Analiza GC, MS i IR lipidów

Transkrypt

1 Analiza GC, MS i IR lipidów Erwin Wąsowicz Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Kurs chromatografii w analizie żywności Nasze początki lata 60-te, 70-te 1

2 Kwasy tłuszczowe 1973 rok znaczanie kwasów tłuszczowych w łoju i oleju z pszenicy przy pomocy chromatografii gazowej Kwasy tłuszczowe 1981 rok Wąsowicz E., Kamiński E. Fatty acid composition of Bebiko infant formula determined by support-coated open tubular gas chromatography. Die Nahrung 25, 6, Analiza kwasów tłuszczowych techniką GC Kwasy tłuszczowe pochodzenia roślinnego (mieszanina 14:0 do 24:0 rzepak std mix, Supelco) HP6890 S/SL, FID Kolumna Supelcowax-10 (30m x 0.25mm x 0.25μm) Gaz nośny: hel Temp analizy: 210 o C (izoterma); Ciśnienie psi Przepływ 1.0ml/min (32cm/s) Split 1:50 Temp analizy: 230 o C (izoterma); Ciśnienie psi Przepływ 1.0ml/min (32cm/s) Split 1: o C 230 o C Analiza kwasów tłuszczowych techniką GC Kwasy tłuszczowe pochodzenia roślinnego (mieszanina 14:0 do 24:0 rzepak std mix, Supelco) HP6890 S/SL, FID Kolumna Supelcowax-10 (15m x 0.100mm x 0.33μm) Gaz nośny: wodór Temp analizy: 210 o C (izoterma); Ciśnienie - 44 psi Przepływ 0.4ml/min (45cm/s) Split 1:150 Temp analizy: 230 o C (izoterma); Ciśnienie - 46 psi Przepływ 0.4ml/min (45cm/s) Split 1:150 FID Hz (opcja) 210 o C 230 o C 2

3 EKSTRAKCJA LIPIDÓW, PRZECHWYWANIE lipidy z tkanek winny być ekstrahowane bezpośrednio z żywego organizmu gdy to nie jest możliwe, tkanka winna być szybko zamrożona (suchy lód, ciekły azot) i przechowywana w zamkniętym naczyniu w atmosferze azotu w temp C (-60 0 C próbki osocza krwi) ażeby zapobiec autooksydacji, zaleca się stosowanie syntetycznego przeciwutleniacza w rozpuszczalnikach stosowanych do przechowywania lipidów (50 do 100mg/litr) o ile to możliwe, badanie próbek lipidów należy prowadzić w atmosferze azotu Kurs- Chromatografia gazowa w analizie żywności, Poznań

4 RZPUSZCZALNŚĆ LIPIDÓW koncentracje lipidów, odparowywanie rozpuszczalnika należy prowadzić w temp. nie wyższej niż 40 0 C próbki lipidów lub standardy nie powinny być przechowywane bez rozpuszczalnika; należy je przechowywać w relatywnie niepolarnym rozpuszczalniku w temp C w szklanych naczyniach (nigdy w plastikowych) w atmosferze azotu (krótkoterminowe przechowywanie) W PTYMALNYCH WARUNKACH LIPIDY NIE PWINNY ZMIENIAĆ SKŁADU ANI STRUKTURY W CZASIE EKSTRAKCJI I PRZECHWYWANIA lipidy o niskiej polarności (triacyloglicerole, estry cholesterolu) są dobrze rozpuszczalne w rozpuszczalnikach węglowodorowych takich jak heksan, cykloheksan, toluen oraz w rozpuszczalnikach o nieco wyższej polarności jak chloroform i etery. Lipidy te nie są raczej nierozpuszczalne w polarnych rozpuszczalnikach takich jak alkohole, szczególnie metanol. lipidy polarne słabo rozpuszczają się w rozpuszczalnikach węglowodorowych, natomiast łatwo w bardziej polarnych rozpuszczalnikach takich jak chloroform, metanol i etanol. Aceton jest dobrym rozpuszczalnikiem dla glikolipidów ale nie fosfolipidów. EKSTRAKCJA LIPIDÓW do ekstrakcji lipidów z tkanek zwierzęcych, roślinnych i bakterii najczęściej używa się mieszaniny chloroform - metanol ( 2:1 vol ) z wodą jako składnikiem tkanek do ekstrakcji lipidów ze skrobi zbożowej stosuje się najczęściej butanol nasycony wodą oczyszczenie ekstraktu z substancji nielipidowych (cukry, aminokwasy, mocznik, sole) polega na przemyciu solanką (0.88% KCL w wodzie). dolna warstwa : chloroform metanol woda ( 86 : 14 : 1 ) zawiera lipidy górna warstwa : chloroform metanol woda ( 3 : 48 : 47 ) zawiera zanieczyszczenia ZALECANE METDY 1. Metoda Folch, Lees i Stanley 2. Metoda Bligh i Dyer 3. Ekstrakcja tkanek roślinnych 4. Metody ekstrakcji dla analizy lipidomic- Han i Gross 4

5 PRZYGTWANIE ESTRÓW METYLWYCH KWASÓW TŁUSZCZWYCH próbka lipidów ; zwykle mniej niż 10 mg (wysoka czułość GC) estry metylowe kwasów przechowywać w heksanie zawierającym 50 ppm BHT hydroliza ( zmydlanie lipidów ) - nadmiar etanolowy roztwór KH w celu otrzymania estrów metylowych KT większość lipidów może być przeestryfikowanych bezpośrednio, bez konieczności ich hydrolizy ESTRYFIKACJA I TRANSESTRYFIKACJA W BECNŚCI KWASÓW Wolne kwasy tłuszczowe są estryfikowane i lipidy acylowe transestryfikowane w dużym nadmiarze bezwodnego metanolu i obecności kwasu jako katalizatora R CR + CH 3 H RCCH 3 + R H R CH + CH 3 H RCCH 3 + H2 Katalizatory : HCl w metanolu 5% (w/v ) H 2 S 4 w metanolu 1 2% ( v/v ) BF 3 w metanolu 12 14% ( w/v ) TRANSESTRYFIKACJA W BECNŚCI ZASAD lipidy acylowe są transestryfikowane szybko w obecności bezwodnego metanolu i katalizatora zasadowego (wolne kwasy tłuszczowe nie są estryfikowane) R CR + CH 3 H R CCH 3 + R H.5 M metanolan sodu w bezwodnym metanolu jest najlepszym katalizatorem K. Ichihara, Y. Fukubayashi ( 2010 ) Preparation of Fatty Acid Methyl Esters for Gas Liquid Chromatography Journal of Lipid Research 51, GC ANALIZA ESTRÓW METYLWYCH KWASÓW TUSZCZWYCH możliwość uzyskania pełnej ilościowej analizy w krótkim czasie analiza GC pozwala tylko na identyfikację tentative nowe próbki, pierwszy raz analizowane powinny znaleźć potwierdzenie w identyfikacji technikami spektroskopowymi wartości ECL ( equivalent chain lengths ) są bardzo użyteczne w identyfikacji kwasów tłuszczowych 5

6 ANALIZA ILŚCIWA SKŁADU KWASÓW TŁUSZCZWYCH niezależnie od kolumny należy sprawdzić działanie GC poprzez analizę mieszaniny standardowej o znanym składzie (zbliżonym do analizowanych prób) w wypadku wymaganej dużej precyzji analiz, w przypadku stosowania FID współczynniki korekcyjne winny być zastosowane w celu kompensacji braku jonizacji węgla karboksylowego w czasie spalania a także minimalnego wpływu na jonizację braku atomów wodoru przy podwójnych wiązaniach ZAPEWNIENIE KNTRLI JAKŚCI W ANALIZIE przed rozpoczęciem serii analiz na kolumnę chromatograficzną zawsze należy wstrzyknąć rozpuszczalnik (heksan lub heptan. Na chromatografie nie powinno być pików innych niż rozpuszczalnik. Test należy powtarzać po 10 analizach zalecane jest uczestnictwo w testach międzylaboratoryjnych co najmniej raz w roku sprawność kolumny i stosowanych parametrów analizy należy sprawdzać z wykorzystaniem dostępnych mieszanin standardów o składzie zbliżonym do analizowanych próbek piki należy identyfikować przez porównanie z czasami retencji standardów FAME. Niezidentyfikowane piki trzeba identyfikować wykorzystując GC - MS, FTIR niezidentyfikowane piki, jeśli potwierdzono, że nie są to kwasy tłuszczowe, nie mogą być włączone do obliczeń całkowitej zawartości tłuszczu, kwasów nasyconych cis monoenowych, cis polienowych itp. 6

7 Regulacje dotyczące oznakowania żywności w Ameryce Północnej definiują całkowitą zawartość tłuszczu jako sumę kwasów tłuszczowych występujących we wszystkich klasach lipidów obecnych w matrycy żywnościowej i wyrażonej jako ekwiwalent triacylogliceroli ( TAG ). Współczynniki przeliczeniowe poszczególnych estrów metylowych kwasów tłuszczowych ( FAME ) do ekwiwalentu TAG przedstawiono w tabeli Regulacje oznakowania żywności wymagają deklaracji całkowitej zawartości tłuszczu i nasyconych kwasów tłuszczowych ( SAFA ) i kwasów trans. Nie ma obowiązku deklaracji kwasów cis monenowych (MUFA), i n 6 i n 3 wielonienasyconych kwasów (PUFA). Dane te można dobrowolnie podawaćw tabelach, podobnie jak zawartość kwasów EPA i DHA ( LC PUFA ). Należy zaznaczyć, że zawartość kwasów musi być podawana jako wolne kwasy tłuszczowe ( FFA ). Współczynniki przeliczeniowe indywidualne FAME na FFA także podano w tabeli. CIS -, TRANS -, KWASY W PRDUKTACH MLECZNYCH I TŁUSZCZACH PRZEŻUWACZY Standard wewnętrzny 13:0 TAG, czystość 99% (2.0 mg/ml heksanu) bliczenie zawartości poszczególnych kwasów jako FAMEx (W FAMEx ) lub jako TAG (W TAGx ) w 100 g próby W FAMEx = A x x W TAGis x g R x A is W TAGx = W FAMEx x F TAGx A x - powierzchnia piku kwasu tłuszczowego x W is - waga standardu wew. TAG 13 : 0 w g A is - powierzchnia piku IS g - współczynnik konwersji wagi IS ( 13 : 0 ) z TAG do wagi FAME R x - współczynnik korekcyjny (obliczony teoretycznie) odpowiedzi FID ( TCFx ) dla FAME w stosunku do IS C 13:0 TAG 7

8 CIS -, TRANS -, KWASY W LEJACH I TŁUSZCZACH NIEPRZEŻUWACZY Standard wewnętrzny - C 21 :0 TAG czystość >99% (5.0 mg/ml chloroformu) bliczenie jako FAME ( W FAMEx ) lub jako TAGx ( W TAGx ) zawartości poszczególnych kwasów tłuszczowych w 100 g próby W FAMEx = A x x W is x x R x A is W TAGx = W FAMEx x F TAGx A x - powierzchnia piku kwasu tłuszczowego x W is - waga standardu wewnętrznego C 21 : 0 mg A is - powierzchnia piku IS współczynnik konwersji wagi IS ( 21 : 0 ) z TAG do wagi FAME R x - współczynnik korekcyjny obliczony teoretycznie odpowiedzi FID ( TCFx) dla FAME w stosunku do IS C 21:0 TAG CIS -MNENWYCH, CIS -PLIENWYCH KWASÓW NASYCNYCH W TŁUSZCZACH ZAWIERAJĄCYCH DŁUGŁAŃCUCHWE WIELNIENASYCNE KWASY TŁUSZCZWE (LC PUFA) Standard wewnętrzny 23 : 0 TAG, czystość > 99%, 2.0 mg/ml chloroformu bliczenie zawartości poszczególnych kwasów jako FAME lub jako TAG ( W TAGx ) w 100 g próby W FAMEx = A x x W TAGis x x R x A is W TAGx = W FAMEx x F TAGx A x - powierzchnia piku kwasu tłuszczowego x W is - waga standardu wewnętrznego TAG 23 : 0 mg współczynnik konwersji wagi IS ( 23 : 0 ) z TAG do wagi FAME R x - współczynnik korekcyjny odpowiedzi FID dla FAMEx w stosunku Do IS C 23:0 TAG (obliczony teoretycznie TCFx) 8

9 Abundance m/z--> /1/2012 GC-MS MS, MS w analizie lipidów żywności Analiza kwasów tłuszczowych techniką GC/MS Rośliny i zwierzęta kwasy parzystowęglowe, prosty łańcuch, terminalna grupa karboksylowa Pochodne: TMS, TBDMS, FAME (diazometan, BF 3, MeNa, KH- MeH) Nasycone FAME (EI): m/z 74 (przegrupowanie McLafferty ego) R H + R CH 2 CH 3 H + H 2 C CH 3 m/z 74 Abundance m/z--> Average of to min.: HJ_BACT4.D (-) 74 C12:0 (MW=214) Average of to min.: HJ_BACT4.D (-) C18:0 (MW=298) FAME Fattyacidmethylesters R C 2 Me są bardzo stabilne, widma masowe dobrze przedstawione w literaturze, pasmo macierzyste estru metylowego kwasu alifatycznego jest przeważnie wyraźne, m/z 74 pasmo główne estrów metylowych kwasów o łańcuchach prostych od C 6 od C 26 zmniejsza się gdy wzrasta ilość wiązań podwójnych, rozpad γ charakterystyczny jon m/z 87(sugeruje ester metylowy), [M-31/2] + strata metanolu [M-43] + strata C 2 do C 4 [M-59] + C()CH 3 [CH 3 C(CH 2 )n] + często m/z 87, 143, 199 UWAGA: chemiczna jonizacja z zastosowaniem amoniaku daje intensywny [M+18] + niezależnieodstopnianienasycenia

10 Estry metylowe kwasów monoenowych Widmo FAME różni się od nasyconych: Charakterystyczne jony: [M-32] +, [M-31] +, [M-74] +, [M-116] +, [C n H 2n-1 ] + brakuje jonów wskazujących pozycję podwójnego wiązania jak i konfigurację Widmo masowe EI pochodnej DMX i picolinylowej kwasu 18:1 n-9. Jony różniące się 12amu zamiast regularnych różniących się 14amu obserwuje się we fragmentach gdzie występuje wiązanie podwójne

11 ANALIZA ILŚCIWA ESTRÓW METYLWYCH KWASÓW TUSZCZWYCH (FAME) TECHNIKĄ GC -MS Technika GC - MS dostarcza ważnych informacji spektrometrycznych analizowanych związków dla charakterystyki jakościowej FA Technika GC - MS posiada także duże możliwości w ilościowej analizie FAME szczególnie w próbach o złożonym biochemicznym składzie 11

12 PŁĄCZNIE CHRMATGRAFU GAZWEG ZE SPEKTRMETREM PDCZERWIENI WSTĘP Zakres podczerwieni obejmuje widmo promieniowania elektromagnetycznego między obszarem widzialnym a mikrofalowym a 200cm -1 ( µm ) Pojęcia podstawowe: Długość fali µ 10-3 mm Częstość liczba falowa ν jednostka ( cm -1 ) Podczerwień właściwa: cm -1, µm (największe znaczenie w badaniach struktury związków organicznych) przejście oscylacyjno rotacyjne Podczerwień daleka: cm -1, µm Podczerwień bliska: cm -1, µm Cząsteczki wirują wokół własnej osi, równocześnie atomy oscylują wokół położeń równowagi. Absorpcja promieniowniapodczerwonego powoduje zmiany energii rotacyjnej i oscylacyjnej cząsteczki. Spektroskopia w podczerwieni jest niezastąpioną metodą identyfikacji grup funkcyjnychiinnych elementów struktury związku. Proste związki chemiczne mają skomplikowane widmo w podczewieni. Porównanie widm dwóch substancji jest znakomitym testem ich identyczności. Spektroskopię w podczerwieni trudno wykorzystać do identyfikacji związków z danego szeregu homologicznego przy braku informacji dotyczącej masy cząsteczkowej Widmo w podczerwieni jest pomocne w ustaleniu drogi fragmentacji widma masowego (aparaty GC FTIR MS) REGINY ABSRPCJI Zakres cm-1 - obszar grup funkcyjnych drganie rozciągające wiązań podwójnych [V (X=Y)], potrójnych [V (XΞY)] i wiązań pojedynczych wodór - heteroatom [V (X-H)] (X,Y=C,,N). Zakres cm-1 - obszar daktyloskopowy związku (ang. fingerprint region) niepowtarzalny układ pasm absorpcyjnych odpowiadający złożonym drganiom rozciągającym i deformacyjnym szkieletu cząsteczki 12

13 DWUWIĄZKWY DYSPERSYJNY SPEKTRFTMETR IR (historycznie pierwszy) promieniowanie podczerwone po przejściu przez komorę próbek jest monochromatyczne detektor mierzy intensywność kolejnych monochromatycznych pasm promieniowania moc promieniowania docierającego w danej chwili do detektora jest ułamkiem mocy źródła promieniowania (kompensacja - długi czas rejestracji) nie nadaje się do rejestracji widm szybko eluujących substancji z kolumny GC SPEKTRMETR FURIERA najważniejszy podzespół interferometr Michelsone (małe dwa lustra ustawione prostopadle do siebie, ruchome skaner), rozdzielacz wiązki (beam spliter) źródło promieniowania wysyła promieniowanie polichromatyczne zależność energii docierającej do detektora od położenia lusterka skanującego nosi nazwę interferogramu (zapis w domenie długości) zmianę zależności pochłaniania energii w domenie funkcji długości na domenę funkcji częstości dokonuje się za pomocą transformacji Fouriera (efekt -tradycyjna forma zapisu widma IR) pomiar widma trwa w czasie jednego przebiegu widma skanującego - ułamek sekundy (w spektrometrze dyspersyjnym kilka minut) pomiar położenia lusterka skanującego odbywa się za pomocą interferometru laserowego (wysoka dokładność pomiaru liczby falowej) wprowadzenie aparatów z interferometrem i poprawienie czułości detektora pozwoliło na połączenie chromatografów ze spektrometrem w podczerwieni. Pełne widmo może być rejestrowane z szybkością 1 20 na sekundę. Skanowanie chromatograficznego piku n razy i sumowanie w pamięci komputera interferogramów zwiększa czułość. SPEKTRMETR FURIERA 13

14 SPRZĘŻENIE CHRMATGRAFU GAZWEG ZE SPEKTRMETREM FTIR (GC/FTIR) 1.Kuweta gazowa light pipe, ogrzewana szklana kapilara, wewnętrzna ściana pokryta warstwą złota (wydłużenie drogi optycznej). Dla GC z kolumnami WCT stosuje się kuwety o długości około 10 cm, średnicy wewnętrznej 1mm, o objętości µl. Widmo można otrzymać z 10 25ng analitu. 2. Zastosowanie powleczonego złotem obracającego się dysku w próżniowej komorze chłodzonej helem (10 K). Gaz nośny z kolumny GC zawierający argon (1%) kierowany jest prostopadle na dysk. Składniki próbki kondensują w zestalonym argonie i są analizowane metodą odbiciowej spektrometrii IR. Widmo może być otrzymane z o ngsubstancji. Wysoki koszt aparatury, specjalne biblioteki komputerowe ograniczają stosownie tego połączenia GC/FTIR do laboratoriów badawczych. 3. Analityz kolumny chromatograficznej przez ogrzewaną kapilarę kierowane są chłodzoną ciekłym azotem (80K ) cynkowo-selenową powierzchnię matrycy. Do transferowej kapilary zamontowana jest dysza o średnicy µm i umieszczona jest 30 µm nad powierzchnią cynkowo-selenowej matrycy. Anality zestalane posiadają powierzchnię µm. Mikroskopowo optyka IR stosowana jest do otrzymania widm zestalonych analitów. PDWÓJNE SPRZĘŻENIE GC/FTIR /MS Spektrometria IR jest doskonałym uzupełnieniem spektrometrii mas (IR potwierdza identyfikację poprzez dodatkowe informacje dotyczące grup funkcyjnych i izomeryzację). Sprzężenie przez równoległą konfigurację: rozdziały eluentu z kolumny GC do kuwety gazowej IR Spektrometru masowego. Sprzężenie szeregowe GC IR MS. Eluent z kolumny GC po przejściu przez kuwetę gazową kierowany jest do spektrometru masowego. ptymalną czułość i odpowiednie ciśnienie uzyskuje się przez stosowanie makeupgas czy też dzielniki strumienia i separatory gazu. 14

15 15

16 Analiza steroli LEJE RŚLINNE: Budowa i podział steroli FRAKCJA GLICERYDWA FRAKCJA NIEGLICERYDWA tokoferole węglowodory STERLE ZWIERZĘCE barwniki sterole STERLE STERLE RŚLINNE FITSTERLE MYKSTERLE 4-DESMETYLSTERLE 4-MNMETYLSTERLE 4.4 -DIMETYLSTERLE cholesterol β-sitosterol Podział fitosteroli Stigmasterol 4-DESMETYLSTERLE (pochodne cholestenu: β-sitosterol stigamsterol, kampesterol, Δ5 awenasterol, brassikasterol ) Kampesterol Stearynian sitosterolu 4-MNMETYLSTERLE (pochodne cholestanu: citrostadienol gramisterol, cykloeukalenol, obtusifoliol) β-sitosterol 4,4 -DIMETYLSTERLE (pochodne lanostanu) Glikozynian sitosterolu HCH 2 H H H btusifoliol 24-metylenocykloartanol β-amyryna 16

17 Glikozynian stearynianu sitosterolu Fitosterole i fitostanole H H H DZIENNE SPŻYCIE: cholesterolu mg fitosteroli mg fitostanoli - ok. 25mg Sitostanol H CH 3 Ester sitostanolu i kwas cynamonowego WCHŁANIANIE: cholesterolu 45-60%, fitosteroli 5-10% Wpływ fitosteroli na metabolizm lipidów i lipoprotein Fitosterole i fitostanole (wolne lub jako estry kwasów tłuszczowych) redukują absorpcję cholesterolu z pożywienia i endogennego, przyczyniając się do obniżenia poziomu cholesterolu całkowitego i frakcji LDL Sterole/stanole z pożywienia Jelito cienkie Cholesterol micelarny Aktywność ABCA1 Absorpcja cholesterolu w jelicie B48 CE Chylomikrony CHLESTERL Rola w chorobie niedokrwiennej serca Poziomy cholesterolu w ocenie ryzyka choroby niedokrwiennej serca [mg/dl] Cholesterol Pożądany Graniczny Wysokie ryzyko Całkowity < > 240 LDL < > 150 HDL > < 35 TC/HDL < < 5.5 Cholesterol LDL w osoczu Wątroba Tworzenie płytek miażdżycowych Synteza endogennego cholesterolu Aktywność receptora LDL Produkcja VLDL 17

18 FITSTERLE I FITSTANLE Rola w obniżaniu poziomu cholesterolu obniżenie wchłaniania cholesterolu z pożywienia poprzez dodatek do diety (kurcząt) β-sitosterolu (Peterson) β-sitosterol (Pollak, 1953) suplement diety i lek (Cytellin, Eli Lilly) słaba rozpuszczalność i biodostępność -dawki rzędu 25g/dzień pierwszy produkt -tłuszcz do smażenia, pieczenia i sałatek ( % oleinianu stigmasterolu lub β-sitosterolu) (Ericson) Rozpowszechnienie leków z grupy statyn spowodowało zanik zainteresowania fitosterolami Raisio Group (Miettinen i in.) estry fitostanoli można łatwo wkomponować w tłuszcze, a po spożyciu enzymy jelita cienkiego w 90% hydrolizują estry do fizjologicznie aktywnej postaci wolnego stanolu 53g/d 3g/d 740mg/d Efekty zdrowotne fitosteroli i fitostanoli BNIŻENIE RYZYKA CHRÓB SERCA 3g/dzień fitostanoli i fitosteroli -zmniejszenie ryzyka o 15-40% (Weststrate i Meijer, 1998), 2g/dzień - 25% (Law, 2000) TKSYKLGIA I DZIAŁANIE ESTRGENNE 25g/dziennie bez efektów ubocznych (2400 pacjentów), Cytellin (głównie β-sitosterol) obecna na rynku od 20 lat poziom we krwi fitosteroli i stanoli niższy u osób spożywających formę zestryfikowaną niebezpieczne dla osób cierpiących na fitosterolemię i sitosterolemię ABSRPCJA WITAMIN RZPUSZCZALNYCH W TŁUSZCZACH Nieznaczne obniżenie wchłaniania α-tokoferolu (witaminy E), β- karotenu (prowitamina A) i likopenu (8-25%). Spożycie estrów steroli na poziomie 1.6 g/dzień obniża LDL-C nie wpływając na poziom karotenoidów osocza krwi ZNACZANIE ZAWARTŚCI STERLI Chromatogram GC cholesterolu w maśle FID1 A, (C:\DCUME~1\EM\MJED~1\MAGDA\KWASYT~1\HCHLAND\MRCH0318.D) pa min 1 standard wewnętrzny 5 -cholestan 2 cholesterol 18

19 Chromatogramy GC steroli w olejach roślinnych 1 cholesterol 2 brassikasterol 3 kampesterol 4 stigmasterol 5 sitosterol 6 -awenasterol 386 [M] [M-CH 3 ] [M-H 2 ] [M-SC] [M-CH 3 -H 2 ] [M-H 2 -SC] utrata pierścienia A 247 i 275 utrata pierścienia A i B 231 i 213 utrata pierścienia D 145 utrata pierścienia C i D 74 Cholesterol pochodna TMS 458 [M] +, 443 [M-CH 3 ] +, 368 [M-C 3 H 9 SiH] +, 329 [M-129] + dłączenie się od pierścienia A cząsteczki sterolowej fragmentu C1,C3-2 1 CH2 CH3 CH2-2 CH 2 1 TMS 3 TMS 3 m/z

20 Abundance m/z--> Average of to min.: HJ_2XY2.D (-) Abundance m/z--> Average of to min.: HJ_2XY2.D (-) Abundance m/z--> Abundance m/z--> m/z--> Abundance Average of to min.: HJ_2XY2.D (-) Average of to min.: HJ_2XY2.D (-) Average of to min.: HJ_2XY2.D (-) /1/2012 Reakcje utleniania cholesterolu znaczanie produktów utleniania cholesterolu techniką GC/MS Abundance TIC: HJ_2XY2.D 7-keto 20α-H-C 25-H-C Abundance Average of to min.: HJ_2XY2.D (-) α, β-h α-H-C 7β-H-C 7-keto-C H 2 5α,6α-epoksy-C 5β, 6β-epoksy-C C-triol 77 m/z--> Time--> α-epoxy α-H triol 25-H znaczanie produktów utleniania cholesterolu w osoczu 1. 10ml krwi % heparyny + 25μg BHT, wirowanie w 4 o C, Przechowywaniew 80 o C 2. IS: 25-H-C(150ng/próbkę) 3. Ekstrakcja lipidów: (CHCl 3 : MeH 1:1, BHT) 4. czyszczanie: Sep-Pak C-18 (EtH: H2, 70:30, elucja ACN) 5. Preparatywna HPLC: (LC-18); (ACN:IPA:H 2 45:45:10v) CP 2-12min.,Cholest 25.3min. 6. Derywatyzacja: DMF + BSTFA, 1 godz. 60 o C, odparowywanie, rozpuszczanie w izooktanie Detekcja: 5971 MSD (SIM 10 jonów: m/z 129, 131, 201, 384, 403, 456, 461, 472, 474) 7-α-H-C: m/z 456(100%), 129(54%) 7-β-H-C: 456(100), 129(47) β-epoxy-c: 129 (100), 201(22), 384 (19), 474(17) α-epoxy-c: 129 (100), 201 (18), 384 (17), 474(12) Triol-C: 129 (100), 403 (39), 456 (21), 546 (9) 7-keto-C: 129(100), 201(6), 472(20) 27-H-C:129(100),456(6),546(2) znaczanie produktów utleniania cholesterolu w odżywkach J. Nutr. Biochem. 12: (2001) Nahrung. 44: (2000) 20