Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "http://www.pm.microbiology.pl"

Transkrypt

1 Punktacja za publikacjê naukow¹ wg MNiSW: (2010) Index Copernicus ICV = 9,00 (2009) Impact Factor ISI = 0,108 (2010)

2 RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY D UGOÑSKI (Uniwersytet ódzki), DANUTA DZIER ANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka), EUGENIA GOSPODAREK (Collegium Medicum UMK w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), MAREK JAKÓBISIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓ ALSKI (Uniwersytet ódzki), ALEKSANDRA SK ODOWSKA (Uniwersytet Warszawski), BOHDAN STAROŒCIAK (Warszawski Uniwersytet Medyczny), BOGUS AW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdañski), EL BIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii), STANIS AWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Pañstwowy Zak³ad Higieny), GRZEGORZ WÊGRZYN (Uniwersytet Gdañski), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastêpca), BOHDAN STAROŒCIAK (sekretarz), MARTA BRZÓSTKOWSKA (korekta tekstów angielskich) Adresy redakcji Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, Warszawa, tel. (22) /304, fax (22) Sekretarz Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej, Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Oczki 3 (parter), Warszawa, tel. (22) , (22) PUBLIKACJE METODYCZNE I STANDARDY Redaktor odpowiedzialny: STEFANIA GIEDRYS-KALEMBA (Pomorska Akademia Medyczna w Szczecinie) Adres Redaktora dzia³u Publikacje Metodyczne i Standardy Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Pomorskiej Akademii Medycznej, Al. Powstañców Wlkp. 72, Szczecin, tel./fax: (91) , 52, lub fax: (91) , lub Stali recenzenci: JERZY D UGOÑSKI (Uniwersytet ódzki), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Leków), JÓZEF KUR (Politechnika Gdañska), EUGENIUSZ MA AFIEJ (Instytut Centrum Zdrowia Matki Polki), ANNA PRZONDO-MORDARSKA (Akademia Medyczna we Wroc³awiu) CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOW POMOC MINISTERSTWA NAUKI I SZKOLNICTWA WY SZEGO ISBN Informacja o zdjêciu na ok³adce: Komórki Bacillus subtilis (BR-1-S) wnikaj¹ce do komórki linii Int 407 Fotografia: J. Wiœniewski Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej Instytut Mikrobiologii Uniwersytetu Warszawskiego POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW Nak³ad egz., Objêtoœæ 10 arkuszy wyd., Papier offser 80 g Sk³ad i druk: Zak³ad Wyd. Letter Quality, tel , , projekt ok³adki: Jerzy Grzegorkiewicz

3 POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 1, ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE Ma³gorzata Joanna Staworzyñska 1, Rados³aw Stachowiak 1 *, Jacek Bielecki 1 1 Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii UW ul. Miecznikowa 1, Warszawa Wp³ynê³o w listopadzie 2010 r. 1. Wprowadzenie. 2. Zastosowania wektorów bakteryjnych Wektory jako podstawowe narzêdzie do klonowania Klasyczne wektory Wektory komercyjne, nowe strategie Wektory s³u ¹ce do przenoszenia genów miêdzy organizmami Transport genów do komórek eukariotycznych Wektory ekspresyjne Nadprodukcja bia³ek Cechy, które powinien spe³niaæ wektor ekspresyjny Przyk³ady wektorów ekspresyjnych Produkcja insuliny Produkcja szczepionek nowej generacji Wektory nios¹ce geny reporterowe. 3. Podsumowanie Applications of bacterial vectors in molecular biology and medicine Abstract: Bacterial vectors are DNA molecules, that are the basic tool of genetic engineering. They are used as vehicles to transfer and multiply foreign DNA in a target organism. They allow to process genetic modifications in organisms by transfer of genes from one organism to another. Scientists use bacterial vectors to produce proteins, as well as for various types of biological research. The most important criteria to be fulfilled by vectors are: the possibility of autonomous replication within the host cell, posession of selection markers and multiple restriction enzyme site (cloning site), that allow to insert the DNA fragment. Today it is technically possible to construct vectors containing many different properties such as: type of host range, size of DNA fragment that can be inserted into a vector, number of vector copies in the target cell and many types of marker genes that allow to differ between recombinated and not recombinated cells. The most commonly used vectors are plasmids. 1. Introduction. 2. Applications of bacterial vectors Vectors as basic tool for DNA cloning Convential vectors Commercial vectors, new strategies Vectors as a tool for gene transfer between organisms Gene transfer to eucaryotic cells Expression vectors Protein overexpression Properties of a succesfull expression vector Examples for expression vectors Production of insulin Production of new generation vaccines Vectors with reporter genes. 3. Summary S³owa kluczowe: klonowanie, nadprodukcja bia³ek, wektor bakteryjny Key words: cloning, protein overproduction, bacterial vectors 1. Wprowadzenie Stosowanymi w biotechnologii wektorami s¹ ró - nego rodzaju noœniki DNA, które wykorzystuje siê w celu klonowania genów i ich wprowadzania do komórek drobnoustrojów gospodarzy [24]. Je eli uda³oby siê wprowadziæ do komórki dowolnego organizmu niczym niechroniony fragment DNA, to wkrótce zosta³by on strawiony do pojedynczych nukleotydów. Natomiast wektory pozwalaj¹ nie tylko na wprowadzenie fragmentu DNA, ale maj¹ równie zdolnoœæ do autonomicznej replikacji w danym typie komórek i dziêki temu zapewniaj¹ powielanie wprowadzonego fragmentu DNA oraz umo liwiaj¹ ekspresjê genów w nim zawartych [48]. Do czasów opracowania metod in ynierii genetycznej pewne manipulacje polegaj¹ce na wyodrêbnianiu genów i ich przenoszeniu z jednej komórki do drugiej mia³y bardzo ograniczony zasiêg. Eksperymenty wykonywano jedynie na bakteriach, wykorzystuj¹c bakteriofagi i metodê transdukcji. Dopiero wprowadzenie metody rekombinacji i klonowania DNA pozwoli³o na przenoszenie materia³u genetycznego na wiêksz¹ skalê. G³ówne etapy takiego doœwiadczenia, przedstawiono na rys. 1. Polegaj¹ one na wyizolowaniu fragmentu DNA, który ma zostaæ sklonowany, pofragmentowaniu DNA przy u yciu enzymów restrykcyjnych, po³¹czeniu fragmentów DNA z wektorem za pomoc¹ ligazy i wprowadzaniu cz¹steczek rekombinowanego DNA do komórek, w których ulegaj¹ one powieleniu [48]. Nastêpnie przeprowadza siê selekcjê klonów komórek zawieraj¹cych zrekombinowany DNA, aby mo na praktycznie wykorzystywaæ w ten sposób otrzymane klony. Do klonowania stosuje siê g³ównie dwa rodzaje wektorów: plazmidowe (pochodzenia bakteryjnego) i pochodzenia wirusowego. W tej pracy skoncentrowano siê g³ównie na wektorach pochodzenia bakteryjnego. We wspó³czesnej biotechnologii rekombinowane szczepy drobnoustrojów wykorzystywane s¹ bardzo * Autor korespondencyjny: Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii UW; ul. Miecznikowa 1, Warszawa; tel ;

4 4 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE Rys. 1. Ogólny schemat klonowania Wektor zawiera miejsce inicjacji replikacji (ori), marker selekcyjny (np. gen opornoœci na antybiotyk) oraz miejsce MCS (multiple cloning site), które jest sekwencj¹ DNA zawieraj¹c¹ wiele miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne. Zarówno wektor oraz klonowany fragment DNA trawione s¹ odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (symbol no yczek na rysunku), które pozostawiaj¹ kompatybilne koñce. Nastêpnie przeprowadzana jest ligacja obu fragmentów. czêsto jako narzêdzia produkcyjne. Znajduj¹ one zastosowania w laboratoriach gdzie mog¹ byæ u ywane w celu poznawania funkcji genów lub bia³ek ró nych organizmów. W medycynie szczególnie wa nym osi¹gniêciem jest wykorzystywanie szczepów rekombinowanych do biosyntezy bia³ek lub hormonów ludzkich, które maj¹ du e znaczenie terapeutyczne. Coraz czêœciej s³yszy siê te o wykorzystywaniu technik rekombinacji DNA do otrzymywania rekombinowanych szczepionek, które stosuje siê do szczepieñ ochronnych ludzi i zwierz¹t [24]. Aby wektor by³ u yteczny, powinien spe³niæ kilka podstawowych warunków. Musi byæ zdolny do autonomicznej replikacji w swoistym gospodarzu i posiadaæ miejsca restrykcyjne umo liwiaj¹ce odpowiednie wstawienie fragmentu DNA. Wektor powinien równie nieœæ gen markerowy pozwalaj¹cy na selekcjê, czyli odró nienie komórek gospodarza, które pobra³y zrekombinowany wektor, od tych, które go nie pobra³y [20]. Obecnie dysponujemy du ¹ gam¹ wektorów o ró - nych cechach, takich jak zakres gospodarza, wielkoœæ fragmentu DNA (który mo e byæ niesiony przez wektor), liczba kopii plazmidu, miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne, iloœæ i typ genów markerowych [20]. Ze wzglêdu na rodzaj gospodarza mo na podzieliæ wektory miêdzy innymi na bakteryjne, grzybowe, komórek ssaków, komórek roœlinnych, komórek owadzich [24]. Wektory mo emy te opisywaæ ze wzglêdu na funkcjê, jak¹ spe³niaj¹ w komórkach gospodarza, na przyk³ad wektory ogólnego stosowania do klonowania genów (np. pbr322, puc), wektory u³atwiaj¹ce sklonowanie produktów reakcji PCR ³añcuchowa reakcja polimerazy; polymerase chain reaction (np. pdrive, TOPO wektory), wektory ekspresyjne do efektywnej syntezy bia³ka (np. seria pgem), wektory umo liwiaj¹ce produkcjê bia³ek ludzkich (np. zawieraj¹ce gen insuliny). W niniejszej pracy przedstawiono podstawowe w³aœciwoœci wektorów bakteryjnych oraz mo liwoœci, jakie daje ich zastosowanie. Opisano zarówno wektory klasyczne, które jako pierwsze stosowane by³y w biotechnologii, jak i najnowsze wektory znajduj¹ce obecnie zastosowanie w ró nych dziedzinach. Wymienione s¹ równie cechy, jakie powinien spe³niaæ wektor ekspresyjny oraz pokrótce przedstawiono wykorzystanie wektorów bakteryjnych nios¹cych geny reporterowe, umo liwiaj¹ce prost¹ obserwacjê ekspresji innych genów w komórce. 2. Zastosowania wektorów bakteryjnych 2.1. Wektory jako podstawowe narzêdzie do klonowania Podstawowym zastosowaniem wektorów bakteryjnych jest u ycie ich jako narzêdzi do klonowania. Pomys³ takiego zastosowania powsta³ wkrótce po tym jak odkryto istnienie bia³ek przecinaj¹cych DNA w specyficznych miejscach nazywanych enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne rozcinaj¹ d³ugie cz¹steczki DNA na specyficzne fragmenty, którymi mo na ³atwo manipulowaæ. Drugim niezbêdnym narzêdziem w laboratorium biologicznym s¹ ligazy, czyli enzymy pozwalaj¹ce na ³¹czenie fragmentów nici DNA. Ligazy katalizuj¹ tworzenie wi¹zañ fosfodiestrowych w obszarach zerwania nici DNA przy wykorzystaniu energii ATP lub NAD +. Zastosowanie enzymów restrykcyjnych oraz ligaz DNA umo liwia wycinanie fragmentów DNA, a nastêpnie ich ligacjê z DNA noœnikowym, czyli wektorem oraz póÿniejszy transfer tak zrekombinowanego DNA do komórek bakteryjnych, gdzie mo na tworzyæ ich setki tysiêcy kopii, klonów. To z kolei umo liwia izolacjê sklonowanych fragmentów DNA na du ¹ skalê. Du e iloœci specyficznych sekwencji DNA mog¹ byæ nastêpnie wykorzystywane do ró nych celów izolacji genów, analizy ich organizacji i ekspresji, odczytania sekwencji nukleotydowej [2].

5 MA GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 5 Mo liwoœæ wyizolowania i sklonowania specyficznych fragmentów DNA otworzy³a nowy rozdzia³ w medycynie genetycznej, biologii molekularnej i komórkowej oraz w biochemii. Sklonowanie wybranego fragmentu DNA umo liwi³o szukanie mutacji i polimorfizmów zwi¹zanych z dan¹ chorob¹, identyfikowanie ekspresji genów w wybranych tkankach oraz warunków ekspresji genów [28]. Z biegiem czasu stworzono bardzo wiele wektorów s³u ¹cych do klonowania, które staj¹ siê coraz bardziej wyspecjalizowane, s¹ zdolne do przenoszenia coraz wiêkszych fragmentów DNA i umo liwiaj¹ przeprowadzanie skomplikowanych badañ [20] Klasyczne wektory Wektor pbr322. Jednym z pierwszych najlepiej poznanych i czêsto wykorzystywanych wektorów bakteryjnych by³ plazmid pbr322 (rys. 2). Jest to ma³y plazmid (4366 pz), który zosta³ skonstruowany przez Bolivara i Rodrigueza w 1976 roku. Mo na do niego wstawiaæ fragmenty DNA do 10 kpz [10]. Zawiera on miejsce inicjacji replikacji origin of replication pozwalaj¹ce na replikacjê w jedynym gospodarzu Escherichia coli. pbr322 jest stabilnym plazmidem, normalnie wystêpuj¹cym w iloœci kopii na komórkê (po dodaniu do pod³o a chloramfenikolu liczba kopii mo e wzrosn¹æ nawet do ). Zawiera dwa geny opornoœci: na ampicylinê (w obrêbie genu $-laktamazy) i tetracyklinê. W obrêbie genu tetracykliny znajduj¹ siê miejsca restrykcyjne BamHI, HindIII, i SalI, natomiast w obrêbie genu opornoœci na ampicylinê miejsce restrykcyjne PstI. Oprócz tego Rys. 2. Mapa plazmidu pbr322 Zaznaczono: rep replikon pozwalaj¹cy na replikacjê plamidu (z plazmidu pmb1), rop fragment koduj¹cy bia³ko Rop, amp gen $-laktamazy nios¹cy opornoœæ na ampicylinê, tet gen opornoœci na tetracyklinê. plazmid pbr322 zawiera te miejsce restrykcyjne EcoRI, poza rejonem koduj¹cego DNA [10]. Plazmid pbr322 sta³ siê prekursorem wielu nowszych, coraz bardziej doskonalszych wektorów. Udoskonalone zosta³y miêdzy innymi metody selekcji klonów zawieraj¹cych zrekombinowany DNA, dodano nowe miejsca umo liwiaj¹ce klonowanie (MCS multiple cloning site), zwiêkszono liczbê kopii plazmidów w komórce oraz skonstruowano wektory wielofunkcyjne, s³u ¹ce do szczegó³owej analizy genów [21]. Wektor puc. Przyk³adami takich ulepszonych plazmidów s¹ plazmidy puc18 i puc19. Wektory te ró - ni¹ siê od siebie jedynie odwrotn¹ orientacj¹ polilinkera w genie lacz [24]. Zosta³y one skonstruowane na Uniwersytecie w Kalifornii przez naukowców Messinga i Vieira. Przy ich konstrukcji oparto siê o plazmid pbr322 i maj¹ one 40% wspólnego z nim DNA. S¹ to ma³e plazmidy o wielkoœci 2686 pz, nios¹ce gen opornoœci na ampicylinê oraz N-koñcowy fragment genu lacz. Miejsce inicjacji replikacji w plazmidach puc pochodzi, tak jak w przypadku plazmidu pbr322, z plazmidu pmb1 (rep pmb1). W plazmidach puc obecna jest jednak pojedyncza mutacja punktowa w miejscu inicjacji replikacji oraz brak jest genu rop. To powoduje, e plazmidy puc wystêpuj¹ w wiêkszej liczbie kopii na komórkê (do 500 kopii) ni plazmid pbr322. Ich zalet¹ w stosunku do pbr322 jest równie to, e zawieraj¹ polilinker, w którym znajduj¹ siê sekwencje rozpoznawane przez wiele enzymów restrykcyjnych [20]. Kolejn¹ zalet¹ tych plazmidów jest prostszy sposób selekcji komórek zawieraj¹cych zrekombinowane DNA. Kolonie komórek zawieraj¹cych plazmid puc z dodatkowo wstawionym DNA bêd¹ mia³y bowiem inny kolor, od tych które zawieraj¹ sam, niezmieniony plazmid puc (selekcja na bia³oniebieskie kolonie). Bezpoœrednia selekcja pozytywnych rekombinantów jest mo liwa dziêki zjawisku "-komplementacji. W tego typu doœwiadczeniach stosuje siê szczepy bakteryjne, posiadaj¹ce pojedyncz¹ delecjê w genie lacz (mutacja we fragmencie lacz") kodowanym na chromosomie bakteryjnym. Takie szczepy (np. DH5a) produkuj¹ jedynie defektywn¹ formê enzymu $-galaktozydazy. Stosuj¹c plazmidy zawieraj¹ce fragment tego genu (lacz") nastêpuje komplementacja mutacji na chromosomie, powstaje aktywna forma $-galaktozydazy z podjednostki LacZS kodowanej na chromosomie oraz LacZ" kodowanej na plazmidzie. Aby zaobserwowanie tego zjawiska by³o mo liwe, komórki wysiewa siê na pod³o e zawieraj¹ce induktor IPTG (izopropylo-$-tiogalaktopiranozyd) umo liwiaj¹cy transkrypcjê genu lacz, oraz chromogenny substrat dla $-galaktozydazy zwi¹zek X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolylo-$-D-galaktopiranozyd). Kolonie komórek zawieraj¹ce plazmid z nieprzerwanym

6 6 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE Rys. 3. Mapa plazmidu pdrive firmy Qiagen Zaznaczono geny: kan opornoœci na kanamycynê, amp gen lacz nios¹cy opornoœæ na ampicylinê, miejsce inicjacji replikacji oraz promotory T7 i SP6. Na rysunku zaznaczono równie miejsce do klonowania, które jest przerwane, a jego sekwencja na koñcu 3 zawiera uracyl (U), co pozwala na bezpoœrednie u ycie produktów reakcji PCR (reakcja PCR z polimeraz¹ Taq) do ligacji z wektorem. fragmentem genu lacz (lacz") s¹ zdolne do komplementacji i wytwarzaj¹ $-galaktozydazê, która powoduje rozszczepienie X-gal, przez co na pod³o u selekcyjnym komórki bêd¹ zabarwione na niebiesko. Wstawienie fragmentu DNA w miejsce MCS powoduje przerwanie genu lacz", komórki na pod³o u selekcyjnym bêd¹ wówczas bia³e, poniewa nie powstanie funkcjonalna $-galaktozydaza. Natomiast gen opornoœci na ampicylinê jest markerem pozwalaj¹cym na ³atw¹ selekcjê bakterii zawieraj¹cych zarówno plazmid zrekombinowany jak i niezrekombinowany [24, 32] Wektory komercyjne, nowe strategie warunek jest polimeraza Taq, wyizolowana z bakterii Thermus aquaticus [29]. Nie mo na stosowaæ natomiast polimeraz takich jak np. polimeraza Pfu z Pyrococcus furiosus, która nie dodaje dodatkowej adenozyny. Wektor pdrive ma formê liniow¹ i na jego koñcach wystêpuje uracyl komplementarny do adenozyny znajduj¹cej siê na zewnêtrznych fragmentach produktów po reakcji PCR z wykorzystaniem polimerazy Taq. Konstrukcja wektora znacznie upraszcza procedurê klonowania, poniewa wektor pdrive jest ju przygotowany do bezpoœredniego zastosowania w reakcji ligacji z produktem reakcji PCR. Wektor pdrive niesie gen opornoœci na kanamycynê i ampicylinê. Prost¹ selekcjê umo liwia gen lacz (selekcja na bia³o-niebieskie kolonie) [57]. Wektory pgem T i pgem T easy. Wektory pgem T (rys. 4) i pgem T easy s¹ wektorami o zastosowaniu podobnym do zastosowania wektorów pdrive. S¹ równie narzêdziami u³atwiaj¹cymi pracê przy klonowaniu produktów reakcji PCR. Oba wektory wystêpuj¹ w formie zlinearyzowanej, a na swoich koñcach maj¹ do³¹czon¹ tyminê, która poprawia wydajnoœæ ligacji produktu PCR z wektorem. W ten sposób zapobiega siê recyrkulizacji wektora i zapewnia kompatybilne sekwencje dla produktu PCR namno onego odpowiednimi, termostabilnymi polimerazami, które na koñcach 3 produktu PCR dodaj¹ pojedyncz¹ adeninê. Wektory te wystêpuj¹ w komórce w du ej liczbie kopii [56]. Wektory TOPO. Kolejnym wektorem u³atwiaj¹cym pracê w laboratorium jest miêdzy innymi wektor zawieraj¹cy enzym topoizomerazê I (produkowany jest Obecnie wektory do klonowania czêsto tworzone s¹ w laboratoriach ró nych firm komercyjnych. S¹ to wektory skonstruowane tak by w maksymalnym stopniu u³atwiæ i przyspieszyæ pracê w laboratorium, s¹ tworzone do konkretnych zastosowañ, jak na przyk³ad wektory do szybkiego klonowania produktów reakcji PCR. Przyk³adami takich wektorów analizowanymi w pracy s¹ wektory pdrive, pgem T i pgem T easy oraz wektory z topoizomeraz¹. Wektor pdrive. Wektor pdrive (rys. 3) pozwala na szybkie wykorzystanie produktów reakcji PCR. Fakt, e na koñcach niektórych produktów reakcji PCR pozostawiona jest adenozyna, pozwoli³ na skonstruowanie wektora, który z wysok¹ specyficznoœci¹ hybrydyzuje z produktami PCR. Do reakcji PCR konieczne jest wówczas zastosowanie odpowiedniej polimerazy, która na koñcach nowosyntetyzowanych nici do³¹cz¹ dodatkow¹ zasadê adenozynê. Polimeraz¹, która spe³nia ten Rys. 4. Mapa wektora pgem T firmy Promega Zaznaczono geny: amp opornoœci na ampicylinê, origin replikacji, lacz oraz promotory T7 i SP6. Zaznaczono równie miejsce do klonowania, które jest przerwane, a jego sekwencja na koñcu 3 zawiera tymidynê (T), co pozwala na szybk¹ ligacjê odpowiednich produktów po reakcji PCR z wektorem.

7 MA GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 7 Rys. 5. Zastosowanie wektora TOPO TA w procesie klonowania Wektor TOPO TA jest zlinearyzowany, a na obu koñcach do reszty 3 fosforanowej (oznaczenie P na rysunku) ma do³¹czon¹ topoizomerazê I (TOPO). Topoizomeraza I rozpoznaje specyficzn¹ sekwencjê DNA (miejsca oznaczone *) i pozwala na po³¹czenie wektora TOPO TA z produktem PCR o lepkich koñcach (A na rysunku oznacza dodatkow¹ adenozynê), amplifikowanym polimeraz¹ Taq. Po ligacji topoizomeraza I uwalnia DNA, a wektor TOPO TA zawiera wstawiony produkt PCR. przez firmê Invitrogen pod nazw¹ TOPO vector). Wektor ten jest zlinearyzowany, a na obu koñcach do reszty 3 fosforanowej ma do³¹czon¹ wi¹zaniem kowalencyjnym topoizomerazê I. Biologiczn¹ funkcj¹ topoizomerazy I jest nacinanie oraz ponowne ³¹czenie DNA podczas procesu replikacji. Topoizomeraza I wykorzystywana w TOPO wektorach pochodzi z wirusa ospy krowiej vaccina virus. Enzym ten rozpoznaje sekwencjê 5 (C/T)CCTT 3 i tworzy wi¹zanie kowalencyjne z grupami fosforanowymi do³¹czonymi do 3 tyminy. Nacina jedn¹ z nici DNA, pozwalaj¹c na rozwiniêcie DNA. Nastêpnie enzym religuje koñce rozciêtych nici i uwalnia DNA. Forma liniowa wektorów TOPO pozwala na proste przeprowadzenie ligacji wektora z kompatybilnymi koñcami produktu PCR. Produkt PCR mo e byæ amplifikowany zarówno z u yciem polimerazy Taq (rys. 5), zostawiaj¹cej lepkie koñce (dodatkowa adenozyna), jak i polimeraz zostawiaj¹cych têpe koñce (rys. 6). Ligacja nastêpuje w zaledwie po 5 minutach, w temperaturze pokojowej [53]. Wektory BAC. Wektory zwane BAC (bacterial artificial chromosomes) czyli sztuczne chromosomy bakteryjne s¹ bakteryjnymi systemami do klonowania, których g³ówn¹ zalet¹ jest mo liwoœæ klonowania na nich du ych fragmentów obcego DNA (do 300 kpz). Znakomicie nadaj¹ siê do tworzenia bibliotek genomowych, pozwalaj¹ na zawarcie ca³ego genomu danego organizmu w stosunkowo niewielkiej liczbie klonów. Skonstruowane s¹ one na bazie wektora plazmidowego F wystêpuj¹cego powszechnie u E. coli. Czynnik F u E. coli determinuje p³eæ bakterii, jest plazmidem o wielkoœci oko³o 100 kpz, który koduje ponad 60 bia- ³ek [48]. Wektor BAC ma wielkoœæ 7,5 kpz i z genów, które wystêpowa³y pierwotnie na wyjœciowym plazmidzie, zawiera miêdzy innymi geny para i parb odpowiedzialne za replikacjê. Replikacja czynnika F podlega œcis³ej kontroli systemów reguluj¹cych E. coli i w wektorze BAC zapewnia to utrzymywanie jego niskiej liczby kopii. To pozwala na stabilne utrzymywanie du ych insertów DNA oraz obni a ryzyko rekombinacji miêdzy fragmentami DNA niesionymi przez wektor. Geny para i parb s¹ odpowiedzialne za prawid³ow¹ segregacjê plazmidów do komórek potomnych. Uniemo liwiaj¹ one wspó³wystêpowanie systemów BAC w pojedynczej komórce, co jest zalet¹ w porównaniu do wektorów dro d owych YAC (yeast artificial chromosome; sztuczne chromosomy dro d owe) [40]. Rys. 6. Zastosowanie wektora Zero Blunt TOPO w procesie klonowania Wektor Zero Blunt TOPO jest zlinearyzowany, a na obu koñcach do reszty 3 fosforanowej (oznaczenie P na rysunku) ma do³¹czon¹ topoizomerazê I (TOPO). Topoizomeraza I rozpoznaje specyficzn¹ sekwencjê DNA (miejsca oznaczone *) i pozwala na po³¹czenie wektora Zero Blunt TOPO z produktem PCR o têpych koñcach. Po ligacji topoizomeraza I uwalnia DNA, a wektor Zero Blunt TOPO zawiera wstawiony produkt PCR.

8 8 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE 2.2. Wektory s³u ¹ce do przenoszenia genów miêdzy organizmami Wa nym zastosowaniem wektorów bakteryjnych jest wykorzystanie ich do przenoszenia genów miêdzy ró nymi organizmami, równie takimi, które nie s¹ ze sob¹ spokrewnione. Wektory umo liwiaj¹ce przenoszenie DNA w ten sposób nazywane s¹ wektorami wahad³owymi. Zawieraj¹ one systemy replikacyjne pozwalaj¹ce im na replikacjê w dwóch ró nych organizmach. W ten sposób mo na je przenosiæ miêdzy tymi organizmami bez potrzeby jakiejkolwiek modyfikacji wektora. Jako przyk³ady mo na wymieniæ miêdzy innymi wektory maj¹ce zdolnoœæ replikacji w E. coli i Bacillus subtilis, w E. coli i dro d ach, w E. coli i komórkach ssaków oraz wiele innych [25]. Najwa niejszymi cechami wektorów s³u ¹cych do przenoszenia genów miêdzy organizmami jest oprócz posiadania miejsca inicjacji replikacji dla obu gospodarzy, posiadanie markerów selekcyjnych, dziêki którym mo na przeprowadziæ selekcjê zarówno w jednym jak i w drugim gospodarzu. Aby osi¹gn¹æ stabilne utrzymywanie siê i ekspresjê genów w danym organizmie b¹dÿ tkance stworzono wektory integracyjne. Wystêpuj¹ one w bardzo niskiej liczbie kopii (na ogó³ jedna kopia) na komórkê [25]. Wektory te zawieraj¹ sekwencje rekombinacyjne, homologiczne do sekwencji w chromosomie gospodarza, które umo liwiaj¹ integracjê w odpowiednim miejscu w chromosomie Transport genów do komórek eukariotycznych Czêsto zachodzi potrzeba wykorzystania wektorów nie tylko w celu ekspresji genów w ró nych komórkach bakteryjnych, lecz równie w komórkach eukariotycznych. Wektory bakteryjne na przyk³ad w postaci plazmidu s¹ wtedy noœnikami fragmentu DNA, który ma zostaæ umieszczony w komórce eukariotycznej. Istnieje jednak równie potrzeba u ycia kolejnego wektora, który pozwoli na dostarczenie plazmidu do komórki. W tym celu wykorzystywane s¹ zazwyczaj komórki bakteryjne takie jak Listeria monocytogenes lub E. coli z wklonowanymi genami pochodz¹cymi od bakterii z rodzaju Listeria lub Yersinia. Dziêki takim systemom mo na dostarczyæ do komórek eukariotycznych bia³ka [14] lub DNA [11], które mog¹ równie pe³niæ funkcjê indukowania odpowiedzi immunologicznej organizmu (szczepionki nowej generacji) [8]. D i e t r i c h i wsp. [7] przedstawiaj¹ wykorzystanie atenuownego szczepu bakterii L. monocytogenes w celu dostarczenia przez wektor bakteryjny genu koduj¹cego antygen do cytozolu makrofagów. Gen lizyny faga L. monocytogenes znajduje siê pod kontrol¹ promotora genu acta, dziêki czemu po wnikniêciu do cytozolu makrofagów komórki bakteryjne s¹ lizowane. Umo liwia to uwolnienie plazmidów wektorów ekspresyjnych, które znajdowa³y siê w cytoplazmie komórek L. monocytogenes. Plazmidy ulegaj¹ ekspresji w j¹drze makrofagów, a jest to mo liwe, poniewa zawieraj¹ eukariotyczne promotory. W ten sposób uzyskano efektywn¹ ekspresjê wklonowanych genów reporterowych oraz prezentacjê antygenu. Podobne zastosowania s¹ opisane w pracy S p r e n g a i wsp. [41], gdzie prezentowane s¹ dwa systemy pozwalaj¹ce na dostarczenie rekombinowanych bia³ek lub DNA do komórek eukariotycznych. Jeden z nich wykorzystuje atenuowane szczepy bakterii gramujemnych, które umo liwiaj¹ sekrecjê heterologicznych antygenów przez system sekrecji hemolizyny z E. coli. Drugi system opiera siê na opisanym powy ej wykorzystaniu bakterii L. monocytogenes pozwalaj¹cym na dostarczenie wektora ekspresyjnego do cytoplazmy komórek prezentuj¹cych antygen, takich jak makrofagi. Ciekawym przyk³adem wykorzystania metody in- ynierii genetycznej jest indukowanie komórkowej odpowiedzi immunologicznej w komórkach ssaków lub projektowanie szczepionek przeciw patogenom wewn¹trzkomórkowym. H i g g i n s i wsp. [14] opisuj¹ wykorzystanie bakterii E. coli produkuj¹cej cytoplazmatyczne, zrekombinowane bia³ko listeriolizyny, które pozwala na dostarczenie innych bia³ek do cytozolu makrofagów w komórkach ssaków. Przy u yciu takiego systemu mo na dostarczyæ do cytozolu dowolne bia³ko, które mo e byæ nastêpnie wytwarzane przez E. coli, bez potrzeby uprzedniego jego oczyszczania Wektory ekspresyjne Wektory bakteryjne mog¹ byæ wykorzystywane jako narzêdzie do produkcji bia³ek oraz ich ewentualnego póÿniejszego oczyszczania (wektory ekspresyjne), jak i do analizy lokalizacji bia³ek w komórce wektory zawieraj¹ce geny reporterowe, np. gen koduj¹cy zielone bia³ko fluorescencyjne GFP (green fluorescent protein), które bêd¹ opisane w kolejnym rozdziale. W ró nego rodzaju badaniach nad bia³kami wektory ekspresyjne mog¹ byæ wykorzystywane do produkcji bia³ek do celów poznawczych takich jak analizy funkcjonalne i strukturalne, lub aplikacyjnych terapia i profilaktyka chorób organicznych i zakaÿnych. Umo liwiaj¹ one nadprodukcjê bia³ek, które na ogó³ w organizmach ywych wystêpuj¹ w iloœci niewystarczaj¹cej by umo liwiæ ich izolacjê na du ¹ skalê [42] Nadprodukcja bia³ek Do nadprodukcji okreœlonego bia³ka niezbêdne s¹ trzy elementy dobrany gospodarz, którym na ogó³ jest organizm modelowy E. coli, w³aœciwy wektor oraz

9 MA GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 9 odpowiednio namno ony gen b¹dÿ fragment genu, koduj¹cy oczyszczane bia³ko [42]. W³aœciwy gospodarz wraz z wektorem, który w nim poprawnie funkcjonuje stanowi¹ razem system ekspresyjny [39]. Przy tworzeniu systemu ekspresyjnego nie bez znaczenia jest wybór odpowiedniego gospodarza, który powinien spe³niaæ pewne kryteria. Po ¹dane jest, aby by³ zdolny do szybkiego wzrostu na tanich substratach, jego genom powinien byæ dobrze scharakteryzowany, a u ywany szczep nie powinien byæ patogenny. Najczêœciej stosowanymi s¹ systemy ekspresyjne, w których gospodarzem jest E. coli. Jest to modelowy organizm, dla którego metody hodowli s¹ dobrze opracowane, a jego genom jest scharakteryzowany o wiele lepiej ni innych mikroorganizmów [1]. Gospodarz musi byæ odpowiednio dobrany w stosunku do genu bia³ka, tak by by³ on efektywnie eksprymowany. Wa - ne jest miêdzy innymi, aby nie wystêpowa³y znaczne ró nice w czêstotliwoœci wystêpowania poszczególnych kodonów gospodarza w stosunku do genu bia³ka, mrna powinno byæ stabilne, translacja mrna powinna przebiegaæ efektywnie [26]. Gospodarz musi umo liwiaæ poprawne przeprowadzanie procesów takich jak modyfikacje posttranslacyjne bia³ek, fa³dowanie bia³ek, sekrecjê bia³ek do pod³o a. Powstaj¹ce w du ej iloœci bia³ko nie powinno byæ równie toksyczne w stosunku do gospodarza [26]. Mimo e E. coli posiada bardzo wiele zalet, niejednokrotnie konieczne jest u ycie organizmu innego gatunku jako gospodarza. W przypadku, gdy nie mo emy jako gospodarza wykorzystaæ szczepu E. coli alternatyw¹ mog¹ byæ bakterie z rodzaju Bacillus, Streptomyces, czy gatunki Lactococcus lactis, Corynebacterium glutamicum. Ze wzglêdu na pewne modyfikacje posttranslacyjne zdarza siê, e niezbêdnym jest zastosowanie gospodarzy innych ni bakteryjne (np. grzyby z typu workowców lub grzyby strzêpkowe, komórki owadzie, mysie lub ludzkie linie komórek ssaczych) [42] Cechy, które powinien spe³niaæ wektor ekspresyjny Charakterystyczne w³aœciwoœci wektorów ekspresyjnych zosta³y schematycznie przedstawione na rys. 7. Ka dy wektor ekspresyjny zawiera sekwencjê promotorow¹ inicjacji transkrypcji, która jest umieszczona powy ej miejsca wklonowania obcego fragmentu DNA. Za miejscem inicjacji transkrypcji znajduje siê sekwencja nazywana miejscem wi¹zania rybosomu (Shine Dalgarno), poni ej której znajduje siê miejsce insercji klonowanego DNA. Na pocz¹tku fragmentu obcego DNA znajduje siê kodon AUG inicjuj¹cy translacjê, a na koñcu kodon stop, który jest terminatorem syntezy polipeptydu. Oprócz tych sekwencji wektory posiadaj¹ równie miejsce inicjacji replikacji oraz Rys. 7. Cechy charakterystyczne wektora ekspresyjnego gen umo liwiaj¹cy przeprowadzenie selekcji. Szersz¹ analizê poszczególnych elementów wektorów ekspresyjnych przedstawiono w dalszej czêœci pracy. Promotor. W eksperymentach s³u ¹cych nadprodukcji bia³ek g³ówny cel stanowi otrzymanie du ej iloœci badanego bia³ka. W wiêkszoœci przypadków wa ne jest by nadprodukowane bia³ko stanowi³o 10 30% wszystkich bia³ek w komórce. W zwi¹zku z tym zastosowany promotor powinien byæ silny, ale jednoczeœnie powinien wykazywaæ minimaln¹ ekspresjê podstawow¹ [26]. Oprócz tego optymaln¹ sytuacj¹ jest gdy indukcja promotora jest prosta i mo liwa przy u yciu tanich substratów, które nie s¹ stosowane w standardowych pod³o ach [13]. Znaczniki. Znaczniki, które s¹ do³¹czane do rekombinowanych bia³ek maj¹ na celu u³atwienie ich oczyszczania, detekcji, lub zwiêkszenia rozpuszczalnoœci. Znacznikiem mo e byæ krótki peptyd, domena, b¹dÿ ca³e bia³ko. Znacznik powinien wykazywaæ du e powinowactwo do z³o a, na którym bêdzie oczyszczane bia³ko, pozwalaæ na elucjê substancjami niskocz¹steczkowymi, mieæ niewielki wp³yw na aktywnoœæ i strukturê trzeciorzêdow¹ bia³ka, jak i ³atw¹ wykrywalnoœæ [45]. Wa nymi cechami znaczników jest równie mo - liwoœæ ich jednoetapowej adsorpcji na z³o u, ³atwe i specyficzne usuniêcie ich w celu otrzymania natywnego bia³ka oraz mo liwoœæ zastosowania do ró nych bia³ek. Jednak ka dy ze znaczników w czasie oczyszczania wymaga specyficznych warunków, które mog¹ wp³ywaæ na w³aœciwoœci bia³ka. Z tego powodu istniej¹ ró ne strategie u ywane przy produkcji bia³ek na du ¹ skalê. Jedn¹ z nich jest u ywanie ma³ych znaczników, które nie powinny wp³ywaæ na oczyszczane bia³ko, takich jak: poly-arg, FLAG-, poli-his, S-tag. W niektórych wypadkach ma³e znaczniki nie

10 10 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE Cechy charakterystyczne niektórych najczêœciej u ywanych znaczników [wg 43, 45, 32] Tabela I Znacznik Poly-Arg Poly-His FLAG Strep-tag S-tag Opis i w³aœciwoœci znacznik poliargininowy, sk³ada siê z piêciu do szeœciu arginin, oczyszczany na z³o u kationowymiennym SP-Sephadex, mo e wp³ywaæ na strukturê trzeciorzêdow¹ bia³ka znacznik polihistydynowy, oczyszczany na z³o u niklowym Ni 2+ -NTA, lub Co 2+ -CMA, umo liwia oczyszczanie w warunkach natywnych i denaturuj¹cych, elucja zachodzi w ³agodnych warunkach, z³o e jest tanie, specyficznoœæ IMAC jest mniejsza ni innych metod chromatografii powinowactwa, nie zwiêksza rozpuszczalnoœci bia³ka znacznik wykorzystuj¹cy krótki, hydrofilowy oœmioaminokwasowy peptyd, wi¹ e siê do przeciwcia³a M1, mo e byæ przy³¹czony do bia³ka na C- lub N-koñcu, mo e byæ u ywany w ró nego typu komórkach, ma wysok¹ specyficznoœæ, oczyszczanie zachodzi w warunkach niedenaturuj¹cych, z³o e jest drogie znacznik sk³adaj¹cy siê z nonapeptydu, wi¹ e siê do streptawidyny, ma wysok¹ specyficznoœæ, eluowany w ³agodnych warunkach, stosowane z³o e jest drogie 15-aminokwasowy fragment rybonukleazy A, ma wysok¹ specyficznoœæ, pozwala na proste wykrycie iloœci rekombinowanego bia³ka mniejszych ni 1 fmol, elucja nastêpuje w surowych warunkach, z³o e jest drogie, znacznik nie zwiêksza rozpuszczalnoœci bia³ka musz¹ byæ usuwane z bia³ka. Czasem lepsz¹ strategi¹ jest u ycie du ych peptydów lub bia³ek jako znaczników. Zalet¹ tego typu znaczników jest nadawanie przez nie bia³ku rozpuszczalnoœci, wad¹ natomiast, e w wiêkszoœci przypadków musz¹ byæ z produkowanego bia³ka usuniête [44]. Niestety nie istniej¹ znaczniki idealne, które spe³nia- ³yby wszystkie po ¹dane kryteria. Niekiedy optymalnym rozwi¹zaniem jest wiêc stosowanie jednoczeœnie dwóch lub wiêcej znaczników [47]. W zwi¹zku z zapotrzebowaniem na ró nego rodzaju znaczniki pracowano nad ich konstrukcj¹ ju w latach 80 i 90. Bior¹c pod uwagê tak du ¹ iloœæ kryteriów, które powinny byæ spe³nione przez dobry znacznik nie jest zaskoczeniem fakt, e nadal istnieje potrzeba konstruowania nowych, coraz lepiej nadaj¹cych siê do konkretnych doœwiadczeñ znaczników [45]. Znaczniki, które s¹ najczêœciej stosowane zaprezentowano w tabeli I. Terminatory procesu transkrypcji oraz translacji. W wektorach ekspresyjnych terminator transkrypcji umieszcza siê na ogó³ poni ej eksprymowanego genu (co zwiêksza stabilnoœæ plazmidu zapobiegaj¹c transkrypcji przez miejsce startu replikacji) [38] oraz powy ej (aby zminimalizowaæ ekspresjê podstawow¹) [13]. W organizmach prokariotycznych terminacja transkrypcji mo e byæ powodowana przez dwa mechanizmy: Rho-zale ny b¹dÿ Rho-niezale ny. W mechanizmie Rho-zale nym terminacja tranksrypcji zale y od heksamerycznego bia³ka Rho powoduj¹cego uwolnienie powstaj¹cego mrna z matrycy [26]. Terminatory Rho-niezale ne sk³adaj¹ siê natomiast z odwróconych sekwencji nukleotydowych, po których nastêpuje ci¹g nukleotydów adenylowych. Po przejœciu polimerazy RNA przez sekwencjê odwróconych powtórzeñ mrna tworzy strukturê szpilki do w³osów, co powoduje zatrzymanie siê enzymu. Ci¹g nukleotydów urydynylowych znajduj¹cy siê za sekwencj¹ odwróconych powtórzeñ s³abo oddzia³uje z nukleotydami adenylowymi na nici matrycowej, przez co polimeraza oddysocjowuje. W wektorach ekspresyjnych wykorzystuje siê terminatory Rho-niezale ne [38]. Najwiêksze efekty terminacji translacji uzyskuje siê stosuj¹c przed³u ony kodon stop UAAU lub kilka kolejnych kodonów stop umieszczonych jeden za drugim [35]. Markery selekcyjne. Najczêœciej w wektorach ekspresyjnych stosowane s¹ jako markery selekcyjne geny warunkuj¹ce opornoœæ na antybiotyki (np. ampicylinê, kanamycynê, chloramfenikol, tetracyklinê). Alternatywnymi strategiami mog¹ byæ miêdzy innymi systemy trucizna-antidotum (np. system hok/sok z plazmidu R1), które zapewniaj¹ stabilny rozdzia³ plazmidów miêdzy komórkami potomnymi [42] Przyk³ady wektorów ekspresyjnych Plazmid pub110. Wektor pub oraz jego pochodne s¹ plazmidami pochodz¹cymi z bakterii Staphylococcus aureus przystosowanymi do wykorzystania w pracach z B. subtilis. Ze wzglêdu na mo liwoœæ u ywania tych wektorów przy pracy z B. subtilis maj¹ one wiele zalet. Mog¹ byæ u ywane do analizy procesu sporulacji, kie³kowania przetrwalników i transformacji. Równoczeœnie wektory te daj¹ mo liwoœæ porównywania systemu ekspresji genów z B. subtilis w stosunku do E. coli. Zalet¹ u ycia B. subtilis jest te fakt, e bakteria ta jest niepatogenna oraz nie wystêpuje w naturalnej mikroflorze cz³owieka [12]. Ponadto B. subtilis jest bakteri¹ doœæ dobrze poznan¹, która nie posiada zewnêtrznej b³ony, co upraszcza sekrecjê i oczyszczanie produkowanego bia³ka [9]. Poza tym szczepy Bacillus s¹ czêsto u ywane do produkcji antybiotyków, enzymów, insektycydów, jak i w procesach fermentacji.

11 MA GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 11 Rys 8. Schematyczne mapy ró nych wektorów typu pet Zaznaczono: ori miejsce inicjacji replikacji, f1 origin, promotor T7, gen laci, amp gen opornoœci na ampicylinê, kan gen opornoœci na kanamycynê. A: wektory pet-3a-d, pet-12a-c, pet-14b, pet-17b, pet-17xb B: wektory pet-21(+), pet-21a-d(+), pet-22b(+), pet-25b(+), pet-31b(+), pet-32a-c(+), pet-32 Ek/LIC, pet-32 Xa/LIC, pet-43.1a-c(+) C: wektory pet-24+, pet-24a-d(+), pet-26b(+), pet-27b(+), pet-28a-c(+), pet-29a-c(+), pet-30a-c(+), pet-30 LIC, pet-33b(+), pet-34b(+), pet-35b(+), pet-36b(+), pet-37b(+), pet-38b(+), pet-39b(+), pet-40b(+), pet-41a-c(+), pet-42a-c(+) Wektor pub110 zawiera geny opornoœci na bleomycynê i kanamycnê. Jest on stabilny w komórkach B. subtilis, wystêpuje w liczbie kopii oko³o 50 na chromosom [19]. Gryczan i wsp. [12] wykazali, e jest on utrzymywany w komórkach B. subtilis, nawet przy braku kanamycyny w pod³o u. Mo na go izolowaæ na du ¹ skalê, w B. subtilis replikuje siê autonomicznie i jest wówczas wysokokopiowy. Ustalono wiele miejsc restrykcyjnych dla tego plazmidu. pub110 daje siê ³atwo transformowaæ do komórek gospodarza i pozwala na efektywn¹ selekcjê zrekombinowanych komórek [12]. Problemami pojawiaj¹cymi siê w pracy z B. subtilis jako z organizmem do produkcji bia³ek s¹ czêsto: niestabilnoœæ strukturalna zrekombinowanego plazmidu oraz niestabilnoœæ rekombinowanych bia³ek wydzielanych do pod³o a. Przyczyna molekularnej niestabilnoœci jest u nich zwi¹zana ze sposobem replikacji plazmidów wed³ug modelu tocz¹cego siê ko³a. Powstaje wówczas jednoniciowe DNA oraz krótkie sekwencje powtórzone (direct repeats), co mo e prowadziæ do delecji jednego z dwóch powtórzeñ i inwersji fragmentu DNA umieszczonego miêdzy nimi. Ta obserwacja doprowadzi³a do rozwoju grupy wektorów nios¹cych kasetê ekspresyjn¹ umieszczon¹ w œrodku genów takich jak amye, thrc, laca, pyrd. W miejscach w chromosomie, gdzie znajduj¹ siê wy ej wymienione geny, wektory te umo liwiaj¹ stabiln¹ integracjê sekwencji DNA [30]. Kolejnym problemem zwi¹zanym z prac¹ z B. subtilis jest produkcja przez tê bakteriê pozakomórkowych proteaz, które rozpoznaj¹ i degraduj¹ wiêkszoœæ heterologicznych bia³ek wydzielanych do pod³o a [9]. Problem ten mo na rozwi¹zaæ przez wprowadzanie mutacji typu null w genach koduj¹cych proteazy. Zosta³y stworzone szczepy z szeœcioma lub nawet oœmioma tego typu mutacjami. Alternatywnym rozwi¹zaniem tego problemu by³oby zidentyfikowanie i znalezienie gospodarza, który nie wydziela³by proteaz [30]. Wektory pet. Wektory typu pet s¹ interesuj¹cymi narzêdziami wykorzystywanymi do klonowania i nadprodukcji bia³ek w E. coli. Wszystkie s¹ pochodnymi plazmidu pbr322. S¹ skonstruowane w oparciu o system promotora T7 [43], geny klonowane na tym wektorze znajduj¹ siê pod kontrol¹ sygna³ów transkrypcyjnych i translacyjnych pochodz¹cych z bakteriofaga T7. Natomiast ekspresja kontrolowana jest przez operon laktozowy i jej inicjacja nastêpuje przez dodanie IPTG do pod³o a. Istnieje wiele wektorów serii pet (rys. 8), które w zale noœci od celu wykorzystania, mog¹ ró niæ siê na przyk³ad sekwencj¹ liderow¹, sygna³ami ekspresyjnymi, miejscami restrykcyjnymi, genami nios¹cymi opornoœæ na antybiotyki oraz znacznikami dodawanymi do bia³ek. Mo na wyró niæ dwie g³ówne grupy wektorów pet pe³ni¹cych funkcje wektorów transkrypcyjnych lub translacyjnych. Wektory transkrypcyjne pozwalaj¹ na ekspresjê docelowego RNA, ale nie zawieraj¹ sygna³ów translacyjnych. S¹ przydatne w wypadku, gdy po ¹dane jest uzyskanie bia³ek kodowanych przez geny, które posiadaj¹ w³asne sygna³y translacyjne. Wektory translacyjne natomiast same zawieraj¹ sygna³y inicjacji translacji. Wektory pet mog¹ umo liwiaj¹ ró nego rodzaju zastosowania, miêdzy innymi: pet-31b(+) wysokowydajna produkcja peptydów i ma³ych bia³ek pet-32a-c produkcja rozpuszczalnych, aktywnych bia³ek w E. coli pet-33b produkcja docelowych bia³ek nadaj¹cych siê do wyznakowania P 32 pet-44a-c dodawanie sekwencji Nus Tag oraz N- i C-terminalnej metki His Tag pet-45b(+) dodawanie metki histydynowej przy sekwencji terminalnej bia³ka [52 54]. Wektory pqe. Wektory typu pqe (rys. 9) s³u ¹ do klonowania i ekspresji genów, s¹ alternatyw¹ dla wektorów typu pet. Umo liwiaj¹ one dodanie do badanych bia³ek metki histydynowej. Stworzono równie wektory pqe z podwójn¹ metk¹ zawieraj¹ce, oprócz metki histydynowej w czêœci N-terminalnej, Tag*100 w czêœci C-terminalnej. Wektory te osi¹gaj¹ wysoki

12 12 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE poniewa chromatyna otaczaj¹ca miejsce integracjii istotnie wp³ywa na ekspresjê genów w takim uk³adzie oraz wystêpuje tendencja do wyciszania ekspresji [50]. W takiej sytuacji korzystne jest u ycie systemu do klonowania BAC, poniewa jest on mniej wra liwy na stopieñ upakowania i aktywnoœci chromatyny otaczaj¹cej miejsce integracji [3] Produkcja insuliny Rys. 9. Mapa plazmidu pqe-100 firmy Qiagen Zaznaczono: promotor T5 (PT5), operator lac (lac O), miejsce wi¹zania rybosomu (RBS), kodon startowy (ATG), metka histydynowa (6xHis), miejsce wielokrotnego klonowania (MCS), metka Tag 100, kodon stop, origin replikacji (Col E1), amp gen opornoœci na ampicylinê. poziom ekspresji w E. coli, a metkowane mo e byæ ka de bia³ko. Metka histydynowa umo liwia oczyszczenie bia³ka na matrycy Ni 2+ -NTA i jego immobilizacjê. Z kolei metka Tag*100 w czêœci C-terminalnej jest rozpoznawan¹ przez przeciwcia³a monoklonalne, co pozwala na bardzo specyficzn¹ detekcjê bia³ka (przy u yciu antymysich przeciwcia³ skoniugowanych z IgG) [58]. Zastosowanie wektorów BAC w nadprodukcji bia- ³ek. Opracowanie systemów do klonowania BAC mia- ³o doœæ du y zwi¹zek z projektem odczytania sekwencji ludzkiego genomu Human Genome Project. Przy realizacji tego projektu niezbêdne by³o tworzenie map fizycznych ludzkich chromosomów, które pozwala³yby na izolacjê, sekwencjonowanie oraz inne manipulacje na fragmentach DNA. Pocz¹tkowo w odpowiedzi na te potrzeby zosta³y rozwiniête systemy YAC. Stwarza³y one jednak pewne problemy w stosowaniu. Przeszkod¹ by³ równie fakt, e praca z komórkami dro d owymi by³a bardziej skomplikowana ni z dobrze poznanym organizmem modelowym jakim jest E. coli. Wykorzystanie systemów BAC u³atwi³o prace badawcze i pozwoli³o na klonowanie wiêkszych ni dotychczas fragmentów DNA [40]. Wektory typu BAC odgrywaj¹ wa n¹ rolê przy produkcji bia³ek w komórkach ssaków [3]. Jednym z punktów krytycznych w produkcji rekombinowanych bia³ek jest izolacja pojedynczych komórek, które pozwalaj¹ na ekspresjê genów i otrzymywanie bia³ka w du ych iloœciach. Na ogó³ stosuje siê wektory zawieraj¹ce promotor, konkretny gen oraz marker selekcyjny. Jednak metoda ta nie jest wystarczaj¹co skuteczna, Pierwszym bia³kiem z organizmu ssaków produkowanym w komórkach bakteryjnych dziêki wykorzystaniu techniki rekombinacji DNA by³a ludzka insulina [17, 34]. Ludzka insulina jest bardzo wa nym lekiem dla pacjentów chorych na cukrzycê. Insulina produkowana jest przez komórki $ wyspy Langerhansa. BodŸcem do jej produkcji jest zwiêkszone stê enie glukozy we krwi (np. po spo yciu posi³ku). Insulina wp³ywa na komórki efektorowe miocyty, adipocyty, hepatocyty, przez co zwiêksza siê transport glukozy do wnêtrza komórek i jednoczeœnie obni a poziom glukozy we krwi. Niedobór insuliny u chorych na cukrzycê powoduje zaburzenia gospodarki wêglowodanowej. Zastosowanie w leczeniu chorych ludzkiej insuliny ma znaczn¹ przewagê nad stosowaniem insuliny zwierzêcej (uzyskiwanej od ciel¹t b¹dÿ œwiñ). Insulina zwierzêca wprawdzie nieznacznie ró ni siê od insuliny produkowanej w organizmie ludzkim, ale jej podawanie mo e powodowaæ u pacjenta produkcjê przeciwcia³ skierowanych przeciwko insulinie zwierzêcej. W ten sposób dzia³anie takiej insuliny by³oby obni one oraz mog³oby powodowaæ stan zapalny. Ludzka insulina produkowana w bakteriach jest identyczna do tej, która jest produkowana w organizmie cz³owieka. Jest wiêc du o lepiej tolerowana przez pacjenta. Prace nad otrzymaniem preparatu ludzkiej insuliny zosta³y podjête ju w 1978 roku przez wspó³pracuj¹ce ze sob¹ firmy Eli Lilly i Genentech. Fragmenty DNA koduj¹ce ³añcuch A i B insuliny zosta³y oddzielnie wklonowane do plazmidu pbr322 i umieszczone w fuzji z genem $-galaktozydazy [21]. Pierwszym preparatem zawieraj¹cym ludzk¹ insulinê dostêpnym dla pacjentów by³ lek lispro, który na rynku ukaza³ siê w 1996 roku. Nadal jednak opracowywane s¹ leki, które maj¹ coraz lepsze w³aœciwoœci takie jak wiêksza stabilnoœæ, mniejsza zmiennoœæ, tworzone s¹ analogi o krótkim b¹dÿ d³ugim dzia³aniu. Ma to na celu jak najlepsze dostosowanie indywidualnej terapii do pacjenta [46] Produkcja szczepionek nowej generacji Jednym z nowoczesnych i bardzo wa nych zastosowañ wektorów bakteryjnych jest ich wykorzystanie do produkcji szczepionek nowej generacji. Obecnie nadal znakomit¹ wiêkszoœæ szczepionek, które s¹ sto-

13 MA GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 13 sowane zarówno w medycynie jak i w weterynarii stanowi¹ szczepionki tradycyjne, skonstruowane w oparciu o wykorzystywanie atenuowanych lub zabitych mikroorganizmów albo oczyszczonych toksyn bakteryjnych [37]. Konstruowane s¹ one na ogó³ poprzez pasa owanie mikroorganizmów patogennych na pod- ³o ach stwarzaj¹cych nieoptymalne warunki wzrostu, b¹dÿ przez poddawanie ich mutagenezie chemicznej lub fizycznej. Mutacje powstaj¹ce w ten sposób w genomie s¹ przypadkowe i zawsze istnieje pewne ryzyko rewersji szczepu do pe³nej zjadliwoœci. Wykorzystanie metod rekombinacji DNA pozwala na wprowadzanie œciœle zdefiniowanych mutacji, co znacznie zmniejsza szansê rewersji szczepu do typu wirulentnego [33]. Nowe strategie tworzenia szczepionek polegaj¹ na wykorzystaniu mikrooganizmów zmodyfikowanych genetycznie, rekombinowanych bia³ek oraz stosowaniu zarówno wektorów bakteryjnych jak i wirusowych. Dziêki temu staje siê mo liwe projektowanie szczepionek, które zapewniaj¹ wy sz¹ efektywnoœæ oraz bezpieczeñstwo dla pacjenta [22], a ponadto znacznie redukuj¹ koszty [9]. Istotnymi zaletami szczepionek nowej generacji jest zwiêkszona immunogennoœæ, ³atwoœæ przechowywania i podawania, brak koniecznoœci stosowania adiuwantów, mo liwoœæ indukcji konkretnego typu odpowiedzi, mo liwoœæ immunizacji wieloma antygenami równoczeœnie i teoretyczna mo liwoœæ prezentacji antygenów w natywnej postaci [33]. Bardzo wa nym etapem przy konstrukcji szczepionek jest wybór sposobu umieszczenia heterologicznych genów w komórkach noœnika. Mo na wykorzystaæ tu plazmidy, które po dostarczeniu do komórki docelowej bêd¹ wystêpowa³y w cytoplazmie w ró nej iloœci kopii. Zalet¹ takiego podejœcia jest mo liwoœæ, w zale noœci od liczby kopii plazmidu, sterowania iloœci¹ produktu obcego genu. Wad¹ natomiast to, e plazmidy w warunkach in vivo bez presji selekcyjnej nie s¹ stabilnie utrzymywane. Aby omin¹æ ten problem mo na zaopatrzyæ wektory w geny metabolizmu podstawowego, które komplementuj¹ chromosomalne delecje w analogicznych genach. Alternatywnym podejœciem jest zastosowanie wektorów, które pozwalaj¹ na insercjê obcego genu do chromosomu szczepu noœnikowego (co jednoczeœnie eliminuje problem niestabilnoœci plazmidu). Niestety czêsto zdarza siê, e iloœæ powstaj¹cego produktu mo e byæ niewystarczaj¹ca do indukcji odpowiednio silnej odpowiedzi immunologicznej. Ekspresja obcych genów na ogó³ kontrolowana jest przez promotory szczepu noœnikowego. Jeœli jest zbyt silna to du a iloœæ powstaj¹cego produktu obcego genu w komórce mo e byæ dla niej toksyczna. Z tego wzglêdu zosta³y rozwiniête systemy zawieraj¹ce promotory, które mog¹ byæ aktywowane in vivo, dopiero gdy mirkroorganizm noœnikowy dotrze do konkretnej niszy ekologicznej gospodarza. Wówczas, nawet jeœli powstanie zabójcza iloœæ heterologicznego antygenu dla komórki noœnikowej, nie zostanie zaburzona indukcja w³aœciwej odpowiedzi immunologicznej [33]. W celu dostarczenia heterologicznego antygenu do komórek eukariotycznych nie wystarczy jednak sam wek'tor bakteryjny w postaci plazmidu, potrzebny jest jeszcze jeden wektor, którym jest najczêœciej zrekombinowany szczep bakteryjny, pozwalaj¹cy na dostarczenie plazmidu do cytoplazmy komórki. Szczepem noœnikowym mo e byæ prawdopodobnie ka dy scharakteryzowany patogen, którego biologia jest dostatecznie dobrze poznana. Wœród szczepów noœnikowych wyró nia siê g³ównie bakterie nale ¹ce do gatunków Mycobacterium bovis i Salmonella enterica oraz rodzajów: Vibrio, Shigella, Listeria [33]. Mikroorganizmem noœnikowym o interesuj¹cych w³aœciowoœciach, które mog¹ byæ wykorzystane do konstrukcji szczepionki, jest L. monocytogenes. Bakteria ta to Gram-dodatnia pa³eczka, która jest fakultatywnie wewn¹trzkomórkowym patogenem zdolnym do wnikania, prze ywania oraz namna ania siê w komórkach eukariotycznych. Ma ona doœæ unikalny cykl yciowy, a jej g³ównym czynnikiem wirulencji jest listeriolizyna O (LLO). LLO kodowana przez gen hly, jest pozakomórkowo wydzielan¹ hemolizyn¹. Powoduje ona zniszczenie b³ony fagolizosomu i pozwala bakterii na wydostanie siê do cytopazmy [16]. Przy konstruowaniu szczepionek wykorzystuje siê atenuowane delecyjnie szczepy Listeria, które s¹ niezdolne do rozprzestrzeniania miêdzykomórkowego. Poza tym rozwijane s¹ systemy oparte na wykorzystaniu rekombinowanych szczepów, takich jak E. coli, B. subtilis, Mycobacterium bovis i Salmonella Typhimurium nios¹cych gen hly z Listeria [16]. Listeria w trakcie infekcji atakuje komórki prezentuj¹ce antygen APC antigen presenting cells. W ten sposób Listeria mo e wywieraæ bardzo du y efekt na odpowiedÿ immunologiczn¹ i jest przez to bardzo wygodnym narzêdziem przy produkcji szczepionek. Indukowana przez infekcjê L. monocytogenes odpowiedÿ immunologiczna obejmuje aktywacjê neutrofili, makrofagów, komórek NK, limfocytów CD4 +, limfocytów CD8 + oraz produkcjê wielu cytokin [18]. L. monocytogenes mo e byæ równie wykorzystana w produkcji szczepionek przeciwnowotworowych. Próbê jej skonstruowania podjê³a miêdzy innymi firma advaxis w celu uzyskania szczepionki przeciwko rakowi szyjki macicy, wywo³ywanemu przez wirus HPV (Human Papilloma Virus) (preparat Lovaxin C, obecnie w fazie testów klinicznych). W bakterii zosta³ umieszczony plazmid zawieraj¹cy gen koduj¹cy wybrany antygen komórki rakowej [51].

14 14 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE 2.4. Wektory nios¹ce geny reporterowe Geny reporterowe to geny koduj¹ce bia³ka, których obecnoœæ mo na w ³atwy sposób zbadaæ w komórce. Metodami in ynierii genetycznej tworzy siê ich fuzje z genami b¹dÿ promotorami genów, których aktywnoœæ jest obiektem zainteresowañ. Ca³oœæ umieszcza siê na wektorze ekspresyjnym. Pozwoli on na wyra enie bia³ka kodowanego przez gen reporterowy w danym uk³adzie. Istnieje wiele ró nych genów reporterowych, których aktywnoœæ bada siê metodami autoradiograficznymi, spektrofotometrycznymi, bioi chemoluminescencyjnymi. Najczêœciej u ywanymi genami s¹ $-galaktozydaza, acetylotransferaza chloramfenikolu, lucyferaza, $-glukoronidaza, oraz zielone bia³ko fluorescencyjne (GFP) [20]. Geny reporterowe s¹ wa nym narzêdziem u ywanym w medycynie na przyk³ad w celu badania zmian na poziomie komórkowym lub molekularnym zwi¹zanych z chorobami nowotworowymi w zwierzêtach modelowych in vivo. Pomagaj¹ one w zrozumieniu mechanizmów chorób nowotworowych oraz rozwijaniu efektywnych terapii [6]. Bia³ka fluorescencyjne. Bia³ka fluorescencyjne umo - liwiaj¹ obserwacjê ekspresji genów przy yciowo, np. w organizmie myszy. Coraz czêœciej d¹ y siê do prowadzania obserwacji na zwierzêtach multireporterowych, w których umieszcza siê kilka genów reporterowych w jednym locus. Wtedy bardzo przydatne okazuj¹ siê wektory typu BAC, ze wzglêdu na ich du ¹ wielkoœæ, która pozwala na bli sz¹ prawdzie obserwacjê endogennej ekspresji genów. Jako przyk³ady tego typu wektorów mog¹ s³u yæ m.in. wektory GM i SP opisane w pracy Maye a [27], s³u ¹ce do obserwacji ekspresji genów w organizmach myszy: Trap (Tartrate Resistant Acid Phosphatase) w osteoklastach, Dmp1 (Dentin Matrix Protein-1) i Ibsp (Integrin Binding Sialoprotein) w osteocytach i osteoblastach [27]. Najczêœciej wykorzystywanym bia³kiem fluorescencyjnym w badaniach biologicznych jest zielone bia³ko fluorescencyjne GFP wyizolowane z organizmu meduzy Aequorea victoria. Ze wzglêdu na swoje w³aœciwoœci, takie jak stabilnoœæ oraz to, e jego chromofor powstaje w wyniku autokatalitycznej cyklizacji aminokwasów, która wymaga jedynie obecnoœci tlenu, jest ono wyj¹tkowo u yteczne. Bia³ko GFP jest czêsto wykorzystywane miêdzy innymi do analizy lokalizacji bia³ek obecnych w ywych komórkach, wzajemnych interakcji bia³ek oraz jako gen reporterowy w monitorowaniu wzoru i poziomu ekspresji genów [4, 5]. Jak dot¹d stworzono wiele mutantów bia³ka GFP na przyk³ad: o zwiêkszonej fluorescencji, emituj¹cych œwiat³o o innej d³ugoœci fali ni dzikie bia³ko GFP, systemy te umo liwiaj¹ obserwacjê nawet do 3 bia³ek na raz w komórce. Jednak s¹ one tworzone g³ównie do badañ na du ych komórkach eukariotycznych i nie nadaj¹ siê do u ycia w komórkach mikroorganizmów, ze wzglêdu na zbyt ma³¹ jasnoœæ bia³ek GFP w tych komórkach. Aby prowadziæ obserwacjê jednoczeœnie dwóch bia³ek w komórkach mikroorganizmów potrzeba systemów z wysokofluorescencyjnym bia³kiem GFP. Seria tego typu systemów zosta³a opisana w pracy L e w i s a [23]. Wektory te pozwalaj¹ na tworzenie zarówno N- jak i C-koñcowych fuzji genów badanych bia³ek z genami reporterowymi gfpmut1 oraz gfpuv. Opisane bia³ka reporterowe mog¹ byæ te umiejscowione w tej samej komórce, poniewa maj¹ ró ne widma wzbudzenia [23]. 3. Podsumowanie W dzisiejszych czasach rozwój nauki i postêp techniki nastêpuje bardzo szybko. Wiedza genetyczna, posiadana przez nas jak i dostêpne technologie pozwalaj¹ osi¹gaæ cele, które kiedyœ by³y niemo liwymi do realizacji. Wykorzystanie praktyczne badañ z takich dziedzin naukowych jak in ynieria genetyczna i biotechnologia spowodowa³o rozwój przemys³u biotechnologicznego oraz postêp w medycynie. Nic wiêc dziwnego, e biotechnologia jest obecnie bardzo dynamicznie rozwijaj¹c¹ siê dziedzin¹ gospodarki XXI wieku. Wektory bakteryjne s¹ wa nymi narzêdziami biotechnologii, pozwalaj¹cymi na wiele istotnych zastosowañ. Wykorzystywane s¹ na ró nych etapach pracy w laboratorium. Ich najbardziej podstawowym u yciem jest wykorzystanie jako wektorów do klonowania. Stosowanie wektorów pozwala na tworzenie bibliotek genowych ró nych organizmów, a w konsekwencji u³atwi³o i nadal u³atwia poznanie genomów wielu organizmów jak i przeszukiwanie bibliotek genowych pod k¹tem znalezienia odpowiednich genów. Wektory bakteryjne s¹ kluczowym narzêdziem przy przenoszeniu DNA miêdzy ró nymi organizmami. Taki transfer genów pozwala na produkcjê ró nego rodzaju bia³ek w organizmach, które naturalnie ich nie wytwarzaj¹. Godne podkreœlenia s¹ przede wszystkim bia³ka o znaczeniu terapeutycznym wykorzystywane w medycynie. Nie bez znaczenia jest te wp³yw wektorów bakteryjnych na postêp w przemyœle biotechnologicznym. W laboratorium wektory s¹ równie czêsto wykorzystywane przy prowadzeniu wielu rodzajów badañ, a bardzo wa nym ich zastosowaniem jest niesienie genów reporterowych umo liwiaj¹cych obserwacjê procesów zachodz¹cych w ró nych organizmach. Wektory s¹ tak e wygodnymi systemami kieruj¹cymi ekspresj¹ badanych genów. Pozwalaj¹ one na utrzymywanie ekspresji na minimalnym poziomie w stanie represji, jednoczeœnie umo liwiaj¹c szybk¹ i prost¹ indukcjê ekspresji genu.

15 MA GORZATA JOANNA STAWORZYÑSKA, RADOS AW STACHOWIAK, JACEK BIELECKI 15 Nale y podkreœliæ, e wektory bakteryjne u³atwiaj¹ bardzo wiele aspektów pracy biotechnologa i wiele technik wykorzystywanych w laboratoriach biologicznych na ca³ym œwiecie, które bez u ycia wektorów bakteryjnych nie by³yby mo liwe do zastosowania. Piœmiennictwo 1. Baneyx F.: Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 10, (1999) 2. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L.: Biochemia. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 2005, s.143, s. 144, s Blaas L., Musteanu M., Eferl R., Bauer A., Casanova E.: Bacterial artificial chromosomes improve recombinant protein production in mammalian cells. BMC Biotechnol. 9, 3 (2009) 4. Brewczyñski K., Fronk J.: Wykorzystanie zielonego bia³ka fluorescencyjnego GFP w badaniach biologicznych. Post. Biol. Kom. 31, (2004) 5. Brewczyñski K., Fronk J.: Zielone bia³ko fluorescencyjne GFP struktura i w³aœciwoœci. Post. Biol. Kom. 31, (2004) 6. Contag C.H., Jenkins D., Contag P.R., Negrin R.S.: Use of Reporter Genes for Optical Measurements of Neoplastic Disease In vivo. Neoplasia, 2, (2000) 7. Dietrich G., Bubert A., Gentschev I., Sokolovic Z., Simm A., Catic A., Kaufmann S.H., Hess J., Szalay A.A., Goebel W.: Delivery of antigen-encoding plasmid DNA into the cytosol of macrophages by attenuated suicide Listeria monocytogenes. Nat. Biotechnol. 18, (1998) 8. Dietrich G., Viret J.F., Gentschev I.: Haemolysin A and listeriolysin two vaccine delivery tools for the induction of cellmediated immunity. Int. J. Parasitol. 33, (2003) 9. Ferreira L.C., Ferreira R.C., Schumann W.: Bacillus subtilis as a tool for vaccine development: from antigen factories to delivery vectors. An. Acad. Bras. Cienc. 77, (2005) 10. Glick B.R., Pasternak J.J.: Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA. American Society for Microbiology, Washington, 2003, s Grillot-Courvalin C., Goussard S., Courvalin P.: Wild-type intracellular bacteria deliver DNA into mammalian cells. Cell. Microbiol. 4, (2002) 12. Gryczan T.J., Contente S., Dubnau D.: Characterization of Staphylococcus aureus plasmids introduced by transformation into Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 134, (1978) 13. Hanning G., Makrides S.C.: Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol. 16, (1998) 14. Higgins D.E., Shastri N., Portnoy D.A.: Delivery of protein to the cytosol of macrophages using Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 31, (1999) 15. Hoffman R.M., Yang M.: Dual-color, whole-body imaging in mice. Nat. Biotechnol. 23, 790 (2005) 16. Jagielski T., Osiñska O.A., Bielecki J.: Molekularne determinanty wirulencji Listeria monocytogenes. Post. Mikrobiol. 45, (2006) 17. Johnson I.S.: Human insulin from recombinant DNA technology. Science, 219, (1983) 18. Kaufmann S.H.: Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11, (1993) 19. Keggins K.M., Lovett P.S., Duvall E.J.: Molecular cloning of genetically active fragments of Bacillus DNA in Bacillus subtilis and properties of the vector plasmid pub110. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, (1978) 20. Klug W.S., Cummings M.R., Spencer C.A.: Concepts of genetics. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ, 2006 s. 8, s Ladisch M.R., Kohlmann K.L.: Recombinant Human Insulin. Biotechnol. Prog. 8, (1992) 22. Leclerc C.: New technologies for vaccine development. Med. Sci. (Paris), 23, (2007) 23. Lewis P.J., Marston A.L.: GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene, 227, (1999) 24. Libudzisz Z., Kowal K., akowska Z. (red.): Mikrobiologia techniczna. Tom 1. Mikroorganizmy i œrodowiska ich wystêpowania. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 2008, s. 317, s Madigan M.T., Martinko J.M., Brock T.D.: Brock Biology of microorganisms. Pearson Prentice Hall, San Francisco, USA, 2006, s. 975, s Makrides S.C.: Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60, (1996) 27. Maye P., Stover M.L., Liu Y., Rowe D.W., Gong S., Lichtler A.C.: A BAC-bacterial recombination method to generate physically linked multiple gene reporter DNA constructs. BMC Biotechnol. 9, 20 (2009) 28. Miles J.S., Wolf C.R.: Principles of DNA cloning. BMJ, 299, (1989) 29. Mülhardt C.: Der Experimentator: Molekularbiologie / Genomics. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 2009, s Nguyen H.D., Nguyen Q.A., Ferreira R.C., Ferreira L.C., Tran L.T., Schumann W.: Construction of plasmid-based expression vectors for Bacillus subtilis exhibiting full structural stability. Plasmid, 54, (2005) 31. Nuc P., Nuc K.: Produkcja rekombinowanych bia³ek w Escherichia coli. Post. Biochem. 52, (2006) 32. Pasternak J.J.: An introduction to Human Molecular Genetics: Mechanisms of Inherited Diseases. Wiley-Liss, New Jersey, 2005, s Pawelec D.P., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Atenuowane szczepy Salmonella enterica noœniki heterologicznych antygenów. Post. Mikrobiol. 39, (2000) 34. Petrides D., Sapidou E., Calandranis J.: Computer-aided process analysis and economic evaluation for biosynthetic human insulin production A case study. Biotechnol. Bioengineering, 48, (2004) 35. Poole E.S., Brown C.M., Tate W.P.: The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBO J. 14, (1995) 36. Rosenberg A.H., Lade B.N., Chui D.S., Lin S.W., Dunn J.J., Studier F.W.: Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene, 56, (1987) 37. Roth J.A., Henderson L.M.: New technology for improved vaccine safety and efficacy. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 17, (2001) 38. Schumann W., Ferreira L.C.: Production of recombinant proteins in Escherichia coli. Genet. Mol. Biol. 27, (2004) 39. Sêktas M.: Ekspresja genów klonowanych w wektorach plazmidowych w zrekombinowanych szczepach Escherichia coli. Kosmos, 51, (2002) 40. Shizuya H., Kouros-Mehr H.: The development and applications of the bacterial artificial chromosome cloning system. Keio J. Med. 50, (2001) 41. Spreng S., Dietrich G., Niewiesk S., ter Meulen V., Gentschev I., Goebel W.: Novel bacterial systems for the delivery of recombinant protein or DNA. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27, (2000)

16 16 ZASTOSOWANIE WEKTORÓW BAKTERYJNYCH W BIOLOGII MOLEKULARNEJ I W MEDYCYNIE 42. Staroñ A., Grabowska A., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Nadprodukcja i oczyszczanie rekombinowanych, heterologicznych bia³ek w komórkach Escherichia coli. Post. Mikrobiol. 47, (2008) 43. Studier F.W., Moffat B.A.: Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189, (1986) 44. Terpe K., Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundaments to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, (2003) 45. Terpe K.: Protein-Affinität-Tags. Biospektrum (Heidelb.), 4, (2007) 46. Vajo Z., Fawcett J., Duckworth W.C.: Recombinant DNA Technology in the Treatment of Diabetes: Insulin Analogs. Endocr. Rev. 22, (2001) 47. Waugh D.S.: Making the most of affinity tags. Trends. Biotechnol. 23, (2005) 48. Wêgleñski P.: Genetyka molekularna. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 2007, s. 110, s. 116, s Winter P.C., Hickey G.I., Fletcher H.L.: Genetyka. Wyd. Naukowe PWN, Warszawa, 2004, s Wurm F.M.: Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, (2004) ród³a internetowe: 51. uses_list.html strona internetowa firmy Advaxis, ( ) 52. strona internetowa firmy Novagen, ( ) 53. Services/Applications/Cloning/PCR-cloning/PCRC-Misc/ The-Technology-Behind-TOPO-Cloning.html strona internetowa firmy Invitrogen, ( ) 54. strona internetowa firmy Novagen, pet System manual ( ) 55. strona internetowa firmy Novagen, Protein expression, pet System tutorial ( ) 56. strona internetowa firmy Promega, The pgem -T and pgem -T Easy Vector Systems. Promega Notes Magazine 58, 36 (1996), ( ) 57. strona internetowa firmy Qiagen, Qiagen PCR Cloning Handbook, ( ) pro2.pdf strona internetowa firmy Qiagen, ( )

17 POST. MIKROBIOL., 2011, 50, 1, ROLA RAMNOLIPIDÓW W ŒRODOWISKU NATURALNYM ukasz awniczak 1, Katarzyna Czaczyk 2, Miko³aj Owsianiak 1, 3, ukasz Chrzanowski 1 * 1 Politechnika Poznañska, Instytut Technologii i In ynierii Chemicznej, Zak³ad Chemii Organicznej, pl. M. Sk³odowskiej-Curie 2, Poznañ 2 Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu, Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii ywnoœci, ul. Wojska Polskiego 48, Poznañ 3 obecny adres: Section for Quantitative Sustainability Assessment, Department of Management Engineering, Technical University of Denmark, Produktionstorvet, Building 424, DK-2800 Kgs. Lyngby, Denmark Wp³ynê³o w listopadzie 2010 r. 1. Wstêp. 2. Rys historyczny od pierwszej izolacji do chwili obecnej. 3. Czynniki wp³ywaj¹ce na produkcjê ramnolipidów. 4. Ramnolipidy a biodegradacja substratów wêglowodorowych. 5. Ramnolipidy a mobilnoœæ komórek bakteryjnych. 6. Rola ramnolipidów w tworzeniu biofilmu. 7. Genetyczne dowody na ró norodnoœæ roli ramnolipidów. 8. Podsumowanie Role of rhamnolipids in the natural environment Abstract: Rhamnolipids are glycolipidic surfactants of bacterial origin. In the past 20 years rhamnolipids were often associated with the mediation of uptake of hydrophobic substrates by bacterial cells. Recent research has provided evidence that rhamnolipids primarily play a role in surface-associated modes of bacterial mobility and are involved in biofilm development. This review gives an insight into the current state of knowledge on these roles of the rhamnolipid biosurfactants. 1. Introduction. 2. Historical view from the first isolation until present. 3. Factors affecting rhamnolipid production. 4. Role of rhamnolipids in the biodegradation of hydrocarbons. 5. Role of rhamnolipids in bacterial mobility. 6. Role of rhamnolipids in biofilm development. 7. Genetic evidence for multiple roles of rhamnolipids. 8. Summary S³owa kluczowe: biofilm, biosurfaktant, ramnolipidy Key words: biofilm, biosurfactant, rhamnolipids 1. Wstêp Wiedza jest nieodwracalna, nie mo e cofn¹æ siê w mrok s³odkiej ignorancji Stanis³aw Lem G³os Pana Biosurfaktanty, czyli zwi¹zki powierzchniowoczynne pochodzenia mikrobiologicznego, to temat, który przyci¹gn¹³ uwagê ogromnej liczby badaczy na ca³ym œwiecie. Wœród szeregu prac naukowych poœwiêconych tej tematyce wyró niæ mo na te koncentruj¹ce siê na produkcji oraz izolacji nowych biosurfaktantów [92, 111], podejmuj¹ce opis budowy chemicznej danego zwi¹zku wraz z rozbudowan¹ czêœci¹ analityczn¹ [5, 91, 124] oraz te dotycz¹ce analizy otrzymanych biosurfaktantów pod wzglêdem ich w³aœciwoœci fizyko-chemicznych, szczególnie w³aœciwoœci powierzchniowo-czynnych [84]. Innym analizowanym aspektem by³o porównanie klasycznych surfaktantów syntetycznych i biosurfaktantów [85, 86]. Okaza³o siê, e surfaktanty pochodzenia biologicznego wykazuj¹ szereg zalet, takich jak: ma³e obci¹ enie œrodowiska naturalnego, wysoka biodegradowalnoœæ, stosunkowo niskie koszty wytwarzania przy masowej produkcji, mo liwoœæ produkowania biosurfaktantów in situ, niskie wartoœci krytycznego stê enia micelarnego (CMC) oraz wysoka skutecznoœæ solubilizacji. Wiele prac dotyczy³o mo liwoœci praktycznego zastosowania biosurfaktantów w dziedzinach takich jak: farmacja, ochrona roœlin, medycyna, przemys³ kosmetyczny i spo ywczy [32, 43, 88]. Szczególnie du o uwagi poœwiêcono wykorzystaniu biosurfaktantów w technikach remediacyjnych, zwi¹zanych z usuwaniem ska eñ ropopochodnych ze œrodowiska naturalnego [45, 103]. W za³o eniu biosurfaktanty mia³y stanowiæ pomost ³¹cz¹cy yj¹ce w œrodowisku hydrofilowym mikroorganizmy z nierozpuszczalnymi w wodzie, hydrofobowymi wêglowodorami. Spodziewano siê, e wydzielanie biosurfaktantów przez mikroorganizmy zwi¹zane jest przede wszystkim z naturalnie wykszta³conym mechanizmem pozyskiwania substratów. Zwiêkszenie rozpuszczalnoœci ropopochodnych zwiêkszaæ mia³o ich biodostêpnoœæ, co w konsekwencji przyczyni³oby siê do intensywniejszego przebiegu procesów biodegradacyjnych [95]. Alternatywnie modyfikacja w³aœciwoœci powierzchniowych samych mikroorganizmów * Autor korespondencyjny: Politechnika Poznañska, Instytut Technologii i In ynierii Chemicznej, Zak³ad Chemii Organicznej, pl. M. Sk³odowskiej-Curie 2, Poznañ; tel.: ; fax.: ;

18 18 UKASZ AWNICZAK, KATARZYNA CZACZYK, MIKO AJ OWSIANIAK, UKASZ CHRZANOWSKI przez biosurfaktanty mia³a byæ odpowiedzialna za zwiêkszenie kontaktu komórek ze Ÿród³em wêgla [71, 148]. Obiecuj¹cych rezultatów oczekiwano zw³aszcza w odniesieniu do wielopierœcieniowych wêglowodorów aromatycznych (WWA), stanowi¹cych niebezpieczne i trudne do usuniêcia ska enie œrodowiska [89]. Faktycznie, czêœæ badaczy zaobserwowa³a w przeprowadzonych eksperymentach zwiêkszenie skutecznoœci usuwania zanieczyszczeñ po dodaniu biosurfaktantów [149]. Jednak e równie czêsto obserwowano brak wp³ywu lub negatywny efekt dodatku biosurfaktantów [42, 67]. Obecnie, po ponad dwudziestu latach badañ, sposób postrzegania roli biosurfaktantów w funkcjonowaniu mikroorganizmów zmienia siê diametralnie [15, 138]. Na przyk³adzie ramnolipidów, najlepiej poznanego biosurfaktantu, postaramy siê zbli yæ do najbardziej aktualnej odpowiedzi na pytanie: po co mikroorganizmy produkuj¹ biosurfaktanty? 2. Rys historyczny od pierwszej izolacji do chwili obecnej Ramnolipidy s¹ glikolipidami, w sk³ad których wchodzi cukier ramnoza i kwas $-hydroksydekanowy. Produkowane s¹ g³ównie przez bakterie Gram-ujemne z rodzaju Pseudomonas, wystêpuj¹ce powszechnie w œrodowisku wodnym i glebowym. W 1946 roku pojawia siê pierwsze doniesienie literaturowe o ramnolipidach produkowanych przez bakterie Pseudomonas pyocyanea [9], jednoczeœnie opisane zostaje pierwsze ich praktyczne zastosowanie. Pe³niejszy opis budowy wyizolowanych ramnolipdów pojawia siê nieco póÿniej w pracy Jarvisa i Johnsona [72]. W nastêpnych latach zwrócono uwagê na wysoce efektywn¹ produkcjê ramnolipidów przez bakterie z gatunku Pseudomonas aeruginosa [57]. Zainteresowanie t¹ tematyk¹ rozwija siê w latach szeœædziesi¹tych i siedemdziesi¹tych. Scharakteryzowano strukturê chemiczn¹ pierwszych ramnolipidów, identyfikuj¹c je jako typ R2, charakteryzuj¹cy siê dwiema cz¹steczkami ramnozy [39]. Prowadzono tak e intensywne badania nad optymalnymi warunkami do produkcji i wydzielania tych biosurfaktantów przez ró ne szczepy [119]. W 1971 r. wyizolowany zostaje zupe³nie nowy ramnolipid zbudowany z jednej cz¹steczki ramnozy (typ R1). W ci¹gu kolejnych lat pojawia siê coraz wiêcej homologów, nieznacznie ró ni¹cych siê struktur¹. Opisano równie pochodne obu wymienionych wczeœniej glikolipidów, które posiada³y dodatkow¹ resztê kwasu "-dekenowego, nazwane jako ramnolipidy typu A i B [146]. W póÿniejszych eksperymentach uda³o siê wyizolowaæ metylowe pochodne ramnolipidów R1 i R2 [63], oraz warianty pozbawione jednej cz¹steczki kwasu $-hydroksydekanowego, opisane jako typy R3 i R4 [131]. Gwa³towny rozwój technik analitycznych na przestrzeni ostatniej dekady zaowocowa³ odkryciem wielu zupe³nie nowych struktur, których liczba wynosi obecnie ponad 60 [1]. 3. Czynniki wp³ywaj¹ce na produkcjê ramnolipidów W latach 80 i 90 ubieg³ego wieku poszukiwano skutecznych metod produkcji du ych iloœci biosurfaktantów. Opisano wtedy szereg czynników maj¹cych istotny wp³yw na efektywnoœæ wytwarzania ramnolipidów. Zauwa ono, e s¹ one najwydajniej produkowane przy ograniczeniu Ÿróde³ azotu [32, 53, 97]. W fazie stacjonarnej, kiedy azot jest wyczerpywany, dochodzi do akumulacji ramnolipidów w medium hodowlanym [90]. Inne badania donosz¹, e do nadprodukcji ramnolipidów dochodzi równie w przypadku ograniczonej dostêpnoœci makroelementów np. fosforu [98] lub mikroelementów. Z wczeœniejszych badañ wynika³o, e rodzaj substratu jest równie wa nym czynnikiem wp³ywaj¹cym na efektywnoœæ produkcji i rodzaj otrzymywanych ramnolipidów. PóŸniejsze badania nie potwierdzi³y ró nicy w strukturze biosurfaktantu otrzymanego podczas hodowli na hydrofilowych i hydrofobowych substratach [111]. Wielu naukowców otrzyma³o ramnolipidy podczas hodowli na hydrofobowych substratach (oleje i t³uszcze) [24, 91]. Wielu innych uzyska³o podobne rezultaty stosuj¹c hydrofilowe Ÿród³a wêgla np. cukry [52] lub glicerol, co da³o o wiele lepsze rezultaty ni hodowla na hydrofobowych substratach [5]. Doniesiono tak e, e mo liwa jest efektywna synteza z innych, hydrofilowych Ÿróde³ wêgla takich jak etanol [92]. Obecnie znanych jest wiele prac opisuj¹cych efektywne metody produkcji ramnolipidów z ró nych, czêsto odpadowych substratów przy u yciu innowacyjnych rozwi¹zañ technologicznych [88, 115]. 4. Ramnolipidy a biodegradacja substratów wêglowodorowych Produkcja biosurfaktantów przez mikroorganizmy podczas wzrostu na hydrofobowych Ÿród³ach wêgla zwróci³a szczególn¹ uwagê badaczy, gdy dostrze ono w tym aspekt interesuj¹cy z punktu widzenia technik bioremediacyjnych. Biodostêpnoœæ zanieczyszczeñ w œrodowisku naturalnym jest jednym z kluczowych czynników ograniczaj¹cych postêp procesów biodegradacyjnych [139]. Zatem w przypadku szczepów zdolnych do biodegradacji zwi¹zków ropopochodnych zdolnoœæ do produkcji biosurfaktantów jest prawdopodobnie integraln¹ cech¹ tych mikroorganizmów. Wydzielanie ramnolipidów prowadziæ mia³o do solu-

19 ROLA RAMNOLIPIDÓW W ŒRODOWISKU NATURALNYM 19 bilizacji hydrofobowych zwi¹zków, co jednoznacznie skojarzono ze stymulowaniem procesów biodegradacyjnych [64]. St¹d te brak genów odpowiedzialnych za syntezê ramnolipidów niektórzy badacze powi¹zali bezpoœrednio z niezdolnoœci¹ do wzrostu na hydrofobowych Ÿród³ach wêgla, takich jak np. n-alkany [78, 106]. Podczas wielu testów biodegradacyjnych starano siê zwiêkszyæ biodostêpnoœæ substratu poprzez dodawanie biosurfaktantów. Wykazano, e dodatek ramnolipidów w iloœci 300 mg/l stymulowa³ biodegradacjê oktadekanu [147]. Ci sami badacze [148] przeprowadzili badania, w których dodatek ramnolipidów w ma³ych iloœciach stymulowa³ biodegradacjê heksadekanu dla czêœci szczepów, jednak u innych spowodowa³ inhibicjê procesów degradacyjnych oktadekanu. Zaobserwowano wtedy równie, e dodatek ramnolipidów przyczynia³ siê do znacznego wzrostu efektywnoœci procesów degradacyjnych dla szczepów niezdolnych do produkcji w³asnego biosurfaktantu. Wiele prac wskazywa³o zarówno na pozytywne jak i negatywne skutki dodatku biosurfaktantów na degradacjê hydrofobowych substratów przez szczepy œrodowiskowe [108]. W zwi¹zku z licznymi sprzecznoœciami w doniesieniach literaturowych badacze zaczêli wnikliwie przygl¹daæ siê nie tylko interakcjom pomiêdzy ramnolipidami i zanieczyszczeniami, gdy równie istotnym zacz¹³ siê wydawaæ wp³yw biosurfaktantów na mikroorganizmy. Zauwa ono wyraÿny wp³yw dodawanego biosurfaktantu na zmiany w hydrofobowoœci komórek bakteryjnych badanych szczepów [147, 148]. Zaprzestano doszukiwania siê prostych zale noœci pomiêdzy degraduj¹cymi mikroorganizmami, ramnolipidami i hydrofobowymi substratami a zaczêto traktowaæ je jako zale noœci wielop³aszczyznowe. Kolejne lata to okres badañ nad wp³ywem ramnolipidów na w³aœciwoœci powierzchniowe poszczególnych szczepów bakteryjnych powi¹zane z efektywnoœci¹ procesów biodegradacyjnych. W poszukiwaniu odpowiedzi na kolejne pytania prowadzono liczne próby analizy skomplikowanych zale noœci pomiêdzy biosurfaktantami, mikroorganizmami i ksenobiotykami, aby znaleÿæ optymalne warunki do prowadzenia procesów biodegradacyjnych [100]. Na podstawie przeprowadzonych eksperymentów i analizy kinetyki procesów biodegradacyjnych okreœlono ró ne mechanizmy poboru substratów przez mikroorganizmy: bezpoœredni kontakt komórki z hydrofobowym Ÿród³em wêgla lub pobór wêglowodorów, które przesz³y do fazy wodnej pod wp³ywem surfaktantów [14, 66, 125]. Zdolnoœæ do produkcji biosurfaktantów i zmiany napiêcia powierzchniowego powi¹zano z mechanizmem u³atwionego transportu hydrofobowych substratów do roztworu wodnego. Solubilizacja zwi¹zków z fazy olejowej i transportowanie ich do wnêtrza roztworu wodnego prowadzi³aby do znacznej redukcji czynnika dyfuzyjnego jako parametru ograniczaj¹cego przebieg procesów biodegradacyjnych [89]. Z kolei w³aœciwoœci powierzchniowe szczepów, w szczególnoœci zmiany hydrofobowoœci powi¹zano z mechanizmem bezpoœredniego poboru substratu z fazy olejowej [22]. Zmiany te, bêd¹ce np. wynikiem adsorpcji ramnolipidów czy innych surfaktantów na powierzchni komórki, stanowi³y alternatywn¹ metodê pokonania czynników limituj¹cych wynikaj¹cych z transportu [20, 21]. Zwiêkszenie biodegradacji mog³o zatem wynikaæ ze zwiêkszonej solubilizacji hydrofobowego Ÿród³a wêgla lub te z powodu modyfikacji zewnêtrznych struktur komórkowych, co z kolei mog³o przyczyniaæ siê do ³atwiejszego kontaktu miêdzy wêglowodorowym substratem a komórkami [66, 77, 147]. Przeprowadzone badania nie doprowadzi³y jednak do uzyskania jednoznacznych rezultatów. PóŸniejsze prace sugeruj¹, e obserwowany wzrost efektywnoœci procesów biodegradacyjnych móg³ byæ efektem jednoczesnego wystêpowania obydwu zjawisk. Wiele eksperymentów potwierdza, e zarówno mechanizm bezpoœredniego poboru substratu z fazy olejowej, jak i wspomagana biosurfaktantami solubilizacja hydrofobowych substratów w roztworze wodnym wystêpuj¹ podczas biodegradacji WWA [12, 33]. Przeprowadzono eksperymenty, w których ponad szeœædziesi¹t szczepów bakteryjnych wyizolowanych z gleby o ró nym stopniu zanieczyszczenia ropopochodnymi zosta³o przebadanych pod wzglêdem preferowanego mechanizmu poboru substratów [13]. Uzyskano wyniki sugeruj¹ce, e aden z mechanizmów nie dominuje jednoznacznie nad drugim. Dla po³owy badanych szczepów stwierdzono wystêpowanie wy³¹cznie bezpoœredniego poboru substratu z fazy olejowej, podczas gdy pozosta³a po³owa wykazywa³a mechanizm opieraj¹cy siê o transport u³atwiony wystêpowaniem biosurfaktantu. Co ciekawe, autorzy zaobserwowali dla czêœci badanych szczepów brak powi¹zania pomiêdzy hydrofobowoœci¹ komórek bakteryjnych, efektywnoœci¹ produkcji biosurfaktantów, a rodzajem Ÿród³a wêgla. Bardzo zbli one rezultaty uzyskano po hodowli na hydrofobowym heksadekanie i hydrofilowym glicerolu. Wywnioskowano, e warunki œrodowiskowe panuj¹ce w miejscu wzrostu mikroorganizmów kszta³tuj¹ okreœlone mechanizmy poboru substratu. Rozwiniêcie powierzchni ciek³ej fazy wêglowodorowej w danym œrodowisku bêdzie najprawdopodobniej owocowa³o pojawieniem siê szczepów o bezpoœrednim sposobie poboru substratu z fazy olejowej. Wykazano, e transfer masy jest najwiêkszy gdy mikroorganizmy rosn¹ w bezpoœrednim otoczeniu kropli wêglowodorów [75]. Natomiast dla œrodowiska bogatego w wodê, gdzie dominowaæ bêd¹ szczepy o hydrofilowych w³aœciwoœciach

20 20 UKASZ AWNICZAK, KATARZYNA CZACZYK, MIKO AJ OWSIANIAK, UKASZ CHRZANOWSKI powierzchniowych, przewa aæ bêdzie mechanizm oparty o biosurfaktanty, przy czym w takich uk³adach proces emulgowania zanieczyszczeñ dominuje nad procesem solubilizacji. Pewn¹ ciekawostk¹ s¹ bakterie pobieraj¹ce olej w postaci mikrokropli [127]. Autorzy zwracaj¹ uwagê na fakt, e biosurfaktanty produkowane s¹ zarówno przez hydrofilowe, jak i hydrofobowe szczepy, niezale nie od rodzaju Ÿród³a wêgla, co mo e sugerowaæ, e ich rola wykracza dalece poza pocz¹tkowo przyjête ramy. Pojawia siê te wiele doniesieñ literaturowych sugeruj¹cych, e czêsto biodegradacja przebiega bez udzia³u biosurfaktantów. Przyk³adowo, w 2004 r. zaobserwowano, e produkcja biosurfaktantów jest zupe³nie nie zwi¹zana z efektywnoœci¹ procesu biodegradacji hydrofobowych substratów takich jak WWA [74]. St¹d te próby znalezienia korelacji pomiêdzy hydrofobowoœci¹, a efektywnoœci¹ procesów biodegradacyjnych powiod³y siê jedynie w nielicznych badaniach [17, 104, 105]. Na tym etapie pojawi³y siê badania œrodowiskowe o zupe³nie innym wymiarze. Zauwa ono, e chocia pojedyncze szczepy stanowi¹ bardzo wygodny materia³ do modelowych badañ, to próby przeniesienia prawid³owoœci zaobserwowanych w warunkach laboratoryjnych do uk³adów rzeczywistych koñczy³y siê w wiêkszoœci przypadków niepowodzeniem, zw³aszcza dla œrodowiska glebowego [114]. Nale y podkreœliæ, e aden mikroorganizm nie jest samotn¹ wysp¹, a procesy degradacyjne przebiegaj¹ce w œrodowisku naturalnym przebiegaj¹ z udzia³em wyspecjalizowanych zespo³ów mikroorganizmów, zwanych konsorcjami, lub przynajmniej przez kultury mieszane. Obecnie niewiele jest prac opisuj¹cych wp³yw ramnolipidów lub szczepów zdolnych do ich produkcji na konsorcja œrodowiskowe. Jednak e wykazano, e dodatek mikroorganizmów zdolnych do produkcji ramnolipidów praktycznie nie wp³ywa na biodegradacjê zwi¹zków ropopochodnych przeprowadzon¹ w œrodowisku glebowym [71]. Przyczyn¹ by³y najprawdopodobniej trudnoœci w przystosowaniu siê drobnoustrojów do nowego œrodowiska. Badania nad wp³ywem ramnolipidów na efektywnoœæ biodegradacji oleju napêdowego przez 218 konsorcjów œrodowiskowych wykaza³y, e dodatek biosurfaktantu w równym stopniu zwiêksza³, zmniejsza³ lub pozostawa³ bez wp³ywu na przebieg procesów degradacyjnych [109]. Zaobserwowano równie ca³kowity brak korelacji pomiêdzy hydrofobowoœci¹ komórek w konsorcjach, a ubytkiem oleju napêdowego. Podobne obserwacje poczyniono w innych badaniach [18, 19]. Prowadzi to do wniosku, e w wiêkszoœci przypadków dodatek ramnolipidów nie jest istotnym czynnikiem z punktu widzenia efektywnoœci procesów biodegradacyjnych. Powrócono zatem do alternatywnych koncepcji z poprzednich lat [99]. Stwierdzono, e biosurfaktanty te mog¹ uczestniczyæ w wielu innych procesach [23], a wspomaganie mechanizmu pobierania substratu jest prawdopodobnie tylko jednym z obserwowanych zjawisk oraz innych mechanizmów adaptacyjnych [38]. Kolejne lata badañ to etap analizy funkcji ramnolipidów z perspektywy kolonizowania otoczenia, tworzenia i rozpadu biofilmów bakteryjnych oraz specyficznej aktywnoœci wobec innych organizmów. 5. Ramnolipidy a mobilnoœæ komórek bakteryjnych W przypadku wyczerpywania sk³adników pokarmowych w œrodowisku mo liwe s¹ dwa scenariusze: mikroorganizmy wykszta³caj¹ nowe mechanizmy pozyskiwania substratów dot¹d dla nich niedostêpnych lub opuszczaj¹ œrodowisko w poszukiwaniu lepszych warunków. Pocz¹tkowo uwa ano, e ramnolipidy s¹ wykorzystywane g³ównie do zwiêkszenia biodostêpnoœci potencjalnych Ÿróde³ wêgla [5], jednak wydzielanie wielkocz¹steczkowych produktów wy³¹cznie w celu pobrania niskocz¹steczkowych substratów wydaje siê nieuzasadnione z punktu widzenia bilansu energetycznego komórki. Œrednia masa cz¹steczkowa ramnolipidów wynosi 650 g/mol, a przyk³adowo masa cz¹steczkowa heksadekanu to 226 g/mol. Ma³o prawdopodobnym jest by raz wydzielone cz¹steczki ramnolipidów ponownie powróci³y do komórki wraz z heksadekanem. Mog¹ siê one przyczyniaæ do wymywania potencjalnego substratu z najbli szego otoczenia komórek, lub te, zgodnie z za³o eniami drugiego scenariusza, do przemieszczenia samych mikroorganizmów. W œwietle najnowszych odkryæ to w³aœnie mobilnoœæ komórek ma najwy szy priorytet [134, 138]. Na przyk³adzie P. aeruginosa wielu badaczy wykaza³o, e komórki bakteryjne s¹ zdolne do trzech ró nych rodzajów ruchu: p³ywania za spraw¹ rzêsek, ruchu drgaj¹cego (twitching) opartego na pili typu IV oraz wzrostu rozpe³zliwego (swarming) [35, 79]. P. aeruginosa posiada pojedyncz¹, polarn¹ wiæ, która pozwala komórkom p³ywaæ w œrodowisku wodnym. Wiæ wraz z uk³adem chemoreceptorów i systemem przekazywania bodÿców jest wykorzystywana przez bakterie w procesach reagowania na sygna³y z otoczenia [132]. W przypadku poruszania siê po powierzchni mo liwy jest ruch typu drgaj¹cego przy pomocy pili typu IV [29, 141]. Uwa a siê, e u podstaw tego zjawiska le y tendencja do rozci¹gania i kurczenia siê pili, co wprawia komórki w ruch. Synteza i formowanie pili wymaga wielu genów, a warunki œrodowiskowe potrzebne do ich uaktywnienia nie zosta³y do koñca poznane [65]. S¹ one istotnym elementem budowy komórki, bior¹cym udzia³ w infekcyjnych atakach drobnoustrojów i przyczepianiu siê do powierzchni abiotycznych [55, 101].

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna:

Ćwiczenia 1 Wirtualne Klonowanie Prowadzący: mgr inż. Joanna Tymeck-Mulik i mgr Lidia Gaffke. Część teoretyczna: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ===============================================================================================

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany

Bardziej szczegółowo

Wybór systemu ekspresyjnego

Wybór systemu ekspresyjnego Wybór systemu ekspresyjnego Bakterie Escherichia coli Zalety: wysoki poziom ekspresji (do 500 mg/l hodowli) dobrze poznany system proste technologie niskie koszty Wady: brak modyfikacji potranslacyjnych

Bardziej szczegółowo

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Drożdżowe systemy ekspresyjne Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli

Bardziej szczegółowo

Wektory DNA - klonowanie molekularne

Wektory DNA - klonowanie molekularne Wektory DNA - klonowanie molekularne Fragment DNA (np. pojedynczy gen) można trwale wprowadzić do komórek gospodarza (tzn. zmusić go do powielania w tym gospodarzu) tylko wtedy, gdy zostanie on wbudowany

Bardziej szczegółowo

Modułowy system aluminiowy o nieograniczonych możliwościach. Nieograniczony wybór różnych urządzeń o dowolnych. do zastosowania w służbie zdrowie.

Modułowy system aluminiowy o nieograniczonych możliwościach. Nieograniczony wybór różnych urządzeń o dowolnych. do zastosowania w służbie zdrowie. Modułowy system aluminiowy o nieograniczonych możliwościach Nieograniczony wybór różnych urządzeń o dowolnych wymiarach do zastosowania w służbie zdrowie. PVS RVS System profili i połączeń dla rozwiązań

Bardziej szczegółowo

revati.pl Drukarnia internetowa Szybki kontakt z klientem Obs³uga zapytañ ofertowych rozwi¹zania dla poligrafii Na 100% procent wiêcej klientów

revati.pl Drukarnia internetowa Szybki kontakt z klientem Obs³uga zapytañ ofertowych rozwi¹zania dla poligrafii Na 100% procent wiêcej klientów revati.pl rozwi¹zania dla poligrafii Systemy do sprzeda y us³ug poligraficznych w internecie Drukarnia Szybki kontakt z klientem Obs³uga zapytañ ofertowych Na 100% procent wiêcej klientów drukarnia drukarnia

Bardziej szczegółowo

Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach?

Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach? Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach? Czy masz niedosyt informacji niezbêdnych do tego, by mieæ pe³en komfort w podejmowaniu

Bardziej szczegółowo

Temat lekcji: Bakterie a wirusy.

Temat lekcji: Bakterie a wirusy. Anna Tomicka Scenariusz lekcji biologii Dział: Różnorodność organizmów. Klasa: I b Temat lekcji: Bakterie a wirusy. 1.Cele lekcji: Cel ogólny: Uczeń: omawia budowę komórki bakterii oraz wirusów, wyjaśnia

Bardziej szczegółowo

HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.

HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs. HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.pl Wrocław, dnia 22.06.2015 r. OPINIA przedmiot data Praktyczne

Bardziej szczegółowo

Przygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś

Przygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś Przygotowały: Magdalena Golińska Ewa Karaś Druk: Drukarnia VIVA Copyright by Infornext.pl ISBN: 978-83-61722-03-8 Wydane przez Infornext Sp. z o.o. ul. Okopowa 58/72 01 042 Warszawa www.wieszjak.pl Od

Bardziej szczegółowo

CONSTRUCTOR. Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych. Deepstor P90 DRIVE -IN

CONSTRUCTOR. Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych. Deepstor P90 DRIVE -IN CONSTRUCTOR Kompaktowy magazyn z u yciem rega³ów wjezdnych Deepstor P90 CONSTRUCTOR Magazyn w miejsce korytarzy Rega³y wjezdne P90 daj¹ mo liwoœæ zwiêkszenia powierzchni magazynowania nawet o 90% w porównaniu

Bardziej szczegółowo

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne

Techniki molekularne w mikrobiologii SYLABUS A. Informacje ogólne Techniki molekularne w mikrobiologii A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Rodzaj Rok studiów

Bardziej szczegółowo

ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 2. ZATRUDNIENIE NA CZĘŚĆ ETATU LUB PRZEZ CZĘŚĆ OKRESU OCENY

ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 2. ZATRUDNIENIE NA CZĘŚĆ ETATU LUB PRZEZ CZĘŚĆ OKRESU OCENY ZASADY WYPEŁNIANIA ANKIETY 1. ZMIANA GRUPY PRACOWNIKÓW LUB AWANS W przypadku zatrudnienia w danej grupie pracowników (naukowo-dydaktyczni, dydaktyczni, naukowi) przez okres poniżej 1 roku nie dokonuje

Bardziej szczegółowo

Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie

Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie DEFINICJA Mikroorganizm (drobnoustrój) to organizm niewidoczny gołym okiem. Pojęcie to nie jest zbyt precyzyjne lecz z pewnością mikroorganizmami są: bakterie,

Bardziej szczegółowo

Geny i działania na nich

Geny i działania na nich Metody bioinformatyki Geny i działania na nich prof. dr hab. Jan Mulawka Trzy królestwa w biologii Prokaryota organizmy, których komórki nie zawierają jądra, np. bakterie Eukaryota - organizmy, których

Bardziej szczegółowo

Konstrukcja sterownika oparta na 32-bitowym procesorze

Konstrukcja sterownika oparta na 32-bitowym procesorze Konstrukcja sterownika oparta na 32-bitowym procesorze Nowa generacja sterowników System sekwencyjnego wtrysku gazu STAG-4 QBOX BASIC jest pierwszym z rodziny nowej generacji sterowników produkowanych

Bardziej szczegółowo

Dotyczy zastosowania ww produktów w mikrobiologii klinicznej

Dotyczy zastosowania ww produktów w mikrobiologii klinicznej Warszawa,14.11.2013 WAŻNE: Notatka bezpieczeństwa Dotyczy produktów: ZYM B (Nr kat.70493), API Listeria (Nr kat.10300), API NH (Nr kat.10400) nr serii: patrz załącznik 1 Dotyczy zastosowania ww produktów

Bardziej szczegółowo

Biologia Molekularna Podstawy

Biologia Molekularna Podstawy Biologia Molekularna Podstawy Budowa DNA Budowa DNA Zasady: Purynowe: adenina i guanina Pirymidynowe: cytozyna i tymina 2 -deoksyryboza Grupy fosforanowe Budowa RNA Budowa RNA Zasady: purynowe: adenina

Bardziej szczegółowo

Kompensacyjna funkcja internatu w procesie socjalizacji dzieci i m³odzie y upoœledzonych umys³owo

Kompensacyjna funkcja internatu w procesie socjalizacji dzieci i m³odzie y upoœledzonych umys³owo Kompensacyjna funkcja internatu w procesie socjalizacji dzieci i m³odzie y upoœledzonych umys³owo Ma³gorzata Czajkowska Kompensacyjna funkcja internatu w procesie socjalizacji dzieci i m³odzie y upoœledzonych

Bardziej szczegółowo

www.klimatycznykolobrzeg.pl OFERTA PROMOCYJNA

www.klimatycznykolobrzeg.pl OFERTA PROMOCYJNA Portal Klimatyczny Ko³obrzeg www.klimatycznykolobrzeg.pl OFERTA PROMOCYJNA Centrum Promocji i Informacji Turystycznej w Ko³obrzegu widz¹c koniecznoœæ zmiany wizerunku oraz funkcjonalnoœci turystycznej

Bardziej szczegółowo

Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r.

Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r. Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r. Receptory zapachu i organizacja systemu węchowego Takao Ishikawa, M.Sc. Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii Uniwersytetu Warszawskiego 10 mln

Bardziej szczegółowo

ZASADY REPRODUKCJI SYMBOLI GRAFICZNYCH PRZEDMOWA

ZASADY REPRODUKCJI SYMBOLI GRAFICZNYCH PRZEDMOWA Poprzez połączenie symbolu graficznego Unii Europejskiej oraz części tekstowej oznaczającej jeden z jej programów operacyjnych powstaje symbol graficzny, który zgodnie z obowiązującymi dyrektywami ma być

Bardziej szczegółowo

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie

Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3. Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Specjalność: Bionanotechnologie Nazwa modułu: Genetyka molekularna Rok akademicki: 2014/2015 Kod: EIB-2-206-BN-s Punkty ECTS: 3 Wydział: Elektrotechniki, Automatyki, Informatyki i Inżynierii Biomedycznej Kierunek: Inżynieria Biomedyczna

Bardziej szczegółowo

================================================================= Ćwiczenie 6 Oznaczanie aktywności bakteryjnej β-galaktozydazy Materiały:

================================================================= Ćwiczenie 6 Oznaczanie aktywności bakteryjnej β-galaktozydazy Materiały: Uniwersytet Gdański, Wydział Biologii Katedra Biologii Molekularnej Przedmiot: Biologia Molekularna z Biotechnologią Biologia II rok ================================================================= Ćwiczenie

Bardziej szczegółowo

ZAPYTANIE OFERTOWE dot. rozliczania projektu. realizowane w ramach projektu: JESTEŚMY DLA WAS Kompleksowa opieka w domu chorego.

ZAPYTANIE OFERTOWE dot. rozliczania projektu. realizowane w ramach projektu: JESTEŚMY DLA WAS Kompleksowa opieka w domu chorego. ZAPYTANIE OFERTOWE dot. rozliczania projektu Wrocław, 31-07-2014 r. realizowane w ramach projektu: JESTEŚMY DLA WAS Kompleksowa opieka w domu chorego. Zamówienie jest planowane do realizacji z wyłączeniem

Bardziej szczegółowo

DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15

DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15 DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15 Wykonawcy ubiegający się o udzielenie zamówienia Dotyczy: postępowania prowadzonego w trybie przetargu nieograniczonego na Usługę druku książek, nr postępowania

Bardziej szczegółowo

Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska

Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska Zarządzanie projektami wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska 1 DEFINICJA PROJEKTU Zbiór działań podejmowanych dla zrealizowania określonego celu i uzyskania konkretnego, wymiernego rezultatu produkt projektu

Bardziej szczegółowo

MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA

MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA MATERIAŁY DO BLOKU INŻYNIERIA GENETYCZNA 1. AMPLIFIKACJA FRAGMENTU DNA METODĄ PCR Otrzymywanie dużej liczby kopii określonego fragmentu DNA możliwe jest przy zastosowaniu procedur klonowania lub znacznie

Bardziej szczegółowo

DOPALACZE. - nowa kategoria substancji psychoaktywnych

DOPALACZE. - nowa kategoria substancji psychoaktywnych DOPALACZE - nowa kategoria substancji psychoaktywnych CZYM SĄ DOPALACZE? Dopalacze stosowana w Polsce, potoczna nazwa różnego rodzaju produktów zawierających substancje psychoaktywne, które nie znajdują

Bardziej szczegółowo

Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami

Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami Cechy: Kolorowy i intuicyjny wyœwietlacz LCD Czujnik wysokiej jakoœci Inteligentne rozpoznawanie przeszkód Przedni i tylni system wykrywania

Bardziej szczegółowo

Tematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt

Tematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt Tematy prac licencjackich w Zakładzie Fizjologii Zwierząt Zegar biologiczny Ekspresja genów i białek zegara Rytmy komórkowe Rytmy fizjologiczne Rytmy behawioralne Lokalizacja neuroprzekźników w układzie

Bardziej szczegółowo

1. Od kiedy i gdzie należy złożyć wniosek?

1. Od kiedy i gdzie należy złożyć wniosek? 1. Od kiedy i gdzie należy złożyć wniosek? Wniosek o ustalenie prawa do świadczenia wychowawczego będzie można składać w Miejskim Ośrodku Pomocy Społecznej w Puławach. Wnioski będą przyjmowane od dnia

Bardziej szczegółowo

Regulacja ekspresji operonu ksylozowego

Regulacja ekspresji operonu ksylozowego Bacillus spp. Bacillus spp. A - komórka Bacillus megaterium pod mikroskopem B zdjęcie komórek B.megaterium rosnących w postaci długich łańcuszków. Mikroskopia skaningowa. (Visuals Unlimited) C kolonie

Bardziej szczegółowo

Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry. (Plany lekcyjne) POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM FINANSOWANIE: AUTORZY

Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry. (Plany lekcyjne) POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM FINANSOWANIE: AUTORZY POZNAJ NAJNOWSZE INFORMACJE NA TEMAT BADAŃ NAD ZDROWIEM Przewodnik dla instruktora dotyczący raka skóry (Plany lekcyjne) AUTORZY FINANSOWANIE: Plan lekcyjny dla modułu 3 Rak skóry bez tajemnic I. Wprowadzenie

Bardziej szczegółowo

Regulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów. Organizatorzy Konkursu

Regulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów. Organizatorzy Konkursu Regulamin Konkursu Start up Award 9. Forum Inwestycyjne 20-21 czerwca 2016 r. Tarnów 1 Organizatorzy Konkursu 1. Organizatorem Konkursu Start up Award (Konkurs) jest Fundacja Instytut Studiów Wschodnich

Bardziej szczegółowo

Przedmiotowe zasady oceniania. zgodne z Wewnątrzszkolnymi Zasadami Oceniania. obowiązującymi w XLIV Liceum Ogólnokształcącym.

Przedmiotowe zasady oceniania. zgodne z Wewnątrzszkolnymi Zasadami Oceniania. obowiązującymi w XLIV Liceum Ogólnokształcącym. Przedmiotowe zasady oceniania zgodne z Wewnątrzszkolnymi Zasadami Oceniania obowiązującymi w XLIV Liceum Ogólnokształcącym. Przedmiot: biologia Nauczyciel przedmiotu: Anna Jasztal, Anna Woch 1. Formy sprawdzania

Bardziej szczegółowo

Tematyka zajęć z biologii

Tematyka zajęć z biologii Tematyka zajęć z biologii klasy: I Lp. Temat zajęć Zakres treści 1 Zapoznanie z przedmiotowym systemem oceniania, wymaganiami edukacyjnymi i podstawą programową Podstawowe zagadnienia materiału nauczania

Bardziej szczegółowo

BEZPIECZE STWO PRACY Z LASERAMI

BEZPIECZE STWO PRACY Z LASERAMI BEZPIECZE STWO PRACY Z LASERAMI Szkodliwe dzia anie promieniowania laserowego dotyczy oczu oraz skóry cz owieka, przy czym najbardziej zagro one s oczy. Ze wzgl du na kierunkowo wi zki zagro enie promieniowaniem

Bardziej szczegółowo

2.Prawo zachowania masy

2.Prawo zachowania masy 2.Prawo zachowania masy Zdefiniujmy najpierw pewne podstawowe pojęcia: Układ - obszar przestrzeni o określonych granicach Ośrodek ciągły - obszar przestrzeni którego rozmiary charakterystyczne są wystarczająco

Bardziej szczegółowo

Biotechnologia i inżynieria genetyczna

Biotechnologia i inżynieria genetyczna Wersja A Test podsumowujący rozdział II i inżynieria genetyczna..................................... Imię i nazwisko.............................. Data Klasa oniższy test składa się z 16 zadań. rzy każdym

Bardziej szczegółowo

NAPRAWDÊ DOBRA DECYZJA

NAPRAWDÊ DOBRA DECYZJA KARTA SERWISOWA NAPRAWDÊ DOBRA DECYZJA Gratulujemy! Dokonali Pañstwo œwietnego wyboru: nowoczesne drewniane okna s¹ ekologiczne, a tak e optymalne pod wzglêdem ekonomicznym. Nale ¹ do najwa niejszych elementów

Bardziej szczegółowo

PCR - ang. polymerase chain reaction

PCR - ang. polymerase chain reaction PCR - ang. polymerase chain reaction łańcuchowa (cykliczna) reakcja polimerazy Technika PCR umożliwia otrzymywanie dużej liczby kopii specyficznych fragmentów DNA (czyli amplifikację zwielokrotnienie fragmentu

Bardziej szczegółowo

Urząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-30/02:29:36. Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka

Urząd Miasta Bielsko-Biała - um.bielsko.pl Wygenerowano: 2016-06-30/02:29:36. Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka Wpływ promieni słonecznych na zdrowie człowieka Światło słoneczne jest niezbędne do trwania życia na Ziemi. Dostarcza energii do fotosyntezy roślinom co pomaga w wytwarzaniu tlenu niezbędnego do życia.

Bardziej szczegółowo

PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP

PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP Warszawa, dnia 04 września 2015 r. RZECZPOSPOLITA POLSKA MINISTER FINANSÓW PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP W związku z interpelacją nr 34158 posła Jana Warzechy i posła

Bardziej szczegółowo

Skąd się wzięła biologia syntetyczna? Co to są standardowe części biologiczne?

Skąd się wzięła biologia syntetyczna? Co to są standardowe części biologiczne? Skąd się wzięła biologia syntetyczna? Mało kto zdaje sobie sprawę z tego, że termin "biologia syntetyczna" został ukuty w 1974 roku przez polskiego genetyka i biochemika Wacława Szybalskiego. Biologia

Bardziej szczegółowo

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 5 Droga od genu do

Bardziej szczegółowo

MATEMATYKA 4 INSTYTUT MEDICUS FUNKCJA KWADRATOWA. Kurs przygotowawczy na studia medyczne. Rok szkolny 2010/2011. tel. 0501 38 39 55 www.medicus.edu.

MATEMATYKA 4 INSTYTUT MEDICUS FUNKCJA KWADRATOWA. Kurs przygotowawczy na studia medyczne. Rok szkolny 2010/2011. tel. 0501 38 39 55 www.medicus.edu. INSTYTUT MEDICUS Kurs przygotowawczy na studia medyczne Rok szkolny 00/0 tel. 050 38 39 55 www.medicus.edu.pl MATEMATYKA 4 FUNKCJA KWADRATOWA Funkcją kwadratową lub trójmianem kwadratowym nazywamy funkcję

Bardziej szczegółowo

Politechnika Warszawska Wydział Matematyki i Nauk Informacyjnych ul. Koszykowa 75, 00-662 Warszawa

Politechnika Warszawska Wydział Matematyki i Nauk Informacyjnych ul. Koszykowa 75, 00-662 Warszawa Zamawiający: Wydział Matematyki i Nauk Informacyjnych Politechniki Warszawskiej 00-662 Warszawa, ul. Koszykowa 75 Przedmiot zamówienia: Produkcja Interaktywnej gry matematycznej Nr postępowania: WMiNI-39/44/AM/13

Bardziej szczegółowo

PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc

PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc PRAWA ZACHOWANIA Podstawowe terminy Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc a) si wewn trznych - si dzia aj cych na dane cia o ze strony innych

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie SCENARIUSZ LEKCJI OPRACOWANY W RAMACH PROJEKTU: INFORMATYKA MÓJ SPOSÓB NA POZNANIE I OPISANIE ŚWIATA. PROGRAM NAUCZANIA INFORMATYKI Z ELEMENTAMI PRZEDMIOTÓW MATEMATYCZNO-PRZYRODNICZYCH Autorzy scenariusza:

Bardziej szczegółowo

Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją).

Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją). Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją). Czym jest życie? metabolizm + informacja (replikacja) 2 Cząsteczki organiczne mog y powstać w atmosferze pierwotnej

Bardziej szczegółowo

PROGRAM KURSU ONLINE Asertywność i poczucie własnej wartości

PROGRAM KURSU ONLINE Asertywność i poczucie własnej wartości PROGRAM KURSU ONLINE Asertywność i poczucie własnej wartości Marta Pyrchała-Zarzycka www.astrosalus.pl www.kosmetyka-fitness.pl http://www.astrosalus.com/ www.sukces-biznes.pl kursy@astrosalus.pl 506-320-330

Bardziej szczegółowo

Druk nr 1013 Warszawa, 9 lipca 2008 r.

Druk nr 1013 Warszawa, 9 lipca 2008 r. Druk nr 1013 Warszawa, 9 lipca 2008 r. SEJM RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ VI kadencja Komisja Nadzwyczajna "Przyjazne Państwo" do spraw związanych z ograniczaniem biurokracji NPP-020-51-2008 Pan Bronisław

Bardziej szczegółowo

Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem

Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem Zarządzanie czasem TOMASZ ŁUKASZEWSKI INSTYTUT INFORMATYKI W ZARZĄDZANIU Zarządzanie czasem w projekcie /49 Czas w zarządzaniu projektami 1. Pojęcie zarządzania

Bardziej szczegółowo

Wytyczne Województwa Wielkopolskiego

Wytyczne Województwa Wielkopolskiego 5. Wytyczne Województwa Wielkopolskiego Projekt wspó³finansowany przez Uniê Europejsk¹ z Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego oraz Bud etu Pañstwa w ramach Wielkopolskiego Regionalnego Programu

Bardziej szczegółowo

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp 1. Informacja o pracownikach wyznaczonych do udzielania pierwszej pomocy oraz o pracownikach wyznaczonych do wykonywania działań w zakresie

Bardziej szczegółowo

MODEL ODPOWIEDZI I SCHEMAT OCENIANIA ARKUSZA EGZAMINACYJNEGO AKADEMIA MEDYCZNA 2006

MODEL ODPOWIEDZI I SCHEMAT OCENIANIA ARKUSZA EGZAMINACYJNEGO AKADEMIA MEDYCZNA 2006 Zasady oceniania MODEL ODPOWIEDZI I SCHEMAT OCENIANIA ARKUSZA EGZAMINACYJNEGO AKADEMIA MEDYCZNA 006 Za rozwiązanie zadań z arkusza I można uzyskać maksymalnie 50 punktów. Model odpowiedzi uwzględnia jej

Bardziej szczegółowo

PLANY WYNIKOWE W ZAKRESIE III KLASY GIMNAZJUM. opracowane na podstawie materia³ów katechetycznych Jezus prowadzi i zbawia z serii W DRODZE DO EMAUS

PLANY WYNIKOWE W ZAKRESIE III KLASY GIMNAZJUM. opracowane na podstawie materia³ów katechetycznych Jezus prowadzi i zbawia z serii W DRODZE DO EMAUS PLANY WYNIKOWE W ZAKRESIE III KLASY GIMNAZJUM opracowane na podstawie materia³ów katechetycznych Jezus prowadzi i zbawia z serii W DRODZE DO EMAUS Dzia³anie nauczyciela, w tym równie katechety, jest œciœle

Bardziej szczegółowo

EGZEMPLARZ ARCHIWALNY WZORU UŻYTKOWEGO (12,OPIS OCHRONNY. (19) PL di)62974 B62D 57/02 (2006.01) Dudek Piotr, Włocławek, PL

EGZEMPLARZ ARCHIWALNY WZORU UŻYTKOWEGO (12,OPIS OCHRONNY. (19) PL di)62974 B62D 57/02 (2006.01) Dudek Piotr, Włocławek, PL EGZEMPLARZ ARCHIWALNY RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12,OPIS OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 114126 (22) Data zgłoszenia: 11.06.2003 (19) PL di)62974

Bardziej szczegółowo

Automatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla oceny użyteczności produktów i usług

Automatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla oceny użyteczności produktów i usług Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu Wydział Informatyki i Gospodarki Elektronicznej Katedra Informatyki Ekonomicznej Streszczenie rozprawy doktorskiej Automatyczne przetwarzanie recenzji konsumenckich dla

Bardziej szczegółowo

Lekcja 173, 174. Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe.

Lekcja 173, 174. Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe. Lekcja 173, 174 Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe. Silnik elektryczny asynchroniczny jest maszyną elektryczną zmieniającą energię elektryczną w energię mechaniczną, w której wirnik obraca się z

Bardziej szczegółowo

oraz wykazuje, że powinna zachodzić przed podziałem komórki recesywność, rekombinacja autosomalne intronem genomów bakterii i organizmów genetyczna

oraz wykazuje, że powinna zachodzić przed podziałem komórki recesywność, rekombinacja autosomalne intronem genomów bakterii i organizmów genetyczna WYMAGANIA EDUKACYJNE Z BIOLOGII W KLASIE VII PODRĘCZNIK: E. Bonar, W. Krzeszowiec-Jeleń, St. Czachorowski Biologia na czasie. Zakres podstawowy. Numer dopuszczenia: 450/2012. ROK SZKOLNY: 2015/2016 OPRACOWAŁA

Bardziej szczegółowo

PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO. w Urzędzie Gminy Mściwojów

PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO. w Urzędzie Gminy Mściwojów I. Postanowienia ogólne 1.Cel PROCEDURA OCENY RYZYKA ZAWODOWEGO w Urzędzie Gminy Mściwojów Przeprowadzenie oceny ryzyka zawodowego ma na celu: Załącznik A Zarządzenia oceny ryzyka zawodowego monitorowanie

Bardziej szczegółowo

RUCH KONTROLI WYBORÓW. Tabele pomocnicze w celu szybkiego i dokładnego ustalenia wyników głosowania w referendum w dniu 6 września 2015 r.

RUCH KONTROLI WYBORÓW. Tabele pomocnicze w celu szybkiego i dokładnego ustalenia wyników głosowania w referendum w dniu 6 września 2015 r. RUCH KONTROLI WYBORÓW Tabele pomocnicze w celu szybkiego i dokładnego ustalenia wyników głosowania w referendum w dniu września r. Plik zawiera - dwie tabele pomocnicze do zliczania wyników cząstkowych

Bardziej szczegółowo

Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence.

Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence. Informacje dla kadry zarządzającej Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence. 2010 Cisco i/lub firmy powiązane. Wszelkie prawa zastrzeżone. Ten dokument zawiera

Bardziej szczegółowo

Zakupy poniżej 30.000 euro Zamówienia w procedurze krajowej i unijnej

Zakupy poniżej 30.000 euro Zamówienia w procedurze krajowej i unijnej biblioteczka zamówień publicznych Agata Hryc-Ląd Małgorzata Skóra Zakupy poniżej 30.000 euro Zamówienia w procedurze krajowej i unijnej Nowe progi w zamówieniach publicznych 2014 Agata Hryc-Ląd Małgorzata

Bardziej szczegółowo

Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko

Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Karta pracy III.. Imię i nazwisko klasa Celem nauki jest stawianie hipotez, a następnie ich weryfikacja, która w efekcie

Bardziej szczegółowo

PODSTAWY METROLOGII ĆWICZENIE 4 PRZETWORNIKI AC/CA Międzywydziałowa Szkoła Inżynierii Biomedycznej 2009/2010 SEMESTR 3

PODSTAWY METROLOGII ĆWICZENIE 4 PRZETWORNIKI AC/CA Międzywydziałowa Szkoła Inżynierii Biomedycznej 2009/2010 SEMESTR 3 PODSTAWY METROLOGII ĆWICZENIE 4 PRZETWORNIKI AC/CA Międzywydziałowa Szkoła Inżynierii Biomedycznej 29/2 SEMESTR 3 Rozwiązania zadań nie były w żaden sposób konsultowane z żadnym wiarygodnym źródłem informacji!!!

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Rozdział 1. Rozdział 2. XIII Przedmowa do wydania polskiego 1Przedmowa

Spis treści. Rozdział 1. Rozdział 2. XIII Przedmowa do wydania polskiego 1Przedmowa Spis treści XIII Przedmowa do wydania polskiego 1Przedmowa Rozdział 1 8 Badanie tajemnic psychiki i zachowania 11 Psychologia: definicje, cele i zadania 20 Historyczne podstawy psychologii 23 Wspó³czesne

Bardziej szczegółowo

Wymagania edukacyjne Biologia na czasie, zakres podstawowy

Wymagania edukacyjne Biologia na czasie, zakres podstawowy Wymagania edukacyjne Biologia na czasie, zakres podstawowy Dział programu I. Od genu do cechy Lp. Temat Poziom wymagań konieczny (K) podstawowy (P) rozszerzający (R) dopełniający (D) 1 Budowa i funkcje

Bardziej szczegółowo

Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT. Departament Ceł, Ministerstwo Finansów

Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT. Departament Ceł, Ministerstwo Finansów Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT Departament Ceł, Ministerstwo Finansów Usługa e-tranzyt System NCTS 2 Aktualny stan wdrożenia Ogólnopolskie

Bardziej szczegółowo

Edycja geometrii w Solid Edge ST

Edycja geometrii w Solid Edge ST Edycja geometrii w Solid Edge ST Artykuł pt.: " Czym jest Technologia Synchroniczna a czym nie jest?" zwracał kilkukrotnie uwagę na fakt, że nie należy mylić pojęć modelowania bezpośredniego i edycji bezpośredniej.

Bardziej szczegółowo

jest częściowe pokrycie wydatków związanych z wychowaniem dziecka, w tym z opieką nad nim i zaspokojeniem jego potrzeb życiowych.

jest częściowe pokrycie wydatków związanych z wychowaniem dziecka, w tym z opieką nad nim i zaspokojeniem jego potrzeb życiowych. Praktyczny poradnik Celem świadczenia wychowawczego jest częściowe pokrycie wydatków związanych z wychowaniem dziecka, w tym z opieką nad nim i zaspokojeniem jego potrzeb życiowych. W zakładce "wnioski

Bardziej szczegółowo

Zasady wizualizacji PROW 2014-2020

Zasady wizualizacji PROW 2014-2020 Zasady wizualizacji PROW 2014-2020 Materiał opracowany przez Instytucja Zarządzająca PROW 2014-2020 Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi Materiał współfinansowany ze środków Unii Europejskiej w ramach Programu

Bardziej szczegółowo

Jacek Mrzyg³ód, Tomasz Rostkowski* Rozwi¹zania systemowe zarz¹dzania kapita³em ludzkim (zkl) w bran y energetycznej

Jacek Mrzyg³ód, Tomasz Rostkowski* Rozwi¹zania systemowe zarz¹dzania kapita³em ludzkim (zkl) w bran y energetycznej Komunikaty 99 Jacek Mrzyg³ód, Tomasz Rostkowski* Rozwi¹zania systemowe zarz¹dzania kapita³em ludzkim (zkl) w bran y energetycznej Artyku³ przedstawi skrócony raport z wyników badania popularnoœci rozwi¹zañ

Bardziej szczegółowo

ZAGADNIENIA PODATKOWE W BRANŻY ENERGETYCZNEJ - VAT

ZAGADNIENIA PODATKOWE W BRANŻY ENERGETYCZNEJ - VAT ZAGADNIENIA PODATKOWE W BRANŻY ENERGETYCZNEJ - VAT Szanowni Państwo! Prowadzenie działalności w branży energetycznej wiąże się ze specyficznymi problemami podatkowymi, występującymi w tym sektorze gospodarki.

Bardziej szczegółowo

Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe

Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe Projekt MES Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe 1. Ugięcie wieszaka pod wpływem przyłożonego obciążenia 1.1. Wstęp Analizie poddane zostało ugięcie wieszaka na ubrania

Bardziej szczegółowo

INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201

INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201 INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: PZ-41SLB-E PL 0101872HC8201 2 Dziękujemy za zakup urządzeń Lossnay. Aby uŝytkowanie systemu Lossnay było prawidłowe i bezpieczne, przed pierwszym uŝyciem przeczytaj niniejszą

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

Od redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2.

Od redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2. Od redakcji Niniejszy zbiór zadań powstał z myślą o tych wszystkich, dla których rozwiązanie zadania z fizyki nie polega wyłącznie na mechanicznym przekształceniu wzorów i podstawieniu do nich danych.

Bardziej szczegółowo

Co zrobić, jeśli uważasz, że decyzja w sprawie zasiłku mieszkaniowego lub zasiłku na podatek lokalny jest niewłaściwa

Co zrobić, jeśli uważasz, że decyzja w sprawie zasiłku mieszkaniowego lub zasiłku na podatek lokalny jest niewłaściwa Polish Co zrobić, jeśli uważasz, że decyzja w sprawie zasiłku mieszkaniowego lub zasiłku na podatek lokalny jest niewłaściwa (What to do if you think the decision about your Housing Benefit or Council

Bardziej szczegółowo

Lp. Tematyka Liczba godzin I. Wymagania edukacyjne

Lp. Tematyka Liczba godzin I. Wymagania edukacyjne Anna Ulrych Plan wynikowy Przedmiot: Materiały fryzjerskie Kierunek : Technikum Usług Fryzjerskich- rok szkolny 05/ 06 Liczba godzin: 76 Liczba godzin w roku szkolnym: KL.II Lp. Tematyka Liczba godzin

Bardziej szczegółowo

Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu

Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Jak ju wspomniano, kinesiotaping mo e byç stosowany jako osobna metoda terapeutyczna, jak równie mo e stanowiç uzupe nienie innych metod fizjoterapeutycznych.

Bardziej szczegółowo

zywania Problemów Alkoholowych

zywania Problemów Alkoholowych Państwowa Agencja Rozwiązywania zywania Problemów Alkoholowych Konferencja Koszty przemocy wobec kobiet w Polsce 2013 Warszawa, 27 maja 2013 r. www.parpa.pl 1 Podstawy prawne Ustawa o wychowaniu w trzeźwości

Bardziej szczegółowo

WÓZKI TRANSPORTOWE WÓZEK DO PRZEWOZU PACJENTÓW TYP 212 EL

WÓZKI TRANSPORTOWE WÓZEK DO PRZEWOZU PACJENTÓW TYP 212 EL WÓZEK DO PRZEWOZU PACJENTÓW TYP 212 EL prowadnice kaset RTG Cena od 4 427,00 kaseta RTG, uchwyt na butle z tlenem Elektryczny wózek transportowo-reanimacyjnodatkow¹ zalet¹ wózka. Wózek wyposa ony zosta³

Bardziej szczegółowo

REGULAMIN. przeprowadzania naboru nowych pracowników do korpusu służby cywilnej w Kuratorium Oświaty w Szczecinie.

REGULAMIN. przeprowadzania naboru nowych pracowników do korpusu służby cywilnej w Kuratorium Oświaty w Szczecinie. Załącznik do zarządzenia Nr 96 /2009 Zachodniopomorskiego Kuratora Oświaty w Szczecinie z dnia 23 września 2009 r. REGULAMIN przeprowadzania naboru nowych pracowników do korpusu służby cywilnej w Kuratorium

Bardziej szczegółowo

Efektywna strategia sprzedaży

Efektywna strategia sprzedaży Efektywna strategia sprzedaży F irmy wciąż poszukują metod budowania przewagi rynkowej. Jednym z kluczowych obszarów takiej przewagi jest efektywne zarządzanie siłami sprzedaży. Jak pokazują wyniki badania

Bardziej szczegółowo

Temat: Funkcje. Własności ogólne. A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1

Temat: Funkcje. Własności ogólne. A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1 Temat: Funkcje. Własności ogólne A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1 Kody kolorów: pojęcie zwraca uwagę * materiał nieobowiązkowy A n n a R a

Bardziej szczegółowo

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane

Bardziej szczegółowo

probiotyk o unikalnym składzie

probiotyk o unikalnym składzie ~s~qoy[jg probiotyk o unikalnym składzie ecovag, kapsułki dopochwowe, twarde. Skład jednej kapsułki Lactobacillus gasseri DSM 14869 nie mniej niż 10 8 CFU Lactobacillus rhamnosus DSM 14870 nie mniej niż

Bardziej szczegółowo

PODSTAWOWA DOKUMENTACJA BADANIA KLINICZNEGO

PODSTAWOWA DOKUMENTACJA BADANIA KLINICZNEGO Załącznik do rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 2 maja 2012 r. PODSTAWOWA DOKUMENTACJA BADANIA KLINICZNEGO 1. Podstawową dokumentację badania klinicznego stanowią dokumenty, które łącznie lub osobno

Bardziej szczegółowo

Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników

Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników Proces wprowadzania nowo zatrudnionych pracowników poradnik dla bezpoêredniego prze o onego wprowadzanego pracownika WZMOCNIENIE ZDOLNOÂCI ADMINISTRACYJNYCH PROJEKT BLIèNIACZY PHARE PL03/IB/OT/06 Proces

Bardziej szczegółowo

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany

Dr. habil. Anna Salek International Bio-Consulting 1 Germany 1 2 3 Saccharomyces carlsbergensis Nowe szczepy w browarnictwie 4 Drożdże transgeniczne Saccharomyces carlsbergensis 5 6 Wśród wielu etapów produkcji piwa, proces pierwotnej i wtórnej fermentacji stwarza

Bardziej szczegółowo

KLAUZULE ARBITRAŻOWE

KLAUZULE ARBITRAŻOWE KLAUZULE ARBITRAŻOWE KLAUZULE arbitrażowe ICC Zalecane jest, aby strony chcące w swych kontraktach zawrzeć odniesienie do arbitrażu ICC, skorzystały ze standardowych klauzul, wskazanych poniżej. Standardowa

Bardziej szczegółowo

DANE MAKROEKONOMICZNE (TraderTeam.pl: Rafa Jaworski, Marek Matuszek) Lekcja XXIII

DANE MAKROEKONOMICZNE (TraderTeam.pl: Rafa Jaworski, Marek Matuszek) Lekcja XXIII DANE MAKROEKONOMICZNE (TraderTeam.pl: Rafa Jaworski, Marek Matuszek) Lekcja XXIII Systemy transakcyjne cz.1 Wszelkie prawa zastrze one. Kopiowanie i rozpowszechnianie ca ci lub fragmentu niniejszej publikacji

Bardziej szczegółowo

www.naszanatura2000.pl

www.naszanatura2000.pl 1 Biuro Projektu Stowarzyszenie Tilia ul. Przysiecka 13, 87-100 Toruń Tel./fax: 6 67 60 8 e-mail: tilia@tilia.org.pl www.tilia.org.pl Szkoła Leśna na Barbarce www.szkola-lesna.torun.pl www.naszanatura2000.pl

Bardziej szczegółowo

Wymagania edukacyjne Biologia na czasie, zakres podstawowy klasa I

Wymagania edukacyjne Biologia na czasie, zakres podstawowy klasa I Wymagania edukacyjne Biologia na czasie, zakres podstawowy klasa I Dział programu I. Od genu do cechy Lp. i zapis w podstawieprogramowej 1 VIII.2 2 VIII.1 3 VIII.3 temat Budowa i funkcje kwasów nukleinowych

Bardziej szczegółowo