(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/13144 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/13144 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO99/64068 PCT Gazette nr 50/99 (51) Int.Cl. A61K 39/12 ( ) A61K 39/145 ( ) C12N 7/00 ( ) (54) Atenuowany wirus grypy, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne (30) Pierwszeństwo: ,US,60/089, ,US,60/108, ,US,60/117,683 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 03/02 (73) Uprawniony z patentu: MOUNT SINAI SCHOOL OF MEDICINE OF NEW YORK UNIVERSITY,Nowy York,US (72) Twórca(y) wynalazku: Peter Palese,Leonia,US Adolfo Garcia-Sastre,New York,US Thomas Muster,New York,US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/09 (74) Pełnomocnik: Elżbieta Pietruszyńska-Dajewska, POLSERVICE, Kancelaria Rzeczników Patentowych Sp. z o.o. PL B1 (57) 1. Atenuowany wirus grypy obejmujący zmodyfikowany gen NS1, znamienny tym, że wirusa grypy stanowi NS1/ Genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, znamienny tym, że wirus atenuowany jest przez mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60, przy czym N końcowy aminokwas oznacza numer 1, i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do miana, które jest przynajmniej o jeden rząd logarytmu wyższe niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnego pod względem interferonu w przypadku propagacji w takich samych warunkach. 3. Atenuowany wirus grypy według zastrz. 2, znamienny tym, że stanowi wirusa grypy A.

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest atenuowany wirus grypy obejmujący zmodyfikowany gen NS1, genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, kompozycje szczepionek i kompozycje farmaceutyczne. 1. Wprowadzenie Zgodnie z wynalazkiem opisano ogólnie atenuowane wirusy o ujemnej nici RNA o zaburzonej zdolności do antagonizacji odpowiedzi komórkowej na interferon (IFN) oraz zastosowania takich atenuowanych wirusów w szczepionkach oraz preparatach farmaceutycznych. 2. Tło wynalazku 2.1 Wirus grypy Rodziny wirusów zawierające genom o ujemnej nici z jednoniciowym RNA w osłonce klasyfikuje się w grupach, mających genomy niesegmentowane (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae i choroby Borna) lub mające genomy segmentowane (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae i Arenaviridae). Rodzina Orthomyxoviridae, opisywana szczegółowo poniżej, i używana w niniejszych przykładach, obejmuje wirusy grypy, wirusy typu A, B i C, jak również wirusy Thogoto i Dhori oraz wirusa zakaźnej anemii łososi. Wiriony grypy składają się z wewnętrznego rdzenia rybonukleoproteinowego (nukleokapsyd w postaci helisy), zawierającego genom o pojedynczej nici RNA, oraz zewnętrznej osłonki lipoproteinowej powleczonej wewnątrz białkiem matriksowym (M1). Segmentowany genom wirusa grypy A składa się z ośmiu cząsteczek (siedem dla grypy C), liniowych, o ujemnej polarności, o pojedynczych niciach RNA, które kodują dziesięć polipeptydów, włączając: białka polimerazy RNA zależne od RNA (PB2, PB1 i PA) oraz nukleoproteinę (NP), która tworzy nukleokapsyd; białka błony matriksowej (M1, M2); dwie glikoproteiny powierzchniowe, które wystają z osłonki zawierającej lipid: hemaglutyninę (HA) i jądrowe białko eksportowe (NEP). Transkrypcja i replikacja genomu ma miejsce w jądrze, a montowanie zachodzi poprzez składanie na błonie plazmatycznej. Wirusy mogą ulegać reasortacji w czasie mieszanych infekcji. Wirus grypy adsorbuje się poprzez HA do sialilooligosacharydów w glikoproteinach i glikolipidach błony komórkowej. Po endocytozie wirionu, zachodzą zmiany konformacyjne w cząsteczce HA wewnątrz endosomu komórkowego, które ułatwiają fuzję błonową, stymulując w ten sposób pozbawienie osłonki. Nukleokapsyd migruje do jądra, gdzie mrna wirusa ulega transkrypcji. Wirusowy mrna ulega transkrypcji przez unikalny mechanizm, w którym endonukleazy wirusowe odcinają czapeczkowany koniec 5' z heterologicznych mrna komórki, które następnie służą jako startery do transkrypcji matryc RNA wirusa przez transkryptazę wirusową. Terminacja transkryptu zachodzi w miejscach 15 do 22 zasad od końców ich matryc, gdzie sekwencje oligo(u) działają jako sygnały do dodawania śladów poli(a). Z ośmiu tak wytworzonych wirusowych cząsteczek RNA, sześć jest informacjami monocistronowymi, które ulegają translacji bezpośrednio do białek, reprezentujących HA, NA, NP i białka polimerazy wirusowej, PB2, PB1 i PA. Inne dwa transkrypty przechodzą splicing, po czym każdy daje dwa mrna, które ulegają translacji w różnych ramkach odczytu, wytwarzając M1, M2, NS1 i NEP. Innymi słowy, osiem segmentów wirusowego RNA koduje dziesięć białek: dziewięć strukturalnych i jedno niestrukturalne. Omówienie genów wirusa grypy i ich produktów białkowych, pokazano w tabeli 1 poniżej. T a b e l a 1: Segment RNA genomu wirusa grzęz i produkty kodowania Segment Długość b (nukleotydy) Kodowany polipeptyd c Długość d (aminokwasy) Cząsteczki na wirion Komentarz PB Składnik transkryptazy RNA; Wiązanie czapeczkowanego RNA komórki gospodarza PB Składnik transkryptazy RNA; inicjacja transkrypcji PA Składnik transkryptazy RNA

3 PL B cd. tabeli HA hemaglutynina; trimer; glikoproteina osłonki; pośredniczy w przyłączaniu do komórek NP Nukleoproteina; związana z RNA; strukturalny składnik transkryptazy RNA NA Neuraminidaza; tetramer; glikoproteina osłonki M Białko matrycowe, powleka wnętrze otoczki M2 96? Strukturalne białko w błonie plazmatycznej; złożony mrna NS1 230 Białko niestrukturalne; funkcja nieznana NEP 121? Jądrowe białko eksportowe; złożony mrna a Dostosowane z R.A. Lamb i P.W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, tom 52, b Dla szczepu A/PR/8/34 c Określone w próbach biochemicznych i genetycznych d Określone w analizie sekwencji nukleotydowej i sekwencjonowaniu białka Genom wirusa grypy A zawiera osiem segmentów RNA o pojedynczej nici o ujemnej polarności, kodujących jedno białko niestrukturalne i dziewięć strukturalnych. Białko niestrukturalne NS1 jest powszechne w komórkach zakażonych wirusem grypy, lecz nie zostało wykryte w wirionach. NS1 jest fosfoproteiną znajdującą się w jądrze wcześnie podczas zakażenia, a także w cytoplazmie w czasie późniejszym cyklu wirusowego (King i inni 1975, Virology 64: 378). Badania z mutantami grypy wrażliwymi na temperaturę (ts) z uszkodzeniami w genie NS, sugerowały, że białko NS1 jest regulatorem transkrypcyjnym i post-transkrypcyjnym mechanizmów, dzięki którym wirus jest zdolny do hamowania ekspresji genów komórki gospodarza i stymulacji syntezy białek wirusowych. Tak jak wiele innych białek, które regulują procesy post-translacyjne, białko NS1 oddziaływuje ze specyficznymi sekwencjami i strukturami RNA. Donoszono, że białko NS1 wiąże się z różnymi rodzajami RNA, łącznie z vrna, poli-a, U6snRNA, regionem 5' nie podlegającym translacji, jak mrna wirusa oraz dsrna (Qiu i inni, 1995, RNA 1: 304; Qiu i inni 1994, J.Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J.Gen.Virol. 73: Ekspresję białka NS1 z cdna w transfekowanych komórkach powiązano z kilkoma skutkami: hamowaniem transportu jądrowo-cytoplazmatycznego mrna, hamowaniem splicingu pre-mrna, hamowaniem poliadenylacji mrna gospodarza i stymulacją translacji wirusowego mrna (Fortes i inni, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami i inni, 1994, J.Virol. 68: 1432; de la Luna i inni 1995, J.Virol. 69:2427; Lu i inni, Genes Dev. 8: 1817; Park i inni, 1995, J.Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff i inni, 1998, Mol. Cell. 1:1991; Chen i inni, 1994, EMBO J. 18: ). 2.2 Wirusy atenuowane Inaktywowane szczepionki wirusowe otrzymuje się przez zabicie" patogenu wirusowego np. przez traktowanie wysoką temperaturą lub formaliną tak, że nie jest on zdolny do replikacji. Inaktywowane szczepionki mają ograniczone wykorzystanie, ponieważ nie zapewniają długotrwałej odporności, a zatem zapewniają ograniczone zabezpieczenie. Alternatywnym podejściem wytwarzania szczepionek wirusowych jest stosowanie atenuowanych żywych szczepionek wirusowych. Atenuowane wirusy są zdolne do replikacji, lecz nie są patogenne, a zatem zapewniają dłużej trwającą odporność i większe zabezpieczenie. Jednakże, konwencjonalne metody wytwarzania atenuowanych wirusów obejmują przypadkową izolację szeregu mutantów gospodarza, z których wiele jest wrażliwych na temperaturę; np. wirusa pasażuje się przez nienaturalnego gospodarza i selekcjonuje wirusy potomne, które są immunogenne, a jeszcze niepatogenne. Konwencjonalnym substratem do izolacji i hodowli wirusów grypy do celów wytwarzania szczepionek, są jaja kurze z zarodkami. Wirusy grypy zwykle rosną w ciągu 2-4 dni w temperaturze 37 C w jajach dniowych. Mimo, że większość pierwotnych izolatów ludzkich wirusów grypy A i B ro-

4 4 PL B1 śnie lepiej w worku owodniowym zarodków, po 2 do 4 pasażach wirusy dostosowują się do wzrostu w komórkach jamy omoczniowej, która jest dostępna z zewnątrz jaja (Murphy, B.R. i R.G. Webster, Orthomyxoviruses, strona W Fields Virology. Lippincott-Raven P.A). Technologia rekombinacji DNA i techniki inżynierii genetycznej teoretycznie pozwalają na lepsze podejście do wytwarzania atenuowanego wirusa, ponieważ w genomie wirusa można celowo dokonać specyficznych mutacji. Jednakże, zmiany genetyczne wymagane do atenuacji wirusów nie są znane ani przewidywalne. Ogólnie, próby stosowania technologii rekombinacji DNA do wytwarzania szczepionek wirusowych dotyczą w większości produkcji szczepionek podjednostkowych, które zawierają tylko podjednostki białka patogenu, związanego z odpowiedzią immunologiczną, poddane ekspresji w rekombinowanych wektorach wirusowych, takich jak wirus krowianki lub bakulowirus. Ostatnio, wykorzystano techniki rekombinacji DNA w próbie wytworzenia mutantów delecyjnych herpeswirusa lub poliowirusów, które naśladują atenuowane wirusy znajdowane w naturze lub znane szeregi mutantów gospodarzy. Do 1990 r.; wirusy o ujemnej nici RNA nie były wcale podatne na manipulacje miejscowo-specyficzne, a więc nie mogły być genetycznie modyfikowane. Atenuowane żywe wirusy grypy wytwarzane dotąd, mogły nie być zdolne do supresji odpowiedzi interferonowej u gospodarza, w którym replikują. Zatem, mimo, że wirusy te są odpowiednie, ponieważ są one immunogenne i niepatogenne, trudno je namnożyć w konwencjonalnych substratach do celów wytwarzania szczepionek. Ponadto, atenuowane wirusy mogą posiadać cechy wirulencji, które są łagodne i nie pozwalają gospodarzowi na wytworzenie odpowiedzi immunologicznej wystarczającej do obrony przed późniejszymi prowokacjami. 3. Omówienie wynalazku Przedmiotem wynalazku jest atenuowany wirus grypy obejmujący zmodyfikowany gen NS1, charakteryzujący się tym, że wirusa grypy stanowi NS1/99. Przedmiotem wynalazku jest również genetycznie zmodyfikowany atenuowany wirus grypy, charakteryzujący się tym, że wirus atenuowany jest przez mutację w genie NS1 skutkującą delecją wszystkich reszt aminokwasowych za wyjątkiem reszt aminokwasowych 1-130, reszt aminokwasowych 1-120, reszt aminokwasowych 1-100, reszt aminokwasowych 1-99, reszt aminokwasowych 1-70 lub reszt aminokwasowych 1-60, przy czym N końcowy aminokwas oznacza numer 1, i przy czym mutacja pozwala na wzrost atenuowanego wirusa w układzie gospodarza z niedoborem interferonu do miana, które jest przynajmniej o jeden rząd logarytmu wyższe niż miano atenuowanego wirusa wzrastającego w układzie gospodarza kompetentnego pod względem interferonu w przypadku propagacji w takich samych warunkach. Korzystnie wirus grypy stanowi wirus grypy A. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni. Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja szczepionki, charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja szczepionki jest skuteczna do zapobiegania chorobie zakaźnej u podmiotu. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja szczepionki, charakteryzująca się tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja szczepionki jest skuteczna do zapobiegania chorobie zakaźnej u podmiotu. Korzystnie chorobę zakaźną stanowi zakażenie wirusem grypy. Korzystniej atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy A. Korzystnie zawiera dawkę skuteczną do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej. Korzystnie stężenie atenuowanego wirusa wynosi około 10 4 do około 5x10 6 pfu. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni.

5 PL B1 5 Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni. Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1. Korzystnie kompozycja przeznaczona jest do podawania donosowego, dotchawiczego, doustnego, śródskórnego, domięśniowego, śródotrzewnowego, dożylnego, lub podskórnego. Korzystnie podmiotem jest człowiek. Przedmiotem wynalazku jest też kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia choroby zakaźnej u podmiotu. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia choroby zakaźnej u podmiotu. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia chorób, w których interferon przynosi korzyść terapeutyczną podmiotowi. Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera genetycznie zmodyfikowanego atenuowanego wirusa grypy określonego powyżej, i fizjologicznie dopuszczalną zaróbkę, przy czym kompozycja jest skuteczna do leczenia chorób, w których interferon przynosi korzyść terapeutyczną podmiotowi. Korzystnie chorobę zakaźną stanowi zakażeniem wirusem grypy. Korzystnie atenuowanego wirusa grypy stanowi wirus grypy A. Korzystnie kompozycja zawiera dawkę skuteczną do wzbudzenia komórkowej odpowiedzi interferonowej. Korzystnie stężenie atenuowanego wirusa grypy wynosi około 10 4 do około 5x10 6 pfu. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do około 8 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 10 do około 12 dni. Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku około 6 do 7 dni, a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu stanowi jajo z zarodkiem w wieku 10 dni. Korzystniej jajo z zarodkiem stanowi jajo kurze z zarodkiem. Korzystnie układ gospodarza z niedoborem interferonu jest ujemny pod względem STAT1 a układ gospodarza kompetentnego pod względem interferonu jest dodatni pod względem STAT1. Korzystnie jest przeznaczona jest do podawania śródskórnego, domięśniowego, śródotrzewnowego, dożylnego, podskórnego, donosowego, podtwardówkowego lub doustnego. Korzystnie jest przeznaczona jest do podawania dopłucnego. Korzystnie zawarta jest w układzie do kontrolowanego uwalniania. Korzystnie podmiotem jest człowiek. Zgodnie z wynalazkiem opisano atenuowane wirusy RNA o ujemnej nici, o zaburzonej zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki oraz zastosowania takich wirusów w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. W szczególności opisano atenuowane wirusy grypy zawierające zmodyfikowany gen NS1. Takie zmutowane wirusy z zaburzoną aktywnością antagonistyczną wobec IFN są atenuowane, czyli są zakaźne, mogą replikować in vivo zapewniając podkliniczny poziom infekcji, i nie są patogenne. Zatem, są one idealnymi kandydatami do żywych szczepionek wirusowych. Ponadto, atenuowane wirusy mogą indukować silną odpowiedź INF, która ma inne konsekwencje biologiczne in vivo, powodując zabezpieczenie przed późniejszymi chorobami zakaźnymi i/lub indukując odpowiedź przeciwnowotworową. Zatem, atenuowane wirusy można stosować farmaceutycznie do zapobiegania lub leczenia innych chorób zakaźnych, nowotworu u osób o wysokim ryzyku i/lub chorób leczonych przy użyciu IFN.

6 6 PL B1 Wirusy stosowane w wynalazku, można selekcjonować ze szczepów występujących naturalnie, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję wobec mutagenów, powtórzone pasaże i/lub pasaże w gospodarzach niedozwolonych); reasortantów (w przypadku segmentowanych genomów wirusowych); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych (np. przy użyciu technik genetyki odwrotnej") mających pożądany fenotyp, czyli zaburzoną zdolność do antagonizacji odpowiedzi IFN komórki. Zmutowane lub genetycznie zmodyfikowane wirusy można selekcjonować na podstawie różnicowania wzrostu w układach z niedoborem IFN, względem układów kompetentnych pod względem IFN. Przykładowo, można selekcjonować wirusy, które rosną w układzie z niedoborem IFN, lecz nie rosną w układzie kompetentnym pod względem IFN (lub które rosną gorzej w układzie kompetentnym pod względem IFN). Tak wyselekcjonowany atenuowany wirus może być stosowany sam jako składnik aktywny w szczepionce lub preparatach farmaceutycznych. Alternatywnie, atenuowany wirus może być stosowany jako wektor lub szkielet" szczepionek wytwarzanych w sposób rekombinacyjny. Jak dotąd, technikę odwrotnej genetyki" można stosować do wprowadzania mutacji lub obcych epitopów do atenuowanego wirusa, który służyłby jako szczep rodzicielski". W ten sposób, można opracować szczepionki do immunizacji przeciw odmianom szczepów, lub alternatywnie, przeciw całkowicie innym czynnikom zakaźnym lub antygenom chorobowym. Przykładowo, atenuowany wirus można zmodyfikować tak, by eksprymował epitopy neutralizujące innych wstępnie wyselekcjonowanych szczepów. Alternatywnie, w atenuowanego mutanta można wbudować epitopy wirusów innych niż wirusy RNA o ujemnej nici (np. gp160, gp120 lub gp41 HIV). Alternatywnie, w wirusa można wbudować epitopy zakaźnych niewirusowych patogenów (np. pasożytów, bakterii, grzybów). W jeszcze innej opcji, można wytworzyć szczepionki nowotworowe, np. przez wbudowanie antygenów nowotworowych do atenuowanego szkieletu wirusowego. W szczególnej postaci realizacji, obejmującej wirusy RNA z genomami segmentowanymi, tzn. wirusa grypy, do przenoszenia atenuowanego fenotypu z rodzicielskiego szczepu wirusa o segmentowanym RNA (naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) do różnych szczepów wirusowych (wirus dzikiego typu, naturalny mutant, wirus mutagenizowany lub wirus genetycznie zmodyfikowany) można stosować techniki reasortacji. Wirusy atenuowane, które indukują silne odpowiedzi IFN u gospodarza, można także stosować w preparatach farmaceutycznych do zapobiegania lub leczenia innych infekcji wirusowych lub chorób które można leczyć przy użyciu IFN, takich jak nowotwór. W takim przypadku można zmieniać tropizm atenuowanego wirusa tak, aby nakierować go na żądany narząd docelowy, tkankę lub komórki, in vivo lub ex vivo. Stosując to podejście, odpowiedź IFN można indukować miejscowo, w docelowym miejscu, unikając w ten sposób lub minimalizując skutki uboczne układowego traktowania IFN. W tym celu można zbudować atenuowanego wirusa do ekspresji liganda specyficznego pod względem receptora docelowego narządu, tkanki lub komórek. Rozwiązania według wynalazku opierają się częściowo na stwierdzeniu, że NS1 wirusa grypy dzikiego typu działa jak antagonista IFN w taki sposób, że NS1 hamuje odpowiedź fy zależną od IFN komórek gospodarza zakażonych wirusem. Stwierdzono, że mutanty wirusowe z niedoborem aktywności NS1 są silnymi induktorami odpowiedzi komórkowej IFN, i przedstawiają atenuowany fenotyp in vivo; czyli zmutowane wirusy replikują in vivo, lecz dają mniejsze skutki patogenne. Nie chcąc wiązać się jakąkolwiek teorią lub wytłumaczeniem działania wynalazku, cechy atenuacji wirusów według wynalazku są prawdopodobnie spowodowane ich zdolnością do indukcji silnej komórkowej odpowiedzi IFN oraz ich zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi IFN gospodarza. Jednakże, korzystne cechy atenuowanych wirusów według wynalazku nie muszą być przypisywane jedynie wpływowi na komórkową odpowiedź IFN. W rzeczywistości, zmiany innych aktywności związanych z NS1 mogą nadawać żądany atenuowany fenotyp. Wykazano, że zmutowany wirus grypy o zaburzonej aktywności antagonistycznej wobec IFN, replikuje in vivo, wytwarzając miana, które są wystarczające do indukcji odpowiedzi immunologicznej i cytokinowej. Przykładowo, szczepienie atenuowanym wirusem grypy zmniejszało miano wirusa u zwierząt, które później prowokowano wirusem grypy dzikiego typu. Atenuowane wirusy grypy przedstawiały także aktywność przeciwwirusową i przeciwnowotworową. Wstępna infekcja atenuowanym wirusem grypy hamowała replikację innych szczepów wirusa grypy dzikiego typu i innych wirusów (takich jak wirus Sendai) nadkażonych w jajach z zarodkami. Szczepienie atenuowanym wirusem grypy u zwierząt, którym, wstrzyknięto komórki nowotworowe, zmniejszyło liczbę utworzonych ognisk. Ze względu na to, że wirus grypy jak wiadomo indukuje odpowiedź CTL (cytotoksyczne limfocyty T),

7 PL B1 7 atenuowany wirus jest bardzo atrakcyjnym kandydatem do szczepionek nowotworowych. Do szczepionek wirusowych zalecane są mutacje, które zmniejszają, lecz nie znoszą aktywności antagonistycznej IFN wirusa, takie wirusy można selekcjonować pod względem wzrostu zarówno w konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych substratach, oraz pod względem wirulencji pośredniej. W szczególności, twórcy wynalazku wykazali, że mutant o skróconym C-terminalnie NS1 replikuje do wysokich mian w substratach z niedoborem IFN, takich jak 6 i 7-dniowe zarodki kurze, jak również w błonie omoczniowej 10-dniowych zarodków kurzych, substracie konwencjonalnym dla wirusa grypy, który nie pozwala na wzrost mutantów wirusa grypy, w których usunięto cały gen NS1 (przytaczanych także w niniejszym opisie jako mutanty knockout"). Jednakże, replikacja mutanta o skróconym końcu C NS1 jest mniejsza u 12-dniowych zarodków kurzych. Z zastosowaniem tego podejścia można wytwarzać i identyfikować żywe atenuowane wirusy RNA o ujemnej nici, ze zmienioną, lecz nie zniesioną aktywnością antagonistyczną wobec IFN i które są zdolne do wzrostu w substratach odpowiednich do wytwarzania szczepionek. Podejście to pozwala także, po raz pierwszy, na układ skutecznej selekcji identyfikacji pod względem wirusów grypy, które zawierają mutacje nadające zmienioną lecz nie zniesioną aktywność antagonistyczną wobec interferonu. Opisane układy z niedoborem IFN mogą być zastosowane do namnażania atenuowanych wirusów, które nie mogą być hodowane w układach konwencjonalnych stosowanych aktualnie przy wytwarzaniu szczepionek. Określenie układy z niedoborem IFN" jakie stosuje się w niniejszym opisie, odnosi się do układów, np. komórek, linii komórkowych i zwierząt, takich jak myszy, kurczęta, indyki, króliki, szczury itd., które nie wytwarzają IFN lub wytwarzają IFN na niskim poziomie, nie odpowiadających lub odpowiadających mniej skutecznie na IFN, i/lub mających braki w indukowanej przez IFN aktywności genów antywirusowych. W tym celu, twórcy wynalazku zidentyfikowali lub opracowali liczne układy z niedoborem IFN, które można stosować, włączając, lecz bez ograniczenia, młode zarodki kurze, linie komórkowe z niedoborem IFN (takie jak komórki VERO lub genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe, takie jak z wyłączeniem (knockout) STAT1). Alternatywnie, zarodki kurze lub linie komórkowe można wstępnie traktować związkami, które hamują układ IFN (łącznie z lekami, przeciwciałami, antysensami, rybozymami, itd). Jeszcze inna postać realizacji może obejmować stosowanie jaj z niedoborem w układzie IFN np. jaj wytworzonych przez ptaki ujemne pod względem STAT1, zwłaszcza drób, włączając lecz bez ograniczenia kurczęta transgeniczne, kaczki lub indyki. 4. Opis rysunków Figura 1. Wirus delns1 hamuje replikację wirusa grypy A dzikiego typu w jajach. Jaja kurze z zarodkami w wieku dziesięciu dni zaszczepiono wskazanymi pfu wirusa delns1. Osiem godzin później, jaja zakażono 10 3 pfu wirusa WSN. Po dwóch dniach inkubacji w temperaturze 37 C zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa WSN przez test łysinek w komórkach MDCK. Wyniki są średnią z dwóch jaj. Figura 2. Indukcja odpowiedzi antywirusowej w zarodkach kurzych przez wirus delns1. Jaja kurze z zarodkami w wieku dziesięciu dni zaszczepiono PBS (nietraktowane) lub 2x10 4 pfu wirusa delns1 (traktowane delns1). Osiem godzin później jaja ponownie zakażono 10 3 pfu wirusa grypy A/WSN/33 (H1N1), wirusa grypy A/PR8/34 (H+N1), wirusa grypy A/K-31 (H3N2), wirusa grypy B/Lee/40 lub wirusa Sendai. Po dwóch dniach inkubacji zebrano płyn omoczniowy i określono miana wirusa przez test hemaglutynacji. Wyniki są średnią z dwóch jaj. Figura 3. Komórki CVI transfekowano plazmidem, wykazującym ekspresję IRF-3 poddanego fuzji z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP). Pozwoliło to na określenie lokalizacji IRF-3 wewnątrz komórek, przez mikroskopię fluorescencyjną. W niektórych przypadkach, plazmid ekspresyjny NS1 kotransfekowano plazmidem ekspresyjnym IRF-3, we wskazanych stosunkach. 24 Godziny po transfekcji, komórki zakażano wirusem PR8 (WT) lub delns1 przy wysokiej moi, zgodnie ze wskazaniami. 10 godzin po zakażeniu, komórki analizowano pod mikroskopem fluorescencyjnym pod względem lokalizacji IRF-3-GFP. Zaznaczono odsetek komórek wykazujących wyłącznie lokalizację cytoplazmatyczną (CYT) oraz komórek wykazujących lokalizację zarówno cytoplazmatyczną i jądrową IRF-3 (Nuc+Cyt). 5. Szczegółowy opis wynalazku Zgodnie z wynalazkiem opisano wytwarzanie, selekcję i identyfikację atenuowanych wirusów RNA o ujemnej nici, o zaburzonej zdolności do antagonizowania odpowiedzi komórkowej IFN, oraz zastosowania takich wirusów w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. Wirusy mogą być selekcjonowane z występujących naturalnie szczepów, odmian lub mutantów; wirusów mutagenizowanych (np. utworzonych przez ekspozycję na promieniowanie UV, mutageny,

8 8 PL B1 i/lub pasażowanie); reasortantów (w przypadku wirusów o segmentowanych genomach); i/lub wirusów genetycznie zmodyfikowanych. Przykładowo, wirusy zmutowane można wytworzyć przez naturalną zmienność, ekspozycję na promieniowanie UV, ekspozycję na mutageny chemiczne, przez pasażowanie w gospodarzach niedozwolonych, przez reasortację (czyli przez koinfekcję atenuowanego segmentowanego wirusa z innym szczepem, mającym żądane antygeny) i/lub przez genetyczne modyfikowanie (np. przy użyciu genetyki odwrotnej" (reverse genetics)). Wirusy selekcjonowane do stosowania w wynalazku, mają defektywną aktywność antagonizowania IFN i są atenuowane; czyli są one zakaźne i mogą replikować in vivo, lecz wytwarzają tylko niskie miana, wywołując poziom subkliniczny infekcji, który nie jest patogenny. Takie atenuowane wirusy są idealnymi kandydatami do żywych szczepionek. W specyficznej postaci realizacji, atenuowane wirusy selekcjonowane do stosowania w wynalazku, powinny być zdolne do indukcji silnej odpowiedzi IFN u gospodarza, cechy, która przyczynia się do wywoływania silnej odpowiedzi immunologicznej przy stosowaniu jako szczepionki, i która ma inne konsekwencje biologiczne, które czynią wirusy użytecznymi jako środki farmaceutyczne do profilaktyki i/lub leczenia innych zakażeń wirusowych, lub powstawania nowotworu u osób z wysokim ryzykiem, lub innych chorób, które leczy się IFN. Wynalazek opiera się częściowo na licznych stwierdzeniach i obserwacjach twórców wynalazku, dokonanych podczas pracy z mutantami wirusa grypy. Po pierwsze, odpowiedź IFN jest istotna dla zakażeń wirusowych in vivo. Twórcy wynalazku stwierdzili, że wzrost dzikiego typu wirusa grypy A/WSN/33 u myszy z niedoborem IFN (myszy STAT1 -/-) spowodował zakażenie wielonarządowe; czyli zakażenie wirusowe nie ograniczało się tylko do płuc, jak to się dzieje u myszy dzikiego typu, u których powstaje odpowiedź IFN (Garcia-Sastre i inni, 1993, J.Virol. 72: 8550, którą załącza się w całości jako odniesienie). Po drugie, twórcy wynalazku stwierdzili, że NS1 wirusa grypy działa jako antagonista IFN. Twórcy wynalazku stwierdzili, że mutant wirusa grypy z delecją całego genu NS1 (czyli knockout" NS1) nie był zdolny do wzrostu do wysokich mian w komórkach gospodarza kompetentnych pod względem IFN, i mógł się namnażać tylko w gospodarzach z niedoborem IFN. Wirus z wyłączonym NS1 przedstawiał fenotyp atenuowany (czyli był on letalny u myszy STAT1-/- bez IFN, lecz nie był u myszy dzikiego typu) i stwierdzono, że jest on silnym induktorem odpowiedzi IFN w komórkach gospodarza (Garcia-Sastre i inni 1998, Virology, 252: , którą załącza się w całości jako odniesienie). Wstępne zakażenie zmutowanym wirusem z wyłączeniem NS1 zmniejszało miana wirusów grypy dzikiego typu i innych (np. Sendai) nadkażonych w jajach kurzych z zarodkami. W innym doświadczeniu, zakażenie zmutowanym wirusem grypy z wyłączeniem NS1, zmniejszało tworzenie ognisk u zwierząt zaszczepionych komórkami nowotworowymi. Tak więc, wirus grypy z wyłączonym NS1 przedstawiał interesujące właściwości biologiczne. Jednakże, wirusy grypy z wyłączonym NS1 nie mogły się namnażać w konwencjonalnych układach do wytwarzania szczepionek. W celu przezwyciężenia tego problemu, twórcy wynalazku użyli i pracowali układy z niedoborem IFN, które pozwalają na wytwarzanie rozsądnych ilości atenuowanego wirusa. Zgodnie z wynalazkiem opracowano mutanty delecyjne NS, które nie mają wydeletowanego całego genu. Niespodziewanie okazało się, że te mutanty NS1 wykazują pośredni" fenotyp, wirus może rosnąć w konwencjonalnych gospodarzach stosowanych do namnażania wirusa grypy (choć wzrost jest lepszy w układach z niedoborem IFN, które dają wyższe miana). Najistotniejsze jest to, że mutanty delecyjne są atenuowane in vivo i indukują silną odpowiedź IFN. Szczepienie mutantami wirusa grypy ze skróconym NS1, powodowało niskie miana wirusa u zwierząt później prowokowanych wirusem dzikiego typu, i powodowało zabezpieczenie przed chorobą. Zgodnie z wynalazkiem opisano substraty z niedoborem interferonu do skutecznego hodowania mutantów wirusa grypy. Substratem z niedoborem interferonu może być taki substrat, który jest defektywny pod względem zdolności do wytwarzania lub odpowiedzi wobec interferonu. Substrat taki można stosować do hodowli każdej ilości wirusów, które mogą wymagać środowiska wzrostu nie zawierającego interferonu. Atenuowane wirusy według wynalazku mogą być zastosowane w szczepionkach i preparatach farmaceutycznych przeznaczonych dla ludzi i zwierząt. W szczególności, atenuowane wirusy można stosować jako szczepionki przeciw szerokiemu zakresowi wirusów lub innych patogenów zakaźnych (np. bakterii, pasożytów, grzybów) lub antygenów specyficznych wobec nowotworu. W innej postaci realizacji, atenuowane wirusy, które hamują replikację wirusową i tworzenie nowotworu, można stosować do profilaktyki lub leczenia infekcji (patogenów wirusowych lub niewirusowych) lub tworzenia nowotworu lub leczenia chorób, dla których zalecana jest terapia IFN. Można stosować wiele metod

9 PL B1 9 wprowadzania żywych atenuowanych preparatów wirusowych do podmiotu ludzkiego lub zwierzęcego celem indukcji odporności lub odpowiedniej odpowiedzi cytokinowej. Obejmują one, lecz bez ograniczenia, drogę donosową, dotchawiczą, doustną, przeskórną, domięśniową, dootrzewnową, dożylną i podskórną. W zalecanej postaci realizacji, atenuowane wirusy według niniejszego wynalazku można preparować w postać do dostarczania donosowego. 5.1 Wytwarzanie mutantów o zmienionej aktywności W antagonistycznej wobec IFN Można wyselekcjonować występujące naturalnie mutanty lub odmiany, albo mutanty spontaniczne, które posiadają zaburzoną zdolność do antagonizacji komórkowej odpowiedzi wobec IFN. Zmutowane wirusy można wytworzyć przez ekspozycję wirusa wobec i mutagenów, takich jak promieniowanie ultrafioletowe lub mutageny chemiczne, lub przez wielokrotne pasażowanie i/lub pasaż w niedozwolonym gospodarzu. Skrining w różnicującym układzie wzrostowym można stosować do selekcji pod względem tych mutantów, które mają zaburzoną funkcję antagonistyczną wobec IFN. W przypadku wirusów grypy o genomie segmentowanym, fenotyp atenuowany można przenieść do innego szczepu, mającego żądany antygen, przez reasortację (czyli koinfekcję atenuowanego wirusa i żądanego szczepu oraz selekcję reasortantów wykazujących oba fenotypy). Do wirusa grypy można wprowadzić mutacje, stosując podejścia genetyki odwrotnej". W ten sposób, mutacje naturalne lub inne, które nadają fenotyp atenuowany, można wbudować w szczepy do szczepionek. Przykładowo, można wbudować delecje, insercje lub substytucje regionu kodującego odpowiedzialnego za aktywność antagonistyczną wobec IFN (tak jak NS1 wirusa grypy). Zgodnie z wynalazkiem zastosować można także mutacje w stosunku do segmentu genu NS1, które niekoniecznie wynikają ze zmiany aktywności antagonistycznej wobec IFN lub fenotypu indukującego IFN, lecz raczej wywołują zmiany funkcji wirusowych i fenotyp atenuowany np. zmianę inhibicji eksportu jądrowego mrna zawierającego poli(a), zmianę inhibicji splicingu pre-mrna, zmianę inhibicji aktywacji PKR przez sekwestrację dsrna, zmianę wpływu na translację RNA wirusa i zmianę inhibicji poliadenylacji mrna gospodarza (np. patrz Krug w Textbook of Influenza, Nicholson i inni, wydawca, 1998, i odniesienia tam cytowane). Technika odwrotnej genetyki obejmuje wytwarzanie syntetycznych rekombinowanych wirusów RNA, które zawierają regiony niekodujące ujemnej nici wirusa RNA, które są zasadnicze dla rozpoznania przez polimerazy wirusowe i dla sygnałów upakowania koniecznych do wytworzenia dojrzałego wirionu. Rekombinowane RNA syntetyzuje się z rekombinowanej matrycy DNA i odtwarza in vitro z kompleksem oczyszczonej polimerazy wirusowej, tworząc rekombinowane rybonukleoproteiny (RNP), które można stosować do transfekcji komórek. Skuteczniejszą transfekcję uzyskuje się jeśli białka polimerazy wirusowej są obecne podczas transkrypcji syntetycznego RNA albo in vitro, albo in vivo. Syntetyczne rekombinowane RNP można odtworzyć do zakaźnych cząstek wirusowych. Powyższe techniki opisano w opisie patentowym U.S nr 5,166,057 złożonym 25 listopada 1992; opisie patentowym U.S nr 5,854,037 złożonym 29 grudnia 1998; w europejskiej publikacji patentowej EP A1, opublikowanej 20 lutego 1996; w zgłoszeniu patentowym U.S numer 09/152,345; w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT WO97/12032 opublikowanym 3 kwietnia 1997; WO96/34625 opublikowanym 7 listopada 1996; w europejskiej publikacji patentowej EP-A780475; WO99/02625 opublikowanej 21 stycznia 1999; WO98/53078 opublikowanej 26 listopada 1998; WO98/02530 opublikowanej 22 stycznia 1998; WO99/15672 opublikowanej 1 kwietnia 1999; WO98/13501 opublikowanej 2 kwietnia 1998; WO97/06270 opublikowanej 20 lutego 1997; oraz EPO SA1 opublikowanej 25 czerwca 1997, z których wszystkie załącza się w całości jako odniesienie. Atenuowane wirusy wytworzone z użyciem podejścia odwrotnej genetyki można stosować w opisanych tu szczepionkach i preparatach farmaceutycznych. Techniki odwrotnej genetyki można także stosować do wprowadzania dodatkowych mutacji w innych genach wirusowych, istotnych dla produkcji szczepionki, to jest do atenuowanego wirusa można wbudować epitopy użytecznych odmian szczepów do szczepionek. Alternatywnie, do atenuowanego szczepu można wbudować całkiem obce epitopy, włączając antygeny pochodzące od innych patogenów wirusowych lub niewirusowych. Przykładowo, do atenuowanego szczepu można wbudować antygeny nie spokrewnionych wirusów, takich jak HIV (gp160, gp120, gp41), antygeny pasożytów (np. malarii), antygeny bakteryjne lub grzybowe albo antygeny nowotworowe. Alternatywnie, do atenuowanych wirusów według wynalazku można wbudować epitopy, które zmieniają tropizm wirusa in vivo. W zamiennej postaci realizacji, do zbudowania atenuowanych wirusów mających żądane epitopy w wirusach o segmentowanym RNA, można użyć połączenie techniki odwrotnej genetyki i reasor-

10 10 PL B1 tacji. Przykładowo, atenuowany wirus (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę odwrotnej genetyki) oraz szczep niosący żądany epitop szczepionki (utworzony przez naturalną selekcję, mutagenezę lub technikę odwrotnej genetyki), można koinfekować w gospodarzu, który pozwala na reasortację segmentowanych W genomów. Następnie można wyselekcjonować reasortanty, które wykazują zarówno fenotyp atenuowany jak żądany epitop. W zalecanej postaci realizacji genetycznie zmodyfikowane wirusy grypy zawierają delecje i/lub skrócenia produktu genowego NS1. Szczególnie zalecane są mutanty NS1 grypy A i B. W jednym podejściu, części regionu aminoterminalnego produktu genowego NS1 są utrzymywane, podczas gdy region C-terminalny produktu genowego NS1, usuwa się. Specyficzne żądane mutacje można konstruować poprzez A insercję kwasu nukleinowego, delecje, lub mutację w odpowiednim kodonie. W szczególności, skrócone białka NS1 mają od 1-60 aminokwasów, 1-70 aminokwasów, 1-80 aminokwasów, 1-90 aminokwasów (aminokwas N-terminalny oznacza 1); od aminokwasów; a korzystnie 99 aminokwasów; od aminokwasów; od aminokwasów; lub od aminokwasów, a korzystnie 124 aminokwasy produktu dzikiego typu genu NS1. Zgodnie z wynalazkiem w wirusie grypy produkt genowy NS1 może być zmodyfikowany przez skrócenie lub modyfikację białka NS1, co zmutowanym wirusom nadaje następujące fenotypy: zdolność wirusów do wzrostu do wysokich mian w substratach niekonwencjonalnych, takich jak jaja kurze z zarodkami w wieku 6-7 dni, lub zdolność wirusów do indukcji odpowiedzi interferonowej gospodarza. Dla wirusów grypy A, obejmują one, lecz bez ograniczenia: wirusy, mające skrócenia NS1. Zgodnie z wynalazkiem mogą być zastosowane naturalnie występujące zmutowane wirusy grypy A lub B, mające fenotyp atenuowany, jak również szczepy wirusa grypy zmodyfikowane tak, aby zawierały takie mutacje odpowiedzialne za fenotyp atenuowany. Atenuowany wirus grypy można ponadto zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję antygenów innych szczepów do szczepienia (np. przy użyciu genetyki odwrotnej lub reasortacji). Alternatywnie, atenuowany wirus grypy można przy użyciu odwrotnej genetyki lub reasortacji z genetycznie zbudowanymi wirusami zmodyfikować tak, aby wykazywał ekspresję całkowicie obcych epitopów, np. antygenów innych patogenów zakaźnych, antygenów nowotworowych lub antygenów kierunkujących. Ponieważ segment RNA NS jest najkrótszy wśród ośmiu RNA wirusowych, możliwe jest, że RNA NS będzie tolerować dłuższe insercje sekwencji heterologicznych niż inne geny wirusowe. Ponadto, segment RNA NS kieruje syntezę dużych ilości białka w zakażonych komórkach, sugerując, że byłby to idealny segment do insercji obcych antygenów. Jednakże, zgodnie z niniejszym wynalazkiem, każdy z ośmiu segmentów wirusów grypy można stosować do insercji sekwencji heterologicznych. Przykładowo, jeśli pożądana jest prezentacja antygenu powierzchniowego, można użyć segmenty kodujące białka strukturalne np. HA lub NA. 5.2 Układ selekcji oparty na restrykcji gospodarza Zgodnie z wynalazkiem można selekcjonować wirusy, które posiadają żądany fenotyp, czyli wirusy, które posiadają niską lub brak aktywności antagonistycznej wobec IFN, otrzymane z naturalnych odmian, odmian spontanicznych (czyli odmian, które ewoluują podczas namnażania wirusa), mutagenizowanych naturalnych odmian, reasortantów i/lub genetycznie zmodyfikowanych wirusów. Takie wirusy można najlepiej przesiewać w testach wzrostu różnicującego, które porównują wzrost w układach z niedoborem IFN wzglądem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN. Wybiera się wirusy, które wykazują lepszy wzrost w układach z niedoborem IFN względem układów gospodarza kompetentnych pod względem IFN; dogodnie, wybiera się wirusy, które rosną do mian co najmniej jeden logarytm wyższy w układach z niedoborem IFN w porównaniu z układem kompetentnym pod względem IFN. Alternatywnie, wirusy można przesiewać przy użyciu układów testowych IFN, np. układów testowych opartych na transkrypcji, w których ekspresja genu reporterowego jest kontrolowana przez promotor odpowiadający na IFN. Ekspresję genu reporterowego w komórkach zakażonych względem niezakażonych można mierzyć w celu identyfikacji wirusów, które skutecznie indukują odpowiedź wobec IFN, lecz które są niezdolne do antagonizacji odpowiedzi IFN. Jednak w zalecanej postaci realizacji, stosuje się testy wzrostu różnicującego do selekcji wirusów, mających żądany fenotyp, ponieważ stosowany układ gospodarza (kompetentny pod względem IFN przeciwko niedoborowi IFN) stosuje odpowiednią presję selekcyjną. Przykładowo, wzrost wirusa (mierzony przez miano) można porównać z różnymi komórkami liniami komórkowymi, lub zwierzęcych układach modelowych, które wykazują ekspresję IFN oraz składników odpowiedzi IFN. W tym celu, można porównać wzrost wirusa w liniach komórkowych, ta-

11 PL B1 11 kich jak linie VERO (które wykazują niedobór IFN) względem komórek MDCK (które są kompetentne pod względem IFN). Alternatywnie, można otrzymać i ustalić linie komórkowe z niedoborem IFN od zwierząt hodowanych lub genetycznie zmodyfikowanych, aby wykazywały niedobór w układzie IFN (np. zmutowane myszy STAT1 -/-). Można mierzyć wzrost wirusa w takich liniach komórkowych, w porównaniu z komórkami kompetentnymi pod względem IFN, otrzymanymi np. od zwierząt dzikiego typu (np. myszy dzikiego typu). W jeszcze innej postaci realizacji można zmodyfikować linie komórkowe, które są kompetentne pod względem IFN i wiadomo, że podtrzymują wzrost wirusa dzikiego typu tak, aby wykazywały niedobór IFN (np. przez wyłączenie STAT1, IRF3, PKR itd). Można stosować sposoby, które są dobrze znane w technice namnażania wirusów w liniach komórkowych (patrz np. przykłady działania poniżej). Można porównać wzrost wirusa w standardowej kompetentnej pod względem IFN linii komórkowej względem genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej z niedoborem IFN. Można także stosować układy zwierzęce. Przykładowo dla grypy, można porównać wzrost w młodych jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN, np. około 6 do 8-dniowych, ze wzrostem w starszych jajach z zarodkami, kompetentnych pod względem IFN, np. około 10 do 12 dniowych. W tym celu można stosować sposoby dobrze znane w technice dla zakażania i namnażania w jajach (np. patrz przykłady działania poniżej). Alternatywnie, można porównać wzrost u myszy z niedoborem IFN STAT1-/-, ze wzrostem u myszy dzikiego typu kompetentnych pod względem IFN. W jeszcze innej alternatywnej realizacji, można porównać wzrost w jajach kurzych z zarodkami z niedoborem IFN wytworzonych przez np. transgeniczny drób STAT1-/-, ze wzrostem w jajach kompetentnych pod względem IFN, wytworzonych przez drób dzikiego typu. Jednak do celów skriningu można stosować układy krótkotrwałe z niedoborem IFN, zamiast układów zmodyfikowanych genetycznie. Przykładowo, układ gospodarza można traktować związkami, które hamują wytwarzanie IFN i/lub składników odpowiedzi IFN (np. leki, przeciwciała przeciwko IFN, przeciwciała przeciwko receptorowi IFN, inhibitory PKR, cząsteczki antysensowne i rybozymy, itd). Wzrost wirusa można porównać w nietraktowanych kontrolach kompetentnych pod względem IFN, względem układów traktowanych, z niedoborem IFN. Przykładowo, starsze jaja kompetentne pod względem IFN można wstępnie traktować takimi lekami przed zakażeniem przesiewanym wirusem. Wzrost porównuje się ze wzrostem uzyskanym w nietraktowanych jajach kontrolnych w tym samym wieku. Opisane tu sposoby skriningu zapewniają prosty i łatwy przesiew w celu identyfikacji zmutowanych wirusów o zniesionej aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez niezdolność zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku odpowiadającym na IFN, w porównaniu ze zdolnością zmutowanego wirusa do wzrostu w środowisku z niedoborem IFN. Opisane tu sposoby skriningu można także stosować do identyfikacji zmutowanych wirusów o zmienionej, lecz nie zniesionej, aktywności antagonistycznej wobec IFN, przez pomiar zdolności zmutowanego wirusa do wzrostu zarówno w odpowiadających na IFN, np. 10-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach MDCK, jak i środowiskach z niedoborem IFN, np. 6 do 7-dniowych jajach z zarodkami lub komórkach VERO. Przykładowo, wirusy grypy, wykazujące co najmniej jeden logarytm niższe miana w 10-dniowych zarodkach w stosunku do 6-7-dniowych zarodków, będą uważane za posiadające zakłóconą zdolność do hamowania odpowiedzi wobec IFN. W innym przykładzie, wirusy grypy, wykazujące co najmniej jeden logarytm mniejsze miano u 12-dniowych zarodków (które wykazują wysoką odpowiedź wobec IFN) w stosunku do 10-dniowych zarodków (które wykazują średnią odpowiedź wobec IFN) uznaje się za częściowo zakłóconą pod względem zdolności do antagonizacji odpowiedzi IFN i uznaje się za atrakcyjnych kandydatów do szczepionki. Opisane tu sposoby selekcji obejmują także identyfikację tych zmutowanych wirusów, które indukują odpowiedzi wobec IFN. Zgodnie z opisanymi tu sposobami selekcji, indukcję odpowiedzi wobec IFN można mierzyć przez testowanie poziomu ekspresji IFN lub ekspresji genów docelowych lub genów reporterowych indukowanych przez IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem lub aktywacji transaktywatorów związanych z ekspresją IFN i/lub odpowiedzią IFN. Indukcję odpowiedzi IFN można określać przez pomiar stanu fosforylacji składników szlaku IFN po zakażeniu testowanym zmutowanym wirusem, np. IRF-3, który jest ufosforylowany w odpowiedzi na podwójną nić RNA. W odpowiedzi na IFN typu I, następuje szybka fosforylacja tyrozyny kinazy Jaki i kinazy TyK2, podjednostek receptora IFN, STAT1 i STAT2. Tak więc, w celu określenia czy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN, komórki, takie jak komórka 293, zakaża się testowanym zmutowanym wirusem i po infekcji komórki poddaje się lizie. Składniki szlaku IFN, takie jak kinaza Jak1, lub kinaza TyK2 poddaje się immunoprecypitacji z lizatów zakażonych komórek, przy użyciu specyficznych surowic poliklonalnych lub przeciwciał, i określa stan fosforylacji tyrozyny kinazy przez testy odci-

12 12 PL B1 sku immunologicznego z użyciem przeciwciała antyfosfotyrozynowego (np. patrz Krishnan i inni 1997., Eur. J.Biochem.247: ) Stan podniesionej fosforylacji jakiegokolwiek składnika szlaku IFN po zakażeniu zmutowanym wirusem będzie wskazywać na indukcję odpowiedzi IFN przez zmutowanego wirusa. Opisane tu układy selekcji obejmują pomiar zdolności do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcyjnych indukowanej w odpowiedzi na infekcję wirusową, np. IRF3, STAT1, STAT2 itd. W szczególności, STAT1 i STAT2 są ufosforylowane i translokowane z cytoplazmy do jądra w odpowiedzi na IFN typu I. Zdolność do wiązania specyficznych sekwencji DNA lub translokacji czynników transkrypcyjnych można mierzyć technikami znanymi fachowcom, np. testami EMSA (Electromobility Shift Assay), barwieniem komórek itd. Indukcję odpowiedzi IFN można określić przez pomiar aktywacji transkrypcji zależnej od IFN po zakażeniu testowym zmutowanym wirusem. Ekspresję genów, o których wiadomo, że są indukowane przez IFN, np. Mx, PKR, 2-5-oligoadenylanosyntetazy, głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I, itd., można analizować technikami znanymi fachowcom (np. hybrydyzacji typu Northern blot, Western blot, PCR itd.). Alternatywnie, testowane komórki, takie jak ludzkie komórki zarodkowe nerek lub ludzkie komórki mięsaka kościotwórczego, modyfikuje się tak, aby wykazywały krótkotrwałą lub konstytutywną ekspresję genów reporterowych, takich jak gen reporterowy lucyferazy lub gen reporterowy transferazy chloramfenikolowej (CAT) pod kontrolą elementu odpowiedzi stymulowanej IFN, takiego jak promotor stymulowany IFN genu ISG-54K (Bluyssen i inni 1994, Eur.J.Biochem. 220: ). Komórki zakaża się testowym zmutowanym wirusem i poziom ekspresji genu reporterowego porównuje z komórkami niezakażonymi lub komórkami zakażonymi wirusem dzikiego typu. Zwiększenie poziomu ekspresji genu reporterowego po zakażeniu testowym wirusem będzie wskazywać, że testowy zmutowany wirus indukuje odpowiedź IFN. Opisane tu układy selekcji obejmują pomiar indukcji IFN przez określenie czy ekstrakt z komórek lub jaj zakażonych testowym zmutowanym wirusem jest zdolny do nadawania aktywności zabezpieczającej przeciw infekcji wirusowej. Konkretniej, grupy 10-dniowych jaj kurzych z zarodkami zakaża się testowym zmutowanym wirusem lub wirusem dzikiego typu. Około 15 do 20 godzin po zakażeniu, zbiera się płyn omoczniowy i testuje pod względem aktywności IFN, przez określenie najwyższego rozcieńczenia z zabezpieczającą aktywnością przed infekcją VSV w komórkach hodowli tkankowej, takich jak komórki CEF. 5.3 Namnażanie wirusa w substratach wzrostowych z niedoborem interferonu Do hodowli i izolacji zmodyfikowanych zmutowanych wirusów o zmienionej aktywności antagonistycznej wobec IFN zastosować można także sposoby i substraty z niedoborem IFN. Substraty z niedoborem IFN, które można stosować do podtrzymywania wzrostu atenuowanych zmutowanych wirusów obejmują, lecz bez ograniczenia, naturalnie występujące komórki, linie komórkowe, zwierzęta lub jaja z zarodkami, które wykazują niedobór IFN, np. komórki Vero, młode jaja z zarodkami; rekombinowane komórki lub linie komórkowe, które są tak zmodyfikowane, aby wykazywały niedobór IFN, np. linie komórkowe z niedoborem IFN pochodzące od myszy z wyłączeniem STAT1 lub innych podobnie zmodyfikowanych zwierząt transgenicznych; jaja z zarodkami otrzymane od ptaków z niedoborem IFN, zwłaszcza drobiu (np. kur, kaczek, indyków), łącznie ze stadem hodowanym tak, aby wykazywało niedobór IFN, lub ptaków transgenicznych (np. z wyłączeniem STAT1). Alternatywnie, układ komórek gospodarza, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można genetycznie zmodyfikować tak, aby wykazywały ekspresję transgenów, kodujących inhibitory układu IFN, np. dominujące mutanty ujemne, takie jak STAT1 bez domeny wiążącej DNA, antysensowny RNA, rybozymy, inhibitory wytwarzania IFN, inhibitory sygnału IFN i/lub inhibitory genów antywirusowych indukowanych przez IFN. Należy pamiętać, że zwierzęta, które są hodowane lub genetycznie zmodyfikowane tak, aby wykazywały niedobór IFN, będą wykazywać nieco obniżoną odporność immunologiczną, i powinny być utrzymywane w kontrolowanym środowisku pozbawionym chorób. Tak więc powinny być przedsięwzięte odpowiednie pomiary (włączając stosowanie antybiotyków w W diecie), aby ograniczyć ryzyko ekspozycji na czynniki zakaźne zwierząt transgenicznych z niedoborem IFN, takich jak stada kur hodowlanych, kaczek indyków, itd. Alternatywnie, układ gospodarza, np. komórki, linie komórkowe, jaja lub zwierzęta można traktować związkiem, który hamuje wytwarzanie IFN i/lub szlak IFN, np. lekami, przeciwciałami, cząsteczkami antysensownymi, cząsteczkami rybozymowymi ukierunkowanymi na gen STAT1 i/lub genami antywirusowymi indukowanymi przez IFN. Niedojrzałe jaja kurze z zarodkami obejmują jaja, które naturalnie są w wieku poniżej dziesięciu dni, korzystnie sześć do dziewięciu dni; oraz jaja, które sztucznie naśladują niedojrzałe jaja w wieku