PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1. (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) (21) Numer zgłoszenia:

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej zwiększonej predyspozycji do raka jelita grubego (73) Uprawniony z patentu: POMORSKI UNIWERSYTET MEDYCZNY W SZCZECINIE, Szczecin, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 19/14 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/16 (72) Twórca(y) wynalazku: DAGMARA DYMERSKA, Szczecin, PL PABLO SERRANO-FERNANDEZ, Szczecin, PL GRZEGORZ KURZAWSKI, Szczecin, PL ZBIGNIEW BANASZKIEWICZ, Osielsko, PL JÓZEF KŁADNY, Szczecin, PL JAN LUBIŃSKI, Szczecin, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka jelita grubego poprzez zastosowanie modelu opartego na nieoczekiwanej kumulacji efektu jednoczesnego występowania trzech markerów niskiego ryzyka - rs (8q24), rsl (gen CHEK2), rsl (10pl4). Nosicielstwo badanych wariantów oznaczane jest w próbce materiału biologicznego pobranej od pacjenta. Ryzyko wynikające z kumulacji wspomnianych polimorfizmów jest wyższe niż suma efektów wywoływanych przez każdy marker z osobna. Opisana metoda może być wykorzystana do badania osób polskiego pochodzenia i osób z populacji słowiańskich. Niniejszy przedmiot wynalazku odnosi się do nieoczekiwanie odkrytego współoddziaływania trzech polimorfizmów: rs , rs , rs Każdy z nich opisano poniżej: Rs jest polimorfizmem (substytucja T>G) leżącym pomiędzy dwoma genami: RP B23 i POU5F1B, w regionie q24 na chromosomie 8. Według danych literaturowych [1] region ten uczestnicząc w regulacji ekspresji proto-onkogenu MYC i oddziaływaniu z czynnikiem transkrypcyjnym TCF4 (TCF7L2) ścieżki sygnalizacyjnej WNT, odgrywa decydującą rolę w patogenezie raka jelita grubego. Badania przeprowadzone na wielu populacjach i grupach etnicznych dowodzą roli polimorfizmu rs jako markera umiarkowanie zwiększonego ryzyka dla raka jelita grubego (OR<1.7) [2 9], zarówno w układzie homozygotycznym (GG) jak i heterozygotycznym (TG), choć szacuje się, że ryzyko wystąpienia raka jelita grubego jest wyższe w układzie homozygotycznym [5]. Polimorfizm rs to substytucja zasady T na C, prowadząca do zamiany Izoleucyny na Treoninę w pozycji 157 w genie CHEK2 (znanym również jako CHK2 [MIM604373], Gen CHEK2 koduje kinazę fazy G2, która aktywowana w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, reguluje ekspresję genów supresorowych takich jak TP53 [10], Rola polimorfizmu jako czynnika ryzyka została dowiedziona dla kilku rodzajów raków [11 14], w tym dla raka jelita grubego. Przeprowadzone badania na populacji polskiej [14] wykazały 1,5-krotnie zwiększenie ryzyka raka jelita grubego. Genotypem ryzyka dla polimorfizmu rs jest genotyp CC lub/i TC. Polimorfizm rsl leży w regionie pl4 na chromosomie 10 w odcinku międzygenowym RNA5SP299 i RP11428L9. Polimorfizm został zidentyfikowany przez GWAS (genome wide association studies) [6,7] jako marker związany z umiarkowanie zwiększonym ryzykiem raka jelita grubego (OR<1,5). SNP rs wydaje się oddziaływać jako modulator ekspresji genu ATP5C1 [15], prawdopodobnie mającego znaczenie w etiologii raka jelita grubego. Przyjęto, iż alldem referencyjnym jest allel G, zamieniony w skutek substytucji w allel A, jednakże istnieją różnice pomiędzy populacjami w tym względzie: badania przeprowadzone przez von Holst i wsp. na populacji szwedzkiej [16] oraz Xiong i wsp [6] na populacji chińskiej wykazały związek występowania allelu G z ryzykiem zachorowania na raka jelita grubego. Allel G okazał się być alldem ryzyka również w populacji polskiej. Kombinacje genetyczne Identyfikowanie grup ze zwiększoną predyspozycją do zachorowania wydaje się być głównym nurtem genetyki medycznej. Wraz z rozwojem nowych technologii, i co za tym idzie, rozszerzaniem wiedzy w tym temacie, zmienia się podejście badaczy. Nacisk kładzie się nie tylko na wpływ pojedynczych markerów, ale także na interakcje pomiędzy markerami i ich skumulowany wpływ na ryzyko zachorowania. Kumulowanie efektów poszczególnych markerów genetycznych jest przedmiotem zastrzeżeń patentowych w biotechnologii. Obecność mutacji w genie RAD51 u nosicieli mutacji w genach BRCA1 lub BRCA2, wpływająca na ryzyko zachorowania na raka piersi wskazuje na możliwość interakcji pomiędzy RAD51 a BRCA1/BRCA2 i jest przedmiotem zgłoszenia WO Zgłoszenie WO dowodzi istnienia kombinacji genotypów, które zakłócają interakcję pomiędzy wspomnianymi genami. Związek pomiędzy variantami genu CHEK2 (włączając rsl ) i mutacjami w genie BRCA1 a haplotypem variantôw genu CYP1B1 w celu określenia wzmożonej predyspozycji do wielu typów raków jest przedmiotem zgłoszenia WO Istnieją również doniesienia dotyczące wspomnianych w niniejszym patencie polimorfizmów. Obniżone ryzyko raka piersi wynikające z braku współdziałania zmian rs i rs (nie rs ) jest przedmiotem zgłoszenia W Według Xiong i wsp. [6] nosicielstwo zmian rs , rsl a także kumulacja zmian rs , rs (nie rs ), rs (18q21.1), rs (11q23), rs (20p12.3) u jednego pacjenta, zwiększa ryzyko zachorowania na raka jelita grubego. He i wsp. [7] opisał interakcje pomiędzy markerami rs i rs w populacji Afroamerykanów, interakcje pomiędzy markerami rs , rs

3 PL B1 3 i rs w populacji Amerykanów pochodzenia europejskiego, a także efekt kumulacji 11 polimorfizmów (rs , rs , rs719725, rs , rs , rs , rs , rs , rs , rs , rs961253) i zwiększone ryzyko zachorowania na raka jelita grubego. Pozostałe publikowane prace dotyczą wpływu uwzględnionych w niniejszym wynalazku markerów (rs , rsl , rsl ) na ryzyko wystąpienia raka jelita grubego niezależnie. Udowodniono, iż żaden z badanych markerów umiarkowanie zwiększonego ryzyka pojedynczo nie jest wystarczający do wywołania choroby, wiele doniesień wskazuje jednak, iż pacjenci z rakiem jelita grubego są nosicielami zmian w ww. markerach z większą częstotliwością w porównaniu do grupy kontrolnej [2 9,11,12,14,16,17]. Żadne z opublikowanych doniesień nie ujawnia ani nie sugeruje możliwości istnienie kumulacji efektu jednoczesnego występowania trzech markerów według niniejszego wynalazku (rs , rs , rs ), nie znaleziono również dotychczas modelu i kombinacji genotypów, który pozwalałby na identyfikowanie grup wysokiego ryzyka raka jelita grubego z wykorzystaniem markerów umiarkowanie zwiększonego ryzyka w polskiej populacji. Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej zwiększonej predyspozycji do raka jelita grubego, charakteryzujący się tym, że w próbce materiału biologicznego pobranej od pacjenta identyfikuje się in vitro obecność w jego genotypie następujących polimorfizmów: rs (8q24), rs (gen CHEK2), rs (10p14), przy czym: dla polimorfizmu rs ryzyko raka jelita grubego wiąże się z nosicielstwem allelu G, a genotypem ryzyka dla jest genotyp GG, dla polimorfizmu rs ryzyko raka jelita grubego wiąże się z nosicielstwem allelu C, a genotypem ryzyka jest genotyp CC lub/i TC, dla polimorfizmu rs ryzyko raka jelita grubego wiąże się z nosicielstwem allelu G, a genotypem ryzyka jest genotyp GG, przy czym wykrycie jednoczesnej obecności genotypów ryzyka dla trzech wspomnianych polimorfizmów świadczy o zwiększonej predyspozycji do raka jelita grubego. Korzystnie, jako próbkę materiału biologicznego stosuje się próbkę wybraną z grupy obejmującej: tkanki płynne, tkanki stałe lub wydzieliny. Korzystnie, identyfikacja obecności polimorfizmów odbywa się na poziomie DNA, RNA lub białka. Korzystnie, identyfikacja obecności polimorfizmów obejmuje stosowanie metody wybranej spośród: spektrometrii masowej, metod elektroforetycznych, zwłaszcza sekwencjonowania, SSCP, HET, ASA, RFLP, metod wykorzystujących barwniki fluorescencyjne, zwłaszcza real-time PCR z sondami, pirosekwencjonowanie lub innych znanych metod genotypowania na poziomie DNA/RNA. Korzystnie, próbkę materiału biologicznego pobiera się od pacjenta pochodzenia słowiańskiego, zwłaszcza polskiego. Ujawniony sposób wykrywania genetycznej predyspozycji do raka jelita grubego charakteryzuje się tym, że w próbce materiału biologicznego pobranej od pacjenta bada się obecność trzech markerów umiarkowanie zwiększonego ryzyka: rs (8q24), rs (gen CHEK2), rs (10p14). Allelem ryzyka dla polimorfizmu rs jest allel G, genotypem ryzyka jest genotyp GG. Allelem ryzyka dla polimorfizmu rs jest allel C, genotypem ryzyka jest genotyp CC lub/i TC. Allelem ryzyka dla polimorfizmu rsl jest allel G, genotypem ryzyka jest genotyp GG. Obecność kombinacji wszystkich trzech genotypów ryzyka u jednego pacjenta determinuje zwiększone, około 6-krotnie, ryzyko do zachorowania na raka jelita grubego (OR>6), kombinacja dwóch (rs i rs ) z trzech wspomnianych markerów determinuje zwiększenie ryzyka zaledwie 1,5-krotnie (OR-1.48). Ryzyko zachorowania dla nosicieli zmian według wynalazku (rs , rs , rs ) zależy od kraju pochodzenia badanej grupy pacjentów. Przedmiot wynalazku dotyczy populacji polskiej. Ze względu na dużą homogenność wśród populacji słowiańskich, użyty model badania trzech polimorfizmów (rs , rs , rs ) będzie miał znaczenie również dla ludności pochodzenia polskiego (np. grupy mniejszości polskiej w USA, na Litwie, w Niemczech itd.) a także prawdopodobnie, dla ludności z krajów słowiańskich. Badanie zmian może odbywać się zarówno na poziomie DNA, RNA jak również białka. Obok przedstawionej w przykładzie niniejszego wynalazku metodzie (real-time PCR z sondami typu TaqMan) wiele znanych metod może być użytecznych w determinowaniu nosicielstwa tych zmian m.in. spektrometria masowa, metody elektroforetyczne (m.in. sekwencjonowanie, SSCP, HET, ASA,

4 4 PL B1 RFLP), metody wykorzystujące barwniki fluorescencyjne (m.in. real-time PCR z sondami, pirosekwencjonowanie) czy metody wiązania specyficznych przeciwciał. P r z y k ł a d 1 - opisuje zastosowanie modelu kumulacji na grupie 1590 polskich pacjentów i nie powinien być interpretowany jako ograniczenie możliwości zastosowania przedmiotu niniejszego wynalazku. Figura 1 przedstawia ryzyko zachorowania na raka jelita grubego (w OR), w zależności od ilości skumulowanych markerów u jednego nosiciela, dla polskiej populacji. Poszczególne linie reprezentują kumulacyjny model dla dwóch, trzech, czterech itd. markerów. Figura 2 przedstawia ryzyko zachorowania na raka jelita grubego (w OR), w zależności od liczby skumulowanych markerów ryzyka z uwzględnieniem optymalnego modelu włączającego trzy markery ryzyka (rs , rsl (CHEK2) rsl ) w populacji polskiej. P r z y k ł a d 1. Rak jelita grubego (CRC) jest jednym z najczęściej występujących nowotworów diagnozowanych na świecie. Około 30% nowowykrytych raków jelita grubego powstaje w wyniku wysokiej genetycznej predyspozycji [17], część z nich (<5% [18]) jest konsekwencją dziedziczenia jednogenowego (np. MLH1, MSH2 w zespole Lyncha), cześć prawdopodobnie powstaje wskutek nagromadzenia wariantów umiarkowanie zwiększonego ryzyka u poszczególnej osoby. W niniejszym opracowaniu przebadano dziewięć znanych markerów umiarkowanie zwiększonego ryzyka w grupie nieselekcjonowanych pacjentów z rakiem jelita grubego i grupie 795 kontroli - zdrowych pacjentów, aby określić przydatność niniejszych markerów w determinowaniu grup zwiększonego ryzyka do wystąpienia raka jelita grubego. Sześć markerów zostało zidentyfikowanych przez GWAS [4,7 9,19 20]: rs (10p14); rs (11q23); rs (15q13); rs (18q21); rs (18q21) i rs (8q24) jako markery niskiego ryzyka dla raka jelita grubego. W przypadku kolejnych trzech wariantów: 3020insC (rs ) w NOD2 [21], 470T>C (rsl ) w genie CHEK2 [14] oraz 442G>A (rs ) w CDKN2A [22] oraz wcześniej wspomnianego wariantu zidentyfikowanego przez GWAS (rs [5]) wykazano asocjację z podwyższonym ryzykiem raka jelita grubego dla populacji polskiej. Celem badań było określenie możliwości istnienia kumulacyjnego efektu działania co najmniej dwóch z dziewięciu badanych markerów u jednego nosiciela. Materiały Grupa badana składała się z 795 nieselekcjonowanych pacjentów z rakiem jelita grubego, którzy przeszli operację szpitalach klinicznych: w Szczecinie (550) i Bydgoszczy (245) w latach , ze średnią wieku diagnozy 63 lata, i 795 kontroli sparowanych pod względem płci, wieku i danych rodowodowych wśród krewnych I stopnia (86 z rakiem jelita grubego wśród krewnych I stopnia, z innymi nowotworami, 482 z negatywną historią rodzinną, co do występowania nowotworów). Próbki krwi zebrano od pacjentów po uzyskaniu zgody pacjentów na wykonanie badań genetycznych. Metody Genom owe DNA izolowano z leukocytów krwi obwodowej, przy użyciu metody detergentowej [23] zmodyfikowanej w Pracowni Molekularnej Zakładu Genetyki i Patom orfologii Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie. Krew obwodową (zwykle około 10 ml) pobrano do probówek z 1 ml 10% roztworu EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid, sól sodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego). Każdej próbce nadano numer umożliwiający identyfikację w rejestrze pacjentów. W pierwszym etapie w celu oddzielenia osocza, krew wymieszano z 25ml buforu TKM z dodatkiem detergentu IGEPAL (Sigma-Aldrich Inc., Hamburg, Niemcy), a następnie wirowano (3400 obrotów, 10 minut) zużyciem wirówki 5810R z rotorem A-4-62 (Eppendorf Inc., Hamburg, Niemcy). Osad komórkowy przepłukano buforem TKM (około 25 ml) i poddano kolejnemu wirowaniu (3400 obrotów, 5 minut). Płukanie powtarzano do uzyskania białego bądź lekko różowego osadu, który zawieszano w 1 ml buforu TKM. W celu uwolnienia DNA z kompleksów DNA-białko, do osadu dodawano 0,5 ml 10% roztworu SDS (sodium dodecyl sulfate, sól sodowa siarczanu dodecylu) i inkubowano mieszaninę w temperaturze 60 C przez 7 minut. Po rozbiciu kompleksów nukleoproteinowych, białka wysalano przez dodanie 1 ml 5M roztworu NaCl (chlorek sodu). Po żwirowaniu (9600 obrotów, 25 minut) z użyciem wirówki 5810R z rotorem F (Eppendorf Inc., Hamburg, Niemcy) do supematantu dodano około 10ml 96% alkoholu etylowego w celu wytrącenia DNA (w postaci tzw. kłaczka DNA). Wytrącone DNA przemyto dwukrotnie 70% roztworem alkoholu etylowego, wysuszono w suszarce próżniowej 5301 z użyciem rotora F (Eppendorf Inc., Hamburg, Niemcy) i zawieszono w buforze TE o ph 8,0. Przygotowany DNA przechowywano w temperaturze

5 PL B1 5 4 C. Wszystkie próbki DNA rozcieńczono do stężenia 20 ng/ µl w oparciu o pomiar fotometryczny przy 260 nm, który wykonano za pomocą spektrofotometru Victor 3 (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA, USA). DNA pacjentów zostało przebadane na obecność dziewięciu polimorfizmów z użyciem PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem sond typu TaqMan. Sondy i startery zostały zaprojektowane i zsyntetyzowane przez Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA, USA). Reakcję i analizę produktów wykonano przy pomocy termocyklera LightCycler 480 Instrument (Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Niemcy) i programu LightCycler 480 Basic Software Version 1.5 (Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Niemcy), według protokołów dostarczonych przez producentów. Dla polimorfizmów rs oraz rs wykorzystano dostępne zestawy starterów i sond: Pre-designed TaqMan Genotyping Assays (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA): C_ _20 dla rs oraz C_ _10 dla rs Do badania polimorfizmu rs wykorzystano syntetyzowane na potrzebę badań: Custom TaqMan Genotyping Assay (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), sekwencje starterów: F: TGTTCTCTATTTTAGGA AGTGGGTCCT; R: AAGGTTCCATTGCCACTGTGAT, sekwencje sond: VIC: CTTCT AT GT AT GC AAT GT AAG; FAM: CTTCTATGTATGCAGTGTAAG. Analiza statystyczna Wpływ każdego z markerów oszacowano na podstawie wartości OR oraz istotności statystycznej uzyskanych wyników. Wszelkie obliczenia wykonano w programie R, stosując warunkową regresję logistyczną [24]. Allele ryzyka zostały ustalone na podstawie danych literaturowych, genotypy ryzyka określono eksperymentalnie, uwzględniając najwyższe asocjacje. Rozważono tylko dominujący i recesywny model dziedziczenia. Wszystkie badane markery, dla których wartość OR przekroczyła 1 zostały posortowane według istotności statystycznej (p-value) i włączone do modelu kumulacyjnego. Kumulacyjny model przewiduje kumulację ryzyka u nosicieli więcej niż jednej zmiany w sposób nieliniowy. Model został oszacowany dla najlepszych dwóch markerów, następnie najlepszych trzech, najlepszych czterech markerów itd. W ostatecznym etapie analizy wybrano optymalny model, czyli model, który przy minimalnej liczbie markerów włączonych do analizy, umożliwia uzyskanie największej asocjacji szacowanej wartością OR. Wyniki Częstości genotypów a także wyniki analizy statystycznej zamieszczono w tabeli 1. T a b e l a 1. Częstości genotypów oraz wyniki analizy statystycznej dla dziewięciu badanych markerów w populacji polskiej MARKER 795 nieselekcjonowanych raków jelita grubego, 795 sparowanych kontroli - zdrowych pacjentów Rs rs rs rs rs rs rs (NOD2 3020insC) Rs (CHEK2 470T>C) rs (CDKN2A 442G>A) MODEL recesywny GENOTYP RYZYKA GG model dominujący GENOTYP RYZYKA CC+AC MODEL dominujący GENOTYP RYZYKA TT+CT MODEL recesywny GENOTYP RYZYKA CC MODEL recesywny GENOTYP RYZYKA TT GENOTYP RYZYKA recesywny GENOTYP RYZYKA GG MODEL dominujący GENOTYP RYZYKA MM+WM MODEL dominujący GENOTYP RYZYKA CC+TC MODEL dominujący GENOTYP RYZYKA AA+GA 382 raków, 339 kontroli OR=1.23 ( ), p= raków, 384 kontrole OR=1.01 ( ), p= raków, 328 kontrole OR=1.11 ( ), p= raków, 78 kontroli OR=1.23 ( ), p= raków, 212 kontroli OR=1.14 ( ), p= raków, 176 kontroli OR=1.29 ( ), p= raków, 67 kontroli OR=1.15 ( ), p= raków, 40 kontroli OR=1.57 ( ), p= raków, 44 kontrole OR=0.96 ( ), p=0.851

6 6 PL B1 Osiem (rs , rs , rs , rs , rs , rs , rs (NOD2), rs ) z dziewięciu badanych markerów, dla których uzyskano wartość OR>1, zostało włączonych do modelu kumulacyjnego - rycina 1. Jedynie dla trzech z nich asocjacja z ryzykiem wystąpienia raka jelita grubego była statystycznie istotna: rs (OR= 1,29, 0= , p=0,030), rs (OR=1,57, 0= , p=0,031), rs (OR=1,23, 0= , p=0,043) - tabela 1. Optymalny model kumulacyjny, uwzględniający wspomniane trzy markery umożliwił wyselekcjonowanie grupy ryzyka z ponad 6-krotnie zwiększoną predyspozycją do zachorowania na raka jelita grubego (OR=6,52, p=0,016, Cl= ) - rycina 2. Kumulacja minimum jednego lub minimum dwóch markerów zwiększała ryzyko zachorowania zaledwie około 1,5-krotnie - OR=1,34 (p=0,008, CI= ) dla kumulacji minimum jednego markera u jednego nosiciela, OR=1,48 (p=0,010, CI= ) dla kumulacji minimum dwóch. Dyskusja W niniejszym opracowaniu w grupie 795 nieselekcjonowanych raków jelita grubego i 795 kontroli (zdrowych pacjentów) przeprowadzono analizę dziewięciu polimorfizmów, których nosicielstwo, według danych literaturowych, może być związane ze zwiększoną predyspozycją do zachorowania na raka jelita grubego. Cztery polimorfizmy: rs w genie CHEK2, rs w genie NOD2, rs oraz rs w genie CDKN2A badano wcześniej w polskiej populacji [5,14,21], Dla trzech z nich uzyskane wyniki potwierdzają wcześniejsze doniesienia. Wariant rs (gen CHEK2) wystąpił z częstością 7,8% w grupie raków i 5% w grupie kontrolnej, co potwierdza wcześniejsze doniesienia zespołu Cybulski i wsp. [14] - 7,1% w grupie raków i 4,8% w grupie kontrolnej. Według Wokołorczyk i wsp. [5] wariant rs (genotyp ryzyka GG) z większą częstością obserwowano w grupie raków jelita grubego (27,5%) w stosunku do grupy kontrolnej (22%), co zostało potwierdzone w niniejszym opracowaniu (26,8%/22,l%). Również częstości uzyskane dla wariantu rs (gen NOD2): 9,7% w rakach i 8,4% w grupie kontrolnej, potwierdzają wcześniejsze doniesienia: 9,9% w rakach i 8,1% w kontrolach w pracy Suchy i wsp. [21] Jedynie dla polimorfizmu rs (gen CDKN2A) nie uzyskano pełnej zgodności. Częstość występowania wariantu rs w grupie chorych na raka jelita grubego była porównywalna 5,3% w niniejszym opracowaniu i 5,1% w pracy Dębniak i wsp. [22], jednak w niniejszym opracowaniu częstość wariantu w grupie raków i zdrowych osób jest zbliżona - 5,3%/5,5% i nie potwierdza wcześniejszych doniesień - 3,5% w grupie kontrolnej w opracowaniu Dębniak i wsp. W przypadku pięciu kolejnych polimorfizmów - rs ; rs ; rs ; rs ; rs , zidentyfikowanych przez GWAS, niniejsze opracowanie jest pierwszym dotyczącym częstości ww. markerów w nieselekcjonowanych rakach w populacji polskiej. Spośród badanych dziewięciu markerów, nieoczekiwanie jedynie dla trzech uzyskano statystycznie istotną asocjację z podwyższonym ryzykiem raka jelita grubego: rs (OR=1,29, CI= , p=0,030), rs (OR=1,57, CI= , p=0,031), rs (OR=1,23, 0= , p=0,043). Model kumulacyjny, uwzględniający wspomniane trzy markery umożliwił wyselekcjonowanie grupy ryzyka ze zwiększoną predyspozycją do zachorowania na raka jelita grubego i choć grupa nosicieli wszystkich trzech zmian nie była duża (<5%), badania dowiodły, iż ryzyko zachorowania dla tych pacjentów wzrastało ponad 6-krotnie (OR=6,52, p=0,016, 0=1.4130). Zastosowany model umożliwił zdefiniowanie grupy ryzyka raka jelita grubego kładąc nacisk na interakcje pomiędzy markerami i ich skumulowany wpływ na ryzyko zachorowania. Niniejsze opracowanie dotyczy populacji polskiej, jednak, co należy podkreślić, ze względu na dużą homogenność wśród populacji słowiańskich, użyty model może mieć znaczenie dla ludności pochodzenia polskiego poza Polską (mniejszości narodowe), a także prawdopodobnie, dla ludności z krajów słowiańskich. Literatura 1. Pomerantz MM, Ahmadiyeh N, Jia L, Herman P, Verzi MP, Doddapaneni H i wsp. The 8q24 cancer risk variant rs shows long-range interaction with MYC in colorectal cancer. Nat Genet. 2009; 41 (8): Li L, Plummer SJ, Thompson CL, Merkulova A, Acheson LS, Tucker TC i wsp. A common 8q24 variant and the risk of colon cancer: a population-based case-control study. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2008; 17(2): Tomlinson I, Webb E, Carvajal-Carmona L, Broderick P, Kemp Z, Spain S i wsp. A genomewide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility variant for colorectal cancer at 8q Nat Genet 2007; 39(8):

7 PL B Tomlinson IP, Webb E, Carvajal-Carmona L, Broderick P, Howarth K, Pittman AM i wsp. A genome-wide association study identifies colorectal cancer susceptibility loci on chromosomes 10p14 and8q23.3. Nat Genet. 2008; 40: Wokołorczyk D, Gliniewicz B, Sikorski A, Zlowocka E, Masojc B, Dębniak T i wsp. A range of cancers is associated with the rs marker on chromosome 8. Cancer Res. 2008; 68: Xiong F, Wu C, Bi X, Yu D, Huang L, Xu J i wsp. Risk of genome-wide association studyidentified genetic variants for colorectal cancer in a Chinese population. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2010; 19(7): He J, Wilkens LR, Stram DO, Kolonel LN, Henderson BE, Wu AH i wsp. Generalizability and epidemiologic characterization of eleven colorectal cancer GWAS hits in multiple populations. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2011;20: Giraldez MD, López-Dóriga A, Bujanda L, Abuli A, Bessa X, Fernandez-Rozadilla C i wsp.: Susceptibility genetic variants associated with early-onset colorectal cancer. Carcinogenesis 2012; 33: Curtin K, Lin W, George R, Katory M, Shorto J, Cannon-Albright LA i wsp: Meta association of colorectal cancer confirms risk alleles at 8q24 and 18q21. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2009; 18: Ahn JY, Schwarz JK, Piwnica-Worms H, Canman CE. Threonine 68 phosphorylation by ataxia telangiectasia mutated is required for efficient activation of Chk2 in response to ionizing radiation. Cancer Res. 2000; 60(21 ): Cybulski C, Górski B, Huzarski T, Masojć B, Mierzejewski M, Dębniak T i wsp. CHEK2 is a multiorgan cancer susceptibility gene. Am J Hum Genet. 2004; 75(6): Irmejs A, Miklasevics E, Boroschenko V, Gardovskis A, Vanags A, Melbarde-Gorkusa i wsp. Pilot study on low penetrance breast and colorectal cancer predisposition markers in latvia. Hered Cancer Clin Pract. 2006; 4: Szymanska-Pasternak J, Szymańska A, Medrek K, Imyanitov EN, Cybulski C, Górski B i wsp. CHEK2 variants predispose to benign, borderline and low-grade invasive ovarian tumors. Gynecol Oncol. 2006; 102(3): Cybulski C, Wokołorczyk D, Kladny J, Kurzawski G, Suchy J, Grabowska E i wsp. Germline CHEK2 mutations and colorectal cancer risk: different effects of a missense and truncating mutations? Eur J Hum Genet. 2007; 15: Loo LW, Cheng I, Tiirikainen M, Lum-Jones A, Seifried A, Dunklee LM i wsp. Cis-Expression QTL analysis of established colorectal cancer risk variants in colon tumors and adjacent normal tissue. PLoS One. 2012; 7(2):e von Holst S, Picelli S, Edler D, Lenander C, Dalén J, Hjern F i wsp. Association studies on 11 published colorectal cancer risk loci. Br J Cancer. 2010; 103(4): Lichtenstein P, Holm NV, Verkasalo PK, lliadou A, Kaprio J, Koskenvuo M i wsp. Environmental and heritable factors in the causation of cancer-analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland. N Engl J Med. 2000; 343(2): Aaltonen L, Johns L, Järvinen H, Mecklin JP, Houlston R. Explaining the familial colorectal cancer risk associated with mismatch repair (MMR)-deficient and MMR-stable tumors. Clin Cancer Res. 2007; 13(1 ): Broderick P, Carvajal-Carmona L, Pittman AM, Webb E, Howarth K, Rowan A i wsp. A genome-wide association study shows that common alleles of SMAD7 influence colorectal cancer risk. Nat Genet. 2007; 39: Pittman AM, Webb E, Carvajal-Carmona L, Howarth K, Di Bernardo M, Broderick P i wsp. Refinement of the basis and impact of common 11 q23.1 variation to the risk of developing colorectal cancer. Hum Mol Genet. 2008; 17: Suchy J, Kłujszo-Grabowska E, Kładny J, Cybulski C, Wokołorczyk D, Szymańska- Pasternak J i wsp. Inflammatory response gene polymorphisms and their relationship with colorectal cancer risk. BMC Cancer 2008; 8: Dębniak T, Scott RJ, Huzarski T, Byrski T, Rozmiarek A, Dębniak B: CDKN2A common variant and multi-organ cancer risk-a population-based study. Int J Cancer. 2006; 118:

8 8 PL B1 23. Lahiri DK, Schnabel B. DNA isolation by a rapid method from human blood samples: effects of MgCI2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality. Biochem Genet. 1993; 31: R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing 2012, Vienna, Austria, ISBN Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej zwiększonej predyspozycji do raka jelita grubego, znamienny tym, że w próbce materiału biologicznego pobranej od pacjenta identyfikuje się In vitro obecność w jego genotypie następujących polimorfizmów: rs (8q24), rs (gen CHEK2), rs (10p14), przy czym: dla polimorfizmu rs ryzyko raka jelita grubego wiąże się z nosicielstwem allelu G, a genotypem ryzyka dla jest genotyp GG, dla polimorfizmu rs ryzyko raka jelita grubego wiąże się z nosicielstwem allelu C, a genotypem ryzyka jest genotyp CC lub/i TC, dla polimorfizmu rs ryzyko raka jelita grubego wiąże się z nosicielstwem allelu G, a genotypem ryzyka jest genotyp GG, przy czym wykrycie jednoczesnej obecności genotypów ryzyka dla trzech wspomnianych polimorfizmów świadczy o zwiększonej predyspozycji do raka jelita grubego. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako próbkę materiału biologicznego stosuje się próbkę wybraną z grupy obejmującej: tkanki płynne, tkanki stałe lub wydzieliny. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że identyfikacja obecności polimorfizmów odbywa się na poziomie DNA, RNA lub białka. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że identyfikacja obecności polimorfizmów obejmuje stosowanie metody wybranej spośród: spektrometrii masowej, metod elektroforetycznych, zwłaszcza sekwencjonowania, SSCP, HET, ASA, RFLP, metod wykorzystujących barwniki fluorescencyjne, zwłaszcza real-time PCR z sondami, pirosekwencjonowanie lub innych znanych metod genotypowania na poziomie DNA/RNA. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę materiału biologicznego pobiera się od pacjenta pochodzenia słowiańskiego, zwłaszcza polskiego. Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)