Ćwiczenie 1. Oznaczanie aktywności trypsyny metodą Ansona

Transkrypt

1 Ćwiczenie 1 Oznaczanie aktywności trypsyny metodą Ansona Trypsyna jest enzymem katalizującym hydrolizę wiązań peptydowych, w których grupy karbonylowe naleŝą do argininy lub lizyny. Efektem działania trypsyny na białko są peptydy o róŝnej długości łańcucha. Optimum aktywności wykazuje przy ph 7-9. Cechą charakterystyczną produktów enzymatycznej hydrolizy katalizowanej przez trypsynę, wynikającą z jej specyficzności substratowej, jest występowanie w nich lizyny lub argininy jako aminokwasów C-terminalnych. W wyniku procesu trawienia trypsyna roztworu kazeiny, w środowisku zasadowym, z łańcucha polipeptydowego uwalniane są rozpuszczalne w kwasie trichlorooctowym peptydy. Występujące w centrum aktywnym trypsyny aminokwasy (Rys. 1) seryna, histydyna i kwas asparaginowy zwane są triadą katalityczną; triada ta występuje jest miejscem aktywnym wielu α/β fałdowych hydrolaz i zawiera trzy katalityczne reszty, występujące zawsze w tej kolejności w sekwencji aminokwasowej: 1. Reszta nukleofilową (seryna, cysteina lub asparaginian), 2. Reszta katalityczną kwasu (asparaginowego lub glutaminowego), 3. Reszta histydyny. Za pomocą odczynnika Folina-Ciocalteu moŝna oznaczyć zawartość tyrozyny w uwolnionych peptydach. Oznaczenia dokonuje się fotometrycznie, wykorzystując natęŝenie barwy badanej próby wprost proporcjonalnie do ilości zawartej w niej tyrozyny. W środowisku zasadowym odczynnik fosforomolibdenofosforowolframowy jest redukowany zawartą w peptydach tyrozyną do błękitu fosforomolibdenowego. W ćwiczeniu podjęta zostanie równieŝ próba określenia aktywności katalitycznej triady aminokwasów obecnych w miejscu aktywnym trypsyny w postaci wolnej.

2 Rys 1. Schemat przedstawiający strukturę centrum aktywnego i specyficzność substratową trypsyny i chymotrypsyny, Odczynniki: roztwór trypsyny (~3 µm) 1 mm roztwór tyrozyny 1 µm roztwory seryny, histydyny i kwasu asparaginowego 0,1 M bufor dietanoloamina-hcl (ph=8,6) 1 % roztwór kazeiny 0,5 M roztwór NaOH 7 % roztwór CCl 3 COOH 0,2 M roztwór HCl 10% roztwór Na 2 CO 3 Odczynnik Folina-Ciocalteu Inhibitor trypsyny, roztwór 0,05M (Soyabean tripsin inhibitor, B grade 3xcrystalized, Calbiochem )

3 Wykonanie: 1. Hydroliza kazeiny: Do dwóch czystych probówek dodać po 2 ml roztworu kazeiny. Umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 C. Po około 5 minutach do probówki z kazeiną (próba badana) dodać 1 ml enzymu, wymieszać i inkubować w temperaturze 37 C dokładnie przez 15 minut. W celu zakończenia reakcji enzymatycznej, do obu prób, badanej i kontrolnej dodać po 5 ml kwasu trichlorooctowego, a do próby kontrolnej dodatkowo 1 ml enzymu. Wszystkie próby dokładnie wymieszać i pozostawić na 30 minut aŝ do całkowitego wytrącenia osadu białka. Próby przesączyć do suchych probówek przez sączek z bibuły, co pozwoli uzyskać, klarowny przesącz niezawierający białek. Tabela 1 Kolejność odczynników Próba badana Próba kontrolna 1 % roztwór kazeiny 2 ml 2 ml Inkubacja prób w temperaturze 37 C; ok. 5min Roztwór enzymu 1ml - 7 % roztwór kwasu trichlorooctowego Inkubacja prób w temperaturze 37 C; dokładnie 15 minut Roztwór enzymu - lml 2. Spektrofotometryczne oznaczanie zawartości tyrozyny w badanej próbie: Do pięciu czystych enzymatycznie probówek dodać podane w tabeli 2 ilości roztworów. Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję poszczególnych prób w fotometrze przy długości fali 750 nm, ustawionym na zero wobec ślepej próby. Tabela 2 Numer próby Przesącz próby Przesącz próby 0,5 M NaOH Odczynnik Folina H 2 O kontrolnej badanej ml ml ml ml ml KA 2-4 1,2 - KB 2-4 1,2 - BA ,2 -

4 BB ,2 - SP , Wykonanie krzywej wzorcowej dla tyrozyny: Do 6 probówek wprowadzić kolejno podane w tabeli 3 ilości roztworów. Wymieszać dokładnie zawartość wszystkich probówek. Po dziesięciu minutach odczytać wartość absorbancji dla poszczególnych roztworów tyrozyny w odniesieniu do próby kontrolnej (próba 0) przy długości fali 750 nm. Numer próby Roztwór tyrozyny 0,2 M HCI 10% Na 2 CO 3 Odczynnik Folina-C. ml ml ml ml 0 0 2, ,2 1, ,4 1, ,6 1, ,8 1, ,0 1, Wykonać hydrolizę kazeiny za pomocą triady aminokwasowej (His, Asp, Ser) wg punktu 1 uŝywając 1ml mieszaniny aminokwasów. Oznaczenie zawartości tyrozyny przeprowadzić wg. opisu w punkcie Wykonać hydrolizę kazeiny w układzie opisanym w punkcie 1, dodając do pięciu próbek 2, 5, 10, 50, 100 µl roztworu inhibitora trypsyny. Oznaczenie zawartości tyrozyny przeprowadzić wg. opisu w punkcie 2 6. Opracowanie wyników: Wykreślić krzywą wzorcową. Od średniej wartości absorbancji prób badanych odjąć średnią absorbancję prób kontrolnych. Posługując się krzywą wzorcową, odczytać ilość mikromoli tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych przez 1 ml preparatu zawierającego trypsynę w ciągu 15 minut inkubacji z kazeiną. Aktywność enzymu wyrazić w mikromolach tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych podczas hydrolizy przeprowadzonej w warunkach metody, w ciągu 1 minuty przez 1 ml preparatu. Porównać aktywność trypsyny i triady aminokwasów, wyjaśnić obserwowane róŝnice. Opisać wpływ inhibitora trypsyny na reakcję; oszacować ilość enzymu w próbce wiedząc Ŝe 1mg inhibitora wiąŝe się z 1mg trypsyny.

5 ĆWICZENIE 2 Rozkład nadtlenku wodoru w obecności katalazy 0,lM roztwór Na 2 S 2 O 3 ; Roztwór nasycony KI; Lodowaty kwas octowy (80%) Roztwór wodny skrobi Katalaza jest enzymem z grupy oksydoreduktaz, katalizuje proces rozkładu nadtlenku wodoru do wody i tlenu. Otrzymana po raz pierwszy w postaci krystalicznej w 1937 roku przez J.B. Sumnera. Znaczne jej ilości występują w komórkach zwierzęcych np. w wątrobie, nerce, leukocytach i erytrocytach (krwinkach czerwonych), w bakteriach tlenowych oraz w peroksysomach komórek roślinnych fotosyntezujących. Jest bardzo aktywnym enzymem, którego grupę prostetyczną stanowi hem (rysunek 1 przedstawia strukturę katalazy). Produktem wielu reakcji utleniania-redukcji zachodzących w organellach komórkowych jest nadtlenek wodoru, który moŝe być źródłem wolnych rodników. Utrata kontroli organizmu nad produkcją wolnych rodników (tzw. stres oksydacyjny) moŝe prowadzić do uszkodzeń komórek i tkanek. Katalazy obok innych enzymów pełnią kluczową rolę w mechanizmie obronnym rozkładając nadtlenek wodoru do wody i tlenu cząsteczkowego. Rys. 1 Struktura trzecio- i czwartorzędowa katalazy z ludzkich erytrocytów

6 Celem eksperymentu jest zbadanie kinetyki reakcji rozkładu nadtlenku wodoru katalizowanej enzymatycznie katalazą zawartą w ziemniaku. Reakcja zachodzi wg kinetyki pierwszego rzędu, a jej produktem jest tlen cząsteczkowy. Badana będzie początkowa szybkość reakcji w zaleŝności od stęŝenia substratu (H 2 O 2 ). Nieprzereagowany nadtlenek wodoru będzie oznaczany jodometrycznie po 20 minutach reakcji. H 2 O 2 utlenia jony jodkowe: H 2 O 2 + 2I - + 2H + --> 2H 2 O + I 2 (1) Wydzielony w reakcji (1) jod jest odmiareczkowywany za pomocą roztworu tiosiarczanu sodu w obecności skrobi (reakcja 2): I 2 + 2S 2 O > 2I - + S 4 O 6 2- (2) Miareczkowanie jodometryczne: Do kolbki stoŝkowej ze szlifem o pojemności 100 cm 3 wlać 5 cm 3 roztworu kwasu octowego (pod wyciągiem), dodać X cm 3 próbki (X odczytac z Tabeli 1 jako V Próbki). Roztwór nasycić gazowym azotem, dodać 1 cm 3 nasyconego roztworu KI. Kolbkę zatkać korkiem i odstawić do szafki na 10 minut. Po tym czasie odmiareczkować wydzielony jod roztworem tiosiarczanu sodu, dodając pod koniec miareczkowania kilkanaście kropli skrobi. Wykonanie 1. Sporządzić 100 cm 3 0,8 M roztwór H 2 O 2 w wodzie poprzez rozcieńczenie 25% perhydrolu. 2. Korzystając z 0,8 M roztworu H 2 O 2 przygotować próbki macierzyste 1-4 pobierając wskazane w tabeli ilości 0,8 M roztworu (wiersz 1) i dodając wskazane ilości wody destylowanej (wiersz 2). PrzybliŜone stęŝenia nadtlenku wodoru są podane w wierszu Pobrać próbki do miareczkowania jodometrycznego (stosując V Próbki z Tabeli 1), wykonać miareczkowanie. Wpisać objętości 0,1 M roztworu Na 2 S 2 O 3 zuŝytego na miareczkowanie w wierszu 5 tabeli Na podstawie miareczkowania wyznaczyć stęŝenie H 2 O 2 w tak przygotowanych próbkach. Wyniki wpisać do wiersza 6 tabeli 1.

7 Tabela 1 Nr wiersza Nr próbki > V (H 2 O 2 ) V (H 2 O) C (H 2 O 2 ) 0,047 0,093 0,205 0,432 4 V próbki V (Na 2 S 2 O 3 ) 6 C oznaczone 5. Następnie do próbek macierzystych dodać po 5 cm 3 roztworu katalazy. Po 20 minutach pobrać próbki (Tabela 1, V Próbki) do jodometrycznego oznaczenia zawartości H 2 O 2. Wpisać objętości 0,1 M roztworu Na 2 S 2 O 3 zuŝytego na miareczkowanie w wierszu 7 tabeli Wyliczyć stęŝenia H 2 O 2 w wyjściowym roztworze zawierającym katalazę (C 0 ) oraz stęŝenia H 2 O 2 po 20 minutach reakcji rozkładu (C 0 ). Wyniki wpisać do tabeli 2 w wierszach, odpowiednio 8 i 9. C jest miarą postępu reakcji rozkładu H 2 O 2 katalizowanego przez katalazę. Wartości początkowej szybkości reakcji v (wyraŝonej w moldm -3 s -1 ) wpisać do wiersza 11 tabeli 2. Tabela 2 Nr wiersza Nr próbki > V (Na 2 S 2 O 3 ) 8 C 0 9 C C 11 v Opracowanie wyników A. Sporządzić wykres zaleŝności v = f(c ). Skomentować przebieg krzywej. B. Sporządzić wykres Lineweavera-Burka. Wyznaczyć V max i K M. C. Scharakteryzować uŝyty do reakcji enzym

8 ĆWICZENIE 3 Utlenianie fenylenodiamin w obecności peroksydaz Odczynniki: Wodne ekstrakty z ziemniaka i chrzanu; 0,4 M H 2 O 2 ; p-fenylenodiamina (PDA) m-fenylenodiamina (mpda) 2-nitro-1,4-fenylenodiamina (NPDA) Kwas octowy 99,5%, d = 1,05 g/cm3 Octan sodowy Grupą prostetyczną peroksydaz jest protohem, który przeciwnie niŝ w większości hemoprotein jest luźno związany z apoenzymem. W reakcji katalizowanej przez peroksydazę nadtlenek wodoru jest redukowany kosztem róŝnych związków np. kwasu askorbinowego, hydrochinonów i zredukowanego cytrochromu, który działają jako dawcy elektronów. Choć reakcja katalizowana przez peroksydazę jest złoŝona moŝna ją zapisać w następującej formie: H 2 O 2 + AH 2 2 H 2 O + A W erytrocytach i innych tkankach peroksydaza glutatinowa zawiera selen jako grupę prostetyczną. Katalizuje w obecności zredukowanego glutationu rozkład nadtlenku wodoru oraz nadtlenków lipidów, zapobiegając w ten sposób utlenieniu błon fosfolipidowych i hemoglobiny przez nadtlenki

9 Rys 1. Struktura trzecio- i czwartorzędowa peroksydazy chrzanowej Celem eksperymentu jest zbadanie kinetyki reakcji utleniania p-fenylenodiaminy (PPD), m-fenylenodiaminy (mpda) i 2-nitro-1,4-fenylenodiaminy (NPDA) katalizowanej enzymatycznie peroksydazą ziemniaka. Reakcja zachodzi według kinetyki pseudopierwszego rzędu. Reagentem uŝywanym w nadmiarze jest donor atomu tlenu - nadtlenek wodoru. Enzym w obecności nadmiaru utleniacza przechodzi ilościowo w postać formy aktywnej (EO), poniewaŝ równowaga reakcji: H 2 O 2 + E <==> EO +H 2 O E = peroksydaza jest całkowicie przesunięta w kierunku tworzenia EO. Następcza reakcja - utlenianie PPD, mppd i NPPD z wytworzeniem barwnego, fioletowego produktu (PPDO) zachodzi z szybkością zaleŝną wprost proporcjonalnie od stęŝenia substratu w reakcji: PPD + EO --> PPDO + E Reakcja jest katalizowana peroksydazą ziemniaka, której maksimum aktywności przypada na ph 5,5.

10 Wykonanie: 1. Sporządzić po 100 cm 3 0,4 M wodnych roztworów: CH 3 COOH i CH 3 COONa. 2. Wykorzystując te roztwory przygotować 100 cm3 roztworu buforowego o ph 5,5. 3. Sporządzić po 25 cm3 roztworu PPD, mppd i NPPD o dokładnie znanym stęŝeniu, wynoszącym około l,3xl0-2 M w roztworze buforowym o ph 5,5. Do sporządzenia roztworu naleŝy uŝyć odtleniony bufor. Odtlenić równieŝ roztwór w kolbce. 4. Sporządzić 100 cm 3 wodnego 0,4 M roztworu H 2 O 2. Przebieg reakcji będzie obserwowany metodą spektrofotometryczną przy uŝyciu spektrofotometru UV-VIS. Monitorowanie reakcji wymaga sporządzenia roztworu odniesienia, w którym znajduje się PPD, mppd i NPPD o stęŝeniu 3,7xl0-4 M) w roztworze buforowym. Roztwór badany, który naleŝy sporządzić w kuwecie pomiarowej, bezpośrednio przed rozpoczęciem pomiaru, będzie zawierał fenylenodiaminy o takim samym stęŝeniu oraz dodatkowo wyciąg z ziemniaka lub chrzanu oraz nadtlenek wodoru. Szczegóły opisane są w punktach Sporządzić roztwór odniesienia poprzez odmierzenie bezpośrednio do kuwety 100 ul roztworu PPD, mppd i NPPD (z punktu 3) i 3400 ul buforu. Zarejestrować widmo tego odnośnika. 6. Sporządzić roztwór badany poprzez odmierzenie bezpośrednio do kuwety 100 ul roztworu PPD, mppd i NPPD (z punktu 3), 3000 ul buforu, 200 ul roztworu peroksydazy i (szybko wprowadzić i natychmiast wykonać pomiar) 200 ul roztworu H 2 O 2 (z punktu 4). Zarejestrować zmiany absorpcji próbki przy długości fali 520 nm w ciągu 3000 sekund z czasem powtórzenia co 20 sekund. 7. Zarejestrować widmo końcowe. Opracowanie wyników A. Wyliczyć stałą szybkości i czas połówkowej przemiany dla reakcji utleniania PPD, mppd i NPPD; wyjaśnić zróŝnicowanie obliczonych stałych w odniesieniu do własności elektronowych i sterycznych zastosowanych fenylenodiamin. B. Wyjaśnić zaobserwowane róŝnice pomiędzy obserwacjami dla procesów katalizowanych przez peroksydazę z ziemniaka i peroksydazę chrzanową

11