Spektroskopia korelacji fluorescencji w badaniach fizycznych, biochemicznych i medycznych. Jacek Gapiński

Wielkość: px

Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Spektroskopia korelacji fluorescencji w badaniach fizycznych, biochemicznych i medycznych. Jacek Gapiński"

Aleksandra Henryka Jaworska
7 lat temu
Przeglądów:

1 Spektroskopia korelacji fluorescencji w badaniach fizycznych, biochemicznych i medycznych Jacek Gapiński Seminarium w IPPT PAN Warszawa, r.

2 Co może, a czego nie może tradycyjny mikroskop? Tradycyjny mikroskop Najlepiej widać PŁASKIE WYRAŹNE struktury. Dlatego preparaty są ścinkami, a dodatkowo są specjalnie barwione. Przyczyna: mała głębia ostrości, ale jednocześnie zasłanianie głębiej położonych warstw przez zabarwione fragmenty. Bardzo trudno oglądać struktury trójwymiarowe, np. szczegóły budowy komórki.

3 Mikroskop konfokalny 0,3 µm próbka 1,5 µm!konfokalna konfiguracja optyczna pozwala na ograniczenie detekcji do obszaru cylindra 1,5 0,3 µm.!ogniskowanie i konfokalna detekcja wyznaczają obszar pomiaru mniejszy niż 1/4 femtolitra (1 femtolitr = litra). przysłona detektor Dobre np. do rozpraszania Ramana, ale chcemy oglądać większe obiekty!

4 Laserowy fluorescencyjny mikroskop skaningowy A może raczej: Mikroskop?? Przestrzenny (3D) skaner optyczny rejestrujący sygnał fluorescencji wzbudzanej zogniskowaną wiązką lasera. Przestrzenny bo dokładnie definiujemy badane miejsce, zarówno w płaszczyźnie xy jak i głębokości z. Skaner bo przemiatamy wszystkie punkty składające się na obraz. Zazwyczaj jest to obraz danej płaszczyzny xy. Obraz o wielkości 2048x2048 punktów uzyskuje się w ciągu sekundy.

5 Historia mikroskopów fluorescencyjnych według firmy Zeiss 1982 LSM 44 (Zeiss) Pierwszy komercyjny skaningowy mikroskop fluorescencyjny LSM 10 (Zeiss) Układ konfokalny z dwoma kanałami detekcji. Ok r. LSM 510 LSM 5 Pascal

6 Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu skaningowego

7 Dyfuzja fluoroforów

8 δ I (t) natężenie I(t) < I > Mierzony sygnał fluorescencji może być opisywany poprzez stałe średnie natężenie <I > oraz fluktuacje δ I (t). czas pomiaru t Informacja o cząsteczkach w próbce tkwi we fluktuacjach sygnału fluorescencji. Szybkość tych fluktuacji zdeterminowana jest przez ruchliwość cząsteczek, natomiast amplituda fluktuacji wyznaczona jest przez bezwzględne stężenie fluoroforów. Wielkością użyteczną w ilościowych analizach jest czasowa funkcja autokorelacji fluktuacji sygnału fluorescencji.

9 Spotkanie dwu pomysłów: detekcja konfokalna i korelacyjna analiza sygnału. Magde, D., E. L. Elson, and W. W. Webb Thermodynamic fluctuations in a reacting system measurement by fluorescence correlation spectroscopy. Phys. Rev. Lett. 29: B.Berne, R.Pecora, "Dynamic light scattering", John Wiley & Sons, New York Do badania fluktuacji LICZBY CZĄSTECZEK potrzebna jest mała objętość. Ten warunek idealnie spełniał mikroskop konfokalny. 1 cząsteczka w ognisku = 10 nm Narodziła się spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)

10 Podstawowe wielkości w metodzie FCS fluorescence intensity correlation function single component two component function t G( t) T = 1+ e 1 T Funkcja korelacji t / τ t + 1 N n i= 1 (1 + t / τ ) i A i 1+ c 2 t / τ i ω xy ω z τ log τ 2 ωxy D = 4 τ ωz c = ωxy τ = τ = xy z 2 c V = 4 3 πω 2 xy ω z N = 1 ω xy = 0.3 µm ω z = 1.5 µm N C m = V N A C m = 12.3 nm

11 A Kolejne etapy powstawania i analizy sygnału fluorescencji I(t) B 2ω 2 ω 1 <I(t)> Element objętości ( 1 fl) 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 D 1/N+1 1,9 1,7 1,5 1,3 1,1 czas (t) C 0,9 0,01 0, τ swobodne τ związane czas [ms] 0,9 0,01 0, czas [ms] Cząsteczki przemieszczające się poprzez oświetlony wiązką lasera obszar (A) silnie fluoryzują, wywołując fluktuacje sygnału fluorescencji (B) mierzonego w detektorze. Obliczana funkcja korelacji (C) analizowana jest przy użyciu odpowiedniego modelu (D) i na podstawie dopasowania wyznaczane są bezwzględne stężenia cząsteczek w roztworze oraz ich współczynniki dyfuzji translacyjnej.

12 Schematyczny przebieg eksperymentu badania wiązania ligandu do receptora τ Średni czas korelacji dostarcza informacji o rozmiarze i masie obserwowanych molekuł E τ [ms] Rosnący czas dyfuzji = rosnące rozmiary obiektu

13 W 1993 grupa naukowców założyła firmę EVOTEC, której celem było rozwijanie technik zorientowanych przede wszystkim na poszukiwanie nowych leków przy użyciu FCS jako bardzo wydajnej techniki przesiewowej (screening). Evotec Company History ( Evotec BioSystems GmbH was founded in Hamburg, Germany. Among the founders were Nobel Laureate Professor Manfred Eigen, Dr Karsten Henco, Dr Ulrich Aldag, Dr Freimut Leidenberger, Dr Heinrich Schulte, Professor Rudolf Rigler and Dr Charles Weissmann 1996 Collaborations with Novartis and SmithKlineBeecham to develop EVOscreen (High-Throughput Screening System)

14 Działania te skorelowane zostały z firmą Zeiss, która w 1996 wypuściła na rynek pierwszy komercyjny przyrząd do pomiarów FCS: ConfoCor 1. W 1999 roku pojawił się drugi model, ConfoCor 2, w którym dwa tory optyczne detekcji umożliwiały m.in. badanie korelacji krzyżowej.

15 Schemat optyczny CofoCora 2

16 Przykłady zastosowań FCS Oddziaływania kwasów nukleinowych Oddziaływania receptorów z ligandami Oddziaływania antygenów z przeciwciałami

17 Hybrydyzacja DNA Hybrydyzacja znakowanego fluorescencyjnie primera M 13 do M 13 DNA Ułamek związanych Znakowany oligomer DNA Znakowany oligomer + Kinetyka tworzenia kompleksu Długi fragment DNA

18 Tworzenie kompleksów DNA - białko Receptor hormonu tarczycy Wiąże się ze znakowanym oligomerem DNA Funkcje korelacji uzyskane dla wolnego oligomeru, kompleksu w 30 %, kompleksu w 90 %. Porównanie wyników FCS ze standardową chromatografią żelową

19 Wiązanie się przeciwciała do rybonukleazy T1 C N Autocorrelation 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 Swobodny barwnik Alexa 546 Oczyszczona znakowana RNAza T1 ZnakowanaRNAzaT1 + przeciwciało 0,01 0, Time [ms]

Zasada działania ultra-wydajnej techniki przesiewowej (Ultra-high throughput screening) Do zbiorniczków zawierających substancje z badanego zestawu (nie znakowane fluorescencyjnie) dodaje się

20 Zasada działania ultra-wydajnej techniki przesiewowej (Ultra-high throughput screening) Do zbiorniczków zawierających substancje z badanego zestawu (nie znakowane fluorescencyjnie) dodaje się znakowanego preparatu. Tam gdzie powstanie kompleks, nastąpi spowolnienie dyfuzji, natomiast gdy cząsteczki się nie zwiążą, dyfuzja będzie nadal szybka. Pomiar trwa około sekundy, a wynik uzyskuje się natychmiast. Znakowany preparat biblioteka związków

23 Zastosowania bio-medyczne podsumowanie -Technika Spektroskopii Korelacji Fluorescencji powstała na bazie mikroskopów konfokalnych i rozpowszechniła się około 2000 r. -Popularyzacja przebiega dwutorowo: z jednej strony dotyczy badań przesiewowych w poszukiwaniu nowych leków (screening), a z drugiej badań czysto naukowych związanych z badaniem szlaków enzymatycznych oraz pomiarem ruchliwości fluoroforów w różnych środowiskach. -Potencjał techniki badań przesiewowych w szukaniu nowych leków wydaje się być ogromny, o czym najlepiej świadczą umowy zawarte pomiędzy firmą EVOTEC, a największymi koncernami farmaceutycznymi świata. Pozycję firmy EVOTEC wydaje się wyznaczać ogromna biblioteka związków chemicznych gotowych do natychmiastowego użycia.

24 FCS narzędzie do pomiaru współczynnika dyfuzji własnej Ciekawe możliwości: Pomiar współczynnika dyfuzji sondy w różnym otoczeniu: -Wpływ stężenia w układzie jednorodnym (kulki w kulkach, pałeczki w pałeczkach) -Pomiar ruchliwości w żywych komórkach -Pomiar ruchliwości w błonach -Wpływ oddziaływań w układzie jednorodnym (np. dodawanie soli) -Wpływ stężenia w układach mieszanych (kulka w pałeczkach, pałeczka w kulkach) -Wpływ rozmiarów obiektów tworzących środowisko na dyfuzję sondy (mikrolepkość).

25 Pomiary FCS w żywej komórce sekundy µm punkt pomiaru lokalizacja położenie w komórce korelacja stężenie białka 1, 2, 3 w nukleoplazmie niska wysoka 4 w jądrze wysoka niska 5 w cytoplazmie brak brak białka

26 Dyfuzja lipidów w błonie komórkowej

27 Dyfuzja wewnątrz komórki fluoresceina Znakowane kulki lateksowe 14 nm

28 Ruchliwość cząsteczek w stężonych roztworach 20mer DNA D / D M 10-3 M 10-4 M 10-5 M φ h C p [mg/ml]

29 Objętość dodatkowych warstewek

30 κ -1 [nm] (a) 10-5 M 10-4 M 10-3 M κ 2 = 4πL B C n Z eff Objętość efektywna i c* κ 2 = 4πL B 2C s M (b) 10-5 M φ eff φ eff M 10-3 M 0.2 M (c) 10-5 M 10-4 M C p [mg/ml] φ h 10-3 M 0.2 M φ h [mg/ml] C h * C s = 200 mm C s = 10-3 M C s = 10-4 M C s = 10-5 M C* [g/l] 1x10-5 1x C p [mg/ml] calculated from hydrodynamic dimensions C s [M] Z eff = 7

31 Self diffusion of spheres in isotropic solutions of rods Kyongok Kang, J. Gapinski, M.P. Letinga, J. Buitenhuis, G, Meier, M. Ratajczyk, Jan K.G. Dhont, and A. Patkowski, Diffusion of Spheres in Crowded Suspensions of Rods, J. Chem. Phys. 122, (2005). fd virus: L = 880 nm, d = 9 nm BSA: R h = 3.6 nm SSjr6: R h = 35 nm Sisol: R h = 220 nm A diagram showing the proportions of the studied particles.

32 1.0 D/D nm 35 nm 500 nm 210 nm [fd] mg/ml The normalized long time self diffusion coefficient as measured by FCS red, DLS blue and video microscopygreen for tracer spheres of different sizes. Tracer volume fraction: 8.5x x10-3.

33 1.0 D/D nm 35 nm 210 nm a / ξ Test of the scaling of the normalized long-time self diffusion coefficients, measured by means of FCS and DLS for various tracer sphere sizes, as a function of the (sphere size)/(mesh size) ratio.

34 Anisotropic self diffusion of spheres in nematic solutions of rods 1,0 appoferritin in fd D s / D 0 nematic 0,5 parallel isotropic perpendicular 0, [fd] mg/ml

35 Dyfuzja sond o różnej wielkości - mikrolepkość

37 Lepkość mierzona FCS sondy o różnych rozmiarach

38 Mikrolepkość jako funkcja rozmiaru sondy

39 Złamanie bariery dyfrakcyjnej w obrazowaniu i FCS r = 2 λ NA

41 Stimulated emission depletion (STED)

49 Dziękuję za uwagę!

Podobne dokumenty

Repeta z wykładu nr 11. Detekcja światła. Fluorescencja. Eksperyment optyczny. Sebastian Maćkowski

Repeta z wykładu nr 11. Detekcja światła. Fluorescencja. Eksperyment optyczny. Sebastian Maćkowski Repeta z wykładu nr 11 Detekcja światła Sebastian Maćkowski Instytut Fizyki Uniwersytet Mikołaja Kopernika Adres poczty elektronicznej: mackowski@fizyka.umk.pl Biuro: 365, telefon: 611-3250 CCD (urządzenie