B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack

Transkrypt

1 B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack JAA(04) Polski PRZEZNACZENIE Działanie zestawu BD ProbeTec Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack, przeznaczonego do stosowania w systemie BD ProbeTec ET System, opiera się na technice Strand Displacement Amplification (SDA), pozwalającej na bezpośrednie wykrywanie jakościowe DNA kompleksu Mycobacterium tuberculosis, w odkażonych i poddanych trawieniu próbkach pochodzących z układu oddechowego, takich jak plwocina, plwocina indukowana, popłuczyny oskrzelowe i innych próbkach z układu oddechowego. Metoda BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Assay służy do bezpośredniej oceny próbek pochodzących od nieleczonych pacjentów, u których podejrzewa się gruźlicę. Pacjenci nieleczeni to ci, którzy: (1) nie otrzymywali leczenia przeciwgruźliczego, (2) nie byli poddani takiemu leczeniu w ciągu ostatnich 12 miesięcy lub (3) byli leczeni przez okres krótszy niż 7 dni. STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIE Około jedna trzecia światowej populacji ludzkiej jest zakażona Mycobacterium tuberculosis i obciążona 10% ryzykiem rozwoju choroby w ciągu całego życia. 1,2 Szacuje się, że rocznie gruźlica jest przyczyną 3 milionów zgonów, co stawia ją na pierwszym miejscu wśród chorób zakaźnych prowadzących do śmierci. 1,3 Powolny wzrost M. tuberculosis opóźnia rozpoznanie i wdrożenie leczenia, co przyczynia się do rozprzestrzeniania się choroby. Ośrodki Zapobiegania i Zwalczania Chorób USA (U.S. Centers for Disease Control and Prevention) zalecają, aby personel laboratoriów dołożył wszelkich starań, by stosować najszybsze dostępne metody wykrywania mykobakterii. 3 Zastosowanie metod amplifikacji DNA, takich jak SDA, umożliwia szybkie wykrywanie i identyfikację DNA kompleksu M. tuberculosis bezpośrednio w materiale pochodzącym od pacjenta, co pozwala na szybsze rozpoczęcie leczenia. Zestaw odczynnikowy do wykrywania kompleksu Mycobacterium tuberculosis (DTB) stosuje się w systemie BD ProbeTec ET System. W opisywanym systemie, w niezanieczyszczonych i strawionych próbkach pochodzących z układu oddechowego (materiał uzyskany metodą NACL-NaOH), do amplifikacji wykorzystano technikę homogennej SDA, a do wykrycia obecności kompleksu Mycobacterium tuberculosis technikę fluorescencyjnego przekazywania energii (ET). W skład kompleksu Mycobacterium tuberculosis wchodzą M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum i M. microti. 4,5 ZASADY PROCEDURY Metoda BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Assay opiera się na jednoczesnej amplifikacji i wykrywaniu poszukiwanego DNA, z zastosowaniem odpowiednich primerów i znakowanej fluorescencyjnie sondy detektorowej. 6-8 Odczynniki do przeprowadzenia reakcji SDA znajdują się w dwóch osobnych, jednorazowych mikrostudzienkach, w postaci liofilizowanej. Odpowiednio przygotowaną próbkę umieszcza się w mikrostudzience Priming Microwell, zawierającej primery do amplifikacji, znakowane fluorescencyjnie sondy detektorowe oraz pozostałe odczynniki. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną przenosi się do studzienki Amplification Microwell, zawierającej dwa enzymy (polimerazę DNA i endonukleazę restrykcyjną), konieczne do przeprowadzenia reakcji SDA. W celu uniknięcia kontaminacji uszczelnia się studzienki Amplification Microwells, a następnie inkubuje w sterowanym termicznie czytniku fluorescencyjnym, monitorującym reakcję pod względem wytwarzania produktów amplifikacji. W przebiegu każdej reakcji następuje amplifikacja i jednoczesna detekcja wewnętrznej kontroli amplifikacji (IAC, Internal Amplification Control). Próbę kontrolną stosuje się w celu potwierdzenia wiarygodności reakcji amplifikacji oraz wykrywania ewentualnej inhibicji amplifikacji, spowodowanej działaniem czynników zawartych w analizowanej próbce. Uzyskane wyniki przedstawia się jako dodatnie, ujemne lub nieoznaczalne. ODCZYNNIKI I MATERIAŁY Każdy zestaw odczynnikowy BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack zawiera: Mikrostudzienki DTB Priming Microwells, 3 x 32: 4 Oligonukleotydy 7,6 pmol; dntp 37,6 nmol; Sondy detektorowe 30 pmol; Oligonukleotyd syntetyczny kopii Mikrostudzienki DTB Amplification Microwells, 3 x 32: Enzym restrykcyjny 25,5 jednostek; Polimerazę DNA 8 jednostek; dntps 10 nmol Wyposażenie dodatkowe: 10 nakrywek, 8 torebek na odpady, 16 uszczelek Każdy zestaw BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Kit zawiera: Bufor płuczący (DTB Wash Buffer 1) 225 ml roztworu zawierającego mocznik, bufor CAPS Buffer, dimetylosulfotlenek, glicerol i wodorotlenek sodu; Bufor lityczny (DTB Lysis Buffer 2) 50 ml roztworu wodorotlenku potasu; Bufor zobojętniający (DTB Neutralization Buffer 3) 150 ml roztworu zawierającego bicynę, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek, glicerol i 0,03% Proclin (środek konserwujący). Każdy zestaw BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set zawiera: Próbę kontrolną dodatnią DTB Positive Control liofilizowane DNA izolowane z jąder łososia DNA 5 µg i 750 kopii oligonukleotydu syntetycznego przypadających na reakcję, w której ostateczna liczba kopii produktu wynosi Próbę kontrolną ujemną DTB Negative Control liofilizowane DNA izolowane z jąder łososia 5 µg. 1

2 Aparatura, wyposażenie i materiały zużywalne: Aparat BD ProbeTec ET z płytą, blok grzewczy BD ProbeTec ET, cieplarka BD ProbeTec ET Oven lub cieplarka laboratoryjej ogólnego przeznaczenia można ogrzewać próbkę do temperatury 101 C ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min, łaźnia ultradźwiękowa z wkładem BD ProbeTec ET, pipetor BD ProbeTec ET z zasilaniem, statyw na probówki o pojemności 2 ml (Sample Tube Rack), statyw na probówki (Clear Pipetting Rack), nakrętki i probówki o pojemności 2 ml, nakrętki na probówki 2 ml i zestaw BD ProbeTec ET Accessories Kit, wymazówki CultureSwab EZ Swabs. Materiały niezbędne, ale niedostarczane: Mikrowirówka z rotorami zawierającymi aerozol i standardowymi, osiągająca x g (np. Eppendorf Model 5417C Microcentrifuge), mieszadło, rękawiczki jednorazowe, pipety z końcówkami odpornymi na aerozol (z możliwością pobierania objętości 100 µl, 500 µl, 600 µl i 1 ml, 1% (v/v) podchloryn sodu z preparatem Alconox*, sterylne pojemniki (nadające się do przechowywania podzielonych objętości 3 buforów DTB Buffers), minutnik, prątkobójczy środek odkażający, tampony lub gaza absorbująca, kalibrowany termometr. *Dodać 7,5 g preparatu Alconox w przeliczeniu na 1 L 1% (obj./obj.) roztworu podchlorynu sodu (obj./obj.) i wymieszać. Warunki przechowywania i użytkowania: Zestawy DTB Reagent Pack można przechowywać w temperaturze 2 33 C. Nie stosować nieotwartych zestawów Reagent Pack po upływie daty ważności. Po otwarciu opakowania mikrostudzienki, o ile są właściwie uszczelnione, zachowują stabilność przez okres 4 tygodni lub, jeżeli otwarcie nastąpiło wcześniej, do daty ważności. Nie zamrażać. Odczynniki DTB służące do przetwarzania próbek można przechowywać w temperaturze 2 33 C. Nie stosować odczynników po upływie daty ważności. Nie zamrażać. Kontrole DTB można przechowywać w temperaturze 2 33 C. Nie stosować kontroli po upływie daty ważności. Nie zamrażać. OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI Do stosowania w diagnostyce in vitro. 1. Nie zbadano, czy opisywany test może być pomocny w wykrywaniu kompleksu M. tuberculosis w próbkach niepochodzących z układu oddechowego, w tym m.in. we krwi, płynie mózgowo-rdzeniowym, stolcu czy moczu. Nie oceniano opisywanego testu BD ProbeTec ET DTB Assay przy użyciu materiału uzyskanego innymi metodami niż opisywane. 2. Praca z próbkami i ich przetwarzanie, łącznie z etapem inaktywacji termicznej, powinna odbywać się w kabinie bezpieczeństwa mikrobiologicznego (BSC, Biological Safety Cabinet) klasy II. Wirowanie próbek przed etapem inaktywacji termicznej należy wykonywać wyłącznie z zastosowaniem rotorów zawierających aerozol. Rotor zawierający aerozol można otwierać jedynie w BSC. Próbki poddane inaktywacji termicznej można poddawać wirowaniu poza BSC tylko przy użyciu standardowego rotora. 3. Założyć hodowle z wszystkich przetwarzanych próbek w celu stwierdzenia ewentualnej obecności prątków innych niż gruźlicze (MOTT, Mycobacteria other than tuberculosis), wykonania badań wrażliwości na leki przeciwprątkowe, identyfikacji podgatunków kompleksu M. tuberculosis i (lub) określenia ich żywotności. 4. W materiale pochodzącym od pacjentów mogą być obecne drobnoustroje patogenne, w tym wirus zapalenia wątroby typu B i wirus HIV. Z tymi próbkami należy się zatem obchodzić jak z materiałem zakaźnym, stosując przyjęte procedury laboratoryjne 9,10,11 lub wytyczne obowiązujące w danej pracowni. 5. Nie zamieniać i nie mieszać mikrostudzienek, kontroli ani buforów do przetwarzania próbek, pochodzących z zestawów o różnych numerach seryjnych. 6. Przestrzegać przyjętych praktyk laboratoryjnych dotyczących usuwania zużytych końcówek pipet, probówek na próbki, nakrywek mikrostudzienek i innych odpadów. 7. Do przenoszenia przygotowanych próbek do mikrostudzienek Priming Microwells i przenoszenia próbek z mikrostudzienek Priming Microwells do mikrostudzienek Amplification Microwells używać wyłącznie pipetora BD ProbeTec ET Pipettor i końcówek BD ProbeTec ET Pipette. 8. Otwarte opakowania z odczynnikami zawierające niewykorzystane mikrostudzienki Priming Microwells i Amplification Microwells MUSZĄ zostać starannie ponownie uszczelnione. Przed ponownym uszczelnieniem upewnić się, czy w opakowaniu odczynnikowym znajduje się środek osuszający. 9. Przed przeniesieniem płytki zawierającej mikrostudzienki Amplification Microwells z bloku grzewczego BD ProbeTec ET do aparatu BD ProbeTec ET NALEŻY koniecznie całkowicie je zakleić uszczelką przeznaczoną do mikrostudzienek Amplification Microwells. Uszczelnienie jest konieczne w celu uniknięcia kontaminacji aparatu i miejsca pracy produktami amplifikacji. W żadnym wypadku nie usuwać z mikrostudzienek materiału uszczelniającego. 10. Jeżeli rozmiary płytki testowej przekraczają 6 kolumn (> 48 próbek i kontroli), w celu uniknięcia ewentualnej kontaminacji należy koniecznie użyć CAŁEGO arkusza materiału uszczelniającego mikrostudzienki Amplification Microwells. 11. Aby uniknąć kontaminacji środowiska pracy produktami amplifikacji, należy stosować torebki na odpady dostarczone w celu usuwania uszczelnionych mikrostudzienek Amplification Microwells po ukończeniu procedury testowej. 12. W celu uniknięcia krzyżowej kontaminacji próbek należy ZMIENIAĆ R KAWICZKI w trakcie wyszczególnionych etapów przetwarzania próbki i procedury testowej. W przypadku kontaktu rękawiczek z próbką należy je natychmiast zmienić, aby uniknąć kontaminacji pozostałych próbek. 13. W przypadku kontaminacji przetwarzaną próbką miejsca pracy lub aparatury należy gruntownie przemyć strefę kontaminacji 1% (v/v) roztworem podchlorynu sodu z preparatem Alconox i spłukać dokładnie wodą dejonizowaną lub destylowaną. Przed przystąpieniem do dalszych czynności należy odczekać, aż powierzchnia będzie całkowicie sucha. 14. Całą strefę roboczą (powierzchnie blatów i urządzeń) należy codziennie zmywać 1% roztworu podchlorynu sodu z preparatem Alconox. Dokładnie spłukać wodą dejonizowaną lub destylowaną. Przed przystąpieniem do dalszych etapów testu należy odczekać, aż powierzchnia będzie całkowicie sucha. 2

3 15. Mikrostudzienki Priming Microwells z pozostałym płynem (po przeniesieniu płynu z mikrostudzienek Priming Microwells do Amplification Microwells) mogą stanowić źródło kontaminacji. Przed usunięciem Priming Microwells należy starannie uszczelnić mikrostudzienki. 16. Nie wkładać palców lub dłoni do łaźni ultradźwiękowej, gdy łaźnia jest WŁĄCZONA. W przeciwnym wypadku może wystąpić uczucie dyskomfortu i podrażnienia skóry oraz uszkodzenie tkanek miękkich. 17. W celu sprawdzenia temperatury łaźni ultradźwiękowej Sonic Bath nie należy stosować termometru rtęciowego. Do tego celu dostarczono termometr cyfrowy. 18. W przypadku wystąpienia niecodziennych sytuacji, takich jak wylanie płynu do wnętrza aparatu BD ProbeTec ET lub kontaminacja DNA, której nie można się pozbyć przez mycie, należy się skontaktować z obsługą techniczną. 19. W przypadku korzystania z cieplarki laboratoryjnej ogólnego przeznaczenia należy postępować zgodnie z odpowiednimi instrukcjami użytkownika oraz środkami ostrożności. 20. Podczas pracy z próbkami i/lub inaktywacji termicznej należy stosować zatwierdzone procedury laboratoryjne. Numer katalogowy Opis Zestaw BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, dziesięć butelek 75 ml roztworu NALC-NaOH i 5 opakowań buforu fosforanowego Zestaw BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, dziesięć butelek 150 ml roztworu NALC-NaOH i 10 opakowań buforu fosforanowego. Niebezpieczeństwo H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. P260 Nie wdychać pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ ochronę twarzy. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P303+P361+P353 W PRZYPADKU KONTATKU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/międzynarodowymi przepisami. Numer katalogowy Opis Zestaw do przetwarzania próbek BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit. Uwaga H315 Działa drażniąco na skórę. H319 Działa drażniąco na oczy. H335 Może powodować podrażnienie dróg oddechowych. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ochronę twarzy. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P312 W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OS RODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P403+P233 Przechowywać w dobrze wentylowanym miejscu. Przechowywać pojemnik szczelnie zamknięty. P501 Zawartość/ pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/międzynarodowymi przepisami. Niebezpieczeństwo H302 Działa szkodliwie po połknięciu. H314 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. P260 Nie wdychać pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy. P280 Stosować rękawice ochronne/odzież ochronną/ochronę oczu/ ochronę twarzy. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P303+P361+P353 W PRZYPADKU KONTATKU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/międzynarodowymi przepisami. Uwaga H302 Działa szkodliwie po połknięciu. P264 Dokładnie umyć po użyciu. P301+P312 W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: W przypadku złego samopoczucia skontaktować się z OS RODKIEM ZATRUĆ lub z lekarzem. P501 Zawartość/pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi/regionalnymi/krajowymi/ międzynarodowymi przepisami. 3

4 POBIERANIE PRÓBEK I OBCHODZENIE SI Z NIMI Wszystkie próbki należy pobierać i transportować zgodnie z zaleceniami CDC, podręcznikiem Clinical Microbiology Procedures Handbook lub podręcznikiem procedur laboratoryjnych, obowiązującym w laboratorium Użytkownika. 1,8 TRAWIENIE, ODKAŻANIE I ZAG SZCZANIE MATERIAŁU Próbki należy przetwarzać z zastosowaniem metody NALC-NaOH, zgodnie z wytycznymi CDC zawartymi w Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory. 1 Ewentualnie można stosować zestaw BBL MycoPrep, przeznaczony do przetwarzania próbek zawierających prątki (zobacz część Dostępność ). UWAGA: Jeżeli testu BD ProbeTec ET Assay nie wykonuje się natychmiast, osady NALC/NaOH można przechowywać w następujący sposób: (a) W temperaturze 2 8 C przez okres do 5 dni. (b) Przy okresie dłuższym niż 5 dni przechowywać w temperaturze -20 C lub niższej (nie w sposób cykliczny), przez okres do trzech miesięcy. W celu przygotowania do wykonania testu BD ProbeTec ET DTB zamrożone osady należy odmrażać w temperaturze pokojowej. PROCEDURA PRZYGOTOWANIA PRÓBKI A. Przygotowywanie próbki do testu BD ProbeTec ET DTB na zewnątrz BS 1. Bufory stosowane do przetwarzania próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszać przed użyciem. W celu uniknięcia kontaminacji roztworów podstawowych buforów należy rozdzielić bufory w równych i wystarczających ilościach do odpowiednio oznakowanych, sterylnych pojemników, w następujący sposób: a. Bufor płuczący (DTB Wash Buffer 1) 1 ml na osad NALC-NaOH oraz dodatkowe 1 2 ml w celu ułatwienia pipetowania. b. Bufor lityczny (DTB Lysis Buffer 2) 0,1 ml na osad NALC-NaOH i próby kontrolne oraz dodatkowo 0,5 1 ml w celu ułatwienia pipetowania. c. Bufor zobojętniający (DTB Neutralization Buffer 3) 0,6 ml na osad NALC-NaOH i próby kontrolne oraz dodatkowo 0,5 1 ml w celu ułatwienia pipetowania. d. W celu uniknięcia kontaminacji buforów nie wlewać pozostałości buforu z powrotem do butelek. 2. Używać etykiet dostarczanych razem z probówkami na materiał. Dla każdego osadu przeznaczonego do dalszego przetwarzania oznakować jedną probówkę o pojemności 2 ml. 3. Zdjąć nakrętki z probówek i odpipetować po 1,0 ml buforu płuczącego DTB Wash Buffer 1 do każdej z probówek. Ponownie zamknąć probówki. 4. Przenieść probówki do BSC. B. Przygotowanie próbek osadu NALC-NaOH do testu BD ProbeTec ET DTB wewnątrz BSC UWAGA: Przed przystąpieniem do zlewania płynu znad osadu przygotować pojemnik na skażone mikrobiologicznie odpady płynne. 1. Wstrząsać pierwszy osad NALC-NaOH przez 5 s. 2. Pipetą zaopatrzoną w nową końcówkę oporną na aerozol przenieść 500 µl osadu NALC-NaOH do odpowiednio oznaczonej probówki, zawierającej 1 ml buforu płuczącego DTB Wash Buffer. 3. Ponownie mocno zamknąć probówkę. 4. Powtarzać etapy 1 do 3 dla każdego osadu NALC-NaOH. 5. ZMIENIĆ R KAWICZKI. 6. Wstrząsać każdą probówkę przez 5 s. 7. Umieścić wszystkie probówki w rotorze zawierającym aerozol, a następnie mocno zamknąć pokrywę powstrzymującą aerozol. Wytrzeć zewnętrzną powierzchnię rotora ręcznikami lub gazą zwilżonymi roztworem przeciwbakteryjnym. 8. Przenieść rotor zawierający aerozol do mikrowirówki. Wirować próbki przy x g, przez 3 min. UWAGA: Należy zachować opisane warunki wirowania, ponieważ niedostateczne odwirowanie próbek może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. 9. Bezpośrednio po odwirowaniu ostrożnie wyjąć rotor z mikrowirówki (nie przerywając szczelnej uszczelki aerozolu) i przenieść go ponownie do BSC. 10. Usunąć pokrywę powstrzymującą aerozol i natychmiast wyjąć próbki z rotora, starając się unikać ponownego mieszania nadsączu i osadu. 11. Otworzyć pierwszą próbkę i zlać nadsącz do pojemnika na skażone mikrobiologicznie odpady płynne w BSC. Odwracać probówkę łagodnym ruchem; na zakończenie strzepnąć w dół odwróconą probówkę. UWAGA: Wraz z upływem czasu może następować oddzielanie się osadu. Bezzwłocznie wykonywać etapy 9, 10 i Ponownie mocno zatkać probówkę i wstawić ją do statywu na probówki o pojemności 2 ml Sample Tube Rack. 13. Powtórzyć etapy 11 i 12 dla wszystkich próbek. 14. ZMIENIĆ R KAWICZKI. C.1. Ogrzewanie próbki cieplarka BD ProbeTec ET Oven. UWAGI: Dopilnować, by probówki były mocno zamknięte. Przed ogrzaniem próbek w cieplarce wzrokowo skontrolować nakrętki probówek i upewnić się, że okrągłe pierścienie uszczelniające są prawidłowo umiejscowione. Jeżeli pierścienie uszczelniające są zniekształcone lub ich brakuje, należy zmienić nakrętkę na nową. 4

5 Pełna instrukcja obsługi, obejmująca odpowiednie przestrogi i ostrzeżenia, znajduje się w podręczniku użytkownika BD ProbeTec ET System. 1. Wstawić statyw Sample Tube Rack przeznaczony na próbki o pojemności 2 ml do cieplarki i zamknąć drzwiczki. 2. Wybrać RUN #01. Wcisnąć OK. 3. W celu uruchomienia urządzenia wcisnąć START. 4. Po rozpoczęciu ogrzewania wykonać następujące czynności: a. Przygotować łaźnię ultradźwiękową BD ProbeTec ET Sonic Bath, wykonując następujące czynności: (1) Umieścić wkład łaźni ultradźwiękowej Sonic Bath w jej wnętrzu. (2) Napełnić gorącą wodą z kranu łaźnię Sonic Bath do linii Maximum. (UWAGA: Nie stosować wody dejonizowanej.) (3) Ustawić temperaturę na 65 C i włączyć ogrzewacz. (4) Po zamknięciu pokrywy łaźni wodnej włączyć łaźnię ultradźwiękową na 60 min (ustawienie domyślne). b. Umocować w mikrowirówce standardowy rotor. 5. Po 15 min cyklu ogrzewania, sprawdzić temperaturę na zewnętrznym termometrze cieplarki, by upewnić się, że wynosi 95 C. 6. Po zakończeniu cyklu ogrzewania aparat wygeneruje sygnał dźwiękowy, a na wyświetlaczu ciekłokrystalicznym pojawi się komunikat o zakończeniu cyklu ( DONE ). Zwolnić blokadę drzwiczek, wciskając przycisk OPEN DOOR, a następnie wyjąć statyw z probówkami o pojemności 2 ml. UWAGA: Wszystkie prątki obecne w probówkach z próbkami są unieszkodliwione (pozbawione żywotności), dlatego następne etapy mogą mieć miejsce na zewnątrz BSC. Próbki należy jednak traktować jak potencjalne źródło skażenia mikrobiologicznego. C.2. Ogrzewanie próbki cieplarka ogólnego przeznaczenia UWAGI: Należy dopilnować, by probówki na próbki były mocno zamknięte. Przed ogrzaniem próbek w cieplarce należy wzrokowo skontrolować nakrętki probówek i upewnić się, że okrągłe pierścienie uszczelniające są prawidłowo umiejscowione. Jeżeli pierścienie uszczelniające są zniekształcone lub ich brakuje, należy zmienić nakrętkę na nową. Pełna instrukcja obsługi obejmująca odpowiednie przestrogi i ostrzeżenia znajduje się w podręczniku użytkownika cieplarki. 1. Wstawić statyw na próbki o pojemności 2 ml do cieplarki i zamknąć drzwiczki. 2. Temperatura próbki musi osiągnąć 101 C ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min. Proszę przestrzegać odpowiednich instrukcji dotyczących czasu i temperatury inkubacji. 3. Podczas ogrzewania próbek w cieplarce należy wykonać następujące czynności: a. Przygotować łaźnię ultradźwiękową BD ProbeTec ET Sonic Bath wykonując następujące czynności: (1) Umieścić wkład łaźni ultradźwiękowej Sonic Bath w jej wnętrzu. (2) Napełnić gorącą wodą z kranu łaźnię Sonic Bath do linii Maximum. (UWAGA: Nie należy stosować wody dejonizowanej). (3) Ustawić temperaturę na 65 C i włączyć ogrzewacz. (4) Po zamknięciu pokrywy łaźni wodnej włączyć łaźnię ultradźwiękową na 60 min (ustawienie domyślne). b. Umocować w mikrowirówce standardowy rotor. 4. Po zakończeniu cyklu ogrzewania w cieplarce wyjąć statyw 2 ml. OSTRZEŻENIE. Ze statywem próbki nie należy pracować bez odpowiednich środków ochrony osobistej. Zaniechanie tego może być przyczyną oparzeń. UWAGA: Wszystkie prątki obecne w probówkach z próbkami są unieszkodliwione (pozbawione żywotności), dlatego następne etapy mogą mieć miejsce na zewnątrz BSC. Próbki należy jednak traktować jak potencjalne źródło skażenia mikrobiologicznego. D. Liza próbki łaźnia ultradźwiękowa BD ProbeTec ET Sonic Bath OSTRZEŻENIE: Nie wkładać palców lub dłoni do łaźni ultradźwiękowej, gdy ultradźwięki są WŁĄCZONE. W przeciwnym wypadku może wystąpić uczucie dyskomfortu i podrażnienia skóry oraz uszkodzenie tkanek miękkich. OSTRZEŻENIE: W celu sprawdzenia temperatury łaźni ultradźwiękowej nie należy stosować termometru rtęciowego. Do tego celu dostarczono termometr cyfrowy. UWAGA: Pełna instrukcja obsługi, obejmująca odpowiednie przestrogi i ostrzeżenia, znajduje się w podręczniku dla użytkownika BD ProbeTec ET System. 1. Wstawić probówki do mikrowirówki ze standardowym rotorem. 2. Zamknąć pokrywę i włączyć wirówkę na 10 s. 3. Wyjąć probówki z wirówki i sprawdzić obecność wody na zakrętkach probówek. Jeżeli na zakrętce jest widoczne skroplenie, należy powtórzyć wirowanie. 4. Ponownie umieścić probówki w statywie 2 ml. 5. Zdjąć nakrętkę z pierwszej probówki. Stosując pipetor z końcówką odporną na aerozol, dodać do probówki 100 µl buforu DTB Lysis Buffer 2. Ponownie zatkać probówkę z próbką, mocno dociskając nakrętkę. 6. Powtórzyć procedurę w odniesieniu do wszystkich próbek, w każdym przypadku stosując nową końcówkę. 5

6 7. ZMIENIĆ R KAWICZKI. 8. Każdą próbówkę wstrząsać przez 5 s. Po ponownym wstawieniu probówek do statywu należy się upewnić, czy są mocno domknięte, a następnie wcisnąć probówkę w ten sposób, by jej wierzch znalazł się we wcięciu otworu statywu. Tak ustawione probówki są poddane maksymalnemu działaniu ultradźwięków. 9. WYŁĄCZYĆ ultradźwięki i upewnić się, że poziom wody we wkładzie łaźni mieści się pomiędzy liniami oznaczającymi poziom minimalny ( Minimum ) i maksymalny ( Maximum ). W zależności od potrzeb dodać gorącej wody z kranu lub odjąć nadmiar wody. Sprawdzić temperaturę łaźni ultradźwiękowej, używając termometru cyfrowego, by upewnić się, że wynosi 65 +/- 5 C. Wyjąć termometr z łaźni. 10. Przenieść statyw 2 ml do wkładu (Sonic Bath Insert). Ponownie zamknąć pokrywę łaźni ultradźwiękowej. 11. Ustawić minutnik łaźni ultradźwiękowej na 45 min, a następnie WŁĄCZYĆ ultradźwięki. 12. Po zakończeniu sonifikacji WYŁĄCZYĆ łaźnię z ultradźwiękami i wyjąć statyw 2 ml. W celu wysuszenia umieścić statyw na papierowych pochłaniających ręcznikach. E. Zobojętnianie próbki 1. Wstawić probówki do mikrowirówki ze standardowym rotorem. 2. Zamknąć pokrywę i włączyć wirówkę na 10 s. 3. Wyjąć probówki z wirówki i sprawdzić obecność wody na zakrętkach probówek. Jeżeli na zakrętce jest widoczne skroplenie, należy powtórzyć wirowanie. 4. Wstawić probówki do statywu (Clear Pipetting Rack). 5. Zdjąć nakrętkę z pierwszej probówki. Stosując pipetor z końcówką odporną na aerozol, dodać do probówki 600 µl buforu zobojętniającego DTB Neutralization Buffer 3. Ponownie zatkać probówkę z próbką, mocno dociskając nakrętkę. 6. Powtórzyć procedurę w odniesieniu do wszystkich probówek, w każdym przypadku stosując nową końcówkę. 7. ZMIENIĆ R KAWICZKI. 8. Wszystkie probówki należy wstrząsać przez 5 s. 9. Odwirować próbki, postępując zgodnie z etapami 1 3 wymienionymi powyżej. 10. Ponownie wstawić probówki do statywu (Clear Pipetting Rack). 11. Przygotowane w ten sposób próbki analizuje się przy użyciu metody BD ProbeTec ET System. UWAGA: Jeżeli badania nie wykonano natychmiast, przygotowane próbki można przechowywać w następujący sposób: a) W temperaturze C przez okres do 12 h. b) W temperaturze 2 8 C przez okres do 4 dni. Przed wykonaniem testu próbki należy ponownie ogrzać w cieplarce BD ProbeTec ET Oven lub cieplarce laboratoryjej ogólnego przeznaczenia można ogrzewać próbkę do temperatury 101 C ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min. c) Próbki zamrożone w temperaturze -20 C lub niższej (nie w sposób cykliczny) przez okres do trzech miesięcy. Przed wykonaniem testu zamrożone próbki należy odmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie ogrzać w cieplarce BD ProbeTec ET Oven lub cieplarce laboratoryjej ogólnego przeznaczenia można ogrzewać próbkę do temperatury 101 C ± 1 C przez minimum 30 min i maksymalnie 35 min. d) Po ponownym ogrzaniu probówek (zgodnie z opisanymi powyżej etapami b i c umieścić je w mikrowirówce wyposażonej w standardowy rotor. Zamknąć pokrywę i włączyć wirówkę na 10 s. Wyjąć probówki z wirówki i sprawdzić obecność wody na zakrętkach probówek. Jeżeli na zakrętce jest widoczne skroplenie, należy powtórzyć wirowanie. Wstawić probówki do statywu (Clear Pipetting Rack). Gotowe próbki bada się przy użyciu testów BD ProbeTec ET System. PROCEDURA TESTOWA A. Przygotowanie aparatu 1. Przed rozpoczęciem oznaczenia włączyć aparat i odczekać, aż osiągnie temperaturę roboczą. a. Blok grzewczy nagrzewa się i stabilizuje po około 90 min. Wartość nastawcza składowej (Priming) bloku grzewczego wynosi 72,5 C. Wartość nastawcza składowej (Warming) bloku grzewczego wynosi 54 C. b. Aparat BD ProbeTec ET jest sterowany programowo; czas osiągnięcia temperatury roboczej wynosi około 30 min. 2. Przed rozpoczęciem oznaczenia należy sprawdzić temperatury bloku grzewczego. Termometr bloku grzewczego Priming powinien wskazywać temperaturę C. Termometr bloku grzewczego Warming powinien wskazywać temperaturę 53,5 54,5 C. 3. Sprawdzić temperaturę wyświetlaną na ekranie aparatu BD ProbeTec ET. Powinna ona wynosić 47,5 55,0 C. B. Pipetor BD ProbeTec ET Pipettor Szczegółowe wyjaśnienia funkcji klawiatury pipetora BD ProbeTec ET Pipettor znajdują się w podręczniku dla użytkownika BD ProbeTec ET System. Do wykonania oznaczenia DTB Assay niezbędne są następujące programy. Program 1 służy do przenoszenia płynu z przetworzonych próbek do mikrostudzienek Priming Microwells. Program 5 służy do przenoszenia płynu z mikrostudzienek Priming Microwells do mikrostudzienek Amplification Microwells. 6

7 Zaprogramować pipetor w następujący sposób: Program 1: 1. WŁĄCZYĆ pipetor. Pipetor emituje pojedynczy sygnał dźwiękowy, przez chwilę wyświetla się ZERO i Software Version # (wersja oprogramowania), a następnie jest emitowany kolejny sygnał dźwiękowy. 2. Wcisnąć niebieski przycisk Prog (program). Aby wybrać program 1, należy wcisnąć i przytrzymać przycisk Vol (objętość), aż wyświetli się 1. Wcisnąć Enter. 3. Aby przejść do trybu programowania, wcisnąć i przytrzymać przycisk Prog. Przytrzymując wciśnięty przycisk Prog, wcisnąć specjalny przycisk funkcyjny, używając końcówki pipety lub spinacza do papieru. 4. Wcisnąć Fill (pobieranie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 200. Wcisnąć Enter. 5. Wcisnąć Disp (dozowanie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 150. Wcisnąć Enter. 6. Wcisnąć Purge (czyszczenie). Wcisnąć Enter. 7. W celu zapisania danych i zakończenia programu ponownie wcisnąć Enter. Pipetor powinien wyemitować sygnał dźwiękowy potwierdzający zakończenie programowania. 8. Zweryfikować program, wciskając przycisk pozwalający na przejrzenie wszystkich etapów. Po zakończeniu poszczególnych etapów należy ustawić prędkość pobierania/dozowania za pomocą przycisku Vol (objętość). Na każdym etapie wyświetlany jest wskaźnik prędkości (Speed). Stosując przycisk Vol, nastawić wskaźnik prędkości, tak aby wyświetlał 2 kwadraty dla etapów Fill (napełnianie) i Disp (dozowanie) oraz 3 kwadraty dla etapu Purge (usuwanie). Program 5 1. Wcisnąć przycisk Prog (program). Aby wybrać program 5, należy wcisnąć i przytrzymać przycisk Vol, aż wyświetlone zostanie 5. Wcisnąć Enter. 2. Aby przejść do trybu programowania, wcisnąć i przytrzymać przycisk Prog. Przytrzymując wciśnięty przycisk Prog, wcisnąć specjalny przycisk funkcyjny, używając końcówki pipety lub spinacza do papieru. 3. Wcisnąć Fill. Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 100. Wcisnąć Enter. 4. Wcisnąć Disp. Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 100. Wcisnąć Enter. 5. Wcisnąć Mix (mieszanie). Wcisnąć przycisk strzałki w górę, aż zostanie wyświetlone 50. Wcisnąć Enter. 6. W celu zapisania danych i zakończenia programu ponownie wcisnąć Enter. Pipetor powinien wyemitować sygnał dźwiękowy potwierdzający zakończenie programowania. 7. Zweryfikować program wcisnąć przycisk zwalniający, by przejrzeć wszystkie etapy. Po zakończeniu poszczególnych etapów należy ustawić prędkość pobierania, dozowania i mieszania za pomocą przycisku Vol (objętość). Na każdym etapie jest wyświetlany wskaźnik prędkości (Speed). Stosując przycisk Vol, nastawić wskaźnik prędkości, tak aby wyświetlał 2 kwadraty dla etapów aspiracji i dozowania. Stosując przycisk Vol, nastawić wskaźnik prędkości, tak aby wyświetlał 3 kwadraty. Przegląd programów Przed rozpoczęciem procedury należy dokonać przeglądu programów. W celu dokonania przeglądu programów należy WŁĄCZYĆ pipetor. Wcisnąć niebieski przycisk Prog (program). Wcisnąć i przytrzymać przycisk Vol (objętość) aż do wyświetlenia numeru przeglądanego programu. Wcisnąć przycisk Enter. Aby przejść przez wszystkie etapy programu, wcisnąć przycisk zwalniający pipetora. Program 1: Program obejmuje pobieranie 200 µl i dozowanie 150 µl. Na wyświetlaczu pipetora powinny być wyświetlane następujące dane: Fill 200 µl S II Dispense 150 µl S II Purge S III W ten sam sposób należy dokonać przeglądu Programu 5: Program 5: Program obejmuje pobranie 100 µl, dozowanie 100 µl i trzykrotne mieszanie 50 µl. Na wyświetlaczu pipetora powinny być wyświetlane następujące dane: Fill 100 µl S II Dispense 100 µl S II Mix 50 µl S III Zero (jest wyświetlane pulsująco) C. Układ płytki Po wprowadzeniu do systemu typu (-ów) oznaczenia, danych identyfikacyjnych próbek, numerów seryjnych kontroli i numerów seryjnych zestawu, aparat BD ProbeTec ET wyświetla raport o układzie płytki. Raport o układzie płytki przedstawia przestrzenne rozmieszczenie próbek i próbek kontrolnych na każdej badanej płytce. Rozmieszczenie ma zastosowanie zarówno do płytki Priming Microwell, jak i płytki Amplification Microwell. Mikrostudzienki Priming Microwells przeznaczone do oznaczenia DTB są jednolicie pomarańczowe, natomiast mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji (Amplification Microwells) mają pomarańczowe paski. D. Przygotowanie kontroli oznaczenia UWAGA: Przed użyciem próby kontrolnej BD ProbeTec ET DTB bufor lityczny DTB Lysis Buffer 2 i bufor neutralizujący DTB Neutralization Buffer 3 powinny być ogrzane do temperatury pokojowej. Do przygotowania próbki należy używać buforów wcześniej rozdzielonych. Wymieszać przed użyciem. 7

8 1. Dla każdego planowanego cyklu testu (dla każdej płytki) należy przygotować jedną probówkę kontrolną ujemną i jedną dodatnią. Jeżeli płytka zawiera zestawy DTB Reagent Pack o więcej niż jednym numerze seryjnym, należy wykonać test kontroli dla każdego numeru seryjnego. 2. Zdjąć nakrętkę z ujemnej probówki kontrolnej: a. Używając nowej końcówki pipety, dodać 100 µl buforu litycznego DTB Lysis Buffer 2. b. Używając nowej końcówki pipety, dodać 600 µl buforu litycznego DTB Lysis Buffer Ponownie mocno zamknąć probówkę i mieszać przez 5 s. 4. Zdjąć nakrętkę z dodatniej probówki kontrolnej: a. Używając nowej końcówki pipety, dodać 100 µl buforu litycznego DTB Lysis Buffer 2. b. Używając nowej końcówki pipety, dodać 600 µl buforu litycznego DTB Lysis Buffer Ponownie mocno zamknąć probówkę i mieszać przez 5 s. 6. Wstawić probówki kontrolne do mikrowirówki ze standardowym rotorem. Zamknąć pokrywę i włączyć wirówkę na 10 s. Wyjąć probówki z wirówki i wstawić do statywu Clear Pipetting Rack. E. Procedura testowa 1. Zdjąć i odrzucić nakrętki z probówek z próbkami do badania i z próbkami kontrolnymi przeznaczonych do pierwszego cyklu. 2. ZMIENIĆ R KAWICZKI. 3. Posługując się raportem o układzie płytki, przygotować płytkę mikrostudzienek Priming Microwell. 4. Ponownie uszczelnić opakowanie mikrostudzienek Priming Microwell, stosując następującą procedurę. a. Umieścić opakowanie na równej powierzchni. Jedną ręką trzymać otwarty koniec płytki. b. Naciskając płytkę, przesuwać palec wzdłuż zewnętrznej strony uszczelnienia, poruszając się od jednej do drugiej krawędzi opakowania. c. Dopilnować, by opakowanie było wystarczająco uszczelnione. 5. Wybrać Program 1 na pipetorze BD ProbeTec ET. 6. Pobrać końcówki pipet. Rozwinąć pipetor poprzez całkowite wyciągnięcie pokrętła regulującego. UWAGA: Aby uniknąć przecieku, należy się upewnić, że końcówki są pewnie umocowane na pipetorze. UWAGA: Podczas pobierania próbek należy uważać, aby nie pobrać resztek osadu. W przeciwnym wypadku może dojść do zatkania końcówki pipety i zafałszowania wyników testu. 7. Pobrać 200 µl z pierwszej kolumny próbek. 8. Naciskając delikatnie pipetor, dotknąć końcówkami pipet ścianek studzienek i wprowadzić 150 µl roztworu do pierwszej kolumny mikrostudzienek Priming Microwells (1A-H). Uwaga: Aby zapewnić dokładność i precyzję oraz uniknąć krzyżowej kontaminacji, należy dozować płyny na wewnętrzne ścianki mikrostudzienek. 9. Wyrzucić końcówki. Wcisnąć przycisk pipetowania w celu wyzerowania pipetora. 10. Pobrać nowe końcówki, rozwinąć pipetor i pobrać 200 µl z drugiej kolumny próbek. 11. Naciskając delikatnie pipetor, dotknąć końcówkami pipety ścianek studzienek i wprowadzić 150 µl do drugiej kolumny mikrostudzienek Priming Microwells (2A-H). UWAGA: Nie należy naciskać pipetora nad próbkami ani mikrostudzienkami, ponieważ może to spowodować kontaminację. Wykonywanie gwałtownych ruchów może spowodować powstawanie kropelek i aerozoli. 12. Wyrzucić końcówki. UWAGA: Końcówki należy odrzucać ostrożnie, aby uniknąć powstawania kropelek i aerozoli mogących powodować kontaminację miejsca pracy. 13. Kontynuować przenoszenie pozostałych próbek przeznaczonych do danego cyklu. 14. Przykryć płytkę Priming Microwell pokrywą Priming i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej na co najmniej 20 min (maksymalny czas inkubacji: do 6 h). UWAGA: Zamknąć przygotowane próbki nowymi nakrętkami. ZMIENIĆ R KAWICZKI. 15. Pod koniec inkubacji płytki Priming Microwell przygotować płytkę Amplification Microwell. Rozmieścić mikrostudzienki na płytce w sposób odpowiadający raportowi o układzie płytki (Plate Layout Report), podobnie jak w przypadku płytek Priming Microwells. Ponownie uszczelnić opakowanie Amplification Microwell zgodnie z procedurą opisaną w punkcie Zdjąć pokrywę z płytki Priming Microwell i przenieść płytkę do bloku grzewczego. W celu wstępnego ogrzania NATYCHMIAST umieścić płytkę Amplification Microwell w bloku grzewczym. 17. Ustawić minutnik na 10 min. (UWAGA: Dla tego etapu czas ma krytyczne znaczenie.) 18. Pod koniec 10 min (+/-1 min) inkubacji wybrać na pipetorze Program Natychmiast pobrać końcówki do pipety i przenieść 100 µl z kolumny 1 płytki Priming Microwell do kolumny 1 płytki Amplification Microwell. Wprowadzić płyn, dotykając końcówkami pipety ścianek studzienek. Po zakończeniu dozowania płynu odczekać, aż nastąpi automatyczne mieszanie cieczy w studzienkach. 20. Wyrzucić końcówki. Pobrać nowe końcówki i kontynuować przenoszenie mieszaniny reakcyjnej ze studzienek Priming Microwells do studzienek Amplification Microwells, używając nowych końcówek dla wszystkich kolejnych kolumn. 8

9 21. Po przeniesieniu wszystkich kolumn usunąć podklejkę z uszczelki Amplification Sealer. Jedna uszczelka Amplification Sealer [1/2] może pokryć do 6 kolumn. Jeżeli na płytce jest więcej niż 6 kolumn, NALEŻY koniecznie użyć całego arkusza uszczelki. Trzymając brzegi uszczelki, nałożyć uszczelkę na mikrostudzienki. Przy nakładaniu uszczelki pomocne będą wskazówki dotyczące bloku grzewczegor. Docisnąć uszczelkę w celu zapewnienia całkowitego uszczelnienia wszystkich mikrostudzienek. 22. W obszarze użytkowym urządzenia BD ProbeTec ET otworzyć drzwiczki oraz pokrywę płytki. NATYCHMIAST (w ciągu 30 s) przenieść uszczelnioną płytkę Amplification Microwell do aparatu BD ProbeTec ET i rozpocząć cykl. Szczegółowe informacje znajdują się w podręczniku dla użytkownika BD ProbeTec ET System. 23. Po rozpoczęciu cyklu amplifikacji należy odpowiednio wyczyścić płytkę Priming Microwell: a. Uszczelnić płytkę Microwell uszczelką Amplification Sealer i wyjąć płytkę z bloku grzewczego. Do wyjmowania płytki używać rękawicy termochronnej temperatura wynosi powyżej 70 C. b. Pozostawić płytkę na blacie przez 5 min w celu jej ochłodzenia. Wyrzucić mikrostudzienki Priming Microwells do pojemnika na odpady skażone mikrobiologicznie. c. Wyczyścić metalową płytkę: Opłukać płytkę roztworem podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Spłukać płytkę wodą destylowaną lub dejonizowaną. Przed ponownym użyciem należy zawinąć płytkę w czysty ręcznik i pozostawić, aż całkowicie wyschnie. 24. Po zakończeniu cyklu otrzymuje się wydruk wyników testu. 25. Zdjąć nośnik płytki, otworzyć drzwiczki i wyjąć płytkę. Zamknąć drzwiczki i z powrotem umieścić nośnik płytki w aparacie. 26. Usunąć z płytki uszczelnione mikrostudzienki Amplification Microwells. Przestroga: Nie usuwać materiału uszczelniającego z mikrostudzienek. Uszczelnione mikrostudzienki można łatwo odzyskać w całości, trzymając uszczelkę z przodu i z dołu i podnosząc płytkę prosto ku górze i na zewnątrz. Umieścić uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady. Szczelnie zamknąć torebkę. 27. Wyczyścić metalową płytkę: Opłukać płytkę roztworem podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Spłukać płytkę wodą destylowaną lub dejonizowaną. Przed ponownym użyciem należy zawinąć płytkę w czysty ręcznik i pozostawić, aż całkowicie wyschnie. 28. Po zakończeniu ostatniego cyklu danego dnia należy wypełnić następujące procedury porządkowe: a. Wyczyścić blaty roztworem podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Pozostawić roztwór na powierzchniach roboczych na 2 3 min, a następnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną. b. Umyć statywy Sample Tube Rack i Clear Pipetting Rack, zanurzając w roztworze podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox, na nie dłużej niż 60 s. Dokładnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną i suszyć na powietrzu. c. Wyczyścić zewnętrzne powierzchnie bloku grzewczego i aparatu BD ProbeTec ET roztworem podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Przepłukać powierzchnie wodą destylowaną lub dejonizowaną. d. Wyczyścić uchwyt pipetora (WYŁĄCZNIE UCHWYT) roztworem podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Przepłukać uchwyt wodą destylowana lub dejonizowaną, a następnie wytrzeć do sucha czystym ręcznikiem. e. Naładować pipetor. f. Szczelnie zamkniętych torebek na odpady i odpadów skażonych mikrobiologicznie należy się pozbywać zgodnie z przyjętymi procedurami usuwania zanieczyszczonego materiału odpadowego. Kontrola jakości Zestaw kontrolny BD ProbeTec ET DTB Control Set jest dostarczany osobno. W ramach każdego cyklu, a także dla każdego nowego numeru seryjnego zestawu odczynników należy stosować jedną kontrolę dodatnią i jedną ujemną. Kontrole można umieszczać w sposób losowy. Kontrola dodatnia DTB służy do monitorowania uszkodzenia odczynników, ukończenia zasadniczych elementów proceduralnych (pipetowania i inkubacji), amplifikacji i wykrywania. Kontrola ujemna DTB służy do monitorowania kontaminacji odczynników i (lub) otoczenia. Aby można podawać wyniki wyników próbek, konieczne jest uzyskanie wyniku dodatniego kontroli DTB dodatniej i ujemnego kontroli DTB ujemnej. Jeżeli wyniki kontroli różnią się od spodziewanych, cykl oznaczania uważa się za nieważny. Dlatego aparat nie poda wyników oznaczenia próbek pochodzących od pacjentów. Jeżeli wynik kontroli jakości odbiega od spodziewanych wyników, należy powtórzyć cały cykl, z zastosowaniem nowego zestawu kontroli, nowych mikrostudzienek i przetworzonych próbek. Jeżeli powtórna kontrola jakości odbiega od spodziewanych wyników, należy się skontaktować z obsługą techniczną (zobacz część Interpretacja wyników ). Wskazówki dotyczące przygotowania kontroli znajdują się w punkcje D części PROCEDURA TESTOWA. Po przygotowaniu kontroli należy kontynuować wykonywanie testu, zgodnie z opisem przedstawionym w punkcie E części PROCEDURA TESTOWA. Wewnętrzna kontrola amplifikacji (IAC, Internal Amplification Control) jest wbudowana do mikrostudzienek Priming Microwell. IAC zawiera docelowy kwas nukleinowy, amplifikowany w obecności macierzy próbki. IAC jest przeznaczone do potwierdzania wiarygodności reakcji amplifikacji oraz identyfikacji czynników hamujących amplifikację, zawartych w przetworzonej próbce. 9

10 Kontrola przetwarzania próbki: W celu sprawdzenia skuteczności przetwarzania próbki należy rutynowo wykonywać kontrolę procedury zgodnie z lokalnymi przepisami. W skład kontroli procedury wchodzi zawiesina M. tuberculosis (np. American Type Culture Collection, H37Ra ATCC 25177). Zawiesinę należy przygotować w następujący sposób: 1. Przygotować zawiesinę drobnoustroju w roztworze nr 1 McFarlanda. 2. Rozcieńczyć zawiesinę McFarlanda w albuminie wołowej (Frakcja V) w stosunku 1:100, (np. odpipetować 0,1 ml zawiesiny McFarlanda do 9,9 ml albuminy wołowej, a następnie dokładnie zmieszać). 3. Próby rozporcjowane po 1,0 ml można przechowywać w temperaturze -20 C lub niższej (nie rozmrażać i zamrażać prób). 4. Zawiesinę komórek należy przygotować tak, jak przygotowuje się rutynowe próbki przed wykonaniem testu w systemie BD ProbeTec ET. Monitorowanie kontaminacji DNA: Przed wykonaniem pierwszego oznaczenia BD ProbeTec ET DTB a następnie co najmniej raz w miesiącu należy przeprowadzić następującą procedurę testową, służącą do monitorowania strefy roboczej i powierzchni oprzyrządowania pod kątem kontaminacji DNA. Monitorowanie otoczenia ma podstawowe znaczenie dla wykrycia kontaminacji jeszcze przed pojawieniem się problemu. 1. W przypadku każdej powierzchni* poddawanej testowi należy stosować wymazówki CultureSwab EZ. 2. Dla każdej powierzchni, z której będzie pobierany wymaz, należy opisać probówkę Sample Tube, a następnie do każdej probówki odpipetować po 100 µl buforu litycznego DTB Lysis Buffer 2 i 600 µl buforu zobojętniającego DTB Neutralization Buffer Zanurzyć pierwszą wymazówkę w mieszaninie buforów zawartej w probówce Sample Tube, a następnie szerokim ruchem przetrzeć pierwszą badaną powierzchnię. 4. Zamieszać wymazówką w mieszaninie buforów, wycisnąć wymazówkę, ponownie zamknąć probówkę i wstrząsać przez 5 s. Wyrzucić wymazówki. 5. Powtórzyć czynności dla każdej powierzchni z której pobiera się wymaz. 6. Wstawić probówki do statywu Sample Tube Rack i ogrzewać w cieplarce (punkt C części PROCEDURA PRZYGOTOWANIA PRÓBKI). 7. W trakcie podgrzewania probówek należy usunąć pozostałości mieszaniny buforów z powierzchni, z których pobierano wymazy, za pomocą ręczników nasączonych wodą. 8. Po ogrzaniu umieścić probówki w mikrowirówce ze standardowym rotorem, zamknąć pokrywę i wirować przez 10 s. 9. Wyjąć probówki z wirówki i sprawdzić obecność wody na ich zakrętkach. W przypadku stwierdzenia skroplenia należy powtórzyć wirowanie. 10. Wstawić probówki do statywu Clear Pipetting Rack i postępować zgodnie z częścią PROCEDURA TESTOWA. * Zaleca się testowanie następujących miejsc: powierzchni cieplarki, łaźni ultradźwiękowej, statywu Sample Tube Rack na probówki 2 ml, statywu Clear Pipetting Rack, bloku grzewczego, czarnych płytek na mikrostudzienki, uchwytu pipetora, przycisków dotykowych aparatu, klawiatury aparatu i blatu stołu doświadczalnego. Jeżeli powierzchnia daje dodatni wynik, należy ją wyczyścić, stosując świeży roztwór podchlorynu sodu o stężeniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Dopilnować, by cała powierzchnia została zwilżona roztworem odkażającym. Pozostawić roztwór odkażający na powierzchni przez co najmniej 2 min lub do momentu wyschnięcia. Jeżeli to konieczne, należy usunąć nadmiar roztworu odkażającego za pomocą czystego ręcznika. Wytrzeć powierzchnię czystym ręcznikiem nasączonym wodą dejonizowaną lub destylowaną i pozostawić do wyschnięcia. Wykonać ponowny test danej powierzchni. Powtarzać aż do uzyskania ujemnego wyniku. Jeżeli nie udaje się usunąć kontaminacji, w celu uzyskania dalszych instrukcji należy się skontaktować z obsługą techniczną. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wyniki oznaczenia DTB Assay Wynik dodatni Wynik ujemny Nieokreślony Zalecane sprawozdanie Wynik testu z sondą wykrywającą DNA kompleksu M. tuberculosis dodatni. Hodowla AFB w toku. Wynik testu z sondą wykrywającą DNA kompleksu M. tuberculosis ujemny. Hodowla AFB w toku. Powtórzyć oznaczenie z sondą dla przetworzonej próbki. Jeżeli wynik jest dodatni lub ujemny, zastosować odpowiednią formułę przedstawioną powyżej. Jeżeli wynik jest dalej nieokreślony, użyć stwierdzenia Wynik oznaczenia początkowego i powtórzonego jest nieoznaczalny. Proszę o przesłanie nowej próbki do badania. Hodowla AFB w toku. OGRANICZENIA PROCEDURY 1. Opisywaną metodę weryfikowano jedynie w przypadku próbek pochodzących z układu oddechowego, takich jak plwocina (indukowana lub odkrztuszana), popłuczyny oskrzelowo-płucne i aspirat pochodzący z tchawicy lub oskrzeli. Nie oceniano wydajności w odniesieniu do innych próbek. 2. Wynik ujemny nie wyklucza możliwości obecności poszukiwanego drobnoustroju w próbce ilość drobnoustroju może być mniejsza niż próg czułości testu. 3. Podobnie jak w przypadku innych testów diagnostycznych, także wyniki oznaczenia DTB Assay należy interpretować łącznie z innymi danymi laboratoryjnymi i klinicznymi dostępnymi dla lekarza. 4. Oznaczenie DTB Assay nie daje możliwości rozróżnienia pomiędzy poszczególnymi składowymi kompleksu M. tuberculosis M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum i M. microti. 10

11 5. Osiągnięcie optymalnej wydajności oznaczenia wymaga odpowiedniego pobierania i obchodzenia się z próbką. 6. Należy zachować opisane warunki wirowania, ponieważ niedostateczne odwirowanie próbek może prowadzić do wyników fałszywie ujemnych. 7. Oznaczenie DTB Assay nie daje możliwości wykrywania wariantów w obrębie kompleksu M. tuberculosis, nieposiadających sekwencji insercyjnej IS Stosowanie oznaczenia DTB Assay jest ograniczone do personelu przeszkolonego w zakresie procedury oznaczenia i systemu BD ProbeTec ET. 9. Nie należy stosować oznaczenia DTB Assay do oceny powodzenia lub niepowodzenia leczenia, ponieważ kwasy nukleinowe pochodzące z drobnoustrojów kompleksu Mycobacterium tuberculosis, mogą być dalej obecne po zastosowaniu leczenia przeciwbakteryjnego. 10. Oznaczenie DTB Assay nie może zastąpić hodowli prowadzonych w celu zbadania wrażliwości na leki przeciwbakteryjne. 11. Oznaczenie DTB Assay pozwala na uzyskanie wyników jakościowych. Nie istnieje związek pomiędzy wielkością wyniku MOTA, a liczbą komórek w dodatniej próbce. 12. Sekwencja M. tuberculosis (IS6110) komplementarna z sondą jest swoista dla M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum i M. microti. 13. Metodą DTB Assay można wykrywać warianty innych niegruźliczych gatunków prątków, zawierające sekwencję IS Wartość predykcyjna oznaczenia zależy od częstości występowania choroby w danej populacji. 15. Nie badano wpływu takich czynników jak leczenie przeciwdrobnoustrojowe lub nadkażenie próbek. 16. W przypadku korzystania z cieplarki ogólnego przeznaczenia należy upewnić się, że płyn w probówkach osiąga temperaturę101 C ± 1 C przez co najmniej 30 min w celu unieszkodliwienia wszelkich prątków obecnych w próbkach. OCZEKIWANE WYNIKI 1157 próbek pobranych od 986 pacjentów z dwóch różnych geograficznie ośrodków klinicznych testowano przy użyciu oznaczenia BD ProbeTec ET DTB. Na rysunku 1. pokazano rozkład częstości początkowych wyników MOTA. Wyniki BD ProbeTec ET DTB przedstawiono w odniesieniu do referencyjnych wyników TB oraz rozmazu prątków kwasoopornych (AFB, Acid-fast bacilli). Referencyjny wynik TB opierał się albo na wyniku hodowli prątków, albo na rozpoznaniu zaczerpniętym z karty chorobowej pacjenta. Obecność lub brak kompleksu Mycobacterium tuberculosis wyznacza się przez porównanie wyników MOTA BD ProbeTec ET DTB z próbkami, w których wyniki zostały wcześniej ustalone. Punktacja MOTA jest systemem metrycznym stosowanym do oceny wielkości sygnału będącego wynikiem reakcji. Wielkość punktacji MOTA nie oddaje ilości mikroorganizmu w próbce. Wszystkie obliczenia są wykonywane automatycznie przez oprogramowanie urządzenia. Próbki badane w dwóch ośrodkach z zastosowaniem BD ProbeTec ET identyfikowano jako dodatnie, ujemne lub nieoznaczalne. Tylko w przypadku jednej próbki otrzymano w pierwszym oznaczeniu wynik nieoznaczalny. Po wykonaniu powtórnego oznaczenia otrzymano wynik ujemny. Rysunek 1: Dystrybucja częstości wyników MOTA DTB Częstość < Wynik referencyjny TB (-) Wynik referencyjny TB (+) DTB MOTA Wynik rozmazu i wynik referencyjny TB Rozmaz (+) TB (+) Rozmaz (+) TB ( ) Rozmaz ( ) TB (+) Rozmaz ( ) TB ( )