2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej:

Transkrypt

1 Załącznik 2 AUTOREFERAT 1. Imię i Nazwisko: Łukasz Stępień 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej: tytuł magistra inżyniera biotechnologii, specjalność biotechnologia w produkcji roślinnej, Wydział Rolniczy Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu im. A. Cieszkowskiego, 1999 r. stopień doktora nauk rolniczych w zakresie agronomii, Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu, 2005 r. Tytuł rozprawy: Identyfikacja genów odporności na wybrane patogeny grzybowe pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum L.) za pomocą markerów DNA 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych i artystycznych. Od do asystent w Pracowni Biologii Molekularnej, Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu. Od do dzisiaj adiunkt w Pracowni Biologii Molekularnej, w 2010 r. przemianowanej na Pracownię Metabolomiki, od przekształconej wraz z Pracownią Genetyki Odporności w Zakład Genetyki Patogenów i Odporności Roślin, Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu. 4. Wskazanie osiągnięcia* wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego: Analiza genetycznych podstaw zdolności patogenicznych grzybów z rodzaju Fusarium do syntezy różnych grup mikotoksyn. b) autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa wydawnictwa 1) Stępień Ł., Popiel D., Koczyk G., Chełkowski J. Wheat-infecting Fusarium species in Poland their chemotypes and frequencies revealed by PCR assay r. Journal of Applied Genetics 49:

2 2) Stępień Ł., Koczyk G., Waśkiewicz A. FUM cluster divergence in fumonisins-producing Fusarium species r. Fungal Biology 115: ) Stępień Ł., Koczyk G., Waśkiewicz A. Genetic and phenotypic variation of Fusarium proliferatum isolates from different host species r. Journal of Applied Genetics 52: ) Stępień Ł., Gromadzka K., Chełkowski J. Polymorphism of mycotoxin biosynthetic genes among Fusarium equiseti isolates from Italy and Poland r. Journal of Applied Genetics 53: ) Stępień Ł., Jestoi M., Chełkowski J. Cyclic hexadepsipeptides in wheat field samples and esyn1 gene divergence among enniatin producing Fusarium avenaceum strains r. World Mycotoxin Journal 6: DOI: /WMJ ) Stępień Ł., Waśkiewicz A. Sequence divergence of the enniatin synthase gene in relation to production of beauvericin and enniatins in Fusarium species r. Toxins 5: ) Stępień Ł. The use of Fusarium secondary metabolite biosynthetic genes in chemotypic and phylogenetic studies r. Critical Reviews in Microbiology: DOI: / X Mój procentowy udział własny, wyliczony jako średnia udziałów w poszczególnych artykułach, wyniósł około 70%. Kopie prac naukowych stanowiących główne osiągnięcie naukowe wraz z oświadczeniami współautorów określających ich indywidualny wkład w powstanie każdej z publikacji, stanowią załącznik nr 5. c) omówienie celu naukowego ww. prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania. Grzyby z rodzaju Fusarium występują powszechnie w ekosystemach rolniczych i leśnych. Tylko niewielka część spośród kilkudziesięciu gatunków pozostaje wyłącznie saprotrofami, bytującymi w glebie i na martwych szczątkach roślinnych, jednak zdecydowana większość to patogeny, wyspecjalizowane w infekowaniu roślin (Leslie i Summerell 2006), a w przypadku niektórych gatunków Fusarium, także zwierząt i człowieka (Desjardins 2006). Choroby roślin uprawnych, wywoływane przez kompleks gatunków Fusarium powodują każdego roku straty sięgające globalnie kilkunastu procent wysokości plonu (Logrieco i Visconti 2004), co wystarczająco dobitnie świadczy o ogromnym znaczeniu gospodarczym tych grzybów. Skutki porażenia grzybami Fusarium są szczególnie dotkliwe w przypadku roślin zbożowych, takich jak pszenica, ryż, kukurydza, jęczmień, żyto i pszenżyto, w przypadku których grzyb atakuje właśnie najbardziej wartościowe, generatywne części roślin ziarniaki. Ciekawym jest, że te rośliny, stanowiące z jednej strony podstawę wyżywienia ludzkości, z drugiej zaś stanowią grupę roślin uprawnych najbardziej wrażliwych na infekcję przez te patogeny (Chełkowski i in. 2012, Tomczak i in. 2002). 2

3 To jednak nie obniżenie masy ziarniaków, czy zmniejszenie zawartości skrobi i białka stanowi o głównym zagrożeniu ze strony patogenów Fusarium. Praktycznie wszystkie gatunki z tego rodzaju posiadają zdolność biosyntezy rozmaitych metabolitów drugorzędowych, które odznaczają się działaniem toksycznym w stosunku do komórek roślinnych, zwierzęcych, a także ludzkich (Desjardins 2006, Jestoi 2008, Logrieco i in. 1996). Związki te mają różną budowę chemiczną, a także mechanizm ich działania jest różny i ściśle z nią związany. Do najbardziej toksycznych, a także najczęściej zanieczyszczających ziarna zbóż, należą związki z licznej, zróżnicowanej grupy trichotecenów, które wytwarzane są przez takie gatunki jak: Fusarium culmorum, F. graminearum, F. cerealis, F. poae, F. equiseti, F. langsethiae, czy F. sporotrichioides. Należą one do grupy seskwiterpenoidów, a ich spożycie może wywoływać zarówno ostre zatrucia, jak i przewlekłe toksykozy, wymioty, zaburzenia trawienia i centralnego układu nerwowego (Sobrova i in. 2010). Kolejną bardzo istotną grupą mikotoksyn syntetyzowanych przez gatunki Fusarium, stanowią fumonizyny. Występują one w szczególnie wysokich stężeniach w ziarnie kukurydzy i ryżu, a gatunkami odpowiedzialnymi za ich akumulację są głównie F. verticillioides, F. proliferatum i F. fujikuroi, a w mniejszych ilościach także F. anthophilum, F. dlaminii, F. globosum, F. napiforme, F. nygamai, F. sacchari (Kvas i in. 2009). Fumonizyny są związkami o naturze poliketydów, a ich toksyczność polega na zaburzeniu metabolizmu sfingolipidów w komórce (Desjardins 2006). Zearalenon i jego pochodne, syntetyzowane przez takie gatunki jak F. culmorum, F. graminearum, czy F. equiseti, stanowią szczególną grupę związków, wykazujących działanie zbliżone do hormonów estrogenowych. Mimo, że spożycie zanieczyszczonych zearalenonem produktów nie powoduje ostrych zatruć, to potrafi wywołać reakcję (np. hiperestrogenizm u świń) w przypadku znacznie niższych stężeń, niż w przypadku innych toksyn (Gromadzka i in. 2008). Wszystkie wymienione grupy mikotoksyn są zaliczane do najważniejszych ekonomicznie toksycznych metabolitów syntetyzowanych przez grzyby patogeniczne (Desjardins 2006, Logrieco i Visconti 2004), jednakże grzyby z rodzaju Fusarium wytwarzają znacznie więcej toksycznych metabolitów, z których takie jak moniliformina, bowerycyna, eniatyny, czy fuzaproliferyna okazują się związkami o rosnącym znaczeniu (Jestoi 2008). Zdają się to potwierdzać ostatnie doniesienia, zwiększające znacząco stan wiedzy na temat genów zaangażowanych w biosyntezę bowerycyny i eniatyn (Stępień i Waśkiewicz 2012, Zhang i in. 2012), a także fuzaryn i kwasu fuzariowego (Brown i in. 2012). Metody analityczne pozwalające na jakościową i ilościową analizę poszczególnych mikotoksyn w materiale roślinnym i żywności są wykorzystywane i doskonalone od dziesięcioleci. W ostatnich latach co najmniej równym zainteresowaniem naukowców cieszą się mechanizmy i szlaki biochemiczne odpowiedzialne za biosyntezę tych metabolitów, a także czynniki środowiskowe wpływające na intensywność ich tworzenia. Dzięki temu, w ciągu ostatnich kilkunastu lat poznano zarówno strukturę klastrów genów, odpowiedzialnych za biosyntezę trichotecenów, fumonizyn i zearalenonu przez modelowe gatunki Fusarium: 3

4 F. graminearum, F. oxysporum i F. verticillioides, jak i wiele czynników regulujących ich ekspresję i aktywność (Proctor i in. 2003, 2008, Kimura i in. 2007, Lysøe i in. 2008). Wyniki uzyskane dzięki tym badaniom, wraz z lawinowym wręcz rozwojem technik molekularnych otworzyły zupełnie nowy rozdział w badaniach tych ważnych patogenów, jak również innych przedstawicieli rodzaju Fusarium, umożliwiając szczegółowe studiowanie powiązań filogenetycznych pomiędzy nimi, a także zdarzeń, które zaszły w toku ewolucji i przyczyniły się do zmian i przystosowań adaptacyjnych, którym patogeny te podlegały w przeszłości, szczególnie w kontekście najważniejszych szlaków biochemicznych metabolizmu drugorzędowego poszczególnych gatunków z rodzaju Fusarium. Te właśnie założenia legły u podstaw moich badań nad genetycznymi podstawami zdolności patogenicznych grzybów z rodzaju Fusarium do syntezy różnych grup mikotoksyn, opisanych szczegółowo poniżej. Ich zasadniczym celem było zbadanie powiązania pomiędzy występowaniem konkretnych wariantów sekwencji w obrębie klastrów biosyntetycznych genów TRI, FUM, ZEA, ENN/BEA i innych, a zdolnościami badanych genotypów do syntezy odpowiednich grup mikotoksyn: trichotecenów, fumonizyn, zearalenonu oraz eniatyn i bowerycyny. Dodatkowo, potwierdziłem wyjątkową przydatność regionów genomu, kodujących enzymy szlaków biosyntetycznych poszczególnych metabolitów drugorzędowych, do analiz filogenetycznych poszczególnych gatunków, jak również szczepów jednego gatunku o różnym pochodzeniu (Stępień 2013). Pierwszą grupą mikotoksyn fuzaryjnych, nad którą prowadziłem badania, były trichoteceny, a także patogeny odpowiedzialne za ich biosyntezę w porażonych ziarniakach zbóż Fusarium graminearum, F. culmorum i F. cerealis. Izolaty tych trzech gatunków zidentyfikowałem, z wykorzystaniem markerów gatunkowo specyficznych, zarówno w laboratoryjnych kulturach szczepów z kolekcji IGR PAN, jak i bezpośrednio w materiale roślinnym próbkach zebranych z porażonych fuzariozą kłosów pszenicy, zebranych z pól w różnych lokalizacjach z Polski w 2006 roku. Interesującym wnioskiem było zaobserwowanie zwiększenia częstości występowania F. graminearum w okresie od roku 1998 do 2006, przy jednoczesnym zmniejszeniu się częstości występowania F. culmorum. Po raz pierwszy potwierdziłem trzy występujące w polskich populacjach patogenów chemotypy: 3-acetylodeoksyniwalenolu (3Ac-DON), 15-acetylodeoksyniwalenolu (15Ac-DON) oraz niwalenolu (NIV) za pomocą chemotypowo-specyficznych markerów PCR, amplifikując charakterystyczne fragmenty genów TRI3 i TRI7, za pomocą starterów opisanych w dostępnej literaturze. Potwierdziłem także obecność markera genu TRI5, kodującego syntezę trichodienu, kluczowy enzym szlaku biosyntezy trichotecenów, choć nie we wszystkich analizowanych próbach. Wynika to najprawdopodobniej ze znacznej zmienności sekwencji w rejonie wiązania starterów markera tego genu. Uzyskane przeze mnie wyniki wykazały znacznie większą częstość chemotypu 15Ac-DON w populacji F. graminearum, natomiast w populacji F. culmorum częściej występował chemotyp 3Ac-DON. Chemotyp NIV jest w przypadku obu gatunków najrzadziej występującym, natomiast z jednym tylko wyjątkiem został stwierdzony we wszystkich badanych szczepach F. cerealis. 4

5 Kolejnym istotnym etapem mojego osiągnięcia było zbadanie polimorfizmu sekwencji w obrębie klastra genów FUM, zaangażowanych w biosyntezę fumonizyn przez grzyby Fusarium. Analizowana była także zmienność w poziomie biosyntezy tych mikotoksyn przez szczepy kilku gatunków Fusarium: F. anthophilum, F. dlaminii, F. fujikuroi, F. nygamai, F. oxysporum, F. proliferatum, F. verticillioides, oraz szczepów, wstępnie zakwalifikowanych do gatunku F. subglutinans, jednakże później, na podstawie analizy sekwencji dodatkowych regionów genomu, zidentyfikowanych jako F. temperatum i F. ananatum. Ilościowe analizy zawartości fumonizyn B przeprowadzone zostały przez dr Agnieszkę Waśkiewicz z Katedry Chemii UP w Poznaniu. Spośród analizowanych gatunków szczepy F. proliferatum syntetyzowały najwięcej fumonizyn (powyżej 1 mg FB na gram suchej masy), i to niezależnie od gatunku gospodarza i pochodzenia geograficznego, natomiast wśród pozostałych gatunków stwierdzono większą zmienność pomiędzy genotypami. Przynajmniej część tej zmienności może wynikać bezpośrednio ze strukturalnych różnic w klastrze genów FUM pomiędzy szczepami Fusarium pochodzącymi ze zróżnicowanych środowisk. Dlatego też analizom poddano trzydzieści szczepów o różnym pochodzeniu geograficznym, izolowanych z różnych gatunków roślin. Specjalnie w tym celu, zaprojektowałem szereg starterów amplifikujących fragmenty genów FUM1 i FUM8, a także regiony międzygenowe, położone pomiędzy genami FUM21, FUM1, FUM6, FUM7 i FUM8. Na podstawie różnic w sekwencji genu tef-1α, zaprojektowałem marker specyficzny dla gatunku F. fujikuroi, natomiast na podstawie polimorfizmu sekwencji w obrębie klastra genów FUM, marker specyficzny dla F. nygamai. Na podstawie analizy porównawczej międzygenowych regionów w obszarze klastra FUM wykazano, że historia ewolucyjna tego szlaku metabolicznego u przedstawicieli poszczególnych gatunków Fusarium może być odmienna. Na podstawie uzyskanych wyników, w perspektywie dalszych badań, sformułowałem roboczą hipotezę, że analiza sekwencji kodujących z tego klastra (np. genu FUM1), jak również innych klastrów warunkujących biosyntezę mikotoksyn, może być doskonałym narzędziem do badania zróżnicowania genetycznego populacji na poziomie wewnątrzgatunkowym, z uwagi na znacznie wyższą zmienność tych regionów genomu niż powszechnie do tej pory stosowanych zachowawczych sekwencji typu ITS, tef-1α, czy tub-2. W pierwszej kolejności, sprawdzanie słuszności powyższej hipotezy, rozpocząłem od analizy porównawczej grupy 38 genotypów F. proliferatum, izolowanych na przestrzeni ok. 30 lat, pochodzących z różnych krajów świata i z roślin należących do dziewięciu różnych gatunków. Większość z badanych szczepów wyizolowałem samodzielnie w latach , pozostałe pochodziły z kolekcji KF przy IGR PAN. Analiza ta miała na celu porównanie zmienności sekwencji genu FUM1 pomiędzy szczepami, w odniesieniu do polimorfizmu w obrębie genu tef-1α, ulegającemu konstytutywnej ekspresji. Zbadałem zależność szybkości wzrostu szczepów w warunkach laboratoryjnych (na pożywce PDA) w różnych temperaturach (20-35 C), w zależności od pochodzenia. Cztery szczepy rosły zdecydowanie szybciej od pozostałych. Dwa z nich wyizolowano z ryżu, po jednym zaś z kukurydzy i szparaga. Dzięki pomocy dr Agnieszki Waśkiewicz z Katedry Chemii UP w Poznaniu, określiłem także ich zdolność do biosyntezy fumonizyn w warunkach laboratoryjnych. Stwierdzono znaczne różnice w poziomach wytwarzanych fumonizyn B, większość szczepów 5

6 syntetyzowała FB w znacznych ilościach (powyżej 1 mg/g s.m.). Wśród czterech najszybciej rosnących genotypów również zaobserwowano znaczne zróżnicowanie w ilości wytworzonych fumonizyn. Analiza sekwencji genu FUM1 okazała się przydatna do wykazania znacznego zróżnicowania szczepów F. proliferatum, które, co warte podkreślenia, często było ściśle powiązane z pochodzeniem szczepu (jak w przypadku genotypów izolowanych z czosnku i ananasa), jak również z cechami metabolizmu (jak w przypadku 4 szybkorosnących szczepów). W kolejnym doświadczeniu analizie poddanych zostało 27 szczepów reprezentujących dwie niezależne populacje Fusarium equiseti, w większości pochodzące z terenu Polski (zdeponowane w kolekcji KF przy IGR PAN) oraz z Włoch (ITEM Collection przy ISPA, CNR, Bari), ale znalazły się w nich również szczepy pochodzące z innych krajów (np. z Argentyny). Gatunek ten jest częściej spotykany w klimacie tropikalnym i subtropikalnym, ale jest również izolowany z rozmaitych gatunków roślin strefy umiarkowanej. Jedną z podstawowych mikotoksyn syntetyzowanych przez przedstawicieli tego gatunku jest zearalenon (ZEA), jednakże w kulturach F. equiseti identyfikowano także takie metabolity jak fuzarochromanon, fuzarenon X oraz trichoteceny z grupy A. Wykonane analizy molekularne szczepów pochodzących z badanych populacji, wykazały wysoki stopień polimorfizmu sekwencji genomowych. Dowodzą tego uzyskane wyniki, poczynając od identyfikacji markerów gatunkowo-specyficznych, w której siedem genotypów dało wyniki fałszywie negatywne, poprzez brak amplifikacji markerów dla poszczególnych genów TRI i PKS z klastrów TRI i ZEA, warunkujących biosyntezę trichotecenów i zearalenonu, a skończywszy na różnicach w sekwencji genu tef-1α. Geny kodujące dwie syntazy poliketydowe (PKS4 i PKS13) identyfikowałem na podstawie dedykowanych starterów, zaprojektowanych w oparciu o sekwencje zdeponowane w bazie NCBI, pochodzące z F. graminearum, natomiast gen syntazy eniatyn (esyn1) za pomocą markera zaprojektowanego na podstawie sekwencji homologicznego genu z F. scirpi (również dostępnej w bazie NCBI). Do identyfikacji genów TRI5 i TRI4 wykorzystałem markery opisane wcześniej, zaprojektowane na podstawie sekwencji pochodzących z F. graminearum i F. sporotrichioides. Pomimo, że oryginalne sekwencje genów PKS i TRI pochodziły z innych gatunków niż F. equiseti, możliwe było zidentyfikowane genów homologicznych. Szczepy F. equiseti z populacji włoskiej generalnie syntetyzowały większe ilości zearalenonu, niż szczepy polskie, jednak nie udało mi się zidentyfikować w nich genów odpowiedzialnych za zdolność do syntezy ZEA. Prawdopodobnie wynika to ze znacznej zmienności sekwencji tych genów, co może oznaczać, że dla każdego gatunku (a przynajmniej dla niektórych) wymagane będzie niezależne zaprojektowanie starterów służących amplifikacji homologicznych sekwencji w celu ich wiarygodnej identyfikacji. Chociaż w żadnym z badanych genotypów F. equiseti nie stwierdziłem obecności genu esyn1, kodującego syntazę eniatyn, kontynuowałem badania nad szlakiem biosyntezy cyklicznych peptydów, do których między innymi należą wspomniane eniatyny (głównie analogi A, A 1, B i B 1 ). Jednym z gatunków syntetyzujących eniatyny z największą wydajnością, jest Fusarium avenaceum. Jednocześnie, jako jeden z niewielu, nie wytwarza on bowerycyny (BEA). BEA jest również cyklicznym peptydem i związkiem syntetyzowanym przez liczne gatunki z rodzaju 6

7 Fusarium. Markery opracowane we wcześniejszych badaniach, zostały wykorzystane do zbadania wewnątrzgatunkowej zmienności genetycznej pomiędzy szczepami F. avenaceum, uważanego dotąd za gatunek dość zmienny. Oprócz eniatyn, syntetyzuje on w znacznych ilościach moniliforminę, niestety, mimo wieloletnich wysiłków, jak dotąd nie udało się poznać szczegółów powstawania tego metabolitu. W latach 2005 i 2009 na obszarze Polski były wyjątkowo sprzyjające gatunki do infekcji pszenicy przez F. avenaceum, jak również późniejszego rozwoju choroby wywołanej przez tę infekcję. Dlatego też w latach tych pozyskano znaczną liczbę prób kłosów naturalnie porażonych przez F. avenaceum, które rozdzielono na frakcje ziarniaków i plew. We współpracy z Dr. Mariką Jestoi z fińskiego instytutu EVIRA w Helsinkach, przeprowadzono analizy zawartości eniatyn w tych frakcjach, jak również w hodowlach dwóch oczyszczonych szczepów F. avenaceum prowadzonych w warunkach laboratoryjnych. We wszystkich próbach stwierdzono większe zanieczyszczenie eniatynami plew niż ziarna, a we frakcji plew dwóch prób zanotowano ok. 70 mg eniatyn na kg s.m. Z wykorzystaniem starterów zaprojektowanych we wcześniejszych pracach, potwierdziłem obecność genu esyn1 w badanych genotypach, a także przeprowadziłem sekwencjonowanie jego dwóch fragmentów. Analiza filogenetyczna obu sekwencji wykazała większą zmienność regionu amplifikowanego za pomocą starterów beas1/beas2, chociaż nie udało się otrzymać sekwencji fragmentu markerowego w przypadku wszystkich testowanych genotypów F. avenaceum. Należy dodać, że dalsze badania faktycznie wykazały większą przydatność tej pary starterów do identyfikacji gatunków syntetyzujących bowerycynę (BEA), niż eniatyny. W ostatnich latach poznano sekwencję klastra genów odpowiedzialnych za syntezę BEA u grzyba entomopatogenicznego Beauveria bassiana, a także u F. prolifeatum. Fragment tego klastra wykazuje podobieństwo do genu syntazy eniatyn z F. scirpi. Wydało się więc wysoce prawdopodobne, że zarówno eniatyny, jak i BEA, powstają dzięki aktywności jednego klastra, którego funkcja uległa u różnych gatunków znacznej dywergencji, obserwowanej obecnie pomiędzy gatunkami Fusarium syntetyzującymi wyłącznie BEA, bądź eniatyny. Na podstawie własnych sekwencji z F. proliferatum, F. oxysporum i F. nygamai, a także sekwencji pochodzących z bazy NCBI, udało mi się zaprojektować zdegenerowane startery, pozwalające na amplifikację zmiennego regionu genu esyn1 zarówno ze szczepów wytwarzających bowerycynę, eniatyny, oraz mieszaninę obu mikotoksyn. Analiza sekwencji 58 izolatów należących do 20 gatunków Fusarium pozwoliła na rozróżnienie dwóch zasadniczych grup: producentów eniatyn i bowerycyny. Co ciekawe, udało mi się uzyskać sekwencję homologicznego regionu także ze szczepów należących do gatunków uważanych powszechnie za niezdolne do syntezy cyklicznych peptydów: F. verticillioides i F. polyphialidicum. Prawdopodobnie świadczy to o stosunkowo niedawnej utracie funkcjonalności tego klastra w tych gatunkach. Nie udało się natomiast potwierdzić obecności badanego regionu w genomach F. equiseti oraz F. solani. W wyniku przeprowadzonej analizy filogenetycznej, sekwencje pochodzące ze szczepów F. oxysporum grupowały się niezależnie od pochodzącej z bazy NCBI, opisanej jako F. oxysporum, co może sugerować błędne oznaczenie gatunkowe tego konkretnego genotypu. Na podkreślenie zasługuje również fakt odmiennego grupowania izolatów na podstawie porównania sekwencji genu esyn1 pochodzących z Fusarium poae niż miało to miejsce w 7

8 przypadku rekonstrukcji filogenetycznych opartych o inne rejony genomu. Najprawdopodobniej wynika to z odmiennej historii ewolucyjnej tego klastra w przypadku gatunku F. poae. W ostatniej pracy zebrałem i podsumowałem informacje na temat prowadzonych w ostatnich latach pracach molekularnych, zmierzających do jak najlepszego poznania gatunków należących do rodzaju Fusarium, a także do dokładnej charakterystyki populacji poszczególnych gatunków. W analizach tych, oprócz powszechnie stosowanych w analizach filogenetycznych sekwencji ulegających konstytutywnej ekspresji, coraz częściej brane są pod uwagę regiony genomu (klastry genów) zaangażowane w procesy biosyntezy metabolitów drugorzędowych. Poza oczywistym znaczeniem mikotoksyn jako związków niepożądanych w materiale roślinnym, podejście takie pozwala na dokładniejsze prześledzenie ewolucyjnej historii gatunków wchodzących w skład rodzaju Fusarium, szczególnie w kontekście ewolucji funkcji tych klastrów genów u gatunków zajmujących różne środowiska i odmienne nisze ekologiczne. Dodatkowo, analizy takie można prowadzić w szerszym kontekście, na przykład klaster genów FUM poza gatunkami Fusarium posiadają także inne patogeny grzybowe, takie jak Aspergillus niger i Tolypocladium inflatum, a klaster genów warunkujących biosyntezę bowerycyny i eniatyn, oprócz entomopatogenicznego Beauveria bassiana oraz licznych przedstawicieli rodzaju Fusarium, zidentyfikowano również u kilku gatunków z rodzaju Trichoderma (Stępień, dane nieopublikowane). Wyniki badań publikowane w ostatnich kilku latach dobitnie świadczą o rosnącym zainteresowaniu naukowców genetycznymi podstawami biosyntezy rozmaitych grup metabolitów drugorzędowych, i to nie tylko i wyłącznie mikotoksyn, ale także związków potencjalnie użytecznych, w perspektywie konkretnych zastosowań biotechnologicznych. Należy tu wymienić rozmaite grupy enzymów litycznych (celulazy, chitynazy), związki o charakterze antybiotyków, czy pigmentów (aurofuzaryna, bikaweryna). Wydaje się wysoce prawdopodobne, że wraz z lawinowym wzrostem liczby odczytywanych sekwencji genomowych pochodzących z różnych gatunków grzybów, a także sukcesywnie publikowanych sekwencji pełnych poznanych genomów najważniejszych gatunków patogenicznych, zaprezentowany w niniejszym osiągnięciu kierunek badań naukowych będzie się dynamicznie rozwijał, nie tylko w celu uzupełnienia wiedzy w obszarach dotąd nieodkrytych (np. szlak i mechanizm biosyntezy istotnej mikotoksyny fuzaryjnej moniliforminy), jak i stawiania nowych wyzwań w przypadku dobrze już poznanych szlaków (regulacja ekspresji genów, inhibicja szlaków metabolicznych mikotoksyn, nadekspresja genów związanych z wytwarzaniem naturalnych antybiotyków, czy enzymów). 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych. Sumaryczny impact factor wszystkich artykułów według listy Journal Citation Reports (JCR), zgodnie z rokiem opublikowania: IF=30,041 Sumaryczna liczba punktów MNiSW: 469 Liczba cytowań publikacji według bazy Web of Science (WoS): 117 Liczba cytowań publikacji według bazy Scopus: 192 8

9 Indeks Hirscha of według bazy Web Science (WoS): H=7 Indeks Hirscha of według bazy Scopus: H=8 Pracę naukową rozpocząłem jako doktorant w Pracowni Biologii Molekularnej Instytutu Genetyki Roślin PAN w Poznaniu w lutym 2000 roku. Przedmiotem moich badań była identyfikacja genów odporności na rdzę brunatną (geny Lr) i mączniaka prawdziwego (geny Pm) pszenicy przy użyciu markerów DNA. W okresie prowadzenia prac badawczych w literaturze naukowej pojawiła się znaczna liczba nowych, opracowanych w ośrodkach zagranicznych, markerów, zaprojektowanych do identyfikacji poszczególnych genów odporności w różnorodnym materiale roślinnym (Chełkowski i Stępień 2001). Markery te często nie były testowane na wystarczająco szerokiej grupie linii i odmian pszenicy o zróżnicowanym pochodzeniu geograficznym (Stępień i in. 2001). Stąd też wynikał cel podjętych badań, jako że część z identyfikowanych genów odporności była wciąż efektywna w naszej części Europy (Chełkowski i in. 2003, Stępień i in. 2001, 2002, Wiśniewska i in. 2003). Przeprowadzone badania pozwoliły zweryfikować przydatność szesnastu opublikowanych wcześniej markerów do identyfikacji sprzężonych genów odporności Lr i Pm, z których tylko kilka (markery dla genów Pm1, Pm13, Lr1, Lr9, Lr10, Lr19, Lr24, Lr37 i Lr47 okazały się przydatne do wykorzystania w praktyce, np. do selekcji materiałów hodowlanych (Błaszczyk i in. 2004, Stępień i in. 2003, 2004). W trakcie realizacji pracy doktorskiej (lata ) brałem udział jako wykonawca w projekcie zamawianym Wykorzystanie genetycznych i molekularnych podstaw rozmnażania i odporności roślin na stresy środowiskowe dla poprawy właściwości roślin uprawnych, w zakresie zadania badawczego: Markery DNA dla identyfikacji genów odporności na patogeny grzybowe pszenicy. Już po przyznaniu mi stopnia doktora, korzystając z uzyskanych wcześniej wyników badań, realizowałem jako kierownik zadania badawczego projekt Ministerstwa Rolnictwa i Rozwoju Wsi Wykorzystanie markerów molekularnych do oceny materiałów wyjściowych pszenicy ozimej o poprawionej wartości wypiekowej oraz odporności na rdzę brunatną (lata ). Mając do dyspozycji kolekcję kilkudziesięciu odmian polskich pszenic, podczas jednego z zagranicznych stażów naukowych, dokonałem analizy ich zróżnicowania genetycznego za pomocą markerów mikrosatelitarnych (Stępień i in. 2007). W roku 2005 otrzymałem stypendium Fundacji Nauki Polskiej dla młodych naukowców (obecnie program START). W ostatnich latach w moim zespole prowadzone są także badania, których celem jest wykorzystanie naturalnych zdolności niektórych gatunków z rodzajów Trichoderma i Clonostachys do antybiozy i nadpasożytnictwa w stosunku do patogenicznych gatunków Fusarium, oraz do enzymatycznego przekształcania mikotoksyn do związków mniej toksycznych (Popiel i in. 2008). Badania te realizowane były między innymi w ramach dwóch projektów Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego: projektu zamawianego Mikroorganizmy i związki naturalnego pochodzenia potencjalnie przydatne w uprawie roślin oraz mechanizmy ich działania (okres realizacji ) oraz projektu własnego Charakterystyka izolatów grzybów z rodzaju Trichoderma i Clonostachys o zdolnościach do rozkładu mikotoksyn fuzaryjnych (lata ), w których brałem udział jako wykonawca. 9

10 Od kilkunastu lat, w zespole, którego jestem obecnie liderem, realizowany był temat związany z monitorowaniem populacji patogenicznych grzybów z rodzaju Fusarium atakujących zboża, a także syntetyzowanych przez nie toksycznych metabolitów wtórnych. W temacie tym byłem odpowiedzialny za identyfikację molekularną szczepów izolowanych z pozyskanego materiału roślinnego (Chełkowski i in. 2002, Tomczak i in. 2002). Ostatnio, temat ten został poszerzony o analizy populacje toksynotwórczych gatunków Fusarium atakujących inne niż zboża gatunki roślin, np. ananas, kukurydzę, szparag, groch. Wyniki badań są sukcesywnie publikowane (Stępień i in. 2011b, 2013b, Waśkiewicz i in. 2013), a także prezentowane na konferencjach krajowych i zagranicznych. Na bazie zdobytego dzięki temu doświadczenia, a także bogatej kolekcji materiału badawczego, skrystalizowała się tematyka badań stanowiących moje główne osiągnięcie naukowe. Aktualnie jestem kierownikiem dwóch projektów indywidualnych: Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego Zróżnicowanie genów FUM u różnych gatunków Fusarium i jego związek z efektywnością wytwarzania fumonizyn ( ), oraz NCN Wpływ ekstraktu z roślin gospodarzy na syntezę mikotoksyn oraz aktywność transkrypcyjną i metaboliczną patogenicznych izolatów Fusarium proliferatum (także lata ). Ponadto, jestem wykonawcą zadania badawczego Identyfikacja grzybów chorobotwórczych występujących na nasionach roślin strączkowych oraz oznaczanie ich metabolitów o właściwościach toksycznych i antyżywieniowych wykonywanego w ramach Krajowego Projektu Wieloletniego Zwiększenie stabilności i jakości plonu wysokobiałkowych roślin strączkowych (okres realizacji: ). Badania objęte tym projektem stanowić będą zasadniczą część rozprawy doktorskiej pani Karoliny Wilman, której jestem opiekunem naukowym. Ich wyniki były prezentowane na kilku konferencjach naukowych w latach , a także zostały opublikowane w pracy Waśkiewicz i in. (2013). Począwszy od 1999 roku brałem aktywny udział w krajowych i międzynarodowych konferencjach naukowych, prezentując wyniki badań własnych w formie około 30 posterów oraz 19 referatów (12 wystąpień, w kolejnych siedmiu jako współautor). Od roku 2003 byłem współorganizatorem dwunastu tematycznych konferencji krajowych dotyczących genetyki odporności zbóż (Rośliny zbożowe markery molekularne dla jakości, odporności i identyfikacji) oraz identyfikacji i charakterystyki grzybów patogenicznych (Grzyby mikroskopowe i ich metabolity), które odbyły się w Instytucie Genetyki Roślin PAN w Poznaniu. W ramach Centrum Doskonałości w Agrobiologii i Genetyce Molekularnej Roślin PAGEN, współorganizowałem międzynarodową konferencję naukową i byłem współredaktorem monografii Microscopic fungi host resistance genes, genetics and molecular research Chełkowski, Stępień (Eds.), PAGEN Centre of Excellence in Plant Agrobiology and Molecular Genetics, Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań. Brałem również udział w komitecie organizacyjnym warsztatów Krajowej Sieci Naukowej Transgeneza i Genomika Roślin Uprawnych CROPNET. 10

11 W okresie byłem promotorem trzech prac magisterskich, w roku akademickim pod moim kierownictwem realizowana będzie praca inżynierska. Sprawuję opiekę naukową nad doktorantką ( od października 2011), a od września 2013 planowane jest do naszego zespołu kolejnego doktoranta, nad którego pracą będę sprawował opiekę naukową. Zarówno w czasie realizacji doktoratu, jak i w latach późniejszych, odbyłem kilka stażów naukowych w placówkach zagranicznych w uznanych ośrodkach naukowych w Niemczech (Technical University Munich, Freising, oraz Institute of Epidemiology and Resistance, Aschersleben), a także we Włoszech (Institute of Science of Food Production, Bari), łącznie przez prawie sześć miesięcy. Nawiązałem aktywną współpracę z naukowcami z uznanych ośrodków zagranicznych i krajowych, która obejmuje następującą zróżnicowaną tematykę: - mapowanie markerów sprzężonych z genami odporności na patogeny pszenicy, analiza polimorfizmu markerów mikrosatelitarnych pomiędzy odmianami pszenic polskich (TUM, Freising, Niemcy, Dr. Volker Mohler), wyniki prezentowane na konferencjach, a także opublikowane (Stępień i in. 2004, Stępień i in. 2007), - identyfikacja glukozylowanych pochodnych mikotoksyn trichotecenowych w próbach ziarna zbóż (BOKU, Wiedeń, Austria, Dr. Franz Berthiller), wyniki opublikowane w World Mycotoxin Journal (Chełkowski i in. 2012), - identyfikacja cyklicznych peptydów (bowerycyny i eniatyn) w próbach ziarna pszenicy z polskich pól (EVIRA, Helsinki, Finlandia, Dr. Marika Jestoi), wyniki opublikowane w World Mycotoxin Journal (Stępień i in. 2013a), - analiza sekwencji genów kodujących enzymy szlaku biosyntezy trichotecenów i fumonizyn (ISPA CNR, Bari, Włochy, Dr. Antonella Susca, Dr. Antonio Moretti), - identyfikacja mikotoksyn w materiale roślinnym i kulturach szczepów Fusarium (Katedra Chemii, UP, Poznań, dr Agnieszka Waśkiewicz, dr Karolina Gromadzka), wyniki prezentowane na konferencjach i publikowane wielokrotnie w latach , współpraca w ramach projektów MNiSW i NCN - analiza polimorfizmu genów FUM w kolekcji izolatów F. verticillioides (Katedra Fitopatologii, SGGW, Warszawa, prof. dr hab. Wojciech Wakuliński, dr Marcin Wit), wyniki prezentowane były na konferencjach i zostały opublikowane (Stępień i in. 2008), - analiza statystyczna wyników (Katedra Metod Matematycznych i Statystycznych, UP, Poznań, dr Jan Bocianowski), wyniki opublikowane w czasopiśmie Genetic Resources and Crop Evolution (Stępień i in. 2007), - identyfikacja gatunków Fusarium infekujących kukurydzę w polskich warunkach klimatycznych (IHAR-PIB, Radzików, dr Elżbieta Czembor), wyniki prezentowane na trzech konferencjach w 2013 roku, publikacje w przygotowaniu, - molekularna identyfikacja gatunków i chemotypów Fusarium w próbach pszenicy (IHAR-PIB, Radzików, dr Tomasz Góral), wyniki zostaną opublikowane wkrótce (artykuł po recenzji wysłany do Central European Journal of Biology), 11

12 - toksynotwórcze właściwości gatunków Fusarium (Zakład Fitopatologii Molekularnej, UTP Bydgoszcz, dr inż. Leszek Lenc, dr inż. Aleksander Łukanowski, dr inż. Anna Baturo- Cieśniewska), wyniki opublikowane w pracy (Chełkowski i in. 2012), - molekularna identyfikacja grzybów mikroskopowych izolowanych z bibliotek, archiwów i muzeów (Politechnika Łódzka, dr hab. Beata Gutarowska, mgr Justyna Skóra), wyniki badań prezentowane były na konferencji w czerwcu 2013 roku i zostaną wkrótce opublikowane (Skóra i in. 2013). Byłem recenzentem projektu międzynarodowego, zgłoszonego w ramach Food and Nutrition Call 2012, Vienna Science and Technology Fund. Dokonałem także recenzji kilkunastu artykułów w następujących międzynarodowych czasopismach naukowych: Journal of Applied Genetics, Journal of Agricultural and Biological Sciences, Annals of Applied Biology, Canadian Journal of Microbiology, Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology, Polish Journal of Environmental Studies, Journal of Integrative Agriculture, African Journal of Agricultural Research oraz Journal of Applied Microbiology. Od 2013 roku jestem członkiem Polskiego Towarzystwa Genetycznego oraz Polskiego Towarzystwa Mykologicznego. Poza pracą naukową udzielam się także na gruncie działalności kulturalno-oświatowej i społecznej. Od 1997 roku należę do ogólnopolskiego Związku Polskich Fotografów Przyrody, przez dwie kadencje pełniąc funkcję wiceprezesa Zarządu Głównego ZPFP. Należę także do innych organizacji zrzeszających miłośników fotografii (Poznańska Grupa Fotograficzna, Fotoklub RP), organizowałem plenery, wystawy, prelekcje i pokazy slajdów. Literatura Błaszczyk L, Goyeau H, Huang X, Röder M, Stępień Ł, Chełkowski J Identification of leaf rust resistance genes and mapping gene Lr37 on microsatellite map of wheat. Cell Mol Biol Lett 9: Brown DW, Butchko RA, Busman M, Proctor RH Identification of gene clusters associated with fusaric acid, fusarin, and perithecial pigment production in Fusarium verticillioides. Fungal Genet Biol 49: Chełkowski J, Stępień Ł, Tomczak M, Wiśniewska H Identification of toxigenic Fusarium species in wheat ears using PCR assay and their mycotoxins in kernels. Phytopatol Pol 25: Chełkowski J, Gromadzka K, Stępień Ł, Lenc L, Kostecki M, Berthiller F Fusarium species, zearalenone and deoxynivalenol content in preharvest scabby wheat heads from Poland. World Mycotox J 5: Chełkowski J, Golka L, Stępień Ł Application of STS markers for leaf rust resistance genes in near-isogenic lines of spring wheat cv. Thatcher. J Appl Genet 44: Chełkowski J, Stępień Ł Molecular markers for leaf rust resistance genes in wheat. J Appl Genet 42: Desjardins AE Fusarium, mycotoxins, chemistry, genetics and biology. St. Paul, USA: APS Press. Gromadzka K, Waśkiewicz A, Chełkowski J, Goliński P Zearalenone and its metabolites: occurrence, detection, toxicity and guidelines. World Mycotox J 1: Jestoi M Emerging Fusarium mycotoxins: fusaproliferin, beauvericin, enniatins, and moniliformin a review. Crit Rev Food Sci Nutr 48: Kimura M, Tokai T, Takahashi-Ando N, Oshato S, Fujimura M Molecular and genetic studies of Fusarium trichothecene biosynthesis: pathways, genes and evolution. Biosci Biotech Biochem 71: Kvas M, Marasas WFO, Wingfield BD, Wingfield MJ, Steenkamp ET Diversity and evolution of Fusarium species in the Gibberella fujikuroi complex. Fungal Diversity 34: Leslie JF, Summerell BA The Fusarium laboratory manual. Iowa, USA: Blackwell Publishing Logrieco A, Moretti A, Fornelli F, Fogliano V, Ritieni A, Caiaffa MF, Randazzo G, Bottalico A, Macchia L Fusaproliferin production by Fusarium subglutinans and its toxicity to Artemia salina, SF-9 insect cells, and IARC/LCL 171 human B lymphocytes. Appl Environ Microbiol 62:

13 Logrieco A, Visconti A An overview on toxigenic fungi and mycotoxins in Europe. Dodrecht-Dresden- London: Kluwer Academic Publishers. Lysøe E, Bone KR, Klemsdal SS Identification of up-regulated genes during zearalenone biosynthesis in Fusarium. Eur J Plant Pathol 122: Popiel D, Kwaśna H, Chełkowski J, Stępień Ł, Laskowska M Impact of selected antagonistic fungi on Fusarium species toxigenic cereal pathogens. Acta Mycol 43: Proctor RH, Brown DW, Plattner RD, Desjardins AE Co-expression of 15 contiguous genes delineates a fumonisin biosynthetic gene cluster in Gibberella moniliformis. Fungal Genet Biol 38: Proctor RH, Busman M, Seo J-A, Lee YW, Plattner RD A fumonisin biosynthetic gene cluster in Fusarium oxysporum strain O-1890 and the genetic basis for B versus C fumonisin production. Fungal Genet Biol 45: Skóra J, Gutarowska B, Stępień Ł, Pietrowski P, Pietrzak K, Piotrowska M, Pielech-Przybylska K Assessment of microbiological contamination at workplaces in museums, archives and libraries. J Occup Environ Hyg, under review. Sobrova P, Adam V, Vasatkova A, Beklova M, Zeman L, Kizek R Deoxynivalenol and its toxicity. Interdiscip Toxicol 3: Stępień Ł, Jestoi M, Chełkowski J. 2013a. Cyclic hexadepsipeptides in wheat field samples and esyn1 gene divergence among enniatin producing Fusarium avenaceum strains. World Mycotox J 6: DOI: /WMJ Stępień Ł, Koczyk G, Waśkiewicz A. 2013b. Diversity of Fusarium species and mycotoxins contaminating pineapple. Journal of Applied Genetics 54: Stępień Ł, Waśkiewicz A Sequence divergence of the enniatin synthase gene in relation to production of beauvericin and enniatins in Fusarium species. Toxins 5: Stępień Ł The use of Fusarium secondary metabolite biosynthetic genes in chemotypic and phylogenetic studies. Crit Rev Microbiol: DOI: / X Stępień Ł, Chełkowski J, Wenzel G, Mohler V Combined use of linked markers for genotyping the Pm1 locus in common wheat. Cell Mol Biol Lett 9: Stępień Ł, Chen Yu, Chełkowski J, Kowalczyk K Powdery mildew resistance genes in wheat: verification of STS markers. J Appl Genet 42: Stępień Ł, Golka L, Chełkowski J Leaf rust resistance genes of wheat: identification in cultivars and resistance sources. J Appl Genet 44: Stępień Ł, Holubec V, Chełkowski J Resistance genes in wild accessions of Triticeae - inoculation test and STS marker analyses. J Appl Genet 43: Stępień Ł, Mohler V, Bocianowski J, Koczyk G Assessing genetic diversity of Polish wheat (Triticum aestivum) varieties using microsatellite markers. Genet Res Crop Evol 54: Stępień Ł, Waśkiewicz A, Wit M, Goliński P, Chełkowski J, Wakuliński W Polymorphism of selected FUM genes and fumonisin B 1 biosynthesis among isolates of six Fusarium species. Cereal Res Comm 36B: Tomczak M, Wiśniewska H, Stępień Ł, Kostecki M, Chełkowski J. Goliński P Deoxynivalenol, nivalenol and moniliformin in wheat samples with head blight (scab) symptoms in Poland ( ). Eur J Plant Pathol 108: Waśkiewicz A, Stępień Ł, Wilman K, Kachlicki P Diversity of pea-associated F. proliferatum and F. verticillioides populations revealed by FUM1 sequence analysis and fumonisin biosynthesis. Toxins 5: Wiśniewska H, Stępień Ł, Kowalczyk K Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust. J Appl Genet 44: Zhang T, Jia X, Zhuo Y, Liu M, Gao H, Liu J, Zhang L Cloning and characterization of a novel 2- ketoisovalerate reductase from the beauvericin producer Fusarium proliferatum LF061. BMC Biotechnology 12: 55. Poznań, dr Łukasz Stępień 13