( 1 2 ) O P I S P A T E N T O W Y ( 1 9 ) P L. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP94/04067

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA ( 1 2 ) O P I S P A T E N T O W Y ( 1 9 ) P L Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej ( 2 1) Numer zgłoszenia (2 2) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP94/04067 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO95/16030, PCT Gazette nr 25/95 (51) IntCl7: A61K 35/16 C07K 1/16 A61K 38/36 ( 5 4 ) Sposób wytwarzania preparatów zawierających wirusowo inaktywowane składniki osocza zależne od witaminy K (30) Pierwszeństwo: ,DE,P (73) Uprawniony z patentu: OCTAPHARMA AG, Lachen, CH (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 20/96 (72) Twórcy wynalazku: Djuro Josic, Wiedeń, AT Ales Strancar, Ajdovscina, SI (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (74) Pełnomocnik: WUP 12/00 Kamiński Zbigniew, KANCELARIA PATENTOWA PL B1 (57)1 Sposób wytwarzania preparatów zawierających wirusowo inaktywowane składniki osocza zależne od witami ny K, jak również białko C, białko S, czynniki II, VII, IX i/lub X oraz ich mieszaniny, takie jak preparaty PPSB, w którym osocze krwi w stanie stałym lub rozmrożonym ekstrahuje się w fazie stałej, rozdziela na wymieniaczu anionowym 1 ewentualnie przesyła się powstający eluat do dalszych etapów obróbki dla odzysku innych materiałów, następnie wymywa się materiał zaadsorbowany na fazie stałej 1 dostosowuje się moc jonową i/lub wartość ph frakcji zawierającej eluat do warunków kolejnych etapów oczyszczania, po czym inaktywuje się wirusy 1 prowadzi się chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa lub chromatografię hydrofobową, frakcjonuje się poszczególne składniki 1 jeśli jest to pożądane, prowadzi się chromatografię powinowactwa, następnie zbiera się eluat zawierający produkty wcześniej me usunięte 1 prowadzi się dalsze frakcjonowanie eluatu, powtarzając chromatografię powinowactwa, a następnie wymywa się substancje związane z materiałem wykazującym swoistą sorpcję, w warunkach rozrywających swoiste wiązania sorpcyjne 1 zatęża się eluat, ewentualnie ze zmniejszeniem ilości środka używanego do wymywania materiału wykazującego swoistą sorpcję, znamienny tym, że stosuje się wymieniacz anionowy w postaci membrany i/lub zbitej, upakowanej tarczki, z porowatych polimerów hydrofilowych, obejmujących monomery, ko-monowery i kopolimery, w warunkach względnie niskiej mocy jonowej i prowadzi się jonowymienną chromatografię membranową, heparynową chromatografię membranową na zasadzie swoistej sorpcji, membranową chromatografię na zasadzie swo-- istej immunosorpcji z unieruchomionymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko wyodrębnianym substancjom, albo membranową chromatografię powinowactwa przy użyciu membran z ligandami hydrofobowymi, a jako hydrofobowe ligandy modyfikujące nośnik chromatograficzny stosuje się grupy 2-hydroksyaminoalkilowe, takie jak 2- hydroksyaminopropyl, i/albo hydrofobowe ligandy, takie jak grupy propylowa i fenylowa i stosuje się materiał chromatograficzny osadzony na membranie i/lub w postaci zbitej upakowanej tarczki, po czym poszczególne składniki frakcjonuje się przez stopniowe wymywanie przy zmieniającej się mocy jonowej, inaktywację wirusową prowadzi się za pomocą jonowych i/lub niejonowych detergentów w obecności fosforanów di- lub trialkilowych, takich jak fosforan tri-n-butylu, i/lub poprzez obróbkę cieplną, i/lub filtrację

2 Sposób wytwarzania preparatów zawierających wirusowo inaktywowane składniki osocza zależne od witaminy K Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania preparatów zawierających wirusowo inaktywowane składniki osocza zależne od witaminy K, jak również białko C, białko S, czynniki II, VII, IX i/lub X oraz ich mieszaniny, takie jak preparaty PPSB, w którym osocze krwi w stanie stałym lub rozmrożonym ekstrahuje się w fazie stałej, rozdziela na wymieniaczu anionowym i ewentualnie przesyła się powstający eluat do dalszych etapów obróbki dla odzysku innych materiałów; następnie wymywa się materiał zaadsorbowany na fazie stałej i dostosowuje się moc jonow ą i/lub wartość ph frakcji zawierającej eluat do warunków kolejnych etapów oczyszczania, po czym inaktywuje się wirusy i prowadzi się chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa lub chromatografię hydrofobową, frakcjonuje się poszczególne składniki i jeśli jest to pożądane, prowadzi się chromatografię powinowactwa, następnie zbiera się eluat zawierający produkty wcześniej nie usunięte i prowadzi się dalsze frakcjonowanie eluatu, powtarzając chromatografię powinowactwa, a następnie wymywa się substancje związane z materiałem wykazującym swoistą sorpcję, w warunkach rozrywających swoiste wiązania sorpcyjne i zatęża się eluat, ewentualnie ze zmniejszeniem ilości środka używanego do wymywania materiału wykazującego swoistą sorpcję, znamienny tym, że stosuje się wymieniacz anionowy w postaci membrany i/lub zbitej, upakowanej tarczki, z porowatych polimerów hydrofilowych, obejmujących monomery, ko-monowery i ko-polimery, w warunkach względnie niskiej mocy jonowej i prowadzi się jonowymienną chromatografię membranową, heparynową chromatografię membranową na zasadzie swoistej sorpcji, membranową chromatografię na zasadzie swoistej immunosorpcji z unieruchomionymi przeciwciałami skierowanymi przeciwko wyodrębnianym substancjom, albo membranową chromatografię powinowactwa przy użyciu membran z ligandami hydrofobowymi, a jako hydrofobowe ligandy modyfikujące nośnik chromatograficzny stosuje się grupy 2-hydroksyaminoalkilowe, takie jak 2-hydroksyaminopropyl, i/albo hydrofobowe ligandy, takie jak grupy propylowa i fenylowa i stosuje się materiał chromatograficzny osadzony na membranie i/lub w postaci zbitej upakowanej tarczki, po czym poszczególne składniki frakcjonuje się przez stopniowe wymywanie przy zmieniającej się mocy jonowej, inaktywację wirusową prowadzi się za pomocą jonowych i/lub niejonowych detergentów w obecności fosforanów di- lub trialkilowych, takich jak fosforan tri-n-butylu, i/lub poprzez obróbkę cieplną, i/lub filtrację. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wirusy inaktywuje się przez ogrzewanie frakcji w temperaturze od 55 C do 70 C przez okres od 5 do 30 godzin, w obecności stabilizatorów, takich jak cukier, kwasy aminowe, kationy dwuwartościowe i/lub heparyna. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, ze stabilizatory usuwa się w procesach odsalania, takich jak diafiltracja lub ultrafiltracja, heparynowa chromatografia powinowactwa, chromatografia anionowymienna lub na nośnikach zmodyfikowanych grupami dwuetyloaminoetylowymi (DEAE) lub czwartorzędowymi związkami amoniowymi albo na nośnikach zmodyfikowanych ligandami hydrofobowymi. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, ze otrzymane frakcje zatęża się przez liofilizację lub suszenie rozpryskowe. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 3, znamienny tym, ze stosuje się grupę anionowymienną związaną z włóknami materiału podłożowego przez przekładkę, taką jaką stanowi glukozoaminowa część cząsteczki.

3 Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatów zawierających inakty wowane wirusowo składniki osocza zależne od witaminy K, jak również białka C i białka S, z materiałów zawierających te składniki. Składniki osocza zależne od witaminy K, takie jak białko C, białko S, czynniki II, VII, IX i X, są obecne w osoczu krwi i mają ważną rolę w patofizjologii kaskady krzepnienia krwi. Czynniki te używane są jako lekarstwa leczące pacjentów wykazujących objawy wywołane względnym brakiem tych czynników. Josić i wsp. w Journal of Chromatography 632, (1993), 1-10, opisuje przydatność heparynowej chromatografii powinowactwa do wyodrębniania białek osocza z kaskady czynników krzepnięcia krwi. Opisano wyodrębnienie antytrombiny III oraz oddzielenie czynnika IX od czynnika X, po wstępnym rozdzieleniu za pomocą chromatografii anionowej. Chromatografia anionowowymienna dla wstępnego rozdzielenia czynnika IX i czynnika X dokonywana jest preparatywną HPLC. Wzbogacenie próbek zawierających czynnik IX i czynnik X wykonywane jest zgodnie z H.G.J. Brummelhuis, w J.M. Curling (wydawca), "Methods o f Plasma Protein Fractionation", Academic Press, London, Orlando,1980, str.117. Wysokowydajna chromatografia membranowa białek surowicy i błony osocza znana jest z pracy Josića i wsp. w Journal of Chromatography 590, (1992), Opisano tam rozdzielenie białek surowicy i błony osocza. Na przykład rozdzielono białka błon osocza z tkanek wątroby i nerek. Osocze krwi nie jest dostępne jako handlowe źródło pozyskiwania czynników krzepnięcia krwi w pożądanych ilościach. Zarówno ze względów etycznych, jak i ekonomicznych, frakcjonowanie i wyodrębnianie składników osocza zależnych od witaminy K, jak również białka C i białka S, musi być prowadzone z możliwie najwyższą wydajnością, przy równoczesnym umożliwianiu wyodrębniania każdego z pozostałych czynników. Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie sposobu postępowania umożliwiającego osiągnięcie tego celu. Niespodziewanie okazało się, że cenne składniki osocza zależne od witaminy K, takie jak białko C, białko S, czynniki II, VII, IX i X mogą być otrzymane za pomocą sposobu opisanego poniżej, przy wysokim stopniu oczyszczenia i z wysoką wydajnością. Sposób według wynalazku charakteryzuje się zastosowaniem chromatografii membranowej. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatów zawierających wirusowo inaktywowane składniki osocza zależne od witaminy K, jak również białko C, białko S, czynniki II, VII, IX i/lub X oraz ich mieszaniny, takie jak preparaty PPSB. W sposobie tym osocze krwi w stanie stałym lub rozmrożonym poddaje się następującym etapom obróbki: a) ekstrahuje się w fazie stałej materiał zawierający składniki przeznaczone do rozdzielenia na wymieniaczu anionowym, w postaci membrany i/lub zbitej, upakowanej tarczki, w warunkach względnie niskiej mocy jonowej, usuwa się i przesyła się powstający eluat do dalszych etapów obróbki dla odzysku innych materiałów; b) wymywa się materiał zaadsorbowany na fazie stałej; c) dostosowuje się moc jonową i/lub wartość ph frakcji zawierającej eluat do warunków kolejnych etapów oczyszczania; d) inaktywuje się wirusy za pomocą jonowych i/lub niejonowych detergentów w obecności fosforanów di- lub trialkilowych, takich jak fosforan tri-n-butylu, i/lub poddaje się obróbce cieplnej; e) prowadzi się jonowymienną chromatografię membranową, chromatografię membranową powinowactwa z unieruchomionymi substancjami o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej, mającymi wysokie powinowactwo ze składnikami osocza zależnymi od witaminy K, jak również z białkiem C i białkiem S, albo chromatografię na zasadzie oddziaływania hydrofobowego; f) frakcjonuje się poszczególne składniki przez stopniowe wymywanie przy zmieniającej się mocy jonowej, polarności i/lub wartości ph; g) jeśli jest to pożądane, prowadzi się chromatografię membranową na zasadzie swoistej sorpcji;

4 h) jeśli jest to pożądane, zbiera się eluat zawierający produkty wcześniej nie usunięte i prowadzi się dalsze frakcjonowanie eluatu przez powtórzenie etapu g), z zastosowaniem odpowiednich materiałów wykazujących swoistą sorpcję; i) wymywa się substancje związane z materiałem wykazującym swoistą sorpcję, w warunkach rozrywających swoiste wiązania sorpcyjne, a następnie zatęża się eluat, ewentualnie ze zmniejszeniem ilości środka używanego do wymywania materiału wykazującego swoistą sorpcję; przy czym po etapie f) ewentualnie inaktywuje się wirusy, po czym prowadzi się etap chromatografii membranowej i ewentualnie obróbkę cieplną i/lub filtrację, usuwającą wirusy na odpowiednim etapie. W pierwszym etapie, materiały zawierające poszczególne składniki osocza zależne od witaminy K, jak również białko C i białko S, poddawane są ekstrakcji w fazie stałej na wymieniaczu anionowym. Materiałem takim jest korzystnie świeże lub rozmrożone osocze krwi. Substancja anionowymienna może być zastosowana w postaci rozdrobnionej, luźnej masy, uformowanej membrany lub zbitej upakowanej tarczki. Korzystna jest ekstrakcja w fazie stałej na wielocukrach, zmodyfikowanych grupami zasadowymi i ewentualnie usieciowanymi. Konkretnie mogą być używane substancje takie, jak wielocukry zmodyfikowane grupami dwuetyloaminoetylowymi (DEAE) lub aminami czwartorzędowymi. Na przykład można używać takich substancji, jak Sephedex P 50. Szczegółowiej, substancje zmodyfikowane DEAE stosowane są do wydzielania czynnika IX. W metodzie ekstrakcji w fazie stałej ekstrahowany materiał mieszany jest z substancją tworzącą fazę stałą. Ekstrakcja w fazie stałej przeprowadzana jest korzystnie w warunkach niskiej mocy jonowej. Po ewentualnie przeprowadzanych operacjach przemywania, eluat jest gromadzony i może być poddawany innym etapom przeróbki. W celu wydzielenia czynnika IX, korzystnie próbka jest przefiltrowywana przez odpowiednio zmodyfikowaną membranę. Następnie przesącz może być dalej wykorzystywany, na przykład do wytwarzania albuminy. Białka związane z membraną lub z odpowiednią substancją fazy stałej, to znaczy czynnik II, zwłaszcza czynnik IX i czynnik X są następnie wymywane z fazy stałej, w warunkach wyższych mocy jonowych. Jeśli stosowane są membrany zmodyfikowane DEAE lub czwartorzędowe aminy, możliwość ich wielokrotnego użytkowania stanowi oczywistą korzyść, w porównaniu do ekstrakcji w fazie stałej za pomocą wcześniej wymienionych substancji przeznaczonych do ekstrakcji w fazie stałej, w szczególności w porównaniu do materiałów w postaci rozdrobnionej. Materiał zaadsorbowany w fazie stałej jest następnie desorbowany z nośnika roztworami o wyższej mocy jonowej, przy czym moc jonowa frakcji dostosowywana jest do warunków wymaganych do przeprowadzenia następnych etapów rozdzielania, przez odpowiednie działania, takie jak rozcieńczenie, ultrafiltracja lub diafiltracja, względnie dodanie środków zwiększających moc jonową. Następnie może być przeprowadzona anionowymienna chromatografia membranowa lub chromatografia powinowactwa z zastosowaniem substancji o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej, mających wysokie powinowactwo z zależnymi od witaminy K składnikami osocza, poddawanymi oczyszczeniu, jak również z białkiem C i białkiem S. Ten etap chromatograficznego oczyszczania może być również przeprowadzany na materiałach przeznaczonych do chromatografii wykorzystującej oddziaływania hydrofobowe. Jako materiały anionowymienne mogą być rozważane w takim przypadku również membrany zmodyfikowane grupami dwuetyloamino-etylowymi lub aminami czwartorzędowymi. Substancje o wysokim powinowactwie z zależnymi od witaminy K składnikami osocza, jak również z białkiem C i białkiem S, mogą być ligandami zapewniającymi swoistą immunosoipcję. Rozważanymi ligandami zapewniającymi swoistą sorpcję są przeciwciała skierowane przeciwko żądanym czynnikom. Na przykład, dla wyodrębnienia czynnika IX mogą być użyte membrany zawierające unieruchomione przeciwciała oddziałujące z czynnikiem IX. Substancje nie zatrzymywane przez membranę aniono-wymienną lub wymyte z membrany o swoistej immunosorpcji mogą być zbierane i poddawane dalszej obróbce.

5 Typowe ligandy dla chromatografii hydrofobowej wykazują pewną stopniową zmianę hydrofobowości. Ligandami takimi są przykładowo związki acykliczne i alicykliczne, mające na przykład alkilowe łańcuchy węglowe C 1do C 16 albo związki aromatyczne, ewentualnie zmodyfikowane polarnymi protycznymi lub polarnymi aprotycznymi ligandami, takimi jak grupy cyjanowe. Jako ligandy hydrofobowe odpowiednie dla chromatografii opartej na oddziaływaniu hydrofobowym uważa się szczególnie grupy propylową, butylową i fenylową, którymi zmodyfikowany jest materiał nośnikowy, oraz podobne ligandy wykazujące pewną stopniową zmianę hydrofobowości. Na stopniową zmianę hydrofobowości mogą także wpływać grupy polarne. Z tego względu grupy 2-hydroksyloaminoalkilowe, takie jak grupy 2-hydroksyaminopropylowe, są odpowiednie do wyodrębniania czynnika IX jako ligandy hydrofobowe. Następny etap procesu obejmuje dalsze frakcjonowanie zaadsorbowanych składników osocza przez stopniowe wymywanie przy zmianie mocy jonowej i/lub wartości ph, za pomocą układu rozpuszczalników o wyższej mocy jonowej, rozpuszczalników o różnych polamościach albo rozpuszczalnikach odwracających powinowactwo pomiędzy ligandem im munosorpcyjnym a substratem. Powyżej wymienione sposoby postępowania mogą być adoptowane, w celu dostosowania mocy jonowej frakcji wymywanej z membrany do warunków dalszego oczyszczania. Etap f), obejmujący chromatografię powinowactwa, może ale nie musi być stosowany. Chromatografia powinowactwa w sposobie według wynalazku obejmuje także chromatografię hydrofobową. Odpowiednie ligandy scharakteryzowano powyżej. Chromatografia na zasadzie swoistej sorpcji w zakresie sposobu według wynalazku powiązana jest z takimi procedurami chromatograficznymi, w których stosowane są membrany zmodyfikowane ligandami immunosorpcyjnymi. Do tego celu wykorzystywane są monoklonowe przeciwciała skierowane przeciwko składnikom osocza zależnym od witaminy K, jak również białku C i białku S, przy czym przeciwciała monoklonowe są unieruchomione na membranie. Chromatograficzne rozdzielanie w próbce składników osocza zależnych od witaminy K, jak również białka C i białka S, może być przeprowadzone z materiałami substratowymi z jednej strony zmodyfikowanymi grupami jonowymiennymi, szczególnie aniono wymiennymi, a z drugiej strony zmodyfikowanymi ligandami immuno-sorpcyjnymi. W bardzo korzystnym sposobie postępowania wymienione materiały chromatograficzne uformowane są w membrany. Korzystnie, membrana składa się z substratu, takiego jak zmodyfikowana celuloza lub włókno syntetyczne. Bardziej szczegółowo, odpowiednie są membrany, jak również zbite, upakowane tarczki, wykonane z porowatych metakrylanów poliglicydowych i/lub innych porowatych polimerów hydrofitowych o podobnej strukturze, takich jak zhydrofilowany polistyren. Membrana odpowiednia do rozdzielania składa się ze stosu cienkich porowatych warstw, w pierwszej odmianie wykonanych z celulozy lub włókien syntetycznych, w drugiej odmianie zbite, upakowane tarczki wykonane są z żelu krzemionkowego lub polimerowych nośników. W podłoża wspomnianych membran lub tarczek wbudowane są odpowiednie grupy anionowowymienne lub ligandy immunosorpcyjne. Grupami jonowymiennymi mogą być szczególnie grupy anionowowymienne, takie jak czwartorzędowe związki amoniowe lub grupy dwuetyloaminoetylowe (DEAE), Wymieniaczami kationowymi mogą być zasadniczo słabo lub mocno kwasowe wymieniacze kationowe, takie jak materiały zmodyfikowane kwasem sulfonowym lub fosforowym. Grupy wymieniające jony mogą, ale nie muszą, być związane z włóknem materiału podłożowego przez tak zwaną przekładkę. Materiały przekładkowe zwane są także materiałami "czułkowymi". Odpowiednie przekładki i ligandy określono w DE Na przykład, przekładką może być także część gluksoaminowa cząsteczki. Grupy aniono wo-wymienne, takie jak DEAE lub czwartorzędowe związki amoniowe mogą być także związane z membranami wykonanymi z porowatego metakrylanu poliglicydowego lub z innych wymienionych materiałów. Grupy anionowowymienne są związane albo bezpo-

6 średnio z materiałem tworzącym membranę, albo poprzez przekładkę, np. przez glukozoaminową część cząsteczki. W innym wykonaniu sposobu według wynalazku stosowana jest chromatografia membranowa powinowactwa, w której wykorzystuje się unieruchomione substancje o niskiej lub wysokiej masie cząsteczkowej, mające wysokie powinowactwo ze składnikami osocza zależnymi od witaminy K, jak również z białkiem C i białkiem S, korzystnie pochodzącymi od ludzi lub myszy. Substancje mające powinowactwo ze składnikami osocza zależnymi od witaminy K, czynnikami II, VII, IX, lub X, jak również białkiem C i białkiem S, unieruchomiane są na nośniku za pomocą chemicznie aktywnych grup. Korzystnie jest, aby aktywne grupy nie atakowały bezpośrednio materiału nośnikowego, ale r e a g o w a ł z końcem cząsteczki przekładki. Unieruchomianie substancji mających powinowactwo do czynników dokonywane zachodzi przez wytwarzanie wiązań z takimi aktywnymi grupami, jak grupa tosylowa, tresylowa, hydrazydowa i inne. Właściwe sposoby postępowania znane są z publikacji T. M. Phillipsa "Affinity Chromatography" w "Chromatography" (E. Heftmann, Ed.), 5th edition, Elsevier, Amsterdam Przeciwciała mogą być również wstępnie adsorbowane na membranach, z przyłączonymi jako ligandami białkiem A lub białkiem G. Wymywaniu przeciwciał można zapobiec przez następujące po tym sieciowanie wypełnienia kolumny. W celu sieciowania przeciwciał z białkiem A lub białkiem G membrany można zastosować w sposób podobny do procesu wykorzystującego luźne nośniki. Korzyść unieruchomiania przez związanie z białkiem A lub białkiem G polega na tym, że przeciwciała unieruchomiane są wyłącznie stałym fragmentem cząsteczki (Fc). Dlatego wiążąca część przeciwciała (Fab) pozostaje wolna i jej oddziaływanie z odpowiednimi czynnikami nie jest hamowane. Zgodnie ze sposobem opisanym w EP Al inaktywacja wirusowa dokonywana jest przez potraktowanie detergentami frakcji otrzymywanej z oczyszczania chromatograficznego, takimi jak jonowe i/lub niejonowe związki powierzchniowo aktywne, na przykład w obecności fosforanów dwu- lub trójalkilowych, przykładowo takich jak fosforan trój-n-butylu. Zasadniczo, inaktywacja wirusowa może być także przeprowadzona przed pierwszym etapem chromatograficznym. Do inaktywacji wirusowej korzystnie jest używać Triton X Tween/TNBP (fosforan trój-n-butylu). Dobre rezultaty uzyskuje się również z cholanianem sodowym/tnbp. Korzystnie, detergenty są używane w ilości do 15% wagowych. Jednakże, wirusowa inaktywacja może być także dokonywana obróbką cieplną. W tym sposobie postępowania składniki osocza zależne od witaminy K, jak również białko C i białko S, po pierwszym etapie chromatografii membranowej poddawane są pasteryzacji. Odpowiedni proces zaproponowany jest w niemieckim zgłoszeniu patentowym P Zgodnie z nim do frakcji wzbogaconych czynnikiem VIII dodawane są fosforany dwu- lub trójalkilowe i ewentualnie środki zwilżające w obecności stabilizatorów, takich jak cukry, kwasy aminowe, kationy dwuwartościowe i/lub heparyna, przy czym w tym samym czasie albo następczo po tym dodatku, frakcje te poddawane są działaniu podwyższonej temperatury, w zakresie od 55 C do 70 C, przez okres 5 do 30 godzin. Jeśli jest to pożądane, może być również przeprowadzona filtracja oddzielająca wirusy. Korzystne może być połączenie dwóch sposobów inaktywacji, tzn. obróbki detergentami i ciepłem, jak również filtracji. Przy wyodrębnianiu czynnika IX etap pasteryzacji korzystnie przeprowadzany jest po etapie f) według sposobu według wynalazku. Po tym może być przeprowadzany następny etap chromatografii membranowej, usuwający chemikalia używane przy pasteryzacji. Korzystne jest, aby dodane stabilizatory usuwane były za pomocą membrany zmodyfikowanej DEAE lub czwartorzędowymi związkami amoniowymi, umiejscowionymi poprzez przekładkę na powierzchni nośnika chromatograficznego. Możliwa jest także lokalizacja odpowiednich ligandów na powierzchni nośnika chromatograficznego, bez stosowania przekładki.

7 W wybranych warunkach, stabilizatory nie są zatrzymywane przez materiał anionowymienny, podczas gdy czynniki są na nim adsorbowane. Stabilizatory, które generalnie składają się z substancji o niższej masie cząsteczkowej mogą być również usuwane przez ultra- i dia-filtrację. Jeśli jest to pożądane, wytwarzane frakcje z nagromadzonymi składnikami osocza zależnymi od witaminy K, takimi jak białko C i białko S, są zatężane. Korzystnymi sposobami zatężania są metody obejmujące usuwanie rozpuszczalnika, zazwyczaj wody, w łagodnych warunkach. Szczegółowiej, obejmują one usuwanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym ciśnieniem, tak jak dzieje się to przy, na przykład, liofilizacji (suszeniu w zamrożeniu) lub suszeniu rozpryskowym. Wykorzystanie chromatografii membranowej w sposobie według wynalazku oznacza, ze proces chromatograficzny może być przeprowadzony znacznie szybciej. Co więcej, stosowane membrany mogą być wielokrotnie wykorzystywane. W przeciwieństwie do tego, stosowanie materiału w postaci fazy stałej, zgodnie z dotychczasowym stanem wiedzy, nie zezwala na ponowne jego użycie, ale wymusza jego wyrzucenie. Sposób według wynalazku zilustrowany jest szczegółowiej na przykładzie wyodrębniania czynnika IX. Przykład I. Odmrożone osocze krwi poddano ekstrakcji w fazie stałej z Sephadexem P 50. Po wymyciu substancji zaadsorbowanej na fazie stałej, moc jonową wytworzonej frakcji dostosowywano do wartości odpowiadającej od 10 do 20 mm cytrynianu sodowego przy ph 7,4, po czym frakcję poddano chromatografii membranowej na DEAE QuickDisk (średnica 25 mm; grubość 3 mm). Ciśnienie wynosiło w przybliżeniu 0,3 MPa. Proces chromatograficzny prowadzono przy szybkości przepływu 5 ml/min. Zebrana frakcja zawiera mieszaninę czynnika II i czynnika VII i może być poddana dalszej obróbce. Pik wymywany następnie z kolumny zawiera mieszaninę czynnika IX i czynnika X. Chromatografię membranową przeprowadzono zmieniając początkowy skład buforu w kierunku roztworu B, zawierającego 1 M NaCl, niezależnie od 10 do 20 mm cytrynianu sodowego w ph 7,4. Jeśli używany jest silny wymieniacz anionowy, mający powierzchnię w znacznym stopniu zajętą ligandami, osiąga się wysoką wydajność. Pewne czynniki ograniczające wynikają z selektywności materiału. Przebieg gradientu wymywania zależy od stopnia zajęcia powierzchni nośnika ligandami. Mieszaninę zawierającą czynnik IX i czynnik X poddaje się następnie dalszej chromatografii. Przy tej samej ilości materiału pojemność materiału stosowanego do chromatografii membranowej jest równa lub większa od pojemności materiału w postaci luźnych cząstek. Przykład II. Frakcję uzyskaną zgodnie z przykładem I i zawierającą czynniki IX/X poddaje się przerobowi, tak jak opisano to w Journal of Chromatography, 632 (1993), Frakcję uzyskaną w przykładzie I i zawierającą czynniki IX/X poddaje się heparynowej chromatografii membranowej na zasadzie swoistej sorpcji na zbitej, upakowanej tarczce. Po podaniu na kolumnę w buforze o względnie niskiej mocy jonowej, materiał jest wymywany buforem o mocy jonowej około 500 mosm. Następnie czynnik IX jest wymywany roztworem o gradiencie wzrastającym od 500 mosm do 1000 mosm. Otrzymany w ten sposób czynnik IX ma wysoką czystość. Wydajność odzysku czynnik a IX, zaczynając od pierwszego etapu przerobu, wynosi około 87%.

8 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 2,00 zł.