Amylaza Wykrywanie aktywności enzymatycznej amylazy w ślinie

Transkrypt

1 14367 Takao Ishikawa Szkoła Festiwalu Nauki ul. Ks. Trojdena Warszawa sfn@iimcb.gov.pl Amylaza Wykrywanie aktywności enzymatycznej amylazy w ślinie Wstęp Amylaza (E.C ) jest enzymem katalizującym reakcję rozkładu skrobi. W zależności od typu katalizowanej reakcji, amylazy można podzielić na podklasy, choć zawsze ich wspólną cechą jest zdolność hydrolizy skrobi. Alfa-amylaza odpowiedzialna jest za hydrolizę wiązań alfa-1,4-glikozydowych, co powoduje skrócenie łańcuchów polisacharydowych budujących skrobię. Powstają dwucukry i triozy. Alfa-amylaza jest enzymem trawiennym, występuje w ślinie (przeprowadza jeden z pierwszych etapów trawienia) oraz w trzustce. Kiedy długo trzymamy kawałek pieczywa w ustach, po pewnym czasie zaczynamy wyraźnie czuć słodki smak. Dzieje się tak za sprawą właśnie amylazy rozkładającej skrobię z mąki na dwucukry, które odczuwamy jako słodkie. W zestawie doświadczalnym znajduje się alfa-amylaza spożywcza, czyli Termamyl. Enzym ten stosowany jest w przemyśle spożywczym do upłynniania skrobi, np. podczas produkcji syropu. Aktywność amylazy można bardzo łatwo wykryć, dodając tego enzymu do krochmalu, który jest gęstym roztworem skrobi. Działanie amylazy powoduje rozkład skrobi na mniejsze cząsteczki, w wyniku czego krochmal wyraźnie zmienia konsystencję i staje się płynny. Rozkład skrobi można stosunkowo łatwo obserwować wykorzystując specyficzną reakcję barwną, w której wykorzystuje się jodynę. Związek ten wiąże się ze skrobią, dając intensywnie granatowe zabarwienie. W miarę rozkładu skrobi intensywność zabarwienia wyraźnie maleje. Materiały Skrobia (łańcuch n-cząsteczkowy) Płytka z 24 dołkami lub 20 szklanych probówek Skrobia ziemniaczana Słoik odporny na wrzątek Gorąca woda 2 pipetki pasteurowskie Mieszadełko lub łyżka Jodyna Kubek z wodą do płukania pipetek Enzym Termamyl Zegarek lub stoper Kserokopia przepisu wykonania doświadczenia glukoza (n cząsteczek) Struktura przestrzenna amylazy. Na żółto zaznaczone są struktury beta-kartki, na różowo alfa-helisy 1 amy.pdb: Kadziola, A., Abe, J., Svensson, B., Haser, R. Crystal and molecular structure of barley alpha-amylase. J.Mol.Biol. v239 pp , 1994

2 Podział zadań w klasie Wszystkie próby są przeprowadzane w tych samych warunkach, z tego samego roztworu skrobi, w tej samej temperaturze. Kolejne próbki są pobierane zawsze po tym samym czasie i w takiej samej objętości. Kontrolą pozytywną, którą wykonują wszystkie zespoły, jest pierwsza próbka kropla krochmalu bez śliny dodana do roztworu jodyny. Dzięki niej udowadniamy, że roztwór jodyny zabarwia się na granatowo pod wpływem skrobi, a nie na przykład substancji zawartych w ślinie. Grupa A wariant doświadczalny A (kontrola +) Pozytywną kontrolą w tym doświadczeniu jest roztwór komercyjnej amylazy wykorzystywanej w przemyśle spożywczym. Enzym ten nosi nazwę Termamyl. Grupa B wariant doświadczalny B (właściwa próba) Do roztworu skrobi dodawana jest ślina uczestników doświadczenia i badana aktywność amylazy zawartej w ślinie. Grupa C wariant doświadczalny B (kontrola -) Do roztworu skrobi nie dodawany jest żaden enzym, tylko woda i badana jest zmiana zabarwienia jodyny z próbkami roztworu skrobi w czasie. Kontrola ma na celu sprawdzenie, czy skrobia samoistnie nie zmienia swoich właściwości w czasie. Przygotowania wstępne Ponieważ przygotowanie krochmalu w warunkach szkolnych może nastręczyć nieco kłopotów, radzimy przygotować go dzień wcześniej. Skróci to czas potrzebny do przeprowadzenia doświadczenia. 1 a. b. c. d. Przygotowanie krochmalu: Wsyp porcję skrobi (ok. 2 g) do słoika o poj. 200 ml, a następnie rozrób w jak najmniejszej objętości zimnej wody (nie więcej niż 5 ml). Najlepiej posłużyć się łyżeczką do herbaty. Zagotuj w czajniku wodę. Zawiesinę skrobi zalej 50 ml gorącej wody. Zalanie wrzącą wodą jest kluczowe, w przeciwnym razie może nie powstać krochmal! Zamieszaj bardzo energicznie, by nie powstały grudki skrobi. Dokładne mieszanie pozwoli uzyskać krochmal idealnie nadający się do przeprowadzenia doświadczenia. Przygotowany krochmal można przechowywać przez 24 godziny w lodówce. Na minimum godzinę przed wykonaniem eksperymentu należy wyjąć go z lodówki, by osiągnął temperaturę pokojową. Jeżeli przygotowujemy krochmal w trakcie lekcji, należy pamiętać o ostudzeniu go do temperatury pokojowej Pkt. 1a Pkt. 1c Pkt. 1d

3 Amylaza 2. a. b. c. Przygotowanie roztworu jodyny Roztwór jodyny do wykrywania skrobi należy przygotować bezpośrednio przed lekcją. Uwaga! Odczynnik plami ubrania. Do 125 ml wody destylowanej dodaj za pomocą pipetki 0,5 ml jodyny i dokładnie wymieszaj. Przygotowany odczynnik rozlej po ok. 25 ml do 5 kubeczków, po jednym dla każdej grupy. Pkt. 2a Pkt. 2b Pkt. 2c 3. Przygotowanie enzymu Roztwór enzymu Termamyl (alfa-amylaza spożywcza) należy przygotować tuż przed lekcją. Do 0,25 ml enzymu Termamyl dodaj 15 ml wody destylowanej i wymieszaj. Jeden zespół uczniów powinien otrzymać tę probówkę i użyć jej zawartość jako kontroli zamiast śliny. Zaleca się użycie w tym celu 2-3 ml rozcieńczonego enzymu Termamyl na 50 ml przygotowanego krochmalu. Opis doświadczenia Na wstępie postaw pytanie badawcze oraz sformułuj hipotezę Przygotuj zegarek, najlepiej z funkcją stopera. Dodaj przy pomocy pipetki pasteurowskiej po 1 ml roztworu jodyny do wszystkich dołków na płytce z 24 dołkami lub do 20 probówek. Do pierwszego dołka dodaj przy pomocy czystej pipety pasterowskiej jedną kroplę krochmalu, zamieszaj. Obserwuj barwę mieszaniny. Dodaj do słoika z krochmalem kilka mililitrów śliny (objętość około 1 łyżki). (UWAGA! W wariancie A zamiast śliny dodawane są 2-3 ml otrzymanego od prowadzącego roztworu enzymu Termamyl, natomiast w wariancie C zamiast śliny dodawane są 2 ml wody). Bardzo ważne jest mieszanie, aby enzym był rozprowadzony równomiernie w krochmalu. Dokładnie wymieszaj krochmal i od razu dodaj jedną kroplę do drugiego dołka. Uruchom stoper lub zanotuj dokładną godzinę. Po upływie jednej minuty, czystą pipetą pobierz próbkę krochmalu i dodaj jedną kroplę do trzeciego dołka, mieszając jego zawartość końcówką pipety. Cały czas mieszaj krochmal. Copyright Takao Ishikawa, 2005

4 Pkt. 2 Pkt. 6 Pkt Czynność opisaną w pkt. 6 powtarzaj co minutę, dodając krochmal do kolejnych dołków, za każdym razem odnotowując w tabeli zmianę barwy. Zaleca się płukanie w czystej wodzie pipetki po każdym pobraniu krochmalu, gdyż pozostający w niej krochmal może wpływać na wiarygodność wyniku. Możesz zakończyć doświadczenie, gdy odczynnik przestanie zmieniać barwę. Nr dołka Czas [min] Kolor roztworu w dołku Konsystencja krochmalu 1. kontrola

5 Amylaza Oczekiwane wyniki Zanotowane barwy roztworu jodyny po dodaniu kolejnych próbek z krochmalem i wymieszaniu: Wariant Dodany enzym Pomiar 0 Pomiar 1... Pomiar 20 A termamyl granatowy granatowy brak zmiany koloru B amylaza ze śliny granatowy granatowy brak zmiany koloru C woda granatowy granatowy granatowy Rozwiązywanie problemów Nawet w próbkach pobieranych po 20 minutach jodyna staje się granatowa: Aktywność amylazy w próbce jest zbyt niska. Należy dodać więcej enzymu z probówki Termamyl lub więcej śliny. Doświadczenie wychodzi zdecydowanie lepiej, jeżeli osoba plująca do próbki żuła wcześniej gumę lub jadła pieczywo. Krochmal przygotowywany był tuż przed doświadczeniem i był za gorący w momencie, kiedy dodano do niego próbkę śliny. Wysoka temperatura spowodowała dezaktywację enzymu. Przygotowany poprzedniego dnia krochmal nie został wyjęty z lodówki odpowiednio wcześniej. Jeżeli temperatura krochmalu jest zbyt niska, amylaza działa z bardzo małą wydajnością. Krochmal powinien mieć temperaturę pokojową. Roztwór nie zmienia barwy niemal od razu: Enzym zawarty w próbce ma bardzo wysoką aktywność lub objętość dodanego enzymu była zbyt duża. Należy powtórzyć doświadczenie zmniejszając objętość dodawanej śliny. Próba kontrolna w postaci roztworu enzymu Termamyl nie działa: Można zwiększyć objętość próbki enzymu oraz delikatnie podgrzać słoik z krochmalem (np. wstawić go do naczynia z ciepłą wodą). Amylaza Termamyl wykazuje aktywność w temperaturze pokojowej, ale optymalną temperaturą dla jej działania jest o C. Uwagi: Roztwory po eksperymencie można wylać do zlewu; Jodynę i jej roztwory należy chronić przed światłem, np. zakrywając cały pojemnik folią aluminiową. Podziękowania Ilustracje wykonała Anna Lea Chojnacka. Adaptacja protokołu została wykonana w ramach projektu VOLVOX finansowanego przez Komisję Europejską w Szóstym Programie Ramowym. Copyright Takao Ishikawa, 2005