Przegląd moich tematów badawczych

Transkrypt

1 Czy jest coś, czego się nie da zrobid z bakteriofagiem? Przegląd moich tematów badawczych Marcin Łoś Katedra Biologii Molekularnej Uniwersytet Gdaoski

2 Czym jest bakteriofag? hu.cnsi.ucsb.edu

3 Fagi są wszędzie tam, gdzie istnieją organizmy żywe!

4 Najliczniejsze organizmy żywe na ziemi to bakterie ale wirusy są około 10x bardziej liczne Zdecydowana ich większośd jest dla nas nieszkodliwa. Są za to zabójcze dla bakterii Szacowana ilośd cząstek wirusowych wynosi na całej Ziemi Gdyby je ułożyd w jednym rzędzie utworzyłyby linię razy dłuższą niż średnia odległośd Ziemi od Słooca

5 Cykl infekcyjny bakteriofagów

6 Rozwój bakteriofagów w warunkach powolnego wzrostu komórek gospodarza

7 Głodzone komórki bakteryjne Znacznie obniżona wydolnośd aparatu biosyntezy białek Mniejszą objętośd komórek Większa odpornośd na uszkodzenia przez np. antybiotyki, chloroform Namnażanie się faga ograniczone lub całkiem zastopowane

8 Czemu takie badania są istotne? Wzrost bakterii używanych w wielu procesach przemysłowych jest spowolniony wynika to głownie ze względów technologicznych Bakteriofagi są jednym z głównych zagrożeo procesów biotechnologicznych opartych na bakteriach

9 Procesy przemysłowe oparte na bakteriach

10 Hodowle ciągłe bakterii w chemostatach: Stała objętość hodowli. Czas generacji jest uzależniony tylko od tempa wymiany pożywki w chemostacie, a nie od stężenia substancji odżywczej

11 Rozwój bakteriofagów w procesie biofermentacji. Funkcje kontrolowane automatycznie: Pomiar DOT, ph, temperatury, Utrzymywanie stałego ph, temperatury i dozowanie pożywki Sterowanie szybkością mieszania przestawione na manualne w celu zwiększenia kontroli nad przebiegiem fermentacji Funkcje kontrolowane manualnie: Pomiar OD Dostosowywanie prędkości mieszania Dostosowywanie szybkości przepływu powietrza Dozowanie substancji przeciwdziałającej pienieniu się hodowli

12 Rola genów ri i riii w rozwoju bakteriofaga T4

13 Różnice w ekspresji białek w trakcie zakażenia fagami T4D, T4rI i T4rIII

14 Titer of infected bacteria Phage titer Bakteriofag T4 w głodzonych kulturach bakteryjnych 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E Time (days) Miano fagów i bakterii w głodzonych kulturach E. coli MG1655 zakażonych fagami T4D (romby) T4rI (trójkąty) i T4rIII (kwadraty) Time (days)

15 Jakie są powody różnic w poziomie fagów w infekowanych hodowlach? Brak rozwoju mutantów T4rI i T4rIII w głodzonych komórkach przy jednoczesnym rozwoju T4D umożliwiającym podtrzymanie populacji? Zróżnicowana adsorpcja mutantów i szczepu dzikiego? Kombinacja obu??

16 Normalized free phage Normalized free phage Adsorpcja fagów na komórkach gospodarza 1 0,1 0,01 1 0, Time (min) Adsorpcja fagów ze zwykłego lizatu (romby) i lizatu pasażowanego przez hodowle głodzone (kwadraty) na komórkach głodzonych (panel górny) i rosnących (dolny) w 30 C 0, Time (min)

17 Badania egzopolisacharydu w biofilmach bakteryjnych

18 Budowa biofilmu

19 Znaczenie biofilmu Szkody w procesach przemysłowych Duże znaczenie w patogenezie (mukopolisacharydoza, rany, zapalenie wsierdzia) Łatwa kolonizacja powierzchni (implanty i endoprotezy, cewniki)

20 Cele projektu Optymalizacja metod hodowli biofilmów bakteryjnych Dostarczenie dużych ilości materiału bogatego w EPS Określenie struktury EPS produkowanych przez różne gatunki bakterii

21 Metagenomiczne poszukiwanie aktywności przeciwbakteryjnych i przeciwbiofilmowych w populacjach fagowych

22 Aktywności przeciwbakteryjne Ze względu na charakterystykę cyklu życiowego fagów geny o działaniu przeciwbakteryjnym (lizyny, lizozymy, holiny, inhibitiory biosyntezy ściany komórkowej) stanowią duży procent ich genomów

23 Aktywności przeciwbiofilmowe Naturalne populacje bakteryjne występują często w postaci biofilmu, który jest fizyczna barierą uniemożliwiającą penetrację m.in. przez wirusy Niektóre fagi wytworzyły w odpowiedzi enzymy degradujące EPS (egzopolisacharyd). Enzymy takie mogą byd zasocjowane z kapsydem, lub wydzielane przez lizujące komórki bakteryjne

24 Czemu takie aktywności są cenne? Alternatywa dla antybiotyków, szczególnie w leczeniu miejscowym Poznanie mechanizmów działania przeciwbakteryjnego Niszczenie biofilmów istotne w przemyśle, służbie zdrowia oraz leczenia niektórych chorób

25 Cele projektu Znalezienie w ekspresyjnych bibliotekach genowych jak największej ilości genów godujących interesujące nas aktywności Scharakteryzowanie wybranych genów Analiza bioinformatyczna sekwencji w celu ustalenia pokrewieostwa wybranych genów z sekwencjami zdeponowanymi w bazach danych

26 Rozwój bakteriofagów kodujących geny toksyn Shiga

27 Bakteriofagi jako czynniki patogenności Poza bakteriobójczym działaniem bakteriofagi mogą również odpowiadad za zmianę fenotypu bakterii chorobotwórczych Ze względu na szerokie spektrum gospodarzy mogą zapewnid horyzontalny transfer genów między gatunkami bakterii Poznanie mechanizmów regulacji rozwoju fagów oraz regulacji aktywności genów stx może mied duże znaczenie dla zrozumienia patogenezy zakażeo.

28 Indukcja H2O2 Wypełnione kółka lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24b, trójkąty 27delta tox, wypełnione kwadraty 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox

29 Indukcja mitomycyną C Wypełnione kółka lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24b, trójkąty 27delta tox, wypełnione kwadraty 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox

30 Indukcja norfloksacyną Wypełnione kółka lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24b, trójkąty 27delta tox, wypełnione kwadraty 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox

31 Indukcja szokiem solnym Wypełnione kółka lambda, kwadraty- 22deltatox, wypełnione trójkąty-24b, trójkąty 27delta tox, wypełnione kwadraty 32 delta tox, kółka- 933Wdelta tox

32 Bakteriofagi jako składniki systemu detekcji bakterii

33 Czy fagi mogą zastąpid przeciwciała? Shabani et al. Anal. Chem., 2008, 80,

34 Czy są jakieś zalety stosowania fagów zamiast przeciwciał? Fagi maja zwykle znacznie stabilniejsze domeny odpowiadające za oddziaływanie z bakterią Są tanie w produkcji i stosunkowo łatwe w izolacji Występują fagi zarówno o bardzo szerokich spektrach gospodarza, jak i bardzo waskich, co umożliwia dobranie specyficzności faga do danego testu.

35 OD 405 nm OD 405 nm Czy to działa? 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 kontrola bez przeciwciał biotynylowanych kontrola bez surowicy kontrola bez bakterii kontrola bez faga Ilośd faga/test 0,000-0,200 0,450 0,400 T4D λcib2 P1vir O1 ilość faga na studzienkę Ilośd bakterii/test 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 1,00E+08 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 kontrola bez przeciwciał biotynylowanych kontrola bez surowicy kontrola bez bakterii kontrola bez faga 0,000-0,050 O1 T4D λcib2 P1vir ilość bakterii na studzienkę

36 Wykorzystanie bakteriofagów w hodowli i domieszkowaniu kryształów

37 Fagi filamentarne hu.cnsi.ucsb.edu Rozmiary faga: grubość 6-7 nm Długość: 900 nm

38 Phage display hu.cnsi.ucsb.edu Bakteriofagi filamentarne i ogoniaste umożliwiają modyfikacje niektórych składników kapsydu Pozwala to na produkcje dużych ilości ściśle zdefiniowanych peptydów, które są eksponowane na zewnątrz wirusa

39 Po co? Zastosowao jest wiele od produkcji sztucznych przeciwciał do nanostruktur Możliwe jest tworzenie fagów o mieszanym składzie wiążącym różne elementy Po opłaszczeniu faga np. koloidalnymi zawiesinami metali lub ich związków uzyskujemy wysoko zorganizowane nanostruktury

40 Ze wstępnych badao wynika, że użycie fagów eksponujących sekwencje wiążące takie związki może katalizowad ich krystalizacje Dzięki możliwościom techniki phage display takie kryształy mogą byd precyzyjnie domieszkowane wybranymi związkami lub pierwiastkami Wystarczy wyselekcjonowad peptydy, które je wiążą

41 Mgr Joanna Łoś Mgr Agata Jurczak Mgr Piotr Golec Mgr Magdalena Jakubowska Prof. Grzegorz Węgrzyn dr hab. Borys Wróbel Prof. UG dr hab. Janusz Madaj Prof. Andrzej Kłonkowski Prof. Peter Neubauer (Uniwersytet w Oulu, Finlandia)