluorescencji rozwirowanych układów fotosyntetycznych LH2. Fluorescencję wzbudzano światłem o długości fali λ = 640 nm. Koncentrację układów fotosyntetycznych dobrano tak, aby rozwirowane LH2 tworzyły warstwę równomiernie rozłożonych, a jednocześnie leżących blisko siebie pojedynczych układów fotosyntetycznych, co gwarantowało otrzymanie jednorodnych map intensywności fluorescencji. Przy koncentracjach układów fotosyntetycznych wyższych od gęstości optycznej OD 850 = cm -1 na mapach intensywności fluorescencji widoczne były obszary fluorescencji o znacznie większej intensywności, które ze względu na swój rozmiar utożsamiane były z aglomeratami pojedynczych LH2. Natomiast przy koncentracjach mniejszych od gęstości optycznej LH2 OD 850 = cm -1 widoczna była

126 fluorescencja z odseparowanych pojedynczych kompleksów LH2. Przedstawiona na Rys. 56(b) mapa intensywności fluorescencji z nanostruktury złożonej ze srebrnych nanotrójkątów o rezonansie plazmonowym na długości fali λ = 720 nm oraz układów fotosyntetycznych LH2. Podobnie jak na Rys. 56(a) widoczna jest fluorescencja z warstwy układów fotosyntetycznych, której średnia intensywność fluorescencji jest podobna do (a) (b) 10 µm 10 µm (c) (d) 10 µm 10 µm Rys. 56. (a) Mapa intensywności fluorescencji układów fotosyntetycznych, oraz mapy fluorescencji nanostruktur hybrydowych, których składnikiem są srebrne nanotrójkąty o rezonansach plazmonowych (b) 720 nm, (c) 800 nm, (d) 880 nm. Próbki wzbudzano oświetlaczem emitującym światło o długości fali λ= 630 nm