(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 175610"

Transkrypt

1 R ZECZPO SPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US91/08272 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO92/08734, PCT Gazette nr 12/92 (51) IntCl6: A61K 37/10 C12N 15/00 Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) (54) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej (30) Pierwszeństwo: ,US, ,US,07/ (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 08/94 ( 7 3 ) Uprawniony z patentu: Chiron Corporation, Emeryville, US (72) Twórcy wynalazku: Robert O. Ralston, Danville, US Frank Marcus, Danville, US Kent B. Thudium, Oakland, US Barbara A. Gervase, Vallejo, US John A. Hall, Rohnert Park, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/99 (74) Pełnomocnik: Ponikiewski Andrzej, POLSERVICE P L B 1 (57)1. Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej, obejmujący hodowanie komórki gospodarza stransformowanej genem strukturalnym kodującym proteinę HCV w odpowiedniej pożywce hodowlanej, doprowadzenie do ekspresji tego genu strukturalnego i izolowanie tej proteiny HCV z hodowli komórkowej, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania proteiny HCV proteinę tą stanowi asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E1 genomu HCV, asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E2 genomu HCV i ich agregaty, przy czym ekspresję prowadzi się w warunkach hamujących si alację a izolację prowadzi się, kontrolując hodowlę komórkową z białkiem wiążącym mannozę, specyficznym dla glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą.

2 Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej, obejmujący hodowanie komórki gospodarza stransformowanej genem strukturalnym kodującym proteinę HCV w odpowiedniej pożywce hodowlanej, doprowadzenie do ekspresji tego genu strukturalnego i izolowanie tej proteiny HCV z hodowli komórkowej, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania proteiny HCV proteinę tą stanowi asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E 1 genomu HCV, asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E2 genomu HCV i ich agregaty, przy czym ekspresję prowadzi się w warunkach hamujących sjalację a izolację prowadzi się, kontrolując hodowlę komórkową z białkiem wiążącym mannozę, specyficznym dla glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki pochodzenia ssaczego. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że warunki hamujące sialację obejmują obecność wystarczających ilości modulatora wapnia do spowodowania uwalniania białek w retikulum endoplazmatycznym. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że warunki hamujące sjalację obejmują ekspresję asialoglikoprotein na poziomie wystarczającym do hamowania transportu glikoprotein z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgiego. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako białko wiążące mannozę stosuje się lektynę wybraną z ConA i GNA. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że białko wiążące mannozę jest unieruchomione na podłożu. 7. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako modulator wapnia stosuje się modulator wybrany z grupy zawierającej thapsigargin albo EGTA (kwas etylenoglikolo-bis[eter beta-aminoetylowy]n,n,n,n -tetraoctowy). 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresję asialoglikoproteiny prowadzi się z regionu E 1 HCV. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ekspresję asialoglikoproteiny prowadzi się z regionu E2 HCV. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że asialoglikoproteinę stanowi agregat E1/E Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kontaktowanie prowadzi się, inkubując hodowlę komórkową zawierającą asialoglikoproteinę HCV w kolumnie zawierającej unieruchomioną na podłożu lektynę wiążącą mannozę, w ciągu co najmniej 1 godziny i izoluje się tą związaną część asialoglikoproteiny przez eluowanie mannozą. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej. Asialoglikoproteiny, należące do glikoprotein, nadają się do stosowania w diagnozowaniu, leczeniu i profilaktyce infekcji wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV). Wirusowe zapalenie wątroby typu nie-a i nie-b (NANBH) stanowi chorobę zakaźną lub grupę chorób, o których wiadomo, że wywołują je wirusy, i że można je odróżnić od innych wirusowych chorób wątroby obejmujących choroby spowodowane przez wirusa zapalenia

3 wątroby typu A (HAV), wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV), wirusa zapalenia wątroby typu delta (HDV), a także od zapalenia wątroby wywołanego przez cytomegalowirusa (CMV) lub przez wirusa Epste ina-barra (EBV). Dane epidemiologie sugerują, że istnieją trzy typy NANBH: typ epidemiczny rozprze strzeniający się drogą wodną, typ rozprzestrzeniający się przez krew lub igłę i rzadko występujący typ nabyty w grupie. Liczba czynników, które mogą powodować NANBH jest nieznana. Ostatnio zidentyfikowano jako główną przyczynę (jeśli nie jedyną) zapalenia wątroby typu nie-a i nie-b (NANBH) nowy gatunek wirusa, wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) rozprzestrzeniającego się przez krew (BB-NANBH). Patrz na przykład: międzynarodowa publikacja nr WO89/ W wielu krajach lub regionach obejmujących Stany Zjednoczone Ameryki, Europę i Japonię, zapalenie wątroby typu C stanowi główną postać potransfuzyjnego zapalenia wątroby. Są także dowody sugerujące udział HCV w wywoływaniu raka komórek wątroby. Tak więc istnieje potrzeba dysponowania skutecznym sposobem zapobiegania i leczenia infekcji wirusem HCV. Istnieje poważne zapotrzebowanie na czułe, specyficzne sposoby skriningu i identyfikacji nośników HCV i krwi zakażonej HCV lub produktów z takiej krwi. Potransfuzyjne zapalenie wątroby (PTH) występujące u około 10% pacjentów poddanych transfuzji, a HCV stanowi przyczynę do 90% tych przypadków. Głównym problemem tej choroby jest często występujący rozwój chronicznego uszkodzenia wątroby (25-55% ). Leczenie jak również zapobieganie przenoszeniu HCV przez krew i jej produkty lub przez bliski kontakt osobisty wymaga możliwości wykrywania kwasów nukleinowych, antygenów i przeciwciał związanych z HCV, które to wykrywanie stanowiłoby środek niezawodnego diagnozowania i prognozowania. Ponadto istnieje zapotrzebowanie na skuteczne szczepionki i immunoterapeutyczne środki lecznicze zapobiegające i leczące tę chorobę. Okazuje się, że wirus HCV występuje we krwi zakażonych osobników w bardzo niskich stężeniach w porównaniu z innymi wirusami zakażającymi, co czyni go bardzo trudnym do wykrycia. Niskie stężenie wirusa stanowi prawdopodobnie główną przyczynę tego, że czynnik powodujący zapalenie wątroby typu nie-a i nie-b (NANBH) pozostawał tak długo nieznany. Nawet, jeśli ostatnio został on sklonowany, w dalszym ciągu występują trudności w jego hodowaniu i namnażaniu. Dlatego też istnieje silne zapotrzebowanie na rekombinacyjne sposoby wytwarzania diagnostycznych/leczniczych/profilaktycznych białek HCV. Ponadto istnieje zapotrzebowanie na szczepionkę przeciwko HCV. Jednakże, wyhodowanie HCV w liniach komórkowych jest wyjątkowo trudne. Tak więc, nie jest obecnie możliwe wytwarzanie atenuowanych szczepów wirusowych przez kolejne pasażowanie w hodowli tkankowej/komórkowej. Obecnie odkryto, że dwa białka HCV, E1 i E2 są związanymi z błoną komórkową asialoglikoproteinami jeśli ulegają ekspresji w rekombinowanych układach. Jest to zadziwiające, ponieważ zwykle u ssaków glikoproteiny nie pozostają w postaci z przyłączoną na końcu mannozą, stanowi na ogół jedynie postać przejściową. W przypadku białek E 1 i E2 (ulegających ekspresji w sposobie według wynalazku), asialoglikoproteina wydaje się stanowić postać końcową. E1 (białko otoczki 1) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej wynoszącej około 35000, powstającą w wyniku translacji przypuszczalnego regionu E1 genomu HCV. E2 (białko otoczki 2) jest glikoproteiną o masie cząsteczkowej wynoszącej około 72000, powstającą w wyniku translacji przypuszczalnego regionu NS1 (niestru kturalne białko 1) genomu HCV, co stwierdzono w oparciu o flawiwirusowy model HCV. Z uwagi na to, że glikoproteiny są często wysoce immunogenne, E 1 i E2 będą głównymi kandydatami do stosowania w próbkach immunologicznych i jako lecznicze/profilaktyczne szczepionki. Odkrycie, że E1 i E2 nie zawierają reszt kwasu sialowego, jest bardzo ważne. Szczególna postać białka często decyduje o tym, jakie komórki mogą służyć jako odpowiedni gospodarze ekspresji na drodze rekombinacji. Komórki prokariotyczne, takie jak E. coli, nie glikozylują białek i zwykle nie nadają się do wytwarzania glikoprotein przeznaczonych do stosowania jako antygeny, ponieważ często glikozylacja jest istotna dla pełnej antygenowości, rozpuszczalności i trwałości białka. Niższe eukarionty, takie jak drożdże i grzyby, glikozylują białka, lecz zwykle nie są zdolne do przyłączania końcowych reszt kwasu sialowego do kompleksów z węglowoda-

4 nami. Zatem białka pochodzenia drożdżowego mogą różnić się pod względem antygenowości od ich odpowiedników występujących naturalnie (nierekombinowanych). Jeśli istotna jest antygenowość produktu, preferuje się ekspresję w komórkach ssaczych, ponieważ w takim przypadku glikozylacja mogłaby bardzo upodobnić rekombinowane białko do wirusowych białek dzikiego typu. Najnowsze dowody wskazują na to, że podczas zakażenia wirus HCV może z powodzeniem wtargnąć do komórek gospodarza poprzez receptor asialoglikoproteinowy znaleziony na hepatocytach, albo poprzez receptor mannozowy znaleziony na komórkach śródbłonkowych wątroby i makrofagach (zwłaszcza na komórkach Kupffera). Nieoczekiwanie okazało się, że większość naturalnych białek E 1 i E2 nie zawiera końcowych reszt kwasu sialowego, białka te są glikozylowane jedynie w części rdzeniowej. Mała część zawiera dodatkowo końcową N-acetyloglukozaminę. Zatem, celem wynalazku jest dostarczenie glikoprotein otoczki HCV pozbawionych wszystkich lub zasadniczo wszystkich końcowych reszt kwasu sialowego. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania proteiny wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV) nadającej się do stosowania w szczepionce lub w próbie immunologicznej, obejmujący hodowanie komórki gospodarza stransformowanej genem strukturalnym kodującym proteinę HCV w odpowiedniej pożywce hodowlanej, doprowadzenie do ekspresji tego genu strukturalnego i izolowanie tej proteiny HCV z hodowli komórkowej, polegający na tym, że w przypadku wytwarzania proteiny HCV proteinę tą stanowi asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E1 genomu HCV, asialoglikoproteina będąca wynikiem ekspresji regionu E2 genomu HCV i ich agregaty, przy czym ekspresję prowadzi się w warunkach hamujących sjalację a izolację prowadzi się, kontaktując hodowlę komórkową z białkiem wiążącym mannozę, specyficznym dla glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą. Korzystnie w sposobie według wynalazku jako komórki gospodarza stosuje się komórki pochodzenia ssaczego. Stosowane w sposobie według wynalazku warunki hamujące sialację korzystnie obejmują obecność wystarczających ilości modulatora wapnia do spowodowania uwalniania białek w retikulum endoplazmatycznym. Również korzystnie warunki hamujące sjalację obejmują ekspresję asialoglikoprotein na poziomie wystarczającym do hamowania transportu glikoprotein z retikulum endoplazmaty cznego do aparatu Golgiego. W sposobie według wynalazku korzystnie jako białko wiążące mannozę stosuje się lektynę wybraną z ConA i GNA. Jeszcze bardziej korzystne warunki są zapewnione, gdy białko wiążące mannozę jest unieruchomione na podłożu. Jako modulator wapnia korzystnie stosuje się modulator wybrany z grupy zawierającej thapsigargin albo EGTA (kwas etylenoglikolo-bis[eter beta-aminoetylowy]n,n,n',n'-tetraoctowy). W sposobie według wynalazku ekspresję asialoglikoproteiny korzystnie prowadzi się z regionu E1 HCV lub z regionu E2 HCV. Również korzystnie asialoglikoproteinę może stanowić agregat E1/E2. W korzystnym wykonaniu tego sposobu według wynalazku, kontaktowanie prowadzi się, inkubując hodowlę komórkową zawierającą asialoglikoproteinę HCV w kolumnie zawierającej unieruchomioną na podłożu lektynę wiążącą mannozę, w ciągu co najmniej 1 godziny i izoluje się tą związaną część asialoglikoproteiny przez eluowanie mannozą. Termin "asialoglikoproteina" oznacza glikozylowaną proteinę zasadniczo pozbawioną reszt kwasu sialowego. Asialoglikoproteiny można wytworzyć na drodze rekombinacji lub przez oczyszczanie z hodowli komórkowej lub ze źródeł naturalnych. Asialoglikoproteiny otrzymywane w sposobie według wynalazku pochodzą od wirusa HCV, korzystnie są to białka E 1 i E2, najkorzystniej rekombinowane białka E1 i E2 (re1 i re2). Według powyższej definicji, proteina zasadniczo pozbawiona jest kwasu sialowego, jeśli liczba reszt kwasu sialowego zasadniczo nie przeszkadza w wiązaniu się glikoproteiny z białkami wiążącymi mannozę, takimi jak GNA. Taki stopień sialacji ma zwykle miejsce w przypadku, gdy kwas sialowy stanowi mniej niż około 40% wszystkich węglowodanów związanych poprzez wiązanie N-glikozydowe, korzystnie mniej niż około 30%, korzystniej mniej niż około 20%, a jeszcze korzystniej mniej niż około 10%, jeszcze korzystniej mniej niż około 5%, a najkorzystniej mniej niż około 2%.

5 Stosowane tu określenie "E1" oznacza proteinę lub polipeptyd eksprymowany w obrębie pierwszych 400 aminokwasów poliproteiny HCV, czasami określany jako proteina E lub S. W swojej naturalnej postaci jest to glikoproteina o masie 35000, silnie związana z błoną komórkową. W większości naturalnych szczepów HCV proteina E 1 kodowana jest po białku C (rdzeniowym) wirusowej poliproteiny. Proteina E 1 rozciąga się od aminokwasu około 192 do aminokwasu około 383 poliproteiny o pełnej długości. Określenie "E1" obejmuje także analogi i skrócone mutanty reaktywne w krzyżowej reakcji immunologicznej wobec naturalnej proteiny E 1. Stosowane tu określenie "E2" oznacza proteinę lub polipeptyd eksprymowany w obrębie pierwszych 900 aminokwasów poliproteiny HCV, czasami określany jak proteina N S1. W swojej naturalnej postaci jest to glikoproteina o masie 72000, silnie związana z błoną komórkową. W większości naturalnych szczepów HCV proteina E2 następuje po proteinie E 1. Proteina E2 rozciąga się od aminokwasu około 384 do aminokwasu około 820. Określenie "E2" obejmuje także analogi i skrócone mutanty reaktywne w krzyżowej reakcji immunologicznej wobec naturalnej proteiny E2. Stosowane tu określenie "agregat" oznacza kompleks E 1 i/lub E2 zawierający więcej niż jeden monomer E 1 lub E2. W kontekście tej definicji, agregatami są dimery E 1:E1, E2:E2 oraz heterodimery E1:E2. Kompozycje glikoprotein mogą także obejmować większe agregaty, których masy cząsteczkowe przewyższają 800 kda. Stosowane tu określenie "cząstka" oznacza agregat E 1, E2 lub E1/E2 widziany pod mikroskopem elektronowym i o średnicy wynoszącej co najmniej 20 Tm. Cząstki mają w przybliżeniu kulisty kształt i średnicę wynoszącą około 40 nm pod mikroskopem elektronowym. Określenie "oczyszczony" stosowane tu do protein dotyczy takiej kompozycji protein, w której pożądana proteina stanowi co najmniej 35% wszystkich składników białkowych danej kompozycji. Pożądana proteina stanowi co najmniej 40%, lub co najmniej około 50%, lub co najmniej około 60%, lub około 70%, lub 80%, lub 90%, a najlepiej gdy co najmniej około 95% wszystkich składników białka. Kompozycja może zawierać inne związki, takie jak węglowodany, sole, lipidy, rozpuszczalniki i podobne, które nie zmieniają czystości wyrażonej w niniejszym opisie w procentach. Określenie "wyizolowana" asialoglikoproteina HCV odnosi się do takiej asialoglikoproteiny HCV, której czystość określa się jako wynoszącą co najmniej 35%. Stosowane tu określenie "białko wiążące mannozę" oznacza lektynę lub inne białko, które specyficznie wiąże białka zakończone w wyniku glikozylacji mannozą (na przykład asialoglikoproteiny), przykładowo lektyny wiążące mannozę, przeciwciała swoiste dla końcowej glikozylacji mannozowej, białko receptora mannozowego (R. A. B. Ezekwoitz i wsp., J. Exp. Med. (1990), 176: ), białka receptora asialoglikoproteinowego (H. Kurata i wsp., J. Biol. Chem. (1990), 265: ), surowicze białko wiążące mannozę (J. Schuffenecker i wsp., Cytogenet. Cell Genet. (1981), 56: ; K. Sastry i wsp., J. Immunol. (1991), 147: ), surowicze białko wiążące asialoglikoproteinę i podobne. Lektyny wiążące mannozę obejmują przykładowo GNA, konkanawalinę A (ConA) i inne lektyny o takich samych własnościach wiążących. Określenie "lektyna GNA" oznacza aglutyninę Galanthus nivalus, lektynę dostępną w handlu, wiążącą glikoproteiny z przyłączoną na końcu mannozą. Stosowane tu określenie "rekombinowana" glikoproteina oznacza glikoproteinę ekspry mowaną przez rekombinowany polinukleotyd, w którym gen strukturalny kodujący glikoproteinę ulega ekspresji pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które naturalnie nie sąsiadują z tym genem strukturalnym, lub polinukleotyd, w którym gen strukturalny jest w postaci zmodyfikowanej. Przykładowo, można utworzyć wektor, w którym gen strukturalny białka E1 znajduje się pod kontrolą działającego fragmentu promotora drożdżowej dehydrogenazy gliceraldehydo- 3-fosforanowej (GAPDH). Właściwym promotorem do stosowania w drożdżach jest promotor hybrydowy ADH2/GAP, ujawniony w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,880,734, w którym zastosowano fragment promotora GAPDH w połączeniu z sekwencją aktywacji dehydrogenazy alkoholowej 2, umieszczoną w kierunku w górę (od strony 5 ) fragmentu GAPDH. Modyfikacje genu strukturalnego mogą obejmować podstawienia różnych

6 kodonów kodonami równoważnymi (przykładowo, aby zastosować kodony preferowane przez gospodarza, wyeliminować lub utworzyć miejsca restrykcyjne cięcia enzymatycznego, lub w celu kontrolowania budowy "spinki do włosów", itd.), oraz podstawienie, insercję lub delecję ograniczonej liczby kodonów kodujących różne aminokwasy (można zmienić nie więcej niż około 10%, lub mniej niż około 5% liczby naturalnych aminokwasów w sekwencji), i podobne. Podobnie, "rekombinowany"receptor oznacza białko receptorowe eksprymowane przez rekom binowany polinukleotyd, w którym gen strukturalny kodujący receptor ulega ekspresji pod kontrolą sekwencji regulatorowych, które naturalnie nie sąsiadują z tym genem strukturalnym, lub przez polinukleotyd, w którym gen strukturalny jest w postaci zmodyfikowanej. Określenie "wyizolowany polipeptyd" oznacza polipeptyd zasadniczo nie posiadający innych składników wirusa HCV, zwłaszcza polinukleotydów. Polipeptyd "zasadniczo nie posiada" innych składników, jeśli w skład polipeptydu wraz z połączonymi z nim komponentami wchodzi co najmniej 70% wag. polipeptydu, lub co najmniej około 80%, lub około 90%, lub ewentualnie 95% lub więcej. Na przykład, wyizolowanym polipeptydem według powyżej podanej definicji jest polipeptyd zawierający 100 Tg/ml E1 i tylko 3 Tg/ml innych składników HCV (przykładowo DNA, lipidów i podobnych); polipeptyd taki zasadniczo nie posiada "innych składników wirusa HCV". Wyrażenie "lider sekrecji" oznacza polipeptyd, który jeśli jest zakodowany na N-końcu białka, po translacji powoduje sekrecję białka do środowiska hodowli komórki gospodarza. Na przykład, odpowiedni liderzy sekrecji stosowani w drożdżach obejmują sekwencję liderową czynnika I Saccharomyces cerevisiae (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,870,008). Określenie "niższe eukarionty" oznacza komórki takich gospodarzy jak drożdże, grzyby i podobne. Na ogół niższe eukarionty są jednokomórkowcami (ale nie koniecznie). Korzystne niższe eukarionty obejmują drożdże, zwłaszcza gatunki spośród Saccharomyces, Schizosac charomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula i podobne. Najczęściej stosowanymi gospodarzami drożdżowymi są Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis i K. lactis, są one jednocześnie odpowiednimi gospodarzami grzybowymi. Określenie "wyższe eukarionty" oznacza komórki pochodzące od wyższych zwierząt, takich jak ssaki, gady, owady i podobne. Sposób według wynalazku prowadzi się w komórkach gospodarzy wyższych eukariontów pochodzących od chomika chińskiego (na przykład CHO), małpy (na przykład komórki COS), ludzi i owadów (na przykład Spodoptera frugiperda). Komórki gospodarza można dostarczać w zawiesinie lub w hodowlach w kolbie, hodowlach tkankowych, hodowlach narządów i podobnych. Określenie "modulator wapnia" oznacza związek zdolny do maskowania lub wiązania jonów wapnia w retikulum endoplazmatycznym lub zdolny do oddziaływania na stężenie jonów wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) poprzez działanie na białka regulatorowe wapnia (na przykład białka kanalików wapniowych, pompy wapniowe, i podobne). Odpowiednie modulatory wapnia obejmują na przykład tapsigargin, EGTA (kwas bis/9-aminoetoksy/etyleno- N,N,N N -czterooctowy). Obecnie preferowanym modulatorem jest tapsigargin (patrz na przykład O. Thastrup i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990), 87: ). Określenie "immunogenny" oznacza zdolność substancji do wywoływania humoralnej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej, przy czym chodzi o substancję jako taką lub w połączeniu z nośnikiem, w obecności lub pod nieobecność adiuwanta. "Neutralizacja" oznacza odpowiedź immunologiczną, która blokuje częściowo lub całkowicie zakażalność czynnika zakażającego. "Szczepionka" oznacza kompozycję immunogenną zdolną do wywoływania częściowej lub pełnej obrony przeciwko HCV i nadającą się do podawania pacjentowi. Określenie "płyn biologiczny" oznacza płyn pochodzący z organizmu, taki jak surowica, osocze, ślina, wydzieliny żołądkowe, śluz i podobne. Zwykle płyn biologiczny bada się pod kątem obecności cząstek HCV. Niektóre płyny biologiczne stosuje się jako źródło innych produktów, takich jak czynniki krzepnięcia (na przykład Czynnik VIII-C), albumina surowicza, hormon wzrostu i podobne. W takich przypadkach ważne jest, aby źródło w postaci płynu biologicznego było wolne od zanieczyszczeń takim wirusem jak HCV.

7 B. Ogólny sposób Region E 1 genomu HCV ujawniono w europejskim opisie patentowym nr EP jako region "E", a region E2 jako "NS1". Region E 1 zawiera aminokwasy około wirusowej poliproteiny o pełnej długości. Region E2 zawiera aminokwasy około Pełna sekwencja prototypów tych protein (szczep HCV-1) są znane (patrz EP ), jak również znane są ogólne sposoby klonowania i uzyskiwania ekspresji tych białek. Zarówno białko E1 jak i E2 mogą być eksprymowane przez polinukleotyd kodujący pierwsze aminokwasy poliproteiny HCV: w wyniku potranslacyjnego procesowania w większości eukariotycznych komórek gospodarzy następuje rozszczepienie powstałej poliproteiny na białka C, E 1 i E2. Można skrócić koniec 5 regionu kodującego zmniejszając ilości wytwarzanego białka C. Ekspresję asialoglikoprotein można osiągnąć kilkoma metodami. Przykładowo, ekspresję można uzyskać w niższych eukariontach (takich jak drożdże), które zwykle nie przyłączają reszt kwasu sialowego do glikozylowanych białek. W drożdżowych układach ekspresyjnych korzystnie stosuje się taki lider sekrecji jak lider czynnika I S. cerevisiae, w wyniku czego białko ulega ekspresji do środowiska hodowli po translacji. Korzystnie stosuje się mutanty z defektem glikozylacji, takie jak pmrl, ponieważ w przypadku takich mutantów zachodzi jedynie glikozy lacja rdzenia, a ponadto często uzyskuje się wyższą wydajność sekrecji heterologicznych białek (H. K. Rudolph i wsp., Cell (1989), 58: ). Alternatywnie, można stosować inne gatunki drożdży, takie jak Pichia pastoris, które eksprymują glikoproteiny zawierające 8-9 reszt mannosowych ułożonych podobnie, jak w przypadku glikozylacji rdzenia obserwowanej u ssaków i S. cerevisiae. Alternatywnie, można stosować ekspresję w komórkach ssaczych i blokować glikozylację końcową (przyłączanie kwasu sialowego). Rekombinowane konstrukcje zawierają sygnał sekrecji zapewniający kierowanie białka do retikulum endoplazmatycznego. Uważa się, że transport do układu Golgi ego blokują białka E 1 i E2; okazuje się, że wysoki poziom ekspresji E1 i E2 w komórkach ssaczych wstrzymuje sekrecję wszystkich białek komórkowych do retikulum endoplazmatycznego lub układu Golgi ego cis. Dodatkowo można stosować mutanty z defektem glikozylacji. Patrz na przykład: P. Stanley, Ann. Rev. Genet. (1984), 18: W przypadku, gdy mutant glikozylacji lub transportu eksprymuje E 1 i E2 z resztami kwasu sialowego, końcowe reszty kwasu sialowego można usunąć działając neuramimidazą. Dalsze zwiększenie wydajności osiąga się przy użyciu modulatora wapnia uzyskując uwalnianie białka poza retikulum endoplazmatyczne. Odpowiednie modulatory obejmują tapsi gargin, EGTA oraz A23817 (patrz przykładowo: O. Thastrup i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1990), 87: ). Przykładowo, można osiągnąć wewnątrzkomórkową ekspresję dużych ilości E1 i E2 w komórkach ssaczych (na przykład CHO, COS, komórkach HeLa i podobnych) przez transfekcję przy użyciu jako wektora rekombinowanego wirusa krowianki. Po upływie czasu, w którym następuje ekspresja proteiny i akumulacja w retikulum endoplazmatycznym, komórki poddaje się działaniu modulatora wapnia w stężeniu wystarczająco dużym, aby spowodować uwolnienie zawartości retikulum endoplazmatycznego (ER). Następnie białko odzyskuje się z pożywki, którą wymienia się do następnego cyklu. Ponadto, może być korzystne eksprymowanie skróconej postaci białka otoczki. Zarówno E1 jak i E2 posiadają wysoce hydrofobowe domeny, które najwyraźniej zatrzymują białko w retikulum endoplazmatycznym i zapobiegają wydajnemu uwalnianiu. Zatem, można zastosować delecję części sekwencji występujących w jednym lub w większej liczbie następujących regionów białka E 1: aminokwasy , i (numeracja od początku poliproteiny) oraz w regionie białka E2: aminokwasy (patrz na przykład Figura 20-1 w EP ). Prawdopodobnie co najmniej jedna z tych hydrofobowych domen tworzy region transbłonowy, który nie jest istotny z punktu widzenia antygenowości białka, z uwagi na co region taki można bez szkody wydeletować. Najlepszy region do delecji można określić przeprowadzając doświadczenia z małą liczbą delecji, co leży w zakresie możliwości fachowca. Wynikiem delecji hydrofobowego końca 3 białka E2 jest sekrecja części eksprymowanego białka E2 wraz z sialacją wydzielanego białka. W celu uzyskania ekspresji można stosować szereg różnych wektorów. Niższe eukarionty takie jak drożdże, na ogół transformuje się plazmidami z zastosowaniem metody precypitacji

8 fosforanem wapniowym, albo transfekuje się je rekombinowanym wirusem. Wektory ulegają replikacji w komórce gospodarza niezależnie, albo integrują się w genomie komórki gospodarza. Wyższe eukarionty można transferować plazmidami, ale zwykle dokonuje się zakażenia rekombinowanym wirusem, na przykład rekombinowanym wirusem krowianki. Szczególnie preferuje się wirusa krowianki, ponieważ zakażenie krowianką wstrzymuje ekspresję białek komórki gospodarza. Komórki gospodarza stosowane w sposobie według wynalazku mogą obejmować linie komórkowe HeLa i szpiczaka. W obecnym układzie oznacza to, że E1 i E2 akumulują się jako główne glikozylowane substancje w retikulum endoplazmatycznym (ER) gospodarza. Ponieważ E 1 i E2 będą przeważającymi glikoproteinami zakończonymi mannozą, łatwo je oczyścić od komórek przy użyciu lektyn, które wiążą końcowe reszty mannozowe, takich jak aglutynina Galanthus nivalus (GNA). Białka eksprymowane naturalnie jako glikoproteiny z przyłączoną na końcu mannozą występują w fizjologii ssaków stosunkowo rzadko. W większości przypadków ssacza glikopro teina zakończona mannozą jest tylko chwilowym produktem przejściowym procesu glikozylacji. Fakt, że białka otoczki HCV eksprymowane na drodze rekombinacji charakteryzują się końcową glikozylacją nannozową lub (w mniejszym stopniu) N-acetyloglukazalminową oznacza, że białka HCV i całe wiriony można oddzielić i częściowo oczyścić od endogennych białek przy użyciu lektyn specyficznych wobec końcowej mannozy lub N-acetyloglukazaminy. Rekombinowane białka wyglądają jak autentyczne i uważa się, że są one zasadniczo identyczne jak białka otoczki występujące w dojrzałym, wolnym wirionie, albo identyczne jak związana z komórką postać białka otoczki. Zatem, w przypadku protein z przyłączoną na końcu mannozą stosuje się takie lektyny jak GNA, a w przypadku białek z przyłączoną na końcu N-acetyloglukozaminą stosuje się WGA (aglutynina zarodków pszennych). Do oddzielania E1 i E2 od supernatantów hodowli komórkowej i od innych płynów, przykładowo do oczyszczania przy wytwarzaniu antygenów do szczepionki lub do próby immunologicznej, można stosować lektyny związane z fazą stałą, (na przykład kolumnę lektyna-sepharose ). Alternatywnie, odpowiednią lektynę można zastosować w celu wyizolowania E 1, E2 lub wirionów HCV z próbek płynu lub z tkanek pochodzących od osobników podejrzanych o zakażenie wirusem HCV. Ponieważ glikoproteiny z przyłączoną na końcu mannozą występują stosunkowo rzadko, taka procedura służyłaby oczyszczaniu białek obecnych w próbce przy zasadniczej redukcji tła. Po związaniu z lektyną, białko HCV można wykryć przy użyciu przeciwciał anty-hcv. Jeśli obecne są całe wiriony, alternatywnie można wykryć kwasy nukleinowe HCV stosując techniki PCR lub inne metody amplifikacji kwasu nukleinowego konserwatywnych regionów genomu HCV (na przykład niekodujący region 5 ). Sposób ten pozwala na wyizolowanie i scharakteryzowanie różnych szczepów HCV bez względu na dryfowanie antygenowe lub na odmiany antygenowości, na przykład w przypadkach, gdy nowy szczep nie reaguje w immunologicznej reakcji krzyżowej ze szczepem zastosowanym do wytworzenia przeciwciał. Istnieje cały szereg innych dróg wykorzystania specyficznego rozpoznawania glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą przez poszczególne lektyny. Przykładowo, można inkubować próbki podejrzane o zawieranie wirionów lub białek HCV z biotyną lub z lektynami znakowanymi awidyną i wytrącać kompleks białko - lektyna przy użyciu awidyny lub biotyny. Można także wykorzystać powinowactwo lektyny do białek HCV do kierowania związków leczniczych do wirionów, na przykład przez sprzężenie związku prze ciwwirusowego z GNA. Alternatywnie, można zastosować odpowiednie lektyny do usuwania glikoprotein z przyłączoną na końcu mannozą z frakcji surowicy lub osocza, zmniejszając lub eliminując ryzyko zanieczyszczenia HCV. Asialoglikoproteiny E 1 i/lub E2 izoluje się z nieoczyszczonych lizatów komórkowych przez inkubowanie z unieruchomionym białkiem wiążącym mannozę, zwłaszcza z lektyną, taką jak ConA lub GNA. Komórki poddaje się lizie, przykładowo przez mechaniczne rozrywanie w buforze hipotonicznym, a następnie przez odwirowanie w celu wytworzenia pozajądrowego lizatu i przez dalsze odwirowanie w celu otrzymania surowej mikrosomalnej frakcji błonowej. Następnie surową frakcję błonową rozpuszcza się w buforze zawierającym taki detergent jak Triton X-100, NP40 lub podobne. Ten detergentowy ekstrakt klaruje się następnie z cząstek

9 nierozpuszczalnych przez odwirowanie, a uzyskany klarowny lizat inkubuje się na kolumnie chromatograficznej zawierającej unieruchomione białko wiążące mannozę, korzystnie GNA związaną ze stałym podłożem, takim jak agaroza lub Sepharose, w ciągu okresu czasu wystarczającego na związanie, zwykle w ciągu 16 do 20 godzin. Następnie zawiesinę podaje się na kolumnę do chwili, aż E1/E2 nie zacznie pojawiać się w eluacie, po czym inkubuje się w kolumnie w ciągu okresu czasu wystarczającego na związanie, zwykle w ciągu około 12 do 24 godzin. Następnie związaną substancję przemywa się dodatkowym buforem zawierającym detergent (na przykład Triton X-100, NP40 i podobne) i eluuje mannozą w celu uzyskania oczyszczonej asialoglikoproteiny. Najlepiej jest, gdy elucję prowadzi się tylko do chwili, aż białko zacznie pokazywać się w eluacie, w tym momencie elucję zatrzymuje się i pozwala się na zrównoważenie kolumny w ciągu 2-3 godzin przed elucją białka. Uważa się, że takie postępowanie zapewnia wystarczająco dużo czasu na powolny wypływ dużych agregatów białkowych. W przypadkach, gdy E1 i E2 ulegają ekspresji razem w postaci natywnej (to znaczy, z nieskróconą domeną wiążącą się z błoną), zasadnicza frakcja asialoglikoprotein pojawia się w postaci agregatów E1:E2. Pod mikroskopem elektronowym znaczna część tych agregatów widoczna jest jako w przybliżeniu kuliste cząstki o średnicy wynoszącej około 40 nm, którą to wielkość przypisuje się nieuszkodzonemu wirusowi. Cząstki te wydają się być samoistnie składającymi się subwiru sowymi cząstkami. Te agregaty prawdopodobnie wykazują strukturę czwartorzędową bardzo podobną do struktury autentycznych cząstek wirionu HCV i dlatego uważa się, że mogą służyć jako wysoce immunogenne szczepionki. Kompleksy E1/E2 można dalej oczyszczać metodą chromatografii żelowej na zasadowym medium, takim jak Fractogel-DEAE lub DEAE-Sepharose. Stosując chromatografię żelową na Fractogel-DEAE można osiągnąć czystość kompleksów E1/E2 wynoszącą w przybliżeniu %. Białko E1 można dalej oczyszczać przez traktowanie proteazą lizynową, ponieważ E1 posiada 0-1 reszt lizynowych. Traktowanie kompleksu proteazą lizynową powoduje zniszczenie białka E2 i pozwala na łatwe oddzielenie białka E1. Swoistość wirusa HCV w stosunku do tkanki, jak również obserwacja, że glikoproteiny otoczki HCV mają przyłączoną na końcu mannozę sugerują, że wirus wykorzystuje receptor mannozowy lub receptor asialoglikoproteinowy (ASGR) do wtargnięcia do komórek gospodarza. Receptory mannozowe znaleziono na makrofagach i na wątrobowych komórkach zatokowych, podczas gdy ASGR znaleziono na hepatocytach miąższowych. Zatem powinno być możliwe hodowanie HCV z zastosowaniem komórek gospodarza eksprymujących jeden lub oba te receptory. Można stosować pierwotne hodowle komórkowe eksprymujące receptor w sposób naturalny przy zastosowaniu warunków, w których receptor jest zachowany, albo też transfeko wać inną linię komórkową taką jak HeDa, CHO, COS i podobne wektorem zapewniającym ekspresję receptora. Klonowanie receptora mannozowego oraz transfekcję i jego ekspresję w fibroklastach ujawnili M. E. Taylor i wsp., J. Biol. Chem. (1990), 265: Klonowanie i sekwencjonowanie ASGR opisali H. Drickarner i wsp., J. Biol. Chem. (1984), 259: oraz M. Spiess i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1985) 82: i transfekcję i ekspresję działającego ASGR w szczurzych komórkach HTC opisali M. McPhaul i P. Berg, Mol. Cell. Biol. (1987), 7: Zatem, możliwe jest dokonanie transfekcji jednego lub większej liczby receptorów do odpowiednich linii komórkowych i zastosowanie otrzymanych komórek jako gospodarzy do namnażania HCV w hodowli. W wyniku następujących po sobie pasażowań HCV, w takich hodowlach powinny rozwinąć się atenuowane szczepy odpowiednie do stosowania jako żywe szczepionki. Można stosować pierwotne hodowle komórkowe eksprymujące receptor w sposób naturalny w warunkach, w których receptor jest zachowywany, lub transfe kować inną linię komórkową jak HeLa, CHO, COS i podobne wektorem zapewniającym ekspresję receptora. Klonowanie receptora mannozowego oraz transfekcję i jego ekspresję w fibroblastach ujawnili Taylor i wsp., powyżej, a transfekcję i ekspresję działającego ASGR w szczurzych komórkach HTC opisali McPhaul i wsp., powyżej. Obecnie preferuje się stosowanie immortalizowanej linii komórkowej transfekowanej jednym lub dwoma rekombinowanymi receptorami. Kompozycje immunogenne można wytwarzać znanymi sposobami.

10 Kompozycje takie zawierają immunogenną ilość polipeptydu, na przykład mieszaniny cząstek E1, E2 lub E1/E2, zwykle połączonego z farmakologicznie dopuszczalnym nośnikiem, przy czym kompozycje te zawierają ponadto adiuwant. Jeśli pożądany jest "koktail", można zmieszać ze sobą polipeptydy HCV, takie jak na przykład antygeny E1 plus E2 w celu podwyższenia skuteczności. Należy się spodziewać, że wirusopodobne agregaty cząstek E1/E2 zapewnią szczególnie użyteczny antygen szczepionki. Kompozycje immunogenne można podawać zwierzętom w celu wywołania wytwarzania przeciwciał - albo dla uzyskania źródła przeciwciał, bądź też w celu wywołania w zwierzęciu odporności ochronnej. Jako farmakologicznie dopuszczalny nośnik, który jako taki nie wywołuje wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika przyjmującego kompozycję. Odpowiednimi nośnikami są zwykle duże, powoli metabolizowane makrocząsteczki, takie jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, spolimeryzowane aminokwasy i kopolimery aminokwasów, jak również nieaktywne cząstki wirusa. Takie nośniki są znane fachowcom. Jako właściwe adiuwanty wzmacniające skuteczność kompozycji stosuje się wodorotlenek glinu (alum), N-acetylomuramylo-L-treomylo-D-izoglutaminę (thr-mdp), jak ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4,606,918, N-acetylo-normuramylo-Lalanylo-D-izoglutaminę (nor-mdp), N'acetylomuramylo-L-alanylo-D-izoglutaminylo-L-alani no-2-(1-2 -dipalnitoilo-sn-glicero-3-hydroksyfosforyloksy)-etyloaminę (MTP-PE oraz RIBI zawierający trzy składniki wyekstrahowane z bakterii, monofosforylolipid A, dimykolan trehalozy i budulec ściany komórkowej (MPL + TDM - CWS) w 2% emulsji skvalen/tween 80. Ponadto można stosować takie adiuwanty jak Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA). W przypadku stosowania w celach badawczych i z wyłączeniem człowieka stosuje się kompletny adiuwant Freunda (CPA) i niekompletny adiuwant Freunda (IFA). Kompozycje immunogenne będą zwykle zawierać farmakologicznie dopuszczalne nośniki, takie jak woda, sól fizjologiczna, glicerol, etanol i podobne. Do takich nośników można również dodać substancje pomocnicze, takie jak środki zwilżające i emulgujące, bufory ph i podobne. Kompozycje immunogenne zwykle wytwarza się jako środki do iniekcji w postaci płynnych roztworów lub zawiesin lub w postaci ciał stałych nadających się do rozpuszczenia lub zawieszenia w płynach nośnikowych przed iniekcją. Preparaty te można również emulgować lub kapsułkować w liposomach w celu wzmocnienia działania wspomagającego. Kompozycje immunogenne stosowane jako szczepionki zawierają immunologicznie skuteczną ilość polipeptydu HCV, jak również inne wyżej wymienione składniki, jeśli są one potrzebne. Wyrażenie "immunologicznie skuteczna ilość" oznacza taką ilość, która podana pacjentowi jednorazowo lub jako część serii podań, powoduje skutek w leczeniu, jak określono wyżej. Ta ilość różni się w zależności od stanu zdrowia i fizycznej kondycji leczonego pacjenta, grupy taksonomicznej leczonego pacjenta (na przykład naczelne z wyłączeniem człowieka, naczelne i podobne), zdolności układu immunologicznego pacjenta do wytwarzania przeciwciał, pożądanego stopnia ochrony, postaci szczepionki, oceny stanu leczenia przez lekarza leczącego, zakażającego szczepu HCV i innych czynników. Należy się spodziewać, że ilość ta może wahać się w stosunkowo szerokim zakresie i można ją określić drogą rutynowych prób. Samoistnie powstające agregaty E1/E2 mogą także służyć jako nośniki szczepionek dla heterologicznych haptenów (nie-hcv) w taki sam sposób, jak powierzchniowy antygen zapalenia wątroby typu B (patrz Europejskie Zgłoszenie Patentowe nr 174,444). W tym zastosowaniu, agregaty E1/E2 stanowią immunogenny nośnik zdolny do stymulowania odpowiedzi immunologicznej na hapteny lub na antygeny sprzężone z agregatem. Antygen sprzęga się przy użyciu znanych sposobów chemicznych, lub klonuje się w genie kodującym E1 i/lub E2 w miejscu odpowiadającym hydrofilowemu regionowi białka. Kompozycje immunogenne na ogół podaje się pozajelitowo, zwykle przez iniekcję, na przykład podskórną lub domięśniową. Inne postacie nadające się do innych sposobów podawania obejmują postacie do podawania doustnego i czopki. W leczeniu można stosować dawki pojedyncze lub wielokrotne. Szczepionkę można podawać w połączeniu z innymi czynnikami immunoregulującymi.

11 Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. Przykład I. (Klonowanie i ekspresja) (A) Wektory skonstruowano z plazmidów zawierających część 5 genomu HCV według opisów patentowych Europejskiego Urzędu Patentowego nr nr EP i EP Kasetka HCV/S/B zawiera fragment DNA StuI-8glII kodujący koniec 5 poliproteiny od Met1do Leu906, rozpoczynający się nukleotydem -63 w stosunku do Met1. Fragment ten obejmuje białko rdzeniowe (C), białko E1 (czasami określane jako S), białko E2 (również określane jako NS1) oraz część 5 regionu NS2a. Po ekspresji tej konstrukcji, poszczególne białka C, E1 i E2 powstają na drodze procesowania proteolitycznego. Kasetka HCV (A/B) zawiera fragment DNA ApaLI-BglII kodujący koniec 5 poliproteiny od Met1 do Leu906, rozpoczynający się nukleotydem -6 w stosunku do Met1. Fragment ten obejmuje białko rdzeniowe (C), białko E1 (czasami określane jako S), białko E2 (również określane jako NS1) oraz część 5 regionu NS2a. Po ekspresji tej konstrukcji, poszczególne białka C, E1 i E2 powstają na drodze procesowania proteolitycznego. Kasetka C-E1 (S/B) (fragment StuI-BamHI) zawiera koniec 5 od Met1do Ile340 (miejsce BamHI w genie). W wyniku ekspresji tej kasetki powstaje białko C i nieco skrócone E1 (E1 ). Część skrócona od końca 3 stanowi region hydrofobowy, o którym uważa się, że służy jako sygnał translokacji. Kasetka N S1 (B/B) (fragment BamHI-BglII) zawiera małą część 3 białka E1 (od Met364), całość białka E2 oraz część NS2a (od Leu906). W tej konstrukcji fragment E1 służy jako sygnał translokacji. W kasetce TPA-NS1 jako sygnał translokacji wykorzystuje się lidera ludzkiego aktywatora plazminogenu tkankowego (tpa), zamiast fragmentu 3 białka E1. Kasetka zawiera skróconą postać E2, od od Gly406 do od Glu661, w której wy deletowano hydrofobowy koniec 3. Dokonano innercji każdej kasetki od wektora pgem3z (Promega) z i bez niekodującego końca 5 syntetycznej sekwencji Θ-globiny w celu transkrypcji i translacji przy użyciu ekspresji in vitro T7 w króliczych retykulocytach. Wektory w postaci rekombinowanych wirusów krowianki wytworzono przez insercję kasetek do plazmidu psc11 (otrzymanego od Dr B. Moss a, NTH) i rekombinację z wirusem krowianki, jak opisali Carkrabarty i wsp., Mol. Cell. Biol. (1985), 5: (B) Alternatywny wektor ekspresyjny skonstruowano przez insercję HCV (A/B) pomiędzy miejscami StuI i SpeI plazmidu psc59 (otrzymanego od Dr B. Moss a, NIH) i rekombinację z wirusem krowianki, jak opisali Charkrabarty i wsp., Mol. Cell. Biol. (1985), 5: (C) Komórki HeLa S3 zebrano przez odwirowanie z prędkością 2000 obrotów/minutę, w ciągu 7 minut, w temperaturze pokojowej, w sterylnych butelkach do wirowania o pojemności 500 ml (JA-10 rotor). Osad zawieszono ponownie w dodatkowej pożywce hodowlanej (pożywka Spinner a MEM zmodyfikowana przez Joklik a - 5% surowica końska i Gentamycyna) ("spinner medium") do końcowego stężenia wynoszącego 2 x 107 komórek/ml. Dodano surowy szczep muzealny vv/s059-h C V poddany działaniu ultradźwięków w dawce infekcyjnej wynoszącej 8 jednostek łysinkowych wirusa/komórkę (pfu/komórkę) i mieszaninę wytrząsano w ciągu 30 minut w temperaturze 73 C. Następnie zakażone komórki przeniesiono do kolby do wirowania zawierającej 8 litrów pożywki "spinner medium" i inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 37 C. Następnie wyhodowane komórki zebrano przez odwirowanie, a osad zawieszono ponownie w buforze (10 mm Tris-HCl, ph 9,0, 152 ml). Następnie komórki poddano homogenizacji w urządzeniu Dounce Homogenizer o pojemności 40 ml (50 uderzeń) i jądra komórkowe przeprowadzono w postać peletek przez odwirowanie (5 minut, 1600 obrotów/minutę), 4 C, wirnik JA-20). Osad jądrowy zawieszono ponownie w buforze Tris (24 ml), poddano ponownie homogenizacji, wytworzono osad, zbierając wszystkie supernatanty. Zebrany lizat podzielono na próbki o objętości 10 ml i poddano działaniu ultradźwięków 3 razy po 30 minut w sonifikatorze stosując średnią moc. Lizat poddany działaniu ultradźwięków (15 ml) wylano na 17 ml podłoża sacharozowego (36%) tworząc warstwę w probówkach do wirowania SW28 i wirowano z szybkością obrotów/minutę w ciągu 80 minut w temperaturze 4 C uzyskując osad wirusa. Osad wirusa zawieszono ponownie w 1 ml buforu Tris (1 mm Tris-HCl, ph 9,0) i zamrożono w temperaturze -80 C.

12 Przykład II. (Porównanie produktów wytworzonych in vitro in vivo) (A) E1 i E2 znakowane 35S-Met eksprymowano zarówno in vitro jak i in vivo przy użyciu wektorów opisanych w powyższym przykładzie I. Komórki BSC-4G i H e la zakażono wektorami rvv w celu uzyskania ekspresji in vivo. Zarówno pożywkę jak i lizaty komórek badano pod kątem rekombinowanych białek. Stosowano immunoprecypitację produktów przy użyciu ludzkiej surowicy odpornościowej HCV, a proteiny powstałe in vitro analizowano bezpośrednio. Otrzymane proteiny analizowano metodą SDS-PAGE. Układ ekspresyjny w postaci retikulocytów (pgem3z z HCV /S/B/ lub z HCV /A/B/) wytwarzał proteiny C, E 1 i E2 o masach cząsteczkowych wynoszących w przybliżeniu 18 kda, 35 kda i 72 kda, odpowiednio. W lizatach komórek BSC-40 i HeLa stransfekowanych wektorem rvv zawierającym HCV /S/B/, HCV /A/B/ lub C-E1 /S/B/ znaleziono te same proteiny. Z uwagi na to, że retikulocyty nie zapewniają sprawnego procesowania w układzie Golgi ego, a zatem nie dostarczają kwasu sialowego, fakt, że produkty wytworzone zarówno in vivo jak i in vitro wykazywały identyczne ruchliwości sugeruje, że białka nie ulegają sialacji in vivo. Zewnątrzkomórkową sekrecję białka E2 o innej ruchliwości, odpowiadającej sialacji, uzyskano jedynie w przypadku wektora rvv zawierającego TPA-NS1. (B) Spowodowano ekspresję HCV (S/B) in vitro i inkubowano z biotymylowanymi lektykami: GNA, SNA, PNA, WGA i ConA. Po inkubacji, kompleksy zebrano na perełkach avidy no-akrylowych, przemyto, eluowano buforem Laemmli ego i analizowano metodą SDS-PAGE. Wyniki wykazały, że E 1 i E2 związały się z GNA i ConA, co wskazuje na obecność mannozy. GNA wiąże się z końcowymi grupami mannozowymi, a ConA wiąże się z każdą grupą manno zową przyłączoną w pozycji I. Brak wiązania z SNA, PNA i WGA wskazuje na to, że żadne z białeknie zawierało kwasu sialowego, N-acetylogalaktozaminy ani N-acetyloglukozaminy. (C) Białka E 1 i E2 znakowane radiologicznie wytworzono w komórkach BSC-40 przez zakażenie ich rvv zawierającym HCV/S/B/vv SC11-HCV/ i dokonano immunoprecypitacji ludzką surowicą odpornościową HCV+. Połowę tale wtrąconej substancji traktowano w ciągu nocy neuraminidazą w celu usunięcia kwasu sialowego. Po tej obróbce, białka poddane i nie poddane działaniu neuraminidazy analizowano metodą SDS-PAGE. Nie zaobserwowano żadnych znaczących różnic w ruchliwości białek, co wskazuje na brak sialacji in vivo. (D) Białka E1 i E2 znakowane radiologicznie wytworzono w komórkach BSC-40 przez zakażenie ich rvv zawierającym HCV /A/B/vv/SC59-HCV/ i albo dokonano immunoprecypitacji ludzką surowicą HCV+, albo wytrącono przy użyciu biotynylowanej lektyny GNA przyłączonej do akrylowych perełek, stosując jako kontrolę vv/sc11 bez HCV. Precypitaty analizowano metodą SDS-PAGE. Wyniki dowodzą, że E1 i E2 stanowiły główne białka z przyłączoną na końcu mannozą w komórkach zakażonych vv/sc59-hcv. GNA była tak samo skuteczna jak ludzka antysurowica w wytrącaniu E 1 i E2 z pożywki hodowlanej. Zaobserwowano obecność składnika o masie 25 kda, lecz wydaje się, że jest to specyficzny składnik komórek zakażonych krowianką. Przykład III (Stosowanie lektyny do oczyszczania) (A) Komórki HeLa S3 inokulowano oczyszczonym szczepem mezealnym vv/sc59-hcv o wysokim mianie, dawką infekcyjną wynoszącą 5 pfu/komórkę i mieszaninę mieszano w ciągu 30 minut w temperaturze 37 C. Następnie zakażone komórki przeniesiono do kolby do wirowania zawierającej 8 l pożywki "spinner medium" i inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 37 C. Komórki zebrano przez odwirowanie i ponownie zawieszono w buforze hipotonicznym (20 mm HEPES, 10 mm NaCl, 1 mm MgCl2, 120 ml) na lodzie. Następnie komórki poddano homogenizacji w urządzeniu Dounce Homogenizer (50 uderzeń) i jądra komórkowe przeprowadzono do osadu przez odwirowanie (5 minut, 1600 obrotów/minutę, 4 C, rotor JA-20). Osad zebrano, zawieszono ponownie w 48 ml buforu hipotonicznego, ponownie poddano homogenizacji, ponownie odwirowano, zebrano i zamrożono w temperaturze -80 C. Następnie zamrożone supernatanty rozmrożono, a mikrosomalną frakcję błony lizatu po-jądrowego wyizolowano przez odwirowanie w ciągu 20 minut z szybkością obrotów/minutę, w temperaturze 4 C, przy użyciu rotora JA-20. Supernatant usunięto przez zasysanie. Następnie osad roztworzono w 96 ml buforu z detergentem (20 mm Tris-HCl, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1 mm DDT. 0,5% Triton X -100, ph 7,5) i poddano homogenizacji

13 (50 uderzeń). Produkt sklarowano przez odwirowanie w ciągu 20 minut, z szybkością obrotów/minutę w temperaturze 4 C i zebrano supernatanty. Kolumnę z GNA-agarozą (1 cm x 3 cm, 3 mg GNA/ml perełek, objętość wypełnienia 6 ml, Vector Labs, Burlingame, CA) zrównoważono wstępnie buforem z detergentem. Próbkę super natantu naniesiono na kolumnę z zaworem, z szybkością przepływu wynoszącą 1 ml/minutę, w ciągu godzin, w temperaturze 4 C. Następnie kolumnę przemyto buforem z detergentem. Oczyszczone białka E1/E2 eluowano za pomocą I-D-mannozydu (0,9 M w buforze z detergentem) z szybkością przepływu wynoszącą 0,5 ml/minutę. Eluowanie zatrzymano w momencie, gdy E1/E2 pojawiły się w eluacie i kolumnę ponownie zrównoważono w ciągu 2-3 godzin. Frakcje analizowano metodą blottingu Western i barwienia srebrem. Frakcje pików zebrano i naświetlano UV w celu inaktywacji jakichkolwiek pozostałości wirusa krowianki. (B) Asialoglikoproteiny E 1 i E2 oczyszczone na GNA-agarozie poddano sedymentacji w gradientach 20-60% glicerolu. Gradienty zmieniano skokowo, a białka analizowano metodą SDS-PAGE i blottingu Western. W celu identyfikacji E1 i E2 bioty (bibuły) badano za pomocą GNA. Wyniki wskazują na obecność heterodimeru E1:E2, który sedymentuje przy spodziewanej szybkości (to znaczy, w miejscu charakterystycznym dla białka o masie 110 kda). Widoczne są również większe agregaty białek otoczki HCV. W idoczne są też homodimery E2:E2. E2 wydawało się występować w nadmiarze w stosunku do E1 w większych cząstkach, chociaż wykryto również mało widoczne cząstki E1:E2. Większe agregaty sedymentowały znacznie szybciej niż marker w postaci tyroglobuliny. (C) E1 i E2 oczyszczone na GNA-agarozie poddano sedymentacji w gradientach 20-60% glicerolu zawierającego 1 mm EDTA. Frakcje analizowano metodą SDS-PAGE z Θ-merkap toetanolem albo bez Θ-merkaptoetanolu (ΘME). Obserwowano małe różnice lub nie obserwowano żadnych różnic w widocznej ilości E1 i E2 w obecności ΘME lub pod nieobecność ΘME, co wskazuje na brak wiązań disiarczkowych pomiędzy heterodimerami. (D) Kompleksy E1/E2 (o czystości wynoszącej około 40%) analizowano w urządzeniu do badania cząstek o wielkości mniejszej niż mikron DM-4. Wykryto substancje o wielkości w zakresie nm. (E) Kompleksy E1/E2 (o czystości wynoszącej około 40%) analizowano pod mikroskopem elektronowym stosując barwienie negatywowe kwasem fosforowowolframowym. Obraz w mikroskopie elektronowym ujawnił obecność cząstek o kształcie kulistym o średnicy wynoszącej około 40 nm. Kompleksy E1/E2 inkubowano z ludzką surowicą odpornościową HCV+, a następnie analizowano pod mikroskopem elektronowym stosując barwienie negatywne. Obserwowano kompleksy przeciwciał z dużymi agregatami i z mniejszymi cząstkami. Przykład IV. Oczyszczanie chromatograficzne (A) Substancję wytworzoną jak opisano w przykładzie III (0,5-0,8 ml) oczyszczoną za pomocą lektyny GNA rozcieńczono 10-krotnie buforem A (20 mm buforu Tris-Cl; 1 mm ED- TA, ph 8,0) i naniesiono na kolumnę o wymiarach 1,8 x 1,5 cm Fractogel EMD DEAE-650 (EM Separations, Gibbstown, New Jersey, nr katalogowy 16883), zrównoważoną buforem A. Frakcję białkową zawierającą E1/E2 eluowano tym samym buforem z szybkością przepływu wynoszącą 0,2 ml/minutę i zebrano 1 ml frakcji. Frakcje zawierające E 1 i E2 (oznaczono metodą SDS-PAGE) zebrano i przechowywano w temperaturze -80 C. (B) Oczyszczona substancja z części (A) powyżej ma czystość 60-80%, co oznaczono metodą SDS-PAGE. Identyfikację przypuszczalnych pasm E1 i E2 potwierdzono analizując N-końcową sekwencję po zastosowaniu techniki przenoszenia. W tym celu, substancję E1/E2 oczyszczoną na kolumnie fractogel-deae zredukowano przez dodanie buforu Laemmli ego (ph 6,8; 0,06 M Tris-Cl; 2,3% SDS, 10% glicerol, 0,72 M Θ-merkaptoetanol) i gotowano w ciągu 3 minut. Następnie próbkę naniesiono na 10% żel poliakryloamidowy. Po analizie metodą SDS-PAGE, białko przeniesiono na 0,2 Tm błonę z polidwufluorku winylidenu (PVDF) (Bio- Rad Laboratories, Richmond, CA). Odpowiednie przepuszczalne pasma białek E 1 i E2 wycięto z błony i poddano analizie N-końcowych aminokwasów, aczkolwiek nie zwracano specjalnej uwagi na zapobieganie blokowania aminokońców podczas przygotowywania. Pierwsze 15 cykli wykazało, że próbka E 1 ma sekwencję: Tyr-Gln-Val-Arg-X-Ser-Thr-Gly-X-Tyr-His-Val-X- Asn-Asp, a próbka E2 ma sekwencję: Thr-His-Val-Thr-Gly-X-X-Ala-Gly-His-X-Val-X-Gly-Phe.

14 Te sekwencje aminokwasowe są zgodne z tymi, których spodziewano się na podstawie odpowiadających im sekwencji DNA. Uważa się, że produkt E1/E2 oczyszczony chromatograficznie jak opisano wyżej na kolumnie fractogel-deae jest agregatem, czego dowodzi fakt, że duża ilość E 1 i E2 eluuje razem w obszarze wolnej objętości kolumny do chromatografii żelowopermeacyjnej Bio-Sil TSK- 4000SW. Dowodzi to, że w natywnych warunkach znaczna ilość kompleksu E1/E2 ma masę cząsteczkową wynoszącą co najmniej Obserwowano także E1/E2 o masie cząsteczkowej wynoszącej około Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny.

Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. 1 Sposób otrzymywania białek o właściwościach immunoregulatorowych Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania fragmentów witellogeniny. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i

Bardziej szczegółowo

Drożdżowe systemy ekspresyjne

Drożdżowe systemy ekspresyjne Drożdże Drożdżowe systemy ekspresyjne Zalety: możliwość uzyskania dużej biomasy modyfikacje postranslacyjne eksprymowanych białek transport eksprymowanych białek do pożywki Duża biomasa W przypadku hodowli

Bardziej szczegółowo

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP

Klonowanie molekularne Kurs doskonalący. Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Klonowanie molekularne Kurs doskonalący Zakład Geriatrii i Gerontologii CMKP Etapy klonowania molekularnego 1. Wybór wektora i organizmu gospodarza Po co klonuję (do namnożenia DNA [czy ma być metylowane

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.12.1999,PCT/EP99/09864 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 13.12.1999,PCT/EP99/09864 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 202483 (21) Numer zgłoszenia: 349335 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 13.12.1999 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 172133. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego 29.03.1991, PCT/US91/02225

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 172133. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego 29.03.1991, PCT/US91/02225 RZECZPOSPOLITA PO LSKA U rząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 172133 (21 ) Numer zgłoszenia 296329 (22) Data zgłoszenia 29.03.1991 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7 Poznań, dnia 28.04.2014 r. BioVentures Institute Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością ul. Promienista 83 60 141 Poznań Zapytanie ofertowe nr 01/2014 Projekt Nowa technologia wytwarzania szczepionek

Bardziej szczegółowo

PL 204536 B1. Szczepanik Marian,Kraków,PL Selmaj Krzysztof,Łódź,PL 29.12.2003 BUP 26/03 29.01.2010 WUP 01/10

PL 204536 B1. Szczepanik Marian,Kraków,PL Selmaj Krzysztof,Łódź,PL 29.12.2003 BUP 26/03 29.01.2010 WUP 01/10 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204536 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 354698 (22) Data zgłoszenia: 24.06.2002 (51) Int.Cl. A61K 38/38 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa

Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna. Co może byd wynalazkiem. Wynalazek biotechnologiczny. Ochrona patentowa dr Bartosz Walter Agenda: Wynalazek jako własnośd intelektualna Co może byd wynalazkiem Wynalazek biotechnologiczny Ochrona patentowa Procedura zgłoszenia patentowego Gdzie, kiedy i jak warto patentowad

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 17.03.2003, PCT/EP03/002826

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 17.03.2003, PCT/EP03/002826 PL 212981 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 212981 (21) Numer zgłoszenia: 372937 (22) Data zgłoszenia: 17.03.2003 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215

StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 StayRNA bufor zabezpieczający RNA przed degradacją wersja 0215 100 ml, 250 ml, 500 ml Nr kat. 038-100, 038-250, 038-500 Nietosyczny roztwór wodny do przechowywania i zabezpieczania różnego rodzaju tkanek

Bardziej szczegółowo

PL 198188 B1. Instytut Chemii Przemysłowej im.prof.ignacego Mościckiego,Warszawa,PL 03.04.2006 BUP 07/06

PL 198188 B1. Instytut Chemii Przemysłowej im.prof.ignacego Mościckiego,Warszawa,PL 03.04.2006 BUP 07/06 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 198188 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 370289 (51) Int.Cl. C01B 33/00 (2006.01) C01B 33/18 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22)

Bardziej szczegółowo

Podstawy mikrobiologii. Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej

Podstawy mikrobiologii. Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej Podstawy mikrobiologii Wykład 3 Wirusy bezkomórkowe formy materii oŝywionej Budowa wirusów Wirusy nie mają budowy komórkowej, zatem pod względem biologicznym nie są organizmami Ŝywymi! Są to twory nukleinowo

Bardziej szczegółowo

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych dr Małgorzata Kozłowska Ekspert w UPRP dr Ewa Waszkowska

Bardziej szczegółowo

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215

Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 Genomic Midi AX Direct zestaw do izolacji genomowego DNA (procedura bez precypitacji) wersja 1215 20 izolacji Nr kat. 895-20D Pojemność kolumny do oczyszczania DNA wynosi 100 µg 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii

Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Inwestycja w przyszłość czyli znaczenie ochrony własności przemysłowej dla współczesnej biotechnologii Zdolność patentowa wynalazków biotechnologicznych aspekty praktyczne dr Małgorzata Kozłowska Ekspert

Bardziej szczegółowo

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych

Bardziej szczegółowo

Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało. Mariusz Kaczmarek

Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało. Mariusz Kaczmarek Ocena jakościowa reakcji antygen - przeciwciało Mariusz Kaczmarek Antygeny Immunogenność - zdolność do wzbudzenia przeciwko sobie odpowiedzi odpornościowej swoistej; Antygenowość - zdolność do reagowania

Bardziej szczegółowo

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO Załącznik nr 2 SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO CZĘŚĆ I STRESZCZENIE DOKUMENTACJI I A Wniosek o dopuszczenie

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO

SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO Załącznik nr 2 SPOSÓB PRZEDSTAWIANIA DOKUMENTACJI DOŁĄCZANEJ DO WNIOSKU O DOPUSZCZENIE DO OBROTU PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO IMMUNOLOGICZNEGO CZĘŚĆ I - STRESZCZENIE DOKUMENTACJI I A IB I B 1 I

Bardziej szczegółowo

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115

Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115 Genomic Mini AX Body Fluids zestaw do izolacji DNA z płynów ustrojowych wersja 1115 20 izolacji Nr kat. 052-20M tel: +48 58 7351194, fax: +48 58 6228578 info@aabiot.com www.aabiot.com 1 Skład zestawu Składnik

Bardziej szczegółowo

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych

Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Proteomika: umożliwia badanie zestawu wszystkich lub prawie wszystkich białek komórkowych Zalety w porównaniu z analizą trankryptomu: analiza transkryptomu komórki identyfikacja mrna nie musi jeszcze oznaczać

Bardziej szczegółowo

... ...J CD CD. N "f"'" Sposób i filtr do usuwania amoniaku z powietrza. POLITECHNIKA LUBELSKA, Lublin, PL 09.11.2009 BUP 23/09

... ...J CD CD. N f' Sposób i filtr do usuwania amoniaku z powietrza. POLITECHNIKA LUBELSKA, Lublin, PL 09.11.2009 BUP 23/09 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)212766 (13) 81 (21) Numer zgłoszenia 385072 (51) Int.CI 801D 53/04 (2006.01) C01C 1/12 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 28.09.1995, PCT/DK95/00388

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 28.09.1995, PCT/DK95/00388 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 319401 (22) Data zgłoszenia: 28.09.1995 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane

Bardziej szczegółowo

Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie

Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie Mikroorganizmy Zmodyfikowane Genetycznie DEFINICJA Mikroorganizm (drobnoustrój) to organizm niewidoczny gołym okiem. Pojęcie to nie jest zbyt precyzyjne lecz z pewnością mikroorganizmami są: bakterie,

Bardziej szczegółowo

Przeciwciała poliklonalne przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób ich wytwarzania. (74) Pełnomocnik:

Przeciwciała poliklonalne przeciwko białkom Helicobacter pylori oraz sposób ich wytwarzania. (74) Pełnomocnik: RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201982 (21) Numer zgłoszenia: 361069 (22) Data zgłoszenia: 03.07.2003 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/40 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

Priony. co dobrego mówią nam drożdże? Takao Ishikawa Zakład Biologii Molekularnej Uniwersytet Warszawski

Priony. co dobrego mówią nam drożdże? Takao Ishikawa Zakład Biologii Molekularnej Uniwersytet Warszawski Priony co dobrego mówią nam drożdże? Takao Ishikawa Zakład Biologii Molekularnej Uniwersytet Warszawski Choroba Kreutzfeldta-Jakoba Pierwsze opisy pochodzą z lat 30. XX wieku Zakaźna choroba, często rodzinna

Bardziej szczegółowo

PROCEDURA POSTĘPOWANIA POEKSPOZYCYJNEGO W PRZYPADKU WYSTĄPIENIA NARAŻENIA ZAWODOWEGO NA MATERIAŁ ZAKAŹNY

PROCEDURA POSTĘPOWANIA POEKSPOZYCYJNEGO W PRZYPADKU WYSTĄPIENIA NARAŻENIA ZAWODOWEGO NA MATERIAŁ ZAKAŹNY PROCEDURA POSTĘPOWANIA POEKSPOZYCYJNEGO W PRZYPADKU WYSTĄPIENIA NARAŻENIA ZAWODOWEGO NA MATERIAŁ ZAKAŹNY 1. CEL Celem procedury jest określenie zasad postępowania w przypadku wystąpienia u pracownika ekspozycji

Bardziej szczegółowo

PL B1. W.C. Heraeus GmbH,Hanau,DE ,DE, Martin Weigert,Hanau,DE Josef Heindel,Hainburg,DE Uwe Konietzka,Gieselbach,DE

PL B1. W.C. Heraeus GmbH,Hanau,DE ,DE, Martin Weigert,Hanau,DE Josef Heindel,Hainburg,DE Uwe Konietzka,Gieselbach,DE RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204234 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 363401 (51) Int.Cl. C23C 14/34 (2006.01) B22D 23/06 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22)

Bardziej szczegółowo

B. ULOTKA INFORMACYJNA

B. ULOTKA INFORMACYJNA B. ULOTKA INFORMACYJNA 1 ULOTKA INFORMACYJNA Versifel FeLV 1. NAZWA I ADRES PODMIOTU ODPOWIEDZIALNEGO ORAZ WYTWÓRCY ODPOWIEDZIALNEGO ZA ZWOLNIENIE SERII, JEŚLI JEST INNY Podmiot odpowiedzialny: Zoetis

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2131847. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 27.02.2008 08716068.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2131847. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 27.02.2008 08716068. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2131847 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 27.02.2008 08716068.5

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2014 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej EXTRACTME jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy BLIRT S.A. www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU

Bardziej szczegółowo

PL 213904 B1. Elektrolityczna, nanostrukturalna powłoka kompozytowa o małym współczynniku tarcia, zużyciu ściernym i korozji

PL 213904 B1. Elektrolityczna, nanostrukturalna powłoka kompozytowa o małym współczynniku tarcia, zużyciu ściernym i korozji PL 213904 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 213904 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 390004 (51) Int.Cl. C25D 3/12 (2006.01) C25D 15/00 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2004 04740699.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2004 04740699. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1658064 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 06.07.2004 04740699.6 (51) Int. Cl. A61K31/37 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA

PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA PathogenFree RNA Isolation Kit Zestaw do izolacji RNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Specyfikacja zestawu 2 2.3

Bardziej szczegółowo

Wybrane zastosowania metod inżynierii genetycznej

Wybrane zastosowania metod inżynierii genetycznej Wybrane zastosowania metod inżynierii genetycznej Inżynieria genetyczna to inaczej ingerencja w materiał genetyczny organizmów, w celu zmiany ich właściwości dziedzicznych. Polega ona na wprowadzaniu do

Bardziej szczegółowo

(54) Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne

(54) Sposób immunologicznego wykrywania przeciwciał naturalnych, przeciwciała naturalne RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 319878 (22) Data zgłoszenia: 30.10.1995 (86) Data 1 numer zgłoszenia międzynarodowego

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 185228

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 185228 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 185228 (21) Numer zgłoszenia: 331212 ( 13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 04.07.1997 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US99/21960 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197408 (21) Numer zgłoszenia: 346772 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 21.09.1999 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII

ĆWICZENIA Z BIOCHEMII ĆWICZENIA Z BIOCHEMII D U STUDENTfiW WYDZIAŁU LEKARSKIEGO Pod redakcją Piotra Laidlera, Barbary Piekarskiej, Marii Wróbel WYDAWNICTWO UNIWERSYTETU JAGIELLOŃSKIEGO ĆWICZENIA Z BIOCHEMII DLA STUDENTÓW WYDZIAŁU

Bardziej szczegółowo

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia

Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 1 Zakład Mikrobiologii UJK Instrukcje do ćwiczeń oraz zakres materiału realizowanego na wykładach z przedmiotu Inżynieria bioprocesowa na kierunku biotechnologia 2 Zakład Mikrobiologii UJK Zakres materiału

Bardziej szczegółowo

PL 178509 B1 (13) B1. (51) IntCl6: C23C 8/26. (54) Sposób obróbki cieplno-chemicznej części ze stali nierdzewnej

PL 178509 B1 (13) B1. (51) IntCl6: C23C 8/26. (54) Sposób obróbki cieplno-chemicznej części ze stali nierdzewnej RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 178509 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 305287 (22) Data zgłoszenia: 03.10.1994 (51) IntCl6: C23C 8/26 (54)

Bardziej szczegółowo

Dobierając optymalny program szczepień, jesteśmy w stanie zapobiec chorobom, które mogą być zagrożeniem dla zdrowia Państwa pupila.

Dobierając optymalny program szczepień, jesteśmy w stanie zapobiec chorobom, które mogą być zagrożeniem dla zdrowia Państwa pupila. SZCZEPIENIA KOTÓW Działamy według zasady: Lepiej zapobiegać niż leczyć Wychodząc naprzeciw Państwa oczekiwaniom oraz dbając o dobro Waszych pupili opisaliśmy program profilaktyczny chorób zakaźnych psów,

Bardziej szczegółowo

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR)

AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) AmpliTest Salmonella spp. (Real Time PCR) Zestaw do wykrywania sekwencji DNA specyficznych dla bakterii z rodzaju Salmonella techniką Real Time PCR Nr kat.: BAC01-50 Wielkość zestawu: 50 oznaczeń Objętość

Bardziej szczegółowo

Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii

Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii chroń swoje pomysły 3 Kongres Świata Przemysłu Farmaceutycznego Poznań, 16-17 czerwca 2011 Patentowanie wynalazków z dziedziny biotechnologii dr Izabela Milczarek Czym jest biotechnologia? Biotechnologia,

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV

Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Ćwiczenie 3. Amplifikacja genu ccr5 Homo sapiens wykrywanie delecji Δ32pz warunkującej oporność na wirusa HIV Cel ćwiczenia Określenie podatności na zakażenie wirusem HIV poprzez detekcję homo lub heterozygotyczności

Bardziej szczegółowo

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK

Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia Komórki - laboratorium PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK WSTĘP Aby wyizolować białka otrzymane np. w systemach

Bardziej szczegółowo

Plasmid Mini AX Gravity

Plasmid Mini AX Gravity !"# Plasmid Mini AX Gravity zestaw do izolacji ultraczystego plazmidowego DNA (plazmidy wysokokopijne) wersja 0515/I 100 izolacji Nr kat. 015-100 1 Skład zestawu Składnik Ilość Temp. Przechowywania Kolumny

Bardziej szczegółowo

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 08.03.2000, PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: 08.03.2000, PCT/NL00/00152 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 204373 (21) Numer zgłoszenia: 351486 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 08.03.2000 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

Rozmnażanie i wzrost komórek sąściśle kontrolowane. Genetyczne podłoże nowotworzenia

Rozmnażanie i wzrost komórek sąściśle kontrolowane. Genetyczne podłoże nowotworzenia Rozmnażanie i wzrost komórek sąściśle kontrolowane Genetyczne podłoże nowotworzenia Rozmnażanie i wzrost komórek sąściśle kontrolowane Rozmnażanie i wzrost komórek sąściśle kontrolowane Połączenia komórek

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU

SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU SCENARIUSZ LEKCJI BIOLOGII Z WYKORZYSTANIEM FILMU Czy priony zawsze są szkodliwe? SPIS TREŚCI: Wprowadzenie. Części lekcji. 1. Część wstępna. 2. Część realizacji. 3. Część podsumowująca. Karty pracy. 1.

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: 332282 (22) Data zgłoszenia: 17.09.1997 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej

Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT Nr kat. EM05 Wersja zestawu: 1.2012 Zestaw do izolacji DNA z krwi świeżej i mrożonej DNA BLOOD KIT www.dnagdansk.com Nr kat. EM05 I. PRZEZNACZENIE ZESTAWU Zestaw EXTRACTME DNA BLOOD przeznaczony

Bardziej szczegółowo

Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją).

Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją). Historia informacji genetycznej. Jak ewolucja tworzy nową informację (z ma ą dygresją). Czym jest życie? metabolizm + informacja (replikacja) 2 Cząsteczki organiczne mog y powstać w atmosferze pierwotnej

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Aparatura

Spis treści. Aparatura Spis treści Aparatura I. Podstawowe wyposażenie laboratoryjne... 13 I.I. Probówki i naczynia laboratoryjne... 13 I.II. Pipety... 17 I.II.I. Rodzaje pipet automatycznych... 17 I.II.II. Techniki pipetowania...

Bardziej szczegółowo

DNA musi współdziałać z białkami!

DNA musi współdziałać z białkami! DNA musi współdziałać z białkami! Specyficzność oddziaływań między DNA a białkami wiążącymi DNA zależy od: zmian konformacyjnych wzdłuż cząsteczki DNA zróżnicowania struktury DNA wynikającego z sekwencji

Bardziej szczegółowo

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki

wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Genetyka ogólna wykład dla studentów II roku biotechnologii Andrzej Wierzbicki Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii andw@ibb.waw.pl http://arete.ibb.waw.pl/private/genetyka/ Wykład 5 Droga od genu do

Bardziej szczegółowo

Technologie wytwarzania szczepionek

Technologie wytwarzania szczepionek Technologie wytwarzania szczepionek Szczepionki preparaty biofarmaceutyczne chroniące organizm przed czynnikami infekcyjnymi poprzez pobudzenie jego odpowiedzi immunologicznej. Szczepionki klasyczne (I

Bardziej szczegółowo

THE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE

THE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE THE UNFOLDED PROTEIN RESPONSE Anna Czarnecka Źródło: Intercellular signaling from the endoplasmatic reticulum to the nucleus: the unfolded protein response in yeast and mammals Ch. Patil & P. Walter The

Bardziej szczegółowo

PL 189448 B1 (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 189448 (13) B1. (51) IntCl7 A63F 9/08. (54) Łamigłówka. (73) Uprawniony z patentu:

PL 189448 B1 (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 189448 (13) B1. (51) IntCl7 A63F 9/08. (54) Łamigłówka. (73) Uprawniony z patentu: RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 189448 (21) Numer zgłoszenia: 338426 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 14.07.1998 (86) Data i numer zgłoszenia

Bardziej szczegółowo

-1- Preparat o właściwościach immunoregulatorowych

-1- Preparat o właściwościach immunoregulatorowych -1- Preparat o właściwościach immunoregulatorowych Przedmiotem wynalazku jest preparat o właściwościach immunoregulatorowych. Wynalazek może znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym i farmaceutycznym,

Bardziej szczegółowo

PL 216012 B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL 11.10.2010 BUP 21/10

PL 216012 B1. UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL 11.10.2010 BUP 21/10 PL 216012 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 216012 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 391223 (22) Data zgłoszenia: 14.05.2010 (51) Int.Cl.

Bardziej szczegółowo

Suplementy. Wilkasy 2014. Krzysztof Gawin

Suplementy. Wilkasy 2014. Krzysztof Gawin Suplementy Wilkasy 2014 Krzysztof Gawin Suplementy diety - definicja Suplement diety jest środkiem spożywczym, którego celem jest uzupełnienie normalnej diety, będący skoncentrowanym źródłem witamin lub

Bardziej szczegółowo

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624. Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku

Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624. Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008 roku Warszawski Uniwersytet Medyczny Wydział Farmaceutyczny Oddział Analityki Medycznej Justyna Krystyna Ciepły Nr albumu 41624 Charakterystyka lekoopornych szczepów wirusa HIV 1 izolowanych w Polsce w 2008

Bardziej szczegółowo

Immunologia komórkowa

Immunologia komórkowa Immunologia komórkowa ocena immunofenotypu komórek Mariusz Kaczmarek Immunofenotyp Definicja I Charakterystyczny zbiór antygenów stanowiących elementy różnych struktur komórki, związany z jej różnicowaniem,

Bardziej szczegółowo

CHARAKTERYSTYKA PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO

CHARAKTERYSTYKA PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO CHARAKTERYSTYKA PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO 1 1. NAZWA PRODUKTU LECZNICZEGO WETERYNARYJNEGO Rispoval 3 BRSV PI3 BVD Liofilizat i zawiesina do sporządzania zawiesiny do wstrzykiwań dla bydła. 2.

Bardziej szczegółowo

Syngen Viral Mini Kit. Syngen Viral

Syngen Viral Mini Kit. Syngen Viral Syngen Viral Mini Kit Syngen Viral Mini Kit PLUS Zestawy do izolacji materiału genetycznego wirusów (DNA i RNA) z próbek: - osocza - surowicy - płynów ustrojowych pozbawionych komórek - pożywki znad hodowli

Bardziej szczegółowo

Zadanie 2. (2 pkt) Na schemacie przedstawiono namnażanie się retrowirusa HIV wewnątrz limfocytu T (pomocniczego) we krwi człowieka.

Zadanie 2. (2 pkt) Na schemacie przedstawiono namnażanie się retrowirusa HIV wewnątrz limfocytu T (pomocniczego) we krwi człowieka. Zadanie 1. (3 pkt) W aptekach dostępne są bez recepty różnego rodzaju preparaty lecznicze podnoszące odporność, zwane immunostymulatorami. Przeważnie zawierają substancje pochodzenia roślinnego, np. z

Bardziej szczegółowo

ANEKS I. Strona 1 z 5

ANEKS I. Strona 1 z 5 ANEKS I WYKAZ NAZW, POSTAĆ FARMACEUTYCZNA, MOC WETERYNARYJNYCH PRODUKTÓW LECZNICZYCH, GATUNKI ZWIERZĄT, DROGA PODANIA, PODMIOT ODPOWIEDZIALNY POSIADAJĄCY POZWOLENIE NA DOPUSZCZENIE DO OBROTU W PAŃSTWACH

Bardziej szczegółowo

Kiedy lekarz powinien decydować o wyborze terapii oraz klinicznej ocenie korzyści do ryzyka stosowania leków biologicznych lub biopodobnych?

Kiedy lekarz powinien decydować o wyborze terapii oraz klinicznej ocenie korzyści do ryzyka stosowania leków biologicznych lub biopodobnych? Kiedy lekarz powinien decydować o wyborze terapii oraz klinicznej ocenie korzyści do ryzyka stosowania leków biologicznych lub biopodobnych? prof. dr hab. med.. Piotr Fiedor Warszawski Uniwersytet Medyczny

Bardziej szczegółowo

Feli Immun. Feli Immun. Tabletki. Naturalny dodatek do karmy wzmacniający odporność organizmu u kotów

Feli Immun. Feli Immun. Tabletki. Naturalny dodatek do karmy wzmacniający odporność organizmu u kotów Feli Immun Tabletki Feli Immun Naturalny dodatek do karmy wzmacniający odporność organizmu u kotów > Zastosowanie Feli Immun Pomóż swojemu kotu! Produkty linii anivital dla kotów poprawiają kondycję, zdrowie

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.09.2005 05789871.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.09.2005 05789871. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1791422 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 08.09.2005 05789871.0 (51) Int. Cl. A01N1/02 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

(43) Zgłoszenie ogłoszono: (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)166780 (13) B1 PL 166780 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA

(43) Zgłoszenie ogłoszono: (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)166780 (13) B1 PL 166780 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)166780 (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 2 9 3 0 5 8 (22) Data zgłoszenia: 0 2.0 1.1 9 9 2 (51) IntCl6: C 02F

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.06.2006 06754350.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.06.2006 06754350. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1901698 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.06.2006 06754350.4 (51) Int. Cl. A61K36/76 (2006.01)

Bardziej szczegółowo

RYCYNA. Ricinus communis. Z notatnika terrorysty...

RYCYNA. Ricinus communis. Z notatnika terrorysty... Z notatnika terrorysty... wielokrotnie stosowana do zabójstw - skuteczna łatwo dostępna: 1-5% znajduje się w nasionach rącznika pospolitego (Ricinus communis, rodzina Euphorbiaceae), z których wytłacza

Bardziej szczegółowo

RAPORT Z BADAŃ 164/Z/20110825/D/JOGA. Dostarczony materiał: próbki tworzyw sztucznych. Ilość próbek: 1. Rodzaj próbek: tworzywo

RAPORT Z BADAŃ 164/Z/20110825/D/JOGA. Dostarczony materiał: próbki tworzyw sztucznych. Ilość próbek: 1. Rodzaj próbek: tworzywo Blirt S.A. 80-172 Gdańsk, ul. Trzy Lipy 3/1.38 RAPORT Z BADAŃ Dział DNA-Gdańsk Nr zlecenia 164/Z/20110825/D/JOGA NAZWA I ADRES KLIENTA GROUND-Therm spółka z o.o. ul. Stepowa 30 44-105 Gliwice Tytuł zlecenia:

Bardziej szczegółowo

Recenzja pracy doktorskiej Mgr Natalii Sawki. gatunków zespołu Paramecium aurelia

Recenzja pracy doktorskiej Mgr Natalii Sawki. gatunków zespołu Paramecium aurelia NENCKI INSTITUTE OF EXPERIMENTAL BIOLOGY POLISH ACADEMY OF SCIENCES 3, Pasteur Str, 02-093 Warsaw, Poland Phone: (48-22) 5892357; Fax: (48-22) 822 53 42 Recenzja pracy doktorskiej Mgr Natalii Sawki pt.

Bardziej szczegółowo

INFORMACJA O LEKU DLA PACJENTA Należy zapoznać się z właściwościami leku przed zastosowaniem

INFORMACJA O LEKU DLA PACJENTA Należy zapoznać się z właściwościami leku przed zastosowaniem INFORMACJA O LEKU DLA PACJENTA Należy zapoznać się z właściwościami leku przed zastosowaniem Hiberix Vaccinum haemophili influenzae stripe b conjugatum Proszek i rozpuszczalnik do sporządzenia zawiesiny

Bardziej szczegółowo

Syngen Gel/PCR Mini Kit

Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR Mini Kit Syngen Gel/PCR ME Mini Kit Zestawy do oczyszczania DNA: - z żelu agarozowego - po reakcji PCR i innych reakcjach enzymatycznych - z żelu agarozowego z małą objętością elucji - po

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Ćwiczenie 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Część doświadczalna obejmuje: - sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy - oznaczanie aktywności

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie

SCENARIUSZ LEKCJI. TEMAT LEKCJI: Podstawowe techniki inżynierii genetycznej. Streszczenie SCENARIUSZ LEKCJI OPRACOWANY W RAMACH PROJEKTU: INFORMATYKA MÓJ SPOSÓB NA POZNANIE I OPISANIE ŚWIATA. PROGRAM NAUCZANIA INFORMATYKI Z ELEMENTAMI PRZEDMIOTÓW MATEMATYCZNO-PRZYRODNICZYCH Autorzy scenariusza:

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)187065 (2 1) Numer zgłoszenia: 319023 (22) Data zgłoszenia: 18.03.1997 (13)B1 (51) IntCl7 A63F 9/08 (54) Układanka

Bardziej szczegółowo

Profil metaboliczny róŝnych organów ciała

Profil metaboliczny róŝnych organów ciała Profil metaboliczny róŝnych organów ciała Uwaga: tkanka tłuszczowa (adipose tissue) NIE wykorzystuje glicerolu do biosyntezy triacylogliceroli Endo-, para-, i autokrynna droga przekazu informacji biologicznej.

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA

Bardziej szczegółowo

Substancje o Znaczeniu Biologicznym

Substancje o Znaczeniu Biologicznym Substancje o Znaczeniu Biologicznym Tłuszcze Jadalne są to tłuszcze, które może spożywać człowiek. Stanowią ważny, wysokoenergetyczny składnik diety. Z chemicznego punktu widzenia głównym składnikiem tłuszczów

Bardziej szczegółowo

Załącznik nr 4 Metodyka pobrania materiału przedstawiona jest w osobnym Instrukcja PZH

Załącznik nr 4 Metodyka pobrania materiału przedstawiona jest w osobnym Instrukcja PZH Załącznik nr 4 Metodyka pobrania materiału przedstawiona jest w osobnym Instrukcja PZH 1. Rodzaj materiału klinicznego w zależności od kierunku i metodyki badań wykonywanych przez PZH Poz. Badanie Rodzaj

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2124961. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 26.03.2008 08787851.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2124961. (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 26.03.2008 08787851. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2124961 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 26.03.08 0878781.8

Bardziej szczegółowo

Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006

Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006 Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus 25 października 2006 Dr Tobias J. Tuthill Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytet Leeds Leeds LS2 9JT www.fbs.leeds.ac.uk

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.10.2005 05809271.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14.10.2005 05809271. RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 181262 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 14..0 0809271.9 (1) Int. Cl. C12N/071 (06.01) (97) O udzieleniu

Bardziej szczegółowo

Saccharomyces cerevisiae 100% i preparaty na bazie tych drożdży

Saccharomyces cerevisiae 100% i preparaty na bazie tych drożdży Saccharomyces cerevisiae 100% i preparaty na bazie tych drożdży Ideą stworzenia marki AgroYeast było długotrwałe doświadczenie w pracy z drożdżami piwowarskimi Saccharomyces cerevisiae i ich oddziaływaniem

Bardziej szczegółowo

METODY CHEMOMETRYCZNE W IDENTYFIKACJI ŹRÓDEŁ POCHODZENIA

METODY CHEMOMETRYCZNE W IDENTYFIKACJI ŹRÓDEŁ POCHODZENIA METODY CHEMOMETRYCZNE W IDENTYFIKACJI ŹRÓDEŁ POCHODZENIA AMFETAMINY Waldemar S. Krawczyk Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Komendy Głównej Policji, Warszawa (praca obroniona na Wydziale Chemii Uniwersytetu

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Wprowadzenie: Większość lądowych organizmów kręgowych część jonów amonowych NH + 4, produktu rozpadu białek, wykorzystuje w biosyntezie

Bardziej szczegółowo

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) N um er zgłoszenia: 312204 (2 2 ) D ata zgłoszenia: 22.06.1994 (86) D ata i num er zgłoszenia m iędzynarodow

Bardziej szczegółowo

Zadanie 2. (1 pkt) Uzupełnij tabelę, wpisując wzory sumaryczne tlenków w odpowiednie kolumny. CrO CO 2 Fe 2 O 3 BaO SO 3 NO Cu 2 O

Zadanie 2. (1 pkt) Uzupełnij tabelę, wpisując wzory sumaryczne tlenków w odpowiednie kolumny. CrO CO 2 Fe 2 O 3 BaO SO 3 NO Cu 2 O Test maturalny Chemia ogólna i nieorganiczna Zadanie 1. (1 pkt) Uzupełnij zdania. Pierwiastek chemiczny o liczbie atomowej 16 znajduje się w.... grupie i. okresie układu okresowego pierwiastków chemicznych,

Bardziej szczegółowo

Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO)

Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO) Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO) Organizmy modyfikowane genetycznie Organizm zmodyfikowany genetycznie (międzynarodowy skrót: GMO Genetically Modified Organizm) to organizm o zmienionych cechach,

Bardziej szczegółowo

(54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny),

(54) Sposób wytwarzania rekombinacyjnego białka Pallidipiny (Asp-Pallidipiny), RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11)184617 (21) Numer zgłoszenia: 319078 (22) Data zgłoszenia: 11.09.1995 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

Bardziej szczegółowo

Gdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle. czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych

Gdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle. czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych Gdzie chirurg nie może - - tam wirusy pośle czyli o przeciwnowotworowych terapiach wirusowych Wirusy zwiększające ryzyko rozwoju nowotworów HBV EBV HCV HTLV HPV HHV-8 Zmniejszenie liczby zgonów spowodowanych

Bardziej szczegółowo