Farmaceutyczny. Scientific Review in Pharmacy. Cena 24,50 zł ISSN Hepcydyna hormon regulujący gospodarkę żelaza

Transkrypt

1 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Farmaceutyczny Cena 24,50 zł PISMO POD PATRONATEM Przegląd WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU Naukowy MEDYCZNEGO W KATOWICACH IC Value - Current 3.66 MNiSW 4 ROK VI (X) Nr 12/2009 (59) Miesięcznik Scientific Review in Pharmacy Hepcydyna hormon regulujący gospodarkę żelaza Wpływ metioniny na toksyczność fluoru w osoczu krwi szczurów Wiek jako czynnik modyfikujący profil izoform cytochromu P450 w wątrobie szczura Wyznaczanie aktywności inhibitorów acetylocholinoesterazy przy pomocy modelu matematycznego. Nowy rozdział w projektowaniu leków0 Metody biologii molekularnej wykorzystywane w diagnostyce parazytologicznej chorób wywoływanych przez pierwotniaki (Protozoa) Środowisko naturalne jako potencjalne źródło występowania roztoczy alergennych w mieszkaniach 0i pomieszczeniach gospodarstw wiejskich ISSN Zastosowanie kolumn wypełnionych żywicą jonowymienną w preparatyce alkaloidów protoberberynowych w ekstraktach z berberysu kreteńskiego 1 (Berberis Cretica)

2

3 Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Przegląd Naukowy Scientific Review in Pharmacy Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Adres redakcji / Editorial Adress: ul. Jedności 8, Sosnowiec, Polska / Poland Tel , Fax kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board Przewodniczący / Head: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie / Members: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka fpn@kwiecinski.pl Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura Półtorak Dr n. hum. Anna Kierczak Wydawca / Publisher: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego Adres Wydawcy / Publisher Adress: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, Bielsko-Biała, Polska / Poland tel , fax Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor: Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy Partyka agnieszka.romanska@kwiecinski.pl Nakład: do egz. / Print run: up to 7000 copies Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for advertisements and reader letters.

4 Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Zapraszam serdecznie na łamy 12 numeru Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego, który to zeszyt zamyka miniony już rok Z przyjemnością anonsuję nadchodzący, XXI Naukowy Zjazd Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego, który w bieżącym roku odbędzie się w Gdańsku, w dniach września. Organizatorami Zjazdu są Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego oraz Oddział Gdański Polskiego Towarzystwa Farmaceutycznego. Motto Zjazdu to Farmacja polska na tle Unii Europejskiej. Zamieszczamy Komunikat I, przygotowany przez Organizatorów. Życzymy, by nadchodzący Zjazd był równie udany jak poprzednie, a jego obrady oraz towarzyszące imprezy zapadły na zawsze w pamięci uczestników tego Przedsięwzięcia. Pozwalam sobie także przypomnieć Państwu o innym, znaczącym dla europejskiej farmacji wydarzeniu, to jest o dorocznym Kongresie Europejskiego Stowarzyszenia Studentów Farmacji EPSA. 33 rd European Pharmaceutical Students Association Annual Congress odbędzie się w Krakowie, w dniach 26 kwiecień 2 maj br. Miło mi Państwa poinformować, iż Organizatorzy Kongresu zwrócili się do nas z prośbą o objęcie przez Farmaceutyczny Przegląd Naukowy patronatu medialnego nad nadchodzącym Kongresem. Jest to dla nas ogromny zaszczyt i z największą przyjemnością, wraz z Wydawcą naszego czasopisma weźmiemy udział w obradach Kongresu i promocji naukowych dokonań jego Uczestników. Serdecznie dziękujemy Organizatorom za zaufanie i tak znaczące wyróżnienie. W bieżącym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego znajdziemy wartościowe publikacje o zróżnicowanej tematyce, które powstały w różnych Ośrodkach Akademickich naszego kraju. Ta zróżnicowana tematyka jest bogactwem przedkładanego Państwu zeszytu. Życząc zatem miłej i owocnej lektury, jednocześnie obiecuję, iż następny zeszyt, już z bieżącego roku 2010, niebawem do Państwa dotrze. Z serdecznymi pozdrowieniami, Redaktor Naczelny Prof. dr hab. Krystyna Olczyk

5 Farmaceutyczny PISMO POD PATRONATEM WYDZIAŁU FARMACEUTYCZNEGO ŚLĄSKIEGO UNIWERSYTETU MEDYCZNEGO W KATOWICACH Miesięcznik Przegląd Naukowy Scientific Review in Pharmacy Nr 12 / 2009 Index Copernicus 3,66 MNiSW 4 Spis treści Hepcydyna hormon regulujący gospodarkę żelaza0 8 Hepcidin iron balance regulating hormone Wpływ metioniny na toksyczność fluoru 0w osoczu krwi szczurów0 14 The effect of methionine on toxicity of fluoride in blood plasma of rats Wiek jako czynnik modyfikujący profil izoform cytochromu P450 w wątrobie szczura0 18 Age modification cytochrome P450 isoforms content in rat liver Wyznaczanie aktywności inhibitorów acetylocholinoesterazy przy pomocy modelu matematycznego. Nowy rozdział w projektowaniu leków0 24 The prediction of acetylcholinesterase inhibitor activity using a mathematical model: a new age in drug design Metody biologii molekularnej wykorzystywane w diagnostyce parazytologicznej chorób wywoływanych przez pierwotniaki (Protozoa) 30 Molecular biology methods used in the diagnosis of parasitic disease caused by protozoans (Protozoa) Środowisko naturalne jako potencjalne źródło występowania roztoczy alergennych w mieszkaniach 0i pomieszczeniach gospodarstw wiejskich0 37 Natural environment as a potential source of the occurrence of allergenic mites in dwellings and farming environments Zastosowanie kolumn wypełnionych żywicą jonowymienną w preparatyce alkaloidów protoberberynowych w ekstraktach z berberysu kreteńskiego (Berberis Cretica)0 44 Resin columns in analysis of protoberberine alkaloids from different extracts of cretan barberry (Berberis Cretica)

6

7

8 Farm Przegl Nauk, 2009,12, 8-12 Hepcydyna hormon regulujący gospodarkę żelaza Hepcidin iron balance regulating hormone Aleksandra Mianowska, Sławomir Białek, Jan Pachecka Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Wydział Farmaceutyczny Warszawski Uniwersytet Medyczny Streszczenie Hepcydyna jest hormonem peptydowym regulującym homeostazę żelaza. Jest syntetyzowana głównie w wątrobie w postaci 84 aminokwasowego prepropeptydu w odpowiedzi na przeładowanie żelazem i stan zapalny. Jest kluczowym mediatorem w niedokrwistości chorób zapalnych, gdzie nadekspresja hepcydyny prowadzi do hipoferremii spowodowanej zmniejszeniem wchłaniania żelaza z dwunastnicy i jego zatrzymania w makrofagach układu siateczkowato-śródbłonkowego. Mechanizm działania hepcydyny polega na degradacji ferroportyny, jedynego transportera żelaza z komórek. Ostatnie badania dowodzą, że w regulację ekspresji hepcydyny zaangażowane są białka morfogenetyczne kości oraz hemojuwelina będąca ich koreceptorem. Biorac pod uwagę funkcję fizjologiczną hepcydyny oraz jej udział w patogenezie niedokrwistości i innych zaburzeń metabolizmu żelaza hepcydyna mogłaby się stać czułym parametrem w diagnostyce tych schorzeń. Słowa kluczowe: hepcydyna, białka morfogenetyczne kości, hemojuwelina, hemochromatoza Abstract Hepcidin is a principal peptide hormone regulates iron homeostasis. It s synthesized mainly in the liver as a 84-aminoacid prepropeptide in a response to iron overload and inflammation. It s a key mediator in anemia of chronic diseases, where hepcidin hiperexpression leads to hypoferemia due to decreasing of duodenal iron absorption and its sequestration in reticuloendothelial system macrophages. Action mechanism of hepcidin is based on degradation ferroportin, which is the only iron transporter from cells. The latest research demonstrate that, in regulation of hepcidin expression are involved bone morphogenic proteins and hemojuvelin which is their co-receptor. Concerning its physiological function, participating in anaemia pathogenesis and other iron metabolism disorder hepcidin might appeared as a sensitive parameter in diagnostics of these diseases. Key words: hepcidin, bone morphogenetic proteins, hemojuvelin, haemochromatosis Regulacja homeostazy żelaza Żelazo wchodzi w skład niezbędnych do życia dla większości organizmów hemoprotein, takich jak hemoglobina, mioglobina, cytochrom c, cytochrom P-450, katalaza, 2,3- dioksygenaza tryptofanowa. Jego stężenie w tkankach i płynach fizjologicznych musi być ściśle regulowane, ponieważ zarówno niedobór jak i nadmiar żelaza prowadzą do poważnych stanów patologicznych. Jony żelaza niezwiązane z wysokocząsteczkowymi ligandami powodują powstawanie reaktywnych rodników wodorotlenowych i ponadtlenkowych, które mogą wchodzić w reakcję z komórkowym DNA, białkami, lipidami oraz węglowodanami powodując ich uszkodzenie, upośledzenie syntezy białek, indukcję proteaz a nawet śmierć komórki [1,2]. W organizmie zdrowego dorosłego człowieka ilość żelaza to około mg/ kg m.c., z czego 60 70% jest związane z hemoglobiną erytrocytów krążących, 10% z mioglobiną, cytochromami oraz enzymami komórkowymi, 20 30% gromadzone jest w hepatocytach i makrofagach układu siateczkowo-śródbłonkowego jako ferrytyna lub hemosyderyna. Około 1% wewnątrzustrojowych zapasów żelaza pozostaje związane z transferyną, która transportuje żelazo wchłonięte z dwunastnicy bądź uwolnione podczas rozkładu erytrocytów do szpiku kostnego gdzie ferrochelataza wbudowuje je do protoporfiryny IX tworząc hem. Należy zaznaczyć, że tylko 1/3 transferyny jest wysycona żelazem [3-5]. Wchłanianie żelaza z początkowego odcinka dwunastnicy podlega ścisłej regulacji, ponieważ nie ma znaczącego mechanizmu wydalania nadmiaru żelaza z organizmu. Utrata tego pierwiastka może jedynie nastąpić wraz ze złuszczającymi się komórkami nabłonka jelitowego, podczas menstruacji, ciąży, laktacji. Żelazo potrzebne do erytropoezy (20 mg na dzień, u dorosłego człowieka) jest odzyskiwane po rozpadzie starych erytrocytów. Reutylizacją żelaza zajmują się makrofagi układu siateczkowo- śródbłonkowego wątroby, śledziony i szpiku. Zdrowi ludzie wchłaniają 1-4 mg żelaza dziennie. W procesie absorbcji uczestniczą: reduktaza żelazowa (cytochrom b dwunastnicy, duodenal cytochrome b, Dcytb), która redukuje żelazo pokarmowe z trzeciego na drugi stopień utlenienia, transporter żelaza dwuwartościowego białko DMT-1, które wiąże jony Fe 2+ i przenosi je do wnętrza en- 8

9 terocytów, znajdująca się na błonie podstawno bocznej enterocytów ferroportyna (Fpn) oraz ferrooksydaza (hefajstyna), która utlenia żelazo zanim zostanie ono związane przez osoczową transferynę. Transferyna może wiązać jeden lub dwa atomy żelaza (transferyna monoferrycza i diferryczna). Białko to przenosi żelazo do wszystkich komórek organizmu, m.in. wątroby, głównego magazynu żelaza. Aby pobrać kompleks transferyny związanej z żelazem (Tf-Fe) komórki mają na swojej powierzchni receptor dla transferyny. Na powierzchni komórek wątroby znajdują się receptory TfR2, na powierzchni pozostałych komórek ulega ekspresji receptor TfR1. Żelazo odłączone od transferyny jest przenoszone do cytoplazmy przez białko DMT-1. Prawidłowe pobieranie żelaza przez komórki warunkuje białko HFE, które w obecności β2- mikroglobuliny reaguje z TfR. HFE jest białkiem homologicznym z cząsteczkami klasy I głównego układu zgodności tkankowej i ulega ekspresji we wszystkich komórkach, z wyjątkiem mózgu [3,4]. Hepcydyna copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Za regulację gospodarki żelazem odpowiedzialna jest hepcydyna, mały bogaty w cysteinę, kationowy peptyd [6], który został odkryty przez dwie niezależne grupy badaczy. Naukowcy z Centrum UCLA Uniwersytetu Kalifornijskiego wyekstrahowali hepcydynę z ludzkiego moczu jako krążący peptyd wykazujący aktywność antybakteryjną, stąd nazwa uwzględniająca syntezę w wątrobie i właściwości przeciwbakteryjne. Naukowcy z Dolnosaksońskiego Instytutu Badań Peptydów wyizolowali hepcydynę z ultrafiltratu krwi jako LEAP-1 (liver-expressed antimicrobial peptide) [7,8]. Ludzka hepcydyna należy do rodziny β-defensyn. Ulega ekspresji głównie w wątrobie, niski poziom jej ekspresji wykazano w nerce, sercu, mięśniach szkieletowych i mózgu. Co więcej nerki są nie tylko zaangażowane w syntezę hepcydyny, ale także w jej eliminację z ustroju [9]. Ostatnie badania dowodzą, że do syntezy hepcydyny zdolne są także aktywowane antygenami bakteryjnymi makrofagi i neutrofile [10]. Mechanizm działania hepcydyny polega na wiązaniu się z ferroportyną 1, jedynym eksporterem żelaza z komórek [6]. Ferroportyna ulega ekspresji niemal we wszystkich komórkach organizmu, jednak w największych ilościach występuje na powierzchni enterocytów dwunastnicy, makrofagach i hepatocytach. Związanie się ferroportyny z hepcydyną indukuje internalizację i degradację tej pierwszej prowadząc do obniżenia uwalniania żelaza przez komórki. Hepcydyna hamując jelitową absorpcję żelaza, transport łożyskowy i jego uwalnianie z makrofagów zmniejsza ilość tego pierwiastka dostarczaną do dojrzewających w szpiku kostnym erytrocytów. Zatem wzrost produkcji hepcydyny obniża absorpcję żelaza z dwunastnicy i redukuje jego uwalnianie z makrofagów powodując zmniejszenie stężenia żelaza w surowicy [11,12]. Struktura hepcydyny Hepcydyna jest produktem genu HAMP (hepcidin antimicrobial peptide), leżącego na długim ramieniu 19 chromosomu. HAMP jest zbudowany z 2,5 kpz i zawiera 3 egzony i 2 introny. Ludzie i szczury mają jedną kopię genu HAMP, podczas gdy myszy mają dwie funkcjonalne kopie. Gen HAMP jest transkrybowany do 0,4 kpz mrna, które ulega translacji do 84 aminokwasowego prepropeptydu. Preprohormon zawierający na N-końcu 24 aminokwasową sekwencję sygnałową oraz 35 aminokwasowy proregion ulega rozpadowi do 25 aminowasowego aktywnego hormonu. Oprócz 25 aminokwasowej w moczu wykryto też formy 20 i 22 aminokwasowe pozbawione aminokwasów na N- końcu [9,10]. Aktywna 25-aminokwasowa forma hepcydyny tworzy strukturę spinki do włosów dzięki obecności 8 reszt cysteinowych tworzących 4 mostki disiarczkowe, w tym jeden charakterystyczny, utworzony przez dwie sąsiadujące ze sobą cysteiny. Hepcydyna jest u różnych gatunków bardzo konserwatywnym białkiem, głównie dzięki obecności motywów disiarczkowych [6]. Podobna struktura występuje również w wielu peptydach o działaniu przeciwbakteryjnym, które zresztą hepcydyna wywiera in vitro podobnie jak inne defensyny. Jednakże biorąc pod uwagę niskie stężenie hepcydny w surowicy, wynoszące średnio 3,6 ng/ml u zdrowych ochotników [14] nie wydaje się, aby ta aktywność miała znaczenie fizjologiczne. Jest to raczej pozostałość po jej ewolucyjnym pochodzeniu albo wynik strukturalnego ograniczenia narzuconego przez jej aktywność jako hormonu regulującego metabolizm żelaza [2,10]. Ze względu na fakt, że hepcydyna jest produkowana głównie w wątrobie, a nie w śródbłonku to w porównaniu z innymi defensynami ma pewne rozbieżności w budowie i nie wykazuje właściwości chemotaktycznych [9]. Ryc. 1. Sekwencja aminokwasów w prekursorze ludzkiej hepcydyny [13]. 9

10 Farm Przegl Nauk, 2009,12 Regulacja ekspresji hepcydyny Ekspresja hepcydyny jest regulowana na poziomie transkrypcji. Jest pobudzana przez przeładowanie żelazem i stan zapalny oraz hamowana przez hipoksję i anemię [12,15]. Udowodniono, że myszy, u których wywołano niedokrwistość hemolizą bądź flebotomią wykazywały spadek ekspresji hepcydyny w wątrobie. Myszy z indukowaną niedokrwistością drogą flebotomii wykazywały 80% spadek ekspresji hepcydyny. Natomiast iniekcje z fenylohydrazyny (PHZ), powodującej anemię hemolityczną skutkowały trzykrotnym obniżeniem ekspresji HAMP. Przy czym efekt hamowania przez PHZ uzyskano także u myszy przeładowanych żelazem uprzednią iniekcją z dekstranu żelaza. To wskazuje na fakt, że niedokrwistość indukuje obniżenie ekspresji hepcydyny niezależnie od zapasów żelaza w organizmie. Znaczne obniżenie ekspresji hepcydyny zaobserwowano również w hodowlach tkankowych i myszy poddanych hipoksji (2% tlenu). Synteza hepcydyny jest stymulowana przez ostre przeładowanie żelazem. Myszy, którym dożylnie podawano dekstran żelaza wykazywały zwiększenie ekspresji hepcydyny [16]. Pacjenci poddani transfuzji krwi wykazują przeładowanie żelazem, co ma swoje odzwierciedlenie w wynikach laboratoryjnych: TIBC powyżej 50% i poziom ferrytyny przekraczający 300 ng/ml a także 100 krotne zwiększone wydalanie hepcydyny w moczu [10,17]. Również u zdrowych ochotników, którym podano doustnie 65 mg siarczanu żelaza obserwowano już po pięciu godzinach wzrost wydalania hepcydyny w moczu, który był poprzedzony zwiększeniem saturacji osoczowej transferyny. To także sugeruje, że synteza hepcydyny jest stymulowana przez ostre przeładowanie żelazem. Sygnałem dla hepatocytów zaangażowanych w syntezę hepcydyny jest najprawdopodobniej zwiększenie stopnia wysycenia transferyny. Do ciekawych wniosków doszli badacze z Uniwersytetu Kalifornijskiego, którzy poddawali hodowle komórkowe hepatoctów ludzkich działaniu transferyny o różnych stopniach wysycenia żelazem. Uzyskali oni wzrost ekspresji hepcydyny proporcionalny do wysycenia transferyny. Co więcej, tego efektu nie udało się uzyskać za pomocą żelaza niezwiązanego z transferyną [18]. Rola białek morfogenetycznych kości w indukcji ekspresji hepcydyny Ostatnie badania dowiodły, że synteza hepcydyny jest indukowana przez białka morfogenetyczne kości (bone morphogenetic protein BMP). Należą one do cytokin z rodziny TGF- β [1]. Białka morfogenetyczne kości odgrywają ważną rolę na różnych etapach rozwoju kręgowców jak różnicowanie mezodermy, neurogeneza, chondrogeneza i osteogeneza. Są czynnikami transkrypcyjnymi indukującymi działanie zespołów genów. Odkrycie roli BMP w indukcji ekspresji hepcydyny rzuca zupełnie nowe światło na te białka, wiązane do tej pory głównie z osteogenezą. Udowodniano, na hodowlach tkankowych i pracach na zwierzętach laboratoryjnych, że BMP 2, BMP 4 i BMP 9 są induktorami ekspresji hepcydyny silniejszymi niż lipopolisacharyd (LPS). Podanie ludzkich rekombinowanych BMP 2, BMP 4 oraz BMP 9 do hodowli hepatocytów mysich spowodowało po 16 godzinach 10 krotny wzrost ekspresji mrna hepcydyny, natomiast podanie LPS skutkowało zaledwie 2 krotnym wzrostem jej ekspresji [19]. Podobnie in vivo myszy po pozaoczodołowej iniekcji z oczyszczonego BMP 2 wykazywały prawie dwukrotny wzrost ekspresji mrna hepcydyny w wątrobie i znaczące obniżenie stężenia żelaza w surowicy [20]. W hodowlach hepatocytów pochodzących od myszy pozbawionych genu kodującego IL-6 uzyskano podobne wyniki eksperymentu z BMP, natomiast nie odnotowano wzrostu ekspresji hepcydyny pod wpływem LPS, więc indukcja hepcydyny przez BMP jest niezależna od IL-6 [19]. Hemojuwelina Hemojuwelina (HJV) jest koreceptorem dla BMP 2 i BMP 4, który ułatwia sygnalizację BMP oraz stymuluje produkcję hepcydyny [18]. BMP 9, które jest także silnym induktorem jej syntezy nie wykazuje interakcji z hemojuweliną i nie bierze udziału w indukcji ekspresji hepcydyny przez holotransferynę tylko reguluje jej podstawową ekspresję [19]. Najwyższą ekspresję hemojuweliny wykazano w mięśniach szkieletowych, jednakże nie odgrywa ona w ich funkcjonowaniu prawdopodobnie znaczącej roli, co jest potwierdzone faktem, że chorzy na hemochromatozę młodzieńczą nie wykazują żadnych objawów w obrębie mięśni [5]. Hemojuwelina zwiększa indukcję hepcydyny w odpowiedzi na BMP 2 [20]. Komórki Hep3B poddane działaniu sirna hemojuweliny (small interfering RNA, dwuniciowa cząstka RNA wyciszająca ekspresję genów o homologicznej sekwencji) wykazują czterokrotne podwyższoną ekspresję hepcydyny w odpowiedzi na stymulację przez IL-6. To wskazuje na fakt, że hemojuwelina reguluje ekspresję mrna hepcydyny niezależnie od IL-6 [21]. W ludzkich surowicach wykrywana była również rozpuszczalna forma hemojuweliny, która w odróżnieniu od formy komórkowej jest supresorem ekspresji hepcydyny. Hemojuvelina komórkowa jest dodatnim regulatorem ekspresji hepcydyny, natomiast rozpuszczalna hamuje produkcję hepcydyny w zależności od dawki, jest, więc pozytywnym mediatorem w odpowiedzi na przeładowanie żelazem. Ilość rozpuszczalnej hemojuweliny w supernatancie hodowli tkankowej obniża się po podaniu żelaza lub holotransferyny [22]. W surowicach szczurów będących na diecie niskożelazowej zaobserwowano wzrost stężenia surowiczej hemojuweliny, bez znaczącego wzrostu ekspresji Hfe2 w mięśniach szkieletowych [5]. Rozpuszczalna i komórkowa HJV obustronnie regulują poziom żelaza w odpowiedzi na zmiany w jego pozakomórkowym stężeniu. Istnieje hipoteza, że rozpuszczalna HJV działa jako pułapka współzawodnicząca z HJV komórkową [22]. Odkrycie biologicznej roli hemojuweliny daje nadzieję na wykorzystanie w przyszłości rekombinowanej hemojuweliny w terapii chorób związanych z nadekspresją hepcydyny, takich jak niedokrwistości chorób przewlekłych [1]. Indukcja hepcydyny przez IL-6 Hepcydyna stanowi ważne ogniwo łączące metabolizm żelaza z obronnością organizmu i stanem zapalnym. Podczas zakażeń, procesów nowotworowych, uszkodzenia tkanek 10

11 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN czy zaburzeń immunologicznych wątroba zwiększa syntezę wielu białek ostrej fazy stanowiących niespecyficzną odpowiedź na każde zaburzenie homeostazy organizmu prowadzących do jej przywrócenia. Synteza wielu z tych białek jest indukowana przez LPS, a także przez szereg cytokin produkowanych przez makrofagi i monocyty: interleukinę-6 (IL-6), IL-1β, TNF-α, TGF-β, interferon-γ, przy czym najsilniejszym induktorem jest IL-6 [9,24]. Podczas infekcji i stanów zapalnych zwiększa się również ekspresja hepcydyny. Udowodniono, że komórki hodowli hepatocytów ludzkich po stymulacji przez LPS syntetyzowały IL-6, co indukowało ekspresję mrna hepcydyny. Przeciwciała anty-il-6 odwracały ten efekt [12]. Także 16 godzin po podskórnej iniekcji oleju terpentynowego, wywołującego przewlekły stan zapalny wykazano w wątrobie myszy sześciokrotny wzrost mrna hepcydyny [16]. Podobnie ludzie poddani infuzji z IL-6 wykazują hipoferremię oraz przeszło 7 krotny wzrost wydalania hepcydyny w moczu [12]. Induktorami syntezy hepcydyny są, więc zarówno LPS, jak i IL-6, nie wykazano natomiast wpływu IL-1 i TNF-α [9]. W przebiegu infekcji, zapalenia i chorób nowotworowych podwyższony poziom hepcydyny prowadzi do zmniejszenia wchłanianie żelaza i jego zatrzymania w makrofagach układu siateczkowo-śródbłonkowego. Jest to mechanizm obronny mającym na celu ograniczenie dostępności tego pierwiastka dla komórek nowotworowych i mikroorganizmów, które potrzebują żelaza do produkcji dysmutazy ponadtlenkowej, enzymu chroniącego bakterie przed rodnikami tlenowymi wytwarzanymi przez organizm gospodarza. W tym celu organizm zwiększa produkcję transferyny, uwalnia laktoferynę z neutrofili oraz zwiększa syntezę hepcydyny. Długoterminowo może to doprowadzić do rozwoju niedokrwistości [9,15]. Niedokrwistość chorób przewlekłych Niedokrwistość z zapalenia jest konsekwencją chronicznych infekcji, nieinfekcyjnych stanów zapalnych, takich jak nowotwory, reumatoidalne zapalenie stawów czy choroby autoimmunologiczne. Może rozwinąć się także podczas sepsy. Anemię stwierdza się u 75% pacjentów z przewlekłymi chorobami wątroby. Także u pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek stwierdza się funkcjonalny niedobór żelaza i przewlekły stan zapalny, które są przyczyną niewrażliwości na egzogenną erytropoetynę. W niewydolności nerek poziom hepcydyny jest uporczywie wysoki prawdopodobnie nie tylko w wyniku zwiększonej produkcji spowodowaną przewlekłym stanem zapalnym, ale także spadkiem jej wydalania oraz indukcją ekspresji spowodowaną dializami [2,9,15,25]. Niedokrwistość chorób przewlekłych jest najczęściej normocytarna i normobarwliwa, jednakże może być także mikrocytarna i niedobarwliwa. Charakteryzuje się niskim poziomem żelaza, normalnym bądź obniżonym TIBC oraz podwyższonym poziomem ferrytyny w surowicy. Znaczące są także skrócony czas życia krwinek czerwonych oraz zmniejszona produkcja erytrocytów w odpowiedzi na erytropoetynę [25,26]. Chociaż przypomina niedokrwistość z niedoboru żelaza to jednak nie poddaje się terapii suplementacją żelazem. Co więcej suplementacja może okazać się niekorzystna, bo zwiększa ekspresję hepcydyny, która zatrzymuje żelazo w makrofagach. Jony Fe 2+ wyzwalają reakcję Fentona z wytworzeniem toksycznych rodników hydroksylowych. W przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów sytuacja ta zwiększa zdolność makrofagów do niszczenia chrząstki i kości [27]. Anemia w przebiegu chorób przewlekłych jest dużym problemem klinicznym. Pogarsza jakość życia pacjenta i prowadzi do zaburzeń w funkcjonowaniu tkanek poprzez ich słabsze utlenowanie. Wykazano, że nawet łagodna niedokrwistość prowadzi do powstania zmian narządowych [28]. Udział hepcydyny we wrodzonej hemochromatozie Wrodzona hemochromatoza to dziedziczone autosomalnie, recesywnie zaburzenie charakteryzujące się akumulacją żelaza w organizmie. Wrodzona hemochromatoza jest najczęściej uwarunkowana mutacją w obrębie genu kodującego białko HFE. Jest to typ I hemochromatozy. Zamiana C282Y powoduje utratę zdolności przez białko HFE wiązania beta 2-mikroglobuliny, koniecznej do prezentacji HFE na powierzchni komórek krypt jelitowych,co w konsekwencji uniemożliwia tworzenie się kompleksu z receptorem transferynowym (TfR1) i upośledza transport żelaza z krwi do wnętrza enterocytów krypt dwunastniczych. To z kolei jest przyczyną nadekspresji DMT1 i ferroportyny w enterocytach, w których występuje deficyt żelaza [3]. Rzadziej występująca tzw. młodzieńcza postać hemochromatozy jest spowodowana mutacją w obrębie genu HJV kodującego hemojuwelinę lub genu HAMP kodującego hepcydynę (odpowiednio typy IIA i IIB) [8]. Charakteryzuje się znacznie cięższym przebiegiem, w którym zniszczenie organów a nawet śmierć pacjenta mogą nastąpić jeszcze przed ukończeniem 30 roku życia [10]. Za typ III odpowiedzialna jest mutacja w obrębie receptora transferynowego II [4]. Mutacja w genie kodującym ferroportynę jest przyczyną IV typu hemochromatozy, w której zaburzone jest uwalnianie żelaza z makrofagów [3]. Choroba manifestuje się silniej u mężczyzn niż kobiet, u których występuje naturalna utrata żelaza z ustroju. Żelazo odkłada się przede wszystkim w wątrobie, ale także w innych tkankach jak trzustka, stawy, skóra, serce oraz wydzielające gonadotroiny komórki przedniego płata przysadki, to w konsekwencji powoduje zwłóknienie wątroby, cukrzycę, artropatię, kardiomiopatię, pigmentację skóry oraz hipogonadyzm. Żelazo wywiera mitogenny efekt na wątrobę poprzez przewlekłą stymulację proliferacji hepatocytów. Pomimo tego, że wiadomo, które mutacje są odpowiedzialne za wystąpienie choroby to typowa diagnostyka hemochromatozy ma najczęściej miejsce, dopiero wtedy gdy manifestują się już objawy choroby. Ponadto najwcześniejsze symptomy hemochromatozy (zmęczenie i bóle stawowe) nie są charakterystyczne tylko dla tego schorzenia. Marskość wątroby i następcze wysokie ryzyko rozwoju nowotworu wątroby są najczęstszymi przyczynami śmierci chorych na wrodzoną hemochromatozę. Leczeniem z wyboru pozostaje flebotomia, która rozpoczęta wcześnie zapewnia normalne funkcjonowanie i odwraca włóknienie wątroby, ale nie 11

12 Farm Przegl Nauk, 2009,12 marskość. Jednakże nowotwory wątroby rozwijają się także u pacjentów, u których nie stwierdzono marskości i których poddawano flebotomii. Dlatego perspektywa zastosowania hepcydyny w terapii wrodzonej hemochromatozy wydaje się być interesująca [3,4,29,30]. Hepcydyna jako parametr diagnostyczny Z uwagi na swoją funkcję fizjologiczną hepcydyna mogłaby stać się użytecznym parametrem w diagnostyce zaburzeń metabolizmu żelaza, takich jak niedokrwistości, ale również w diagnostyce wrodzonej hemochromatozy, ponieważ nie zawsze istnieje możliwość wykonania badań molekularnych w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej [30]. U pacjentów poddawanych hemodializom stężenie hepcydyny w surowicy koreluje ze stężeniem ferrytyny a także IL-6, która jest markerem stanu zapalnego [31]. Co więcej, poziom hepcydyny podlega częstszym wahaniom w czasie [32], przez co mogłaby być ona czulszym parametrem w monitorowaniu niedokrwistości. Mogłaby stać się użytecznym parametrem służącym do lepszej identyfikacji pacjentów z niedokrwistością chorób przewlekłych, niedokrwistością z niedoboru żelaza oraz pacjentów z przewlekłą niewydolnością nerek. Ze względu na niewielkie stężenia hepcydyny w surowicy rzędu ng/ml metoda jej oznaczania musi być czuła. W ostatnich latach opracowywano metody oparte na nowych technologiach takich jak SELDI-TOF MS (surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spektrometry) oraz HPLC/ MS-MS (tandemowy spektrometr mas sprzężony z chromatografem cieczowym). Wykorzystanie wewnętrznego standardu (peptyd odpowiadający genowi kalcytoniny) umożliwia ilościowe oznaczenie hepcydyny w moczu i surowicy. Wymagają one jednak drogiego sprzętu, który nie zawsze jest dostępny w rutynowej diagnostyce laboratoryjnej [14,32]. Szerzej dostępne metody immunoenzymatyczne (test ELISA) nie dają możliwości oznaczenia aktywnego 25-aminokwasowego peptydu, a jedynie prohormon. Jest to spowodowane trudnościami w wytworzeniu przeciwciał dla dojrzałej hepcydyny, co jest związane z jej mniejszą immunogennością [11]. Badanie przeprowadzone na zdrowych kobietach obciążonych doustnie żelazem wykazało, że stężenie prohepcydyny w surowicy nie tylko nie koreluje z poziomem prohepcydyny w moczu, ale także nie udało się wykazać istotnego statystycznie związku pomiędzy stężeniem prohepcydyny w surowicy, a ilością wchłoniętego żelaza i innymi markerami homeostazy żelaza. Przyczyną tego może być krótki czas półtrwania prohepcydyny we krwi. Ponadto lokalna ekspresja hepcydyny w nerce powoduje, że stężenie prohepcydyny moczu koreluje bardziej z jej lokalną produkcją w nerce niż ze stężeniem we krwi [33]. Istotny jest też fakt, że wydalanie hepcydyny w moczu jest zależne od przesączania kłębuszkowego i reabsorbcji kanalikowej [34]. Również badanie przeprowadzone w grupie 4 12 miesięcznych niemowląt nie wykazało istotnego statystycznie związku pomiędzy poziomem prohepcydyny i ferrytyny w surowicy krwi [23]. W ostatnim czasie zespół Tomasa Ganza opracował i zwalidował pierwszą metodę immunoenzymatyczną (C-ELISA) do oznaczania hepcydyny, która mogłaby być bez trudu wykorzystywana w praktyce. Stężenie hepcydyny w surowicy u osób zdrowych po obciążeniu żelazem uzyskane tą metodą koreluje ze stężeniem ferrytyny i innymi markerami poziomu żelaza. W grupie osób zdrowych ze znormalizowanym poziomem hepcydyny w moczu uzyskano także dobrą korelację z poziomem hepcydyny w surowicy. Określono także poziom hepcydyny w surowicy osób zdrowych. Średnie stężenie u mężczyzn wyniosło 112 ng/ ml, u kobiet ze względu na mniejsze zapasy żelaza 65ng/ml. W niektórych zaburzeniach metabolizmu żelaza, jak niedokrwistość z niedoboru żelaza, z bardzo niskim poziomem ferrytyny (poniżej 10 ng/ml) stężenie hepcyyny było poniżej granicy wykrywalności (poniżej 5,5 ng/ml) [34]. Piśmiennictwo 1. De Domenico I, Ward D, Kaplan J. Hepcidin regulation: ironing out of details. J Clin Invest 2007; 117: Ganz T. Hepcidin and its role in regulating systemic iron metabolism. Hematology 2006: Hartelb M i wsp. Wrodzona hemochromatoza. Prz Gastroenterol 2007; 2: Romanowski T, Sikorska K, Bielawski K. Molekularne podstawy dziedzicznej hemochromatozy. Post Hig 2006; 60: Zhang A, Anderson S, Meyerss K. Evidence that inhibition of hemojuvelin shedding in response to iron is mediated through neogenin. J Biol Chem 2007; 282: Deicher R, Horl W. Hepcidin: a molecular link between inflammation and anaemia. Nephrol Dial Transplant 2004; 19: Krause A i wsp. LEAP-1, a novel highly disulfide-bonded human peptide, exhibits antimicrobial activity. FEBS Lett 2000; 480: Park C i wsp. Hepcidin, a urinary antimicrobial peptide synthesized in the liver. J Biol Chem 2001; 276: Małyszko J, Myśliwiec M. Hepcidin in anemia and inflamation in chronic kidney disease. Kidney Blood Press Res 2007; 30: Ganz T. Hepcidin, a key regulator of iron metabolism and mediator of anemia of inflammation. Blood 2003; 102: Frazer D, Anderson G. Hepcidin compared with prohepcidin: an absorbing story. Am J Clin Nutr 2009; 89: Nemeth E i wsp. IL-6 mediates hypoferremia of inflamation by inducing the synthesis of the iron regulatory hormone hepcidin. J Clin Invest 2004; 9: Kulakisiz H i wsp. Pro-hepcidin: expression and cell specyfic localization in the liver and its regulation in hereditary haemochromatosis, chronic renal insufficiency and renal anaemia. Gut 2004; 53: Murphy A, Witcher D, Luan P. Quantitation of hepcidin from human and mouse serum using liquid chromatography tandem mass spectrometry. Blood 2007; 110: Andrews N. Anemia of inflamation: the cytokine-hepcidin link. J Clin Invest 2004; 113: Nicolas G i wsp. The gene encoding the iron regulatory peptide hepcidin is regulated by anemia hypoxia, and inflammation. J Clin Invest 2002; 110:

13 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Nemeth E i wsp. Hepcidin a putative mediator of anemia of inflammation, is type II acute-phase protein. Blood 2003; 101: Lin L i wsp. Iron transferrin regulates hepcidin synthesis in primary hepatocyte culture through hemojuvelin and BMP 2/4. Blood 2007; 110: Truksa J i wsp. Bone mrphogenetic proteins 2, 4, and 9 stimulate murine hepcidin 1 expression independently of Hfe, transferinn receptor 2 and Il-6. Proc Natl Acad Sci USA 2006; 103: Babitt J i wsp. Modulation of bone morphogenetic protein signaling in vivo regulates systemic iron balance. J Clin Invest 2007; 117: Flanagan J i wsp. In vivo imaging of hepcidin promoter stimulation by iron and inflammation. Blood Cells Mol Dis 2007; 38: Lin L i wsp. Competitive regulation of hepcidin mrna by soluble and cell-associated hemojuvelin. Blood 2005; 106: Ulukol B i wsp. Serum pro-hepcidin levels and relationship with ferritin in healthy non anaemic infants. Acta Haematol 2007; 118: Urbanowicz W. Rola wątroby w odpowiedzi ostrej fazy. Post Nauk Med 2000; 1: Malinowska I i wsp. Niedokrwistość w chorobach wątroby ze szczególnym uwzględnieniem roli hepcydyny. Hepatologia 2007; 7: McGrath H. Jr, Rigby P.G. Hepcidin: inflamation s iron curtain Reumatology 2004; 43: Kelly J. Hepcidin mediates anaemia of chronic disease and is reason iron supplements won t help Podolak-Dawidziak M, Dwilewicz-Trojaczek J. Kliniczne znaczenie niedokrwistości towarzyszące chorobie nowotworowej. Onkol Prakt Klin 2005; 1: Griffiths W.J.H. The Genetic Basis of Haemochromatosis. Aliment Pharmacol Ther 2007; 26: Sikorska K i wsp. Hemochromatoza dziedziczna najczęstsza choroba genetyczna człowieka. Post Hig 2006; 60: Swinkles D, Wetzels J. Hepcidin: a New tool In managment anemia In patients with chronic kidney disease? Nephrol Dial Transplant 2008; 23: Brugnara C. An immunoassay for human serum hepcidin at last: Ganz klar? Blood 2008; 112: Hadley K, Johnson L, Hunt J. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. Am J Clin Nutr 2006; 84: Ganz T, Olbina G, Girelli D. Immunoassay for serum hepcidin. Blood 2008; 112: Adres do korespondencji: mgr Aleksandra Mianowska Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Klinicznej Wydział Farmaceutyczny Warszawski Uniwersytet Medyczny ul. Banacha 1, Warszawa tel amianowska@o2.pl 13

14 Farm Przegl Nauk, 2009,12, Wpływ metioniny na toksyczność fluoru w osoczu krwi szczurów The effect of methionine on toxicity of fluoride in blood plasma of rats Iwona Błaszczyk, Ewa Birkner, Ewa Romuk Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Streszczenie Zbadano wpływ metioniny na system antyoksydacyjny osocza podczas intoksykacji fluorkiem sodu. Badania przeprowadzono na 18 dorosłych szczurach, samicach szczepu Wistar FL, którym podawano wodę destylowaną, NaF lub NaF wraz z metioniną (NaF: 10 mg/kg m.c./dobę, metionina: 10 mg/kg m.c./dobę) przez okres 35 dni. Oznaczono aktywność całkowitą SOD oraz jej izomerów: CuZnSOD i MnSOD, stężenie jonów fluorkowych, a także całkowitą zdolność antyoksydacyjną (FRAP) w osoczu krwi. Stwierdzono niekorzystny wpływ podawanego NaF na układ antyoksydacyjny szczurów (zmniejszenie aktywności SOD, CuZnSOD, MnSOD oraz FRAP). Suplementacja metioniną spowodowała wzrost aktywności CuZnSOD, całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza i zmniejszenie stężenia jonów fluorkowych. Zatem metionina wykazuje korzystne działanie w czasie zatrucia fluorkiem sodu. Słowa kluczowe: fluor, metionina, dysmutaza ponadtlenkowa, całkowita zdolność antyoksydacyjna, osocze, szczury. Wstęp Abstract The aim of the study has been to determine the influence upon the plasma antioxidative system, exercised by administration of methionine (Met), under exposure to sodium fluoride. The experiment was carried out on Wistar FL rats (adult females) that, for 35 days, were administered distilled water, NaF or NaF with methionine (doses: 10 mg NaF/kg bw/day, 10 mg Met/kg bw/day). The influence of administered NaF and Met was examined by analyzing the activity of superoxide dismutase (SOD- total and both its isoenzymes: CuZnSOD and MnSOD), fluoride concentration and total ability antioxidant (FRAP) in blood plasma. The studies carried out confirmed the disadvantageous effect of NaF upon the antixodative system in rats (decrease activity of SOD, CuZnSOD, MnSOD, FRAP). The administration of methionine increased the activity of CuZn- SOD, total ability antioxidant and decreased the concentration of fluoride in blood plasma. Therefore methionine has an ameliorative effect on NaF-exposed rats. Key words: fluoride, methionine, superoxide dismutase, total ability antioxidant, plasma, rats. Skażenie wody pitnej i żywności związkami fluoru oraz powszechne stosowanie ich w stomatologii to główne przyczyny nadmiernego narażenia na fluor. Jony fluorkowe przenikając przez błony komórkowe indukują wiele stanów patologicznych, w tym tworzenie nieprawidłowej struktury kości i zębów [1,2], zaburzenia funkcji nerek [3] i wątroby [4]. W mechanizmie toksycznego działania fluoru istotną rolę odgrywa jego zdolność do wywoływania stresu oksydacyjnego poprzez indukowanie wzmożonych procesów wolnorodnikowych [5]. Wolne rodniki powodują utlenianie lipidów, DNA, białek a nawet wolnych aminokwasów. Jednak utlenianie metioniny (Met) jest reakcją odwracalną. Uważa się nawet, że cykliczne procesy utleniania metioniny do sulfotlenku metioniny (MetO) i redukcji MetO mogą stanowić ważny mechanizm antyoksydacyjny. Przypuszczalnie reszty metioninowe białek pełnią funkcję odtwarzalnych zmiataczy reaktywnych form tlenu i azotu [6]. Celem przeprowadzonych badań było określenie jaki wpływ może mieć podawanie metioniny w czasie intoksykacji fluorkiem sodu na całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) oraz stężenie jonów fluorkowych w osoczu krwi szczurów. Materiał i metody Badania przeprowadzono na 18 dorosłych, 3-miesięcznych szczurach, samicach szczepu Wistar FL, o masie 200g. Zwierzęta pochodziły z Centrum Medycyny Doświadczalnej SUM w Katowicach. Na przeprowadzenie eksperymentu uzyskano zgodę Komisji Etycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego (zgoda nr 29/2006). W trakcie doświadczenia zapewniono zwierzętom 12-godzinny cykl dzienno-nocny oraz swobodny dostęp do wody i standardowej paszy (Labofeed B). Po dwutygodniowym okresie adaptacyjnym szczury umieszczono pojedynczo w klatkach i podzielono na 3 grupy liczące po 6 osobników. 1. Grupa kontrolna (Kontrola) - szczury, które do picia otrzymywały wyłącznie wodę destylowaną. 2. Grupa fluorkowa (NaF) - zwierzęta otrzymujące NaF (Sodium fluoride, POCH Gliwice) w dawce 10 mg/kg 14

15 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN m.c./dobę [7], w postaci roztworu (w ilości 10 ml), a po jego wypiciu miały swobodny dostęp do wody destylowanej. 3. Grupa fluorkowo-metioninowa (NaF+Met) - szczury, które otrzymywały NaF w dawce 10 mg/kg m.c./dobę [7] oraz metioninę (L-Methionine, Sigma) w dawce 10 mg/kg m.c./dobę [7]. Eksperyment prowadzono przez okres 5 tygodni. Po tym czasie zwierzęta usypiano, stosując iniekcję dootrzewnową 1% roztworem heksobarbitalu, w dawce 0,5 ml /100g m.c. Do dalszych badań pobrano krew na heparynę, a w osoczu krwi oznaczono: - stężenie jonów fluorkowych (F - ) przy użyciu jonoselektywnej elektrody fluorkowej Orion (USA), - całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD) [EC ] oraz jej izoenzymów CuZnSOD i MnSOD metodą Oyanagui [8], - całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza (FRAP) wg metody Benzie i Strain [9]. Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej, wykorzystując test ANOVA Kruskala-Wallisa oraz U Manna- Whitney a. Za znamienne statystycznie przyjęto zmiany przy poziomie istotności p 0,05. Wyniki Uzyskane wyniki przedstawia tabela I. Stwierdzono zwiększone stężenie jonów fluorkowych w osoczu krwi szczurów grupy NaF i zmiana ta była statystycznie znamienna w porównaniu z kontrolą. U zwierząt, które dodatkowo otrzymywały metioninę stężenie F - było mniejsze zarówno w stosunku do kontroli jak i grupy NaF (znamienność statystyczna). Wykazano niekorzystny wpływ fluorków na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej. W grupie NaF wystąpiło zmniejszenie całkowitej aktywności SOD (zmiana statystycznie znamienna) oraz jej obu izoenzymów CuZnSOD i MnSOD w porównaniu z grupą kontrolną. Podawana metionina częściowo ograniczała szkodliwe działanie fluoru, zwiększając aktywność CuZnSOD, ale zmniejszając aktywność SOD i MnSOD (znamienność statystyczna) w stosunku do kontroli. Zdolność antyoksydacyjna osocza zmniejszyła się w osoczu krwi szczurów po ekspozycji na NaF (zmiana statystycznie znamienna w porównaniu z grupa kontrolną), natomiast w grupie NaF+Met uległa zwiększeniu. Dyskusja W Polsce spożycie fluorków wraz z niektórymi produktami spożywczymi może przekraczać zalecaną bezpieczną dawkę, a podstawowym źródłem fluoru w diecie jest woda i napoje z ekstraktem herbaty [10]. Po doustnym przyjęciu F - jest wchłaniany z przewodu pokarmowego, a jego transport z krwią do tkanek i narządów może prowadzić do wielu zmian strukturalnych i funkcjonalnych [1-4]. Toksyczne działanie fluoru wynika m.in. z właściwości generowania wolnych rodników i hamującego wpływu na aktywność enzymatycznego układu antyoksydacyjnego [5,7]. Badania naukowe dowodzą, że związki fluoru mogą indukować powstawanie anionorodnika ponadtlenkowego oraz rodnika hydroksylowego [11]. Narażenie na fluorki skutkuje zwiększeniem ich stężenia w surowicy [2]. Potwierdzają to wyniki prezentowanego eksperymentu. Przyjmowany fluorek sodu wywołał zwiększenie stężenia F - w osoczu krwi szczurów. Podawanie metioniny skutecznie temu wzrostowi przeciwdziałało choć mechanizm tego zjawiska pozostaje nieznany. Poza tkankami miękkimi fluorki są w znacznej części wiązane przez tkankę kostną i zęby [2]. Niestety brak doniesień na temat tego, czy metionina wpływa na tę kumulację, w ten sposób zmieniając stężenie F - w osoczu. Nadmierna podaż jonów fluorkowych jest czynnikiem rozwoju stresu oksydacyjnego. W tym czasie wzmożone lub niekontrolowane powstawanie wolnych rodników prowadzi do nasilonej peroksydacji lipidów [5,7]. Ograniczone przenikanie F - do osocza może wynikać z ochronnej roli podawanej metioniny wobec błon komórkowych. Wiadomo, że metionina uczestniczy w syntezie choliny, składnika lecytyny i sfingomieliny, które budują komórkowe membrany [12]. Poza tym metionina dzięki cyklicznym przemianom utleniania i redukcji może również uczestniczyć w zmiataniu wolnych rodników. Jej utlenianie, jako wolnego aminokwasu lub jako białkowych reszt metioninowych prowadzi do powstania mieszaniny izomerów R i S-sulfotlenku metioniny (MetO). W obecności reduktazy sulfotlenku metioniny (Msr), tioredoksyny, reduktazy tioredoksyny i NADPH następuje redukcja MetO ponownie do metioniny. Met + H 2 O 2 MetO + H 2 O MetO + NADPH + H + Met + NADP + + H 2 O zięki tym procesom metionina może unieszkodliwiać rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru i tlen singletowy, ograniczając procesy peroksydacji lipidów [6]. Potwierdzają to badania stężenia dialdehydu malonowego, jednego ze Tab. I. Stężenie jonów fluorkowych, aktywność dysmutazy ponadtlenkowej oraz całkowita zdolność antyoksydacyjna osocza krwi szczurów. Grupa Stężenie F - [µmol/l] Aktywność SOD [NU/ml] Aktywność MnSOD [NU/ml] Aktywność CuZnSOD [NU/ml] FRAP [µmol/l] Kontrola 5,59 ±0,57 33,60 ± 0,84 7,98 ± 1,78 25,60 ± 1,47 226,50 ± 23,87 NaF 7,89 ± 0,49 a 31,90 ± 0,75 a 6,50 ± 1,33 25,40 ± 1,40 157,3 ± 26,4 a NaF+Met 4,21 ± 0,74 a,b 31,10 ± 0,60 a 4,97 ± 1,83 a 26,20 ± 1,94 175,0 ± 43,10 a wyniki statystycznie znamienne (p 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną b wyniki statystycznie znamienne (p 0,05) w porównaniu z grupą NaF 15

16 Farm Przegl Nauk, 2009,12 wskaźników utleniania lipidów w wątrobie, nerkach, erytrocytach i osoczu krwi [7]. Zatem metionina ochraniając błony plazmatyczne przed destrukcyjnym działaniem wolnych rodników oraz uczestnicząc w regeneracji tych struktur być może zapobiega przenikaniu fluorków do osocza. Fluor wpływa również na aktywność enzymów antyoksydacyjnych [5]. Jednym z nich jest dysmutaza ponadtlenkowa, która katalizuje reakcję dysmutacji anionorodnika ponadtlenkowego, w efekcie której powstaje nadtlenek wodoru i tlen. 2O H + H 2 O 2 + O 2 Na całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej składa się aktywność jej izoenzymów MnSOD i CuZnSOD. Aktywność MnSOD jest uwarunkowana dostępnością manganu. CuZnSOD jest natomiast enzymem miedzio- i cynko-zależnym, a rola obu pierwiastków wchodzących w jego skład jest różna. Cynk utrzymuje strukturę trzeciorzędową, miedź jest odpowiedzialna za aktywność katalityczną enzymu, będąc jego aktywatorem [13]. Fluor powoduje zmiany aktywności SOD. Zmiany te wynikają m.in. z hamowania biosyntezy enzymu o czym może świadczyć zmniejszenie stężenia mrna CuZnSOD w wątrobie [14]. Nadmierna lub długotrwała ekspozycja na fluorek sodu przyczynia się do zmniejszenia aktywności Cu- ZnSOD i MnSOD w trzustce [15] oraz nerkach szczurów [5]. Fluorki przyłączają się do centrum katalitycznego Cu- ZnSOD, będąc jego kompetycyjnym inhibitorem. Poza tym fluor wiąże jony magnezu, cynku i manganu [16]. To może tłumaczyć obniżoną aktywność SOD u zwierząt poddanych intoksykacji fluorkiem sodu. W opisywanym doświadczeniu szkodliwe działanie fluorków częściowo znosiła podawana metionina. Wystąpiło bowiem zwiększenie aktywności CuZnSOD, ale zmniejszenie całkowitej aktywności SOD i MnSOD. Metionina jest chelatorem metali ciężkich m.in. Cd, Hg, Pb. Niektórzy autorzy sugerują nawet, że podstawowa ochronna rola reszt metioninowych albumin to wiązanie jonów tych metali, nie zaś bezpośrednie zmiatanie wolnych rodników [17]. Metionina może wpływać na stężenie miedzi [18] i być może uczestniczy również w metabolizmie Zn i Mn, wpływając ostatecznie na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej. Wyniki eksperymentu wskazują na niekorzystny wpływ fluorku sodu na całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza. Działanie to wyraźnie znosiła podawana metionina, zapewne dlatego, że oprócz bezpośredniego zmiatania wolnych rodników, uczestniczy w syntezie i działaniu innych antyoksydantów. Jednym z najważniejszych antyoksydantów płynów ustrojowych jest bowiem glutation, który reaguje m.in. z rodnikiem OH, a powstałe rodniki GS są neutralizowane w reakcji dysmutacji [19]. Komórkowa homeostaza zredukowanego glutationu jest utrzymywana przez syntezę z metioniny i cysteiny oraz regenerację jego utlenionej formy i absorpcję zewnątrzkomórkowego glutationu. Ponad połowa Met jest zużywana do syntezy glutationu w wątrobie, który jest przekazywany potem do osocza [20]. Peterson i wsp. [21] wykazali, że nawet w przypadku diety ubogiej w Se i witaminę E, która skutkuje m.in. zmniejszeniem zawartości glutationu, suplementacja wyłącznie Met przywraca jego prawidłowe stężenie. Podaż glutationu warunkuje również prawidłową aktywność peroksydazy glutationowej, enzymu antyoksydacyjnego osocza, który katalizuje reakcję rozkładania H 2 O 2 i nadtlenków lipidowych [19]. Podobnie jest w przypadku antyoksydacyjnych właściwości witaminy C, obecnej w osoczu w postaci anionu askorbinianowego, który w czasie zmiatania rodników tlenowych przekształca się w dehydroaskorbinian. Aby zaszła reakcja redukcji dehydroaskorbinianu ponownie do askorbinianu niezbędny jest glutation, a jak wykazano fluorki zmniejszają stężenie glutationu we krwi i wątrobie [22]. Metionina poza uczestnictwem w syntezie glutationu, odgrywa również ważną rolę w wiązaniu, transporcie i bioaktywności selenu w organizmie, zwiększając jego przyswajanie [21]. Selen wchodzi w skład peroksydazy glutationowej [19] oraz reduktazy sulfotlenku metioniny i reduktazy tioredoksyny [6]. Tak więc synteza i funkcja tych enzymów wymaga obecności selenu, podczas gdy zwiększona podaż fluorków powoduje nasilone wydalanie selenu z moczem i niedobory tego pierwiastka w organizmie [23]. Na podstawie wyników przeprowadzonego eksperymentu można stwierdzić, że podawanie metioniny w przypadku zatrucia fluorkiem sodu może być bardzo korzystne z uwagi na fakt wzmocnienia całkowitej zdolności antyoksydacyjnej osocza i redukcji stężenia jonów fluorkowych w osoczu krwi. Wnioski Nadmierna ekspozycja na NaF skutkuje zwiększeniem stężenia jonów fluorkowych w osoczu, czemu skutecznie przeciwdziała podawanie metioniny. Fluor hamuje aktywność dysmutazy ponadtlenkowej, natomiast metionina nieznacznie zwiększa aktywność izoenzymu CuZnSOD. Metionina zwiększa całkowitą zdolność antyoksydacyjną osocza w czasie zatrucia fluorem. Piśmiennictwo Wang J i wsp. Amino acid composition and histopathology of goat teeth in an industrial fluoride polluted area. Fluoride 2003; 36: Grucka-Mamczar E i wsp. Wpływ kofeiny i fluorku sodu na stężenie fluorków w surowicy krwi i ich zawartość w zębach i kościach szczurów. Ann Acad Med Stetin 2006; 52: Rao MV, Chawla SL, Patel N. Melatonin reduction of fluoride-induced nephrotixicity in mice. Fluoride 2009; 42: He LF, Chen JG. DNA damage, apoptosis and cell cycle changes induced by fluoride in rat oral mucosal cells and hapatocytes. World J Gastroenterol 2006; 12: Błaszczyk I i wsp. Influence of fluoride on rat kidney antioxidant system: efects of methionine and vitamin E. Biol Trace Elem Res 2008; 121:

17 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN Moskovitz J. Roles of methionine sulfoxide reductases in antioxidant defense, protein regulation and survival. Curr Pharm Des 2005; 11: Błaszczyk I i wsp. Influence of methionine upon the concentration of malondialdehyde in the tissues and blood of rats exposed to sodium fluoride. Biol Trace Elem Res 2009; 129: Oyanagui Y. Revaluation of assay methods and establishment of kid for superoxide dismutase activity. Anal Biochem 1984; 142: Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of antioxidant power : The FRAP assay. Anal Biochem 1996; 239: Dębiński A i wsp. Zawartość fluoru w diecie populacji polskiej próba oszacowania. Żyw Człow Metab 2006; 4: Przybylska D, Długosz A. Wpływ fluorku sodu na procesy wolnorodnikowe. Bromat Chem Toksykol 2007; 1: Brosnan JT, Brosnan ME. The sulfur-containing amino acids: an overview. J Nutr 2006; 136: Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Ann Rev Biochem 1995; 64: Zhan XA i wsp. Effects of fluoride on hepatic antioxidant system and transcription of Cu/Zn SOD gene in young pings. J Trace Elem Med Biol 2006; 20: Chlubek D i wsp. Activity of pancreatic antioxidantive enzymes and malondialdehyde concentations in rats with hyperglycemia caused by fluoride intoxication. J Trace Elem Med Biol 2003; 17: Machoy Z. Biochemiczne mechanizmy działania związków fluoru. Folia Med Cracov1987; 1-2: Bourdon E i wsp. Differential effects of cysteine and methionine residues in the antioxidant activity of human serum albumin. Free Radic Res 2005; 39: Patra RC, Swarup D. Effect of antioxidant ascorbic acid, l-methionine or α tocopherol alone or along with chelator on cardiac tissue of lead-treated rats. Veterinarski Archiv 2004; 74: Shoveller AK i wsp. Nutritional and functional importance of intestinal sulfur amino acid metabolism. J Nutr 2005; 135: Garcia RAG, Stipanuk MH. The splanchnic organs, liver and kidney have unique roles in the metabolism of sulfur amino acids and their metabolites in rats. J Nutr 1992; 122: Brigelius-Flohe R. Tissue-specific functions of individual glutathione peroxidases. Free Radic Biol Med 1999; 27: Kaushik T i wsp. Glutathione metabolism in rats to high-fluoride water and effect of spirulina treatment. Fluoride 2001; 34: Wąsowicz W, Gołębiowska M, Chlebna-Sokół D. Increased urinaty excretion of selenium in children- a response to surplus fluoride in drinking water. Trace Elem Med 1988; 5: Adres do korenspondencji: dr n.med. Iwona Błaszczyk Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Jordana 19, , Zabrze tel./fax iblaszczyk@sum.edu.pl 17

18 Farm Przegl Nauk, 2009,12, Wiek jako czynnik modyfikujący profil izoform cytochromu P450 w wątrobie szczura Age modification cytochrome P450 isoforms content in rat liver Andrzej Plewka 1, Danuta Plewka 2, Jacek Marczyński 1, Józef Waloszek 1 1 Zakład Proteomiki, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach 2 Katedra Morfologii, Zakład Histologii, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Streszczenie Nadal powszechne zainteresowanie budzi nie tylko rozwój poszczególnych enzymów związanych z metabolizmem substancji endo- i egzogennych w okresie płodowym i początkowej fazie życia pozapłodowego, ale także ich ewolucja w zaawansowanym wieku. Celem prezentowanych badań było wykazanie jak zmienia się profil izoform cytochromu P450 związanych z metabolizmem ksenobiotyków w funkcji wieku szczura. Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Doświadczenie obejmowało 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. W wyizolowanej z wątroby frakcji mikrosomalnej oceniano poziomy następujących białek: CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2C12, CYP2A1 i CYP2A2. Wykazano, że z ocenianych izoform, trzy, tj. CYP3A1, CYP2C11 i CYP2C6 były obserwowane we wszystkich badanych przedziałach wiekowych. I tak, izoforma CY- P3A1 począwszy od 1 miesiąca życia szczura utrzymywała porównywalny poziom we wszystkich ocenianych grupach wiekowych. Poziom CYP2C11 najwyższą wartość osiągał już w pierwszym miesiącu, po czym poziom ten delikatnie, sukcesywnie opadał do końca życia szczura. Trzecia z ocenianych izoform, tj. CYP2C6 zachowywała się podobnie jak izoforma CYP2C11. Na podstawie badań można wywnioskować, że ogólne zmiany zawartości cytochromu P450 nie wynikają ze zsynchronizowanych zmian, przynajmniej głównych izoform konstytucyjnych tej hemoproteiny. Słowa kluczowe: szczur, wątroba, wiek, cytochrom P450, CYP Wstęp Enzymy biotransformujące podlegają ewolucji ilościowej i jakościowej w trakcie ontogenezy [1, 2]. Wynika to między innymi z ewolucji genów, zmian składu frakcji lipidowej błon, a tym samym spadku jej płynności [3]. Mikrosomalny transport elektronów ulega modyfikacji, a konsekwencją tego jest zmiana aktywności monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 [4-7]. Ogólne zainteresowanie budzi nie tylko rozwój poszczególnych enzymów związanych z metabolizmem substancji Abstract Not only the development of the individual enzymes connected with the metabolism of endo- and exogenous substances during the foetal period and in the first phase of life after birth still arouse general interest but also their evolution in advanced age. The aim of the presented researches was to demonstrate how the profile of the cytochrome P450 isoforms connected with the xenobiotic metabolism is changing in the function of the age. The researches were done on male rats (breed Wistar). The research series concerned 8 age groups of the rats: 0,5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- and 28 months old. There were evaluated the levels of the following proteins: CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2C12, CYP2A1 and CYP2A2 in the isolated from the liver microsomal fraction. It was proved that three of the evaluated isoforms: CYP3A1, CYP2C11 and CYP2C6 were observed in all researched age brackets. Starting from the 1 month of the rat life the CYP3A1 isoform was keeping comparable level in all evaluated age groups. The level of CYP2C11 reached the highest value in the first month and after that this level slightly, successively was decreasing to the end of the rat life. The third one isoform CYP2C6 behaved similarly to the CYP2C11 isoform. According to the researches we can conclude that general changes of the cytochrome P450 content do not result from the synchronized changes, at least main constitutional isoforms of this hemoprotein. Key words: rat, liver, ageing, cytochrome P450, CYP endo- i egzogennych w okresie płodowym i początkowej fazie życia pozapłodowego, ale także ich ewolucja u osobników w zaawansowanym wieku. Wyniki wielu prac eksponują istnienie zależności między wiekiem zwierząt a aktywnością poszczególnych ogniw mikrosomalnego układu metabolizującego ksenobiotyki [8, 9]. Analizowano takie parametry jak zawartość białka mikrosomalnego, cytochromu P450, aktywność reduktazy NADPH-cytochrom P450, hydroksylacji aniliny, N-demetylacji 4-aminopiryny i innych. Stwierdzono, że większość badanych parametrów wykazywała tendencję spadkową w okresie starzenia. Pomimo 18

19 copyright 2009 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN wielu lat badań, nadal trudno jednoznacznie zidentyfikować przemiany, jakim podlegają składniki układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 w okresie starzenia szczurów. Część badaczy podkreślała spadek zawartości cytochromu P450 i aktywności reduktazy współpracującej z nim, inni sugerują, że wraz z wiekiem nie występuje istotny spadek całkowitej zawartości cytochromu P450, cytochromu b 5 ani aktywności obu reduktaz [10-12]. Wspomniane grupy badaczy są jednak zgodne co do zmian specyficzności substratowej monooksygenaz zależnych od cytochromu P450 w fazie starzenia się. Wykazano między innymi w tym okresie spadek hydroksylacji aniliny, ale równoczesne pewne podwyższenie O-deetylacji p-nitroanizolu. Przyczyn takich zmian specyficzności substratowej autorzy upatrują w ewolucji w proporcjach różnych izoform cytochromu P450 [5, 13-15]. Klucz do pełnego zrozumienia szerokiej roli cytochromu(ów) P450 w ustrojowych przemianach biochemicznych tkwi w istnieniu jego licznych form. Izoformy (izoenzymy) modyfikowane są przez różnorodne czynniki, w tym związki chemiczne, np. induktory. Omawiane hemoproteiny należą do grupy cytochromów typu b o masie cząsteczkowej w zakresie Cechują się konserwatywną sekwencję aminokwasową w tym fragmencie peptydowym, który wzbogacony jest w cysteinę. W pozostałym obszarze łańcucha białkowego izoenzymy te różnią się znacznie, co wiąże się z ich odmienną specyficznością substratową i stanowi podstawę molekularną różnorodności cytochromu P450 [16-20]. Celem badań było wykazanie jak zmienia się profil izoform cytochromu P450 związanych z metabolizmem ksenobiotyków w funkcji wieku. Szczególnie ważne było określenie zestawu tych izoform w okresie młodości, dojrzewania i dojrzałości płciowej oraz w fazie starzenia się i starości. Materiały i metody Zwierzęta Badania przeprowadzono na samcach szczurzych rasy Wistar. Zwierzęta pochodziły z hodowli Centralnej Zwierzętarni Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach-Ligocie. Serie badawcze obejmowały 8 grup wiekowych, tj. szczury: 0.5-, 1-, 2-, 4-, 8-, 12-, 20- i 28 miesięczne. W grupie 0.5 miesięcznej w każdej serii badawczej na 1 punkt pomiarowy przypadało siedem wątrób szczurzych, w grupie 1 miesięcznej trzy wątroby a w pozostałych grupach jedna. Zwierzęta grupy najmłodszej przebywały cały czas z matkami. Po usamodzielnieniu się, każde zwierzę przebywało osobno w klatkach plastikowych a hodowla była prowadzona w tym samym pomieszczeniu o ustalonej wilgotności powietrza (około 60%), temperaturze ( C) i rytmie 12-godzinowego oświetlenia (dzień-noc: ). Szczury karmiono paszą standardową (LSM), którą usuwano na 12 godzin przed zabiciem, pozostawiając wolny dostęp do wody. Szczury zabijano przez dekapitację. Natychmiast pobierano wątroby i umieszczano je w lodowatym roztworze soli fizjologicznej. Izolacja frakcji mikrosomalnej Wątrobową frakcję mikrosomalną izolowano według metody Dallnera [21]. Po kilkukrotnym przepłukaniu w roztworze soli fizjologicznej, wątroby cięto na niewielkie skrawki i rozdrabniano w homogenizatorze Pottera-Elvehjema z tłokiem teflonowym, przy 400 obrotach na minutę i czterech pełnych ruchach tłoka. Środowiskiem homogenizacyjnym był 0,25 molowy roztwór sacharozy w 10 milimolowym buforze Tris-HCl o ph=7,4. Na 1 gram tkanki dodawano 5 cm 3 tego roztworu. Ten i kolejne etapy obróbki wątroby prowadzano w temperaturze C. Czyste frakcje mikrosomalne zawieszano w zbuforowanym 20% o/o roztworze glicerolu, tak aby stężenie białka było nie mniejsze niż 5 mg/cm 3. Próby te natychmiast zamrażano w temperaturze C. Rozdział elektroforetyczny i elektrobloting Podłożem roboczym używanym do rozdziału elektroforetycznego białek był żel poliakrylamidowy o grubości 1 mm i długości 15 cm a sam rozdział odbywał się w układzie opisanym przez Laemmliego [22]. W swoim początkowym odcinku złoże było 4% żelem (tzw. stacking gel) w 0,125 milimolowym Tris-HCl (ph 6,8) zawierającym 0,1% SDS. Część robocza złoża to 10% żel (tzw. running gel) w 0,375 milimolowym Tris-HCl (ph 8,8) zawierającym także 0,1% SDS. W przestrzeniach wokółelektrodowych stosowano 0,1% roztwór SDS, zawierający w 1 dm 3 6 g Tris i 28,8 g glicyny. W miarę potrzeby ph tego roztworu ustawiano na 8,5. Po zakończeniu elektroforezy białka z żelu zostały przeniesione na błonę nitrocelulozową, stosując elektrobloting mokry. Transfer trwał 1 godzinę przy napięciu 100 V w buforze o ph 8,3 o składzie: 25 milimolowy Tris-HCl, 192 milimolowa glicyna i 20% o/o metanol. Wykrywanie antygenów Nitroceluloza po transferze była inkubowana przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym (1% buforowana kazeina), a następnie z odpowiednim przeciwciałem pierwotnym przez całą noc w temperaturze 4 0 C. Przeciwciała odnosiły się do następujących białek: CYP3A1, CYP2C11, CYP2C6, CYP2C12, CYP2A1 i CYP2A2. Po usunięciu przeciwciała, błona nitrocelulozowa była 3-krotnie płukana w roztworze kazeiny, a następnie inkubowana przez 30 minut z odpowiednim biotynylowanym przeciwciałem wtórnym. W kolejnym etapie błona została umieszczona w roztworze ABC na 10 minut (ABC - kompleks awidyna-biotynylowana-peroksydaza). Po usunięciu tego roztworu i wypłukaniu, nitrocelulozę równoważono przez 5 minut 0,1 molowym buforem Tris-HCl o ph 9.5, a następnie dodano roztwór substratu (BCIP/NBT). Całość była inkubowana przez 30 minut w ciemności, płukana w buforze PBS i suszona. Wybarwione bloty poddano ilościowej analizie densytometrycznej. Wyniki Z ocenianych izoform cytochromu P450, trzy obserwowano we wszystkich grupach wiekowych. Należały do nich: CYP3A1, CYP2C11 oraz CYP2C6. Gdyby przyjąć za punkt wyjścia grupę najmłodszą (umowne 100%), to już u zwierząt 1 miesięcznych stwierdzono bardzo wyraźny wzrost zawartości izoformy CYP3A1, przekraczający 530% (Ryc. 1). 19

20 Farm Przegl Nauk, 2009,12 W kolejnych grupach wiekowych stężenie tej izoformy było nieco niższe, bowiem mieściło się w przedziale % wartości grupy najmłodszej. Ten ustabilizowany poziom omawianej izoformy trwał conajmniej aż do 20 miesiąca życia szczura. W grupie najstarszej ujawnił się ponownie silny wzrost zawartości CYP3A1, przekraczając 650% wartości grupy 0,5 miesięcznej. Kolejną izoformą, której obecność ujawniono w całym badanym przedziale czasowym było białko CYP2C11. Do 2. miesiąca życia pozapłodowego jej zawartość rosła do 450% wartości grupy najmłodszej. Od tej momentu obserwowano delikatnie pogłębiający się spadek tej izoformy aż do poziomu grupy najmłodszej po upływie 1 roku życia. Od tej chwili zaznaczył się ponowny, ale słabszy wzrost stężenia tej hemoproteiny, osiągając ostatecznie 200% wartości grupy 0,5 miesięcznej u zwierząt najstarszych. Trzecia z ocenianych izoform, tj. CYP2C6 zachowywała się początkowo podobnie jak izoforma CYP2C11. I tym razem do końca 2 miesiąca życia obserwowano szybki wzrost zawartości tej izoformy, osiągając 5-krotny wzrost w porównaniu z grupą 0,5 miesięczną. W kolejnych przedziałach czasowych poziom CYP2C6 był nadal wysoki i oscylował w granicach 330% wartości grupy najmłodszej. Dyskusja Szczegółowe rozważania dotyczące syntezy cytochromu P450 w rozwoju ontogenetycznym wykazały, że proces ten przebiega szczególnie intensywnie między 15 a 30 dniem życia i jest kontynuacją procesu rozpoczętego w ostatnim okresie ciąży i w pierwszych dniach po urodzeniu [23-25]. Po tym okresie proces ten zostaje wyhamowany, lub może biec jeszcze przez kilka tygodni z różnym nasileniem. Zazwyczaj po 60 dniu życia pozapłodowego szczura ma miejsce wyraźne ograniczenie syntezy cytochromu P450 a następnie zaznacza się jego spadek, trwający co najmniej aż do fazy starzenia się zwierząt [26]. Zmiany w ekspresji cytochromów P450 wynikające z rozwoju organizmu u szczurów były badane zazwyczaj w przedziale: tuż po urodzeniu aż do osiągnięcia pełnej dojrzałości. Danych na temat zmian poziomów izoform cytochromu P450 u zwierząt starych i bardzo starych jest bardzo niewiele. W niektórych laboratoriach stwierdzono, że ma miejsce czynnościowa feminizacja wątroby samców szczurzych w czasie starzenia [27-29]. Aktywności enzymów metabolicznych, wysokie u młodych samców obniżały się u zwierząt starych do poziomu charakterystycznego dla samic. W innym ośrodku [30] stwierdzono, że zależny od wieku spadek aktywności metabolizmu leków u starych samców jest związany z zanikiem specyficznej dla samców izoformy CYP2C11. W naszych badaniach potwierdzono tę obserwację, z tym, że bardzo wyraźny spadek zawartości tej izoformy (do kilkudziesięciu pmoli/mg białka; Ryc. 1) występował już w 1 roku życia szczura. W wątrobach dojrzałych płciowo samców szczurzych izoforma CYP2C11 jest głównym izoenzymem i stanowi zwykle nie mniej niż 50% całej puli cytochromów P450 [31]. Cytochrom ten, jak i inne izoformy cytochromu P450 jest wrażliwy na hormony [32-34] a ekspresja lub depresja tych izoform jest regulowana przez takie czynniki jak hormon wzrostu czy hormony płciowe. Działanie czynników hormonalnych zmienia się wraz z wiekiem [35-37] a zmiany te wpływają na poziom cytochromu P450 [5]. Typowa dla samców izoforma CYP2C11 była stymulowana wiekiem zwierząt i osiągała wysokie stężenie już w 1 miesiącu życia (Ryc. 1) a poziom ten utrzymywał się conajmniej przez kilka następnych miesięcy. Z danych literaturowych wynika, że poziom tej izoformy obniża się wyraźnie u samców 2-letnich, podczas gdy my wykazaliśmy, że praktycznie 3-krotna obniżka poziomu izoformy CYP2C11 miała miejsce już w 12 miesiącu życia szczura. Zauważyliśmy ponadto, że począwszy od 1 roku życia pojawiała się nowa izoforma cytochromu P450, tj. CYP2C12. Z przeprowadzonej analizy wynikało, że izoforma CYP2C12 ilościowo uzupełniała ubytki izoformy CYP2C11. Badany przez nas wpływ starzenia się na zawartość izoform cytochromu P450 wykazał, że rzeczywiście u zwierząt starych miała miejsce tzw. feminizacja wątroby objawiająca się zanikiem głównej konstytucyjnej męskiej izoformy cytochromu P450, tj. CYP2C11 i pojawieniem się izoformy żeńskiej P450 - CYP2C12. Ujawnione w tej pracy zmiany poziomów konstytucyjnych izoform P450 dobrze też ko- 0,3 [nm/mg] 0,25 0,2 0,15 0,1 0, , Wiek szczurów w miesiącach 3A1 0,028 0,15 0,095 0,1 0,093 0,11 0,11 0,185 2C 11 0,056 0,25 0,25 0,21 0,2 0,216 0,137 0,112 2C 6 0,024 0,089 0,115 0,075 0,08 0,076 0,082 0,071 Ryc. 1. Zawartość głównych wątrobowych izoform cytochromu P450 (CYP) wyrażona w nanomolach/mg białka mikrosomalnego u szczurów w różnym wieku. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie dla przedziału ufności p<0,05.