Jakub Karasiński. Scenariusz analityczny badania specjacji cynku w tkankach roślin hałdowych

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Jakub Karasiński. Scenariusz analityczny badania specjacji cynku w tkankach roślin hałdowych"

Transkrypt

1 Jakub Karasiński Scenariusz analityczny badania specjacji cynku w tkankach roślin hałdowych Praca doktorska wykonana w Pracowni Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego pod kierunkiem prof. dr hab. Ewy Bulskiej Promotor pomocniczy dr Marcin Wojciechowski Warszawa 2014

2 Spis treści 1 Wstęp... 5 I. CZĘŚĆ LITERATUROWA Analiza specjacyjna Wprowadzenie Etapy analizy specjacyjnej Pobieranie próbek Mineralizacja i określenie całkowitej zawartości Ekstrakcja Rozdzielenie i identyfikacja Rośliny hałdowe Wprowadzenie Hałdy pokopalniane Występowanie metali w glebach hałdy i porastającej ją roślinności Pobieranie jonów metali przez rośliny Elementy budowy roślin wyższych Elementy budowy komórki roślinnej Toksyczność metali i ich wpływ na rośliny Przystosowania roślin do wysokich zawartości metali w podłożu Unikanie czynnika stresu Wykształcenie mechanizmów tolerancji na nadmiar metali w cytoplazmie Kompartmentacja w wakuoli Kompleksowanie przez metalotioneiny Kompleksowanie przez fitochelatyny Kompleksowanie jonów metali przez kwasy organiczne i aminokwasy Mechanizm wykluczenia z pędów i gromadzenia w pędach Rośliny hiperakumulujące Metody instrumentalne stosowane w badaniu specjacji metali w próbkach roślinnych Wstęp Ekstrakcja związków cynku Metody rozdzielania związków chemicznych stosowane w analizie specjacyjnej Techniki łączone stosowane w analizie specjacyjnej HPLC ICP MS GC MS i techniki kapilarne LC MS Elektrochemiczne techniki badania specjacji Bezpośrednie metody badania specjacji

3 II. CEL PRACY III. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA Aparatura i odczynniki Aparatura i sprzęt laboratoryjny Odczynniki Roztwory wzorcowe Materiały odniesienia Gazy Materiał badawczy Hodowla roślin Różnice morfologiczne pomiędzy populacjami Procedura określania całkowitej zawartości cynku w materiale roślinnym techniką ICP MS Optymalizacja układu ICP MS Interferencje izobaryczne i wieloatomowe przy oznaczaniu cynku techniką ICP MS Określenie całkowitej zawartości Zn w próbkach roślinnych Suszenie i mineralizacja Zawartość cynku w suchym materiale roślinnym Podsumowanie Badanie specjacji selenu z wykorzystaniem układu HPLC ICP MS Optymalizacja procedur ekstrakcji Ekstrakcja jednoetapowa Ekstrakcja po homogenizacji ciekłym azotem Ekstrakcja CO2 w stanie nadkrytycznym Określenie wydajności ekstrakcji Analiza specjacyjna cynku w próbkach roślinnych Wstęp Chromatografia wykluczania Warunki chromatograficzne Kalibracja kolumny wykluczania Wyniki Podsumowanie Chromatografia kationowymienna Warunki chromatograficzne Wyniki Przypisanie sygnałów poszczególnym związkom cynku Podsumowanie Chromatografia anionowymienna w połączeniu z chromatografią kationowymienną Warunki chromatograficzne

4 9.4.2 Wyniki Podsumowanie Porównanie specjacji cynku w dwóch populacjach rośliny Plantago lanceolata L Wprowadzenie Wyniki Przygotowanie tkanek roślinnych Porównanie specjacji cynku w częściach podziemnych obu populacji Podsumowanie Zastosowanie spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylenie w polu elektrycznym (ESI MS) Optymalizacja parametrów układu ESI MS Badania wstępne Chromatagorafia kationowymienna połączona z cząsteczkową spektrometrią mas Podsumowanie Dyskusja i wnioski Streszczenie Wykaz skrótów Spis rysunków Spis tabel Bibliografia

5 1 Wstęp Zmiany w środowisku wywołane działalnością człowieka często powodują zachwianie naturalnej równowagi danego terenu i prowadzą do powstania nietypowych warunków egzystencji organizmów żywych. Konsekwencją tego faktu mogą być reakcje adaptacyjne zasiedlających dany teren organizmów, w tym roślin. Poznanie wytworzonych przez rośliny mechanizmów umożliwiających przetrwanie w nieprzyjaznych warunkach stanowi cel wielu interdyscyplinarnych badań. Bardzo dobrym przykładem organizmów przystosowanych do niekorzystnych warunków otoczenia są rośliny hałdowe, które nie tylko akumulują metale występujące w dużych ilościach na terenach przemysłowych, ale także wykształciły mechanizmy chroniące je przed niekorzystnym ich wpływem. Poznanie form, w jakich występują pierwiastki w poszczególnych częściach rośliny jest kluczowe w celu zrozumienia procesów pozwalających roślinom hałdowym na wzrost w warunkach zanieczyszczenia. Ponadto znajomość metabolizmu danego pierwiastka daje możliwość hodowli roślin o ściśle określonej charakterystyce: np. fitoremedianty, czy żywność funkcjonalna. Badania procesów biochemicznych, jakim podlegają metale w organizmach roślinnych, oraz mechanizmów transportu metali w roślinie stanowią ważny kierunek rozwoju chemii analitycznej, szczególnie analizy specjacyjnej. Celem niniejszej pracy było opracowanie specyficznej procedury analitycznej pozwalającej na badanie, w postaci jakich związków, cynk występuje w próbkach roślinnych. Zakładano, że opracowana procedura pomiarowa pozwoli na uzyskanie informacji na temat metabolizmu cynku i jego transportu pomiędzy częściami podziemnymi a nadziemnymi roślin, oraz umożliwią porównanie różnych populacji roślin hałdowych pod kątem specjacji chemicznej cynku. Mając na uwadze określone wyżej cele, zaproponowano procedurę określania całkowitej zawartości cynku w tkankach roślinnych, przy czym zbadano wpływ różnego sposobu przygotowania próbki na wynik oznaczenia. Następnie duży nacisk położono na sposób wydobycia związków cynku z materiału roślinnego. Etap ten był uznany jako krytycznym w kontekście analizy specjacyjnej, gdyż z jednej strony istotne jest zachowanie 5

6 oryginalnej specjacji, ale jednocześnie ważna jest jak najwyższa wydajności ekstrakcji. W pracy porównano różne sposoby prowadzenia ekstrakcji, między innymi z użyciem ciekłego azotu i ekstrakcję CO2 w stanie nadkrytycznym. Badano również wpływ temperatury prowadzenie ekstrakcji oraz ph ekstrahenta na wydajność ekstrakcji i różnorodność specjacyjną wymytych związków chemicznych cynku. Następnie opracowano sposób rozdzielenia chromatograficznego związków cynku wydobytych z próbki roślinnej. W tym przypadku zastosowano dwuwymiarową chromatografię cieczową z detekcją ICP MS. Badano zastosowanie chromatografii dwuwymiarowej w układzie chromatografia wykluczania kationowymienna i w układzie chromatografia anionowymienna kationowymienna. Ostatecznie podjęto próbę identyfikacji rozdzielonych związków, bądź grup związków metodami cząsteczkowej spektrometrii mas. W ramach niniejszej pracy doktorskiej wykorzystano rośliny hałdowe Plantago lanceolata L. (babka lancetowata). Plantago jest popularną rośliną leczniczą obejmującą swoim zasięgiem niemal całą północną półkulę ziemi. Wybór tego gatunku był spowodowany tym, że rośliny te kumulują w swoich tkankach duże ilości cynku, przez co stanowią interesujący obiekt badań. Wykazują one przystosowanie do wzrostu i rozwoju na terenach zanieczyszczonych i w związku z tym postrzegane są, jako rośliny, które wykształciły odpowiednie mechanizmy tolerancji np. mechanizm akumulacji. Ziarna populacji Plantago badanej w niniejszej pracy pochodzą z dwóch stanowisk: hałd pokopalnianych w okolicy Bolesławia (południowa Polska), oraz z niezanieczyszczonych obszarów centralnej Polski. Ziarna obu populacji były kiełkowane w komorze wzrostowej przez jeden tydzień. Siewki przeniesiono na podłoże perlitowe i podlewano 50% pożywka Knoppa. Po pojawieniu się pierwszych liści wybrane rośliny podlewano pożywką wzbogaconą w azotan (V) cynku, pozostałe stanowiły populację kontrolną. Rośliny uprawiano w szklarni, aż do ich pełnego rozwoju. Zaobserwowano morfologiczne różnice pomiedzy populacjami: w porównaniu do populacji hałdowej, populacja naturalna miała mniej liści i były one mniejsze, rośliny cechowały się mniejszą biomasą i nie wykształciły części generatywnych. 6

7 I. CZĘŚĆ LITERATUROWA 2 Analiza specjacyjna 2.1 Wprowadzenie Termin specjacja jest uznawany za powszechnie znany i chętnie stosowany przez chemików analityków. Specjacja chemiczna, jako dziedzina badań pojawiła się w chemii analitycznej w latach siedemdziesiątych XX wieku. Wtedy właśnie naukowcy zdali sobie sprawę, jak duże znaczenie dla organizmów i środowiska naturalnego ma forma, w jakiej występuje dany pierwiastek. Sytuacja ta zbiegła się w czasie z dynamicznym rozwojem bardzo czułych technik analitycznych, umożliwiających określanie coraz niższych stężeń pierwiastków i ich związków chemicznych [1]. Zgodnie ze współczesnym rozumieniem terminu, specjacja chemiczna to występowanie pierwiastka w różnej postaci [1]. Analiza specjacyjna jest to analityczna działalność mająca na celu identyfikację i określenie ilości jednego lub więcej chemicznych indywiduów w próbce analitycznej [2], natomiast frakcjonowaniem nazywamy proces klasyfikacji analitów w badanym materiale na podstawie właściwości fizycznych (np. wielkość cząstek, rozpuszczalność) lub właściwości chemicznych (np. reaktywność w określonych warunkach) [2]. Niestety, próba zastosowania powyższych definicji do problemów analitycznych, z którymi, na co dzień borykają się chemicy okazuje się, co najmniej kłopotliwa. Dobrym przykładem jest badanie specjacji chromu. W większości prac poświęconych związkom chromu mamy do czynienia jedynie z rozróżnieniem stopnia utleniania tego pierwiastka, bez podania informacji, o formach występowania chromu na tym stopniu utlenienia. Postępowanie takie nie spełnia wymogów nakładanych przez cytowaną wyżej definicję analizy specjacyjnej, nie może też być jednoznacznie uznane jako frakcjonowanie [3]. 7

8 W literaturze można spotkać wiele dyskusji na temat stosowania obu pojęć: frakcjonowanie i analiza specjacyjna. Procedury frakcjonowania były opracowywane równolegle z badaniami specjacji [4-6], a niektóre z zaproponowanych sposobów postępowania wydają się być tak podobne, że ich zastosowanie jest kwestią interpretacji [3]. Pomimo opisanych wyżej niejasności terminologicznych, analiza specjacyjna odgrywa bardzo istotną rolę we współczesnej nauce. Jej zastosowania w różnych dziedzinach życia można mnożyć, a do podstawowych należą: poznawanie cykli biologicznych związków chemicznych, określanie toksyczności wybranych pierwiastków, kontrola jakości produktów spożywczych, kontrola środków medycznych i farmaceutycznych, kontrola procesów technologicznych, badania uszkodzeń instalacji technologicznych, analiza kliniczna [7-8]. Dla pełnej jasności warto wspomnieć, że w biologii terminem specjacji określa się proces biologiczny powstawania gatunków, w wyniku którego powstają nowe gatunki organizmów. Proces ten zachodzi na skutek wytworzenia się bariery rozrodczej pomiędzy wyjściowymi populacjami, czyli zaistnieniu zjawiska, które uniemożliwia między nimi wymianę genów. 2.2 Etapy analizy specjacyjnej Prawidłowe określenie form, w jakich występuje pierwiastek w próbce roślinnej jest trudnym zadaniem. Niemal każda, nawet najprostsza operacja analityczna, niesie za sobą niebezpieczeństwo zmiany równowagi chemicznej, co może doprowadzić badacza do błędnych wniosków. Dlatego też, w przypadku badania specjacji, szczególną dbałość należy przyłożyć do wykonywanych poszczególnych czynności, a całą procedurę analityczną zaplanować w taki sposób, aby zminimalizować możliwość zajścia nieodwracalnych zmian specjacji, lub zanieczyszczenia próbki. Niezależnie od obszaru zastosowania analizy specjacyjnej, kluczową rolę w procesie analitycznym odgrywa etap przygotowania próbki. Prawidłowe określenie form chemicznych danego pierwiastka w badanym materiale związane jest z odpowiednim pobraniem, przygotowaniem i przechowywaniem próbki. Każdy z tych etapów ma wpływ na wynik analizy specjacyjnej, ponieważ na każdym z nich mogą nastąpić nieodwracalne zmiany specjacji badanego pierwiastka. 8

9 Proces analizy specjacyjnej rozpoczyna się już w momencie pobrania próbki. Tak jak wspomniano wyżej, podstawowym założeniem przy pobieraniu próbki do analizy specjacyjnej jest zachowanie oryginalnej specjacji badanego pierwiastka. Na tym etapie należy pamiętać o trwałości termodynamicznej i kinetycznej indywiduów chemicznych [9]. Proste jony metali występujące na różnych stopniach utlenienia są w typowych warunkach przechowywania próbek względnie trwałe. Podobnie jest w przypadku związków metaloorganicznych, w których występuje wiązanie kowalencyjne pomiędzy węglem, a metalem. W przypadku układów biologicznych różnorodność ligandów mających zdolność koordynowania metali jest bardzo szeroka. Począwszy od małych ligandów nieorganicznych (azotany, chlorki, itp.), przez proste ligandy organiczne (cytryniany, szczawiany, fityniany, aminokwasy), po duże cząsteczki, takie jak białka i polisacharydy [10-11]. Z tego względu równowagi ustalone w układach biologicznych są z jednej strony bardzo skomplikowane, a z drugiej niesłychanie łatwe do zaburzenia. Schematycznie proces analizy specjacyjnej przedstawiono na rysunku 1. W dalszej części pracy opisano najważniejsze etapy tego procesu. Rysunek 1 Schemat procedury badania specjacji. 9

10 2.2.1 Pobieranie próbek W literaturze opisano kilka rodzajów postępowań mających na celu pozyskanie próbek roślin do przeprowadzenia analizy specjacyjnej. Typowe podejście to zebranie całej rośliny, a następnie podzielenie jej na poszczególne organy (korzenie, liście, łodygi, itp.), tak aby możliwe było badanie specjacji w poszczególnych częściach rośliny [12-13]. Podkreślić należy, że sposób podziału rośliny na poszczególne części jest kwestią umowną i dokonywany jest pod kątem spełnienia konkretnych założeń analitycznych lub/i biologicznych. Kolejnym etapem jest rozdzielenie świeżego materiału na dwie porcje: - jedna porcja materiału, po wysuszeniu i homogenizacji może być wykorzystana do określenia całkowitej zawartości badanych substancji (pierwiastka, związku chemicznego), - druga porcja świeżego może być poddana dalszej procedurze przygotowania materiału, np. ekstrakcji i wykorzystana do badania specjacji. Takie podejście jest najczęściej wykorzystywane w badaniach specjacji metali w roślinach [6,8,13]. W literaturze opisano również inne sposoby postępowania, np. kolekcjonowanie lotnych związków metali uwalnianych przez rośliny [14]. Są to jednak przypadki rzadkie, mające zastosowanie tylko w szczególnych sytuacjach. 10

11 2.2.2 Mineralizacja i określenie całkowitej zawartości W toku analizy specjacyjnej niezbędne jest poznanie całkowitej zawartości wybranych pierwiastków w oryginalnej próbce, jak również w roztworach otrzymywanych po przeprowadzeniu selektywnej ekstrakcji. Dzięki tym informacjom możliwe jest obliczenie ogólnej wydajności ekstrakcji i wybranie ekstrahentów zapewniających najefektywniejsze wymycie związków badanego pierwiastka. Trzeba jednak podkreślić, że otrzymane w ten sposób informacje należy wnikliwie interpretować. Wyniki oznaczenia całkowitej zawartości analizowanego pierwiastka w badanej próbce materiału roślinnego oraz w ekstrakcie pozwalają na obliczenie wydajności ekstrakcji, natomiast nie wskazują na to, ile form specjacyjnych wymywa dany ekstrahent. Z tego względu nie zawsze medium zapewniające najwyższą wydajność ekstrakcji jest najbardziej korzystnym wyborem z punktu widzenia badania specjacji, ponieważ może okazać się, że np. wymywa tylko jedną grupę związków. Z drugiej strony selektywność ekstrahenta można wykorzystać w celu oszacowania zawartości danej grupy związków. Warto również w tym miejscu zwrócić uwagę na ważny aspekt reprezentatywności otrzymanych wyników względem oryginalnego składu badanych obiektów. Oznaczenie całkowitej zawartości danego pierwiastka pozwala na obliczenie ogólnej wydajności ekstrakcji, natomiast nie uwzględnia tego, że różne związki mogą być ekstrahowane z różną wydajnością. Biorąc pod uwagę fakt, że nie ma ekstrahentów wymywających różne grupy związków z jednakową wydajnością, należy pamiętać, że nawet przy zachowaniu składu jakościowego, proporcje ilościowe mogą znacznie różnić się od oryginalnych. Mineralizacja ma na celu ujednolicenie form specjacyjnych i wyeliminowanie ewentualnego wpływu matrycy na wiarygodność wyników określenia całkowitej zawartości analitu. Obecnie najczęściej wykorzystywanym typem mineralizacji jest mineralizacja wysokociśnieniowa z wykorzystaniem energii mikrofalowej. Jest to sposób mineralizacji, w którym stosuje się kwasy nieorganiczne, gdzie wykorzystywana jest energia chemiczna w procesie rozkładu materii organicznej, podwyższone ciśnienie (co pozwala na stosowanie wysokich temperatur bez doprowadzenia mieszaniny do wrzenia) oraz energia promieniowania o częstotliwości mikrofalowej, najczęściej o częstotliwości około 2450 MHz. Do najważniejszych zalet mineralizacji ciśnieniowej z wykorzystaniem energii mikrofalowej 11

12 można zaliczyć dobrą powtarzalność i krótki czas procesu, niewielka ilość zużywanych odczynników oraz małe ilości materiału badanego [6,15] Ekstrakcja Kolejnym etapem badania specjacji jest wymycie wybranych związków z badanego obiektu. Wyróżnić można dwa różne podejścia do prowadzenia ekstrakcji: - możliwa jest ekstrakcja wybranej grupy związków chemicznych z określonych przedziałów komórkowych (np. wakuola lub czy cytozol). W tym przypadku ważny jest odpowiedni dobór ekstrahentów, tak aby zachować podobieństwo ich cech do roztworu wypełniającego dany przedział komórkowy. Możliwe, aczkolwiek trudne i pracochłonne, jest również oddzielenie od siebie poszczególnych przedziałów komórkowych, a następnie przeprowadzenie ekstrakcji [16-17]. - innym podejściem jest ekstrakcja z całych tkanek rośliny. Odpowiednio dobrany ekstrahent powinien umożliwić efektywne wymycie związków badanego pierwiastka z próbki roślinnej, ale przede wszystkim nie powodować zmiany jego specjacji. Najbardziej odpowiednie wydaje się stosowanie roztworów o ph zbliżonym do ph próbki [18]. Proponowane w literaturze procedury ekstrakcji różnią się między sobą stosunkiem masy próbki do objętości ekstrahenta, rodzajem i stężeniem roztworu ekstrakcyjnego oraz czasem ekstrakcji. Do najczęściej opisywanych w literaturze ekstrahentów można zaliczyć: bufor octanowy [19], bufor Tris-HCl [20], woda [20], roztwory związków powierzchniowo czynnych (dodecylosiarczan sodu (SDS) w buforze Tris-HCl), roztwory zawierające enzymy proteolityczne (np. proteaza w buforze Tris-HCl), roztwory enzymów rozkładających cukry (driselaza w buforze Tris-HCl) [20]. Ekstrakcję prowadzi się z reguły jednoetapowo, po wcześniejszej homogenizacji materiału roślinnego lub w homogenizatorze z odpowiednim ekstrahentem [21]. Innym sposobem ekstrakcji stosowanym w analizie specjacyjnej może być ekstrakcja płynem w stanie nadkrytycznym (SFE; ang. Supercritical Fluid Extraction). W tym przypadku jako ekstrahent stosowany jest płyn w stanie nadkrytycznym (najczęściej jest to CO2). Najważniejszymi zaletami płynu w stanie nadkrytycznym są jego stosunkowo niska lepkość i wysoka dyfuzyjność. Z tego względu płyn w stanie nadkrytycznym może penetrować próbkę stałą bardziej efektywnie niż ciecz, przez co możliwe jest znaczące podniesienie zarówno 12

13 szybkości, jak i efektywności wymywania składników próbki [22-23]. Poza tym moc ekstrakcyjna płynu w stanie nadkrytycznym może być łatwo dopasowana przez zmianę temperatury i/lub ciśnienia [24], co umożliwia istotną zmianę jego selektywności [25]. Prawdopodobnie najważniejszym atutem SFE jest fakt, że ekstrahent w warunkach pokojowych ulega odparowaniu, co umożliwia wielokrotne zatężenie składników ekstraktu i otrzymanie próbki o stosunkowo wysokiej zawartości poszczególnych substancji, dodatkowo umożliwiając pominięcie pracochłonnego etapu zatężania [23]. SFE jest prowadzona w stosunkowo niskiej temperaturze, co ogranicza możliwość zmian specjacji wywołanych termicznym rozkładem form specjacyjnych badanego pierwiastka [26-28]. W analizie specjacyjnej SFE był stosowany w przypadku analizy takich pierwiastków jak ołów [28-29], rtęć [30-31], czy arsen [32-34]. 13

14 2.2.4 Rozdzielenie i identyfikacja Kolejnym etapem analizy specjacyjnej jest rozdzielenie i identyfikacja wyekstrahowanych związków badanego metalu. Mimo tego, że dysponujemy obecnie bardzo czułymi technikami cząsteczkowej spektrometrii mas, umożliwiającymi ustalenie struktury związków chemicznych, etap rozdzielenia chromatograficznego pozostaje krokiem niezbędnym. Fakt ten związany jest ze sposobem prowadzenia analiz przy użyciu metod spektrometrii cząsteczkowej, w których wykorzystuje się porównanie otrzymanego widma, z widmem substancji wzorcowej [35]. Jeżeli jednak w badanym roztworze obecnych będzie kilka związków danego pierwiastka, otrzymane widmo będzie bardzo złożone i często trudne w interpretacji. W literaturze opisano zastosowanie wielu technik pozwalających na rozdzielanie mieszaniny różnych związków danego pierwiastka, chromatografię cieczową, gazową oraz elektroforezę. Techniki chromatografii cieczowej stosowane są bardzo szeroko, w celu rozdzielania związków chemicznych o różnorodnym charakterze, natomiast techniki chromatografii gazowej ograniczone są do związków o odpowiednio wysokiej lotności i stabilności termicznej. Techniki elektroforetyczne stosowane są głównie do rozdzielania białek [36] i łączone z odpowiednimi detektorami, takimi jak UV-Vis, czy cząsteczkowe, lub atomowe techniki spektrometrii mas. Wszystkie techniki specjacyjne umożliwiają rozdzielanie składników próbek ciekłych, a więc w przypadku badania specjacji w roślinie są one pośrednimi technikami badania specjacji. Oznacza to, że ich użycie musi być poprzedzone etapem przygotowania próbki (np. ekstrakcja), wiążącym się z naruszeniem równowagi chemicznej i przeniesieniem badanych związków z próbki do innego medium. Odrębną grupę technik badania specjacji stanowią techniki bezpośrednie, umożliwiające identyfikację poszczególnych form chemicznych w badanym obiekcie bez konieczności przenoszenia form specjacyjnych do innego medium. Techniki te opisano szerzej w rozdziale IV. 14

15 3 Rośliny hałdowe 3.1 Wprowadzenie Zmiany w środowisku wywołane działalnością człowieka często powodują zachwianie naturalnej równowagi danego ekosystemu i prowadzą do powstania nietypowych warunków egzystencji, czego konsekwencją może być wytworzenie przez rośliny mechanizmów chroniących je przed negatywnym wpływem środowiska. Bardzo dobrym przykładem organizmów przystosowanych do niekorzystnych warunków otoczenia są rośliny hałdowe. Rośliny hałdowe zbiorowiska roślinne porastające gleby charakteryzujące się wysoką zawartością związków cynku i ołowiu. W Polsce spotykane są w okolicy Olkusza i Bolesławia na starych hałdach rud metali (głównie cynku). Naturalne tereny metalonośne, a także obszary wtórnie wzbogacone w metale w wyniku działalności człowieka (np. hałdy, zwałowiska, bezpośrednie sąsiedztwo hut, elektrowni itp.) o ekstremalnych warunkach środowiskowych stanowią specjalną niszę ekologiczną, którą kolonizują niektóre rośliny [37]. Organizmy rosnące na takich terenach wykształciły szereg mechanizmów adaptacyjnych, służących unieszkodliwianiu toksycznych substancji chemicznych dostających się do komórek, organizmy te są zaliczane do metalofitów. Rewolucja przemysłowa na terenie Europy, na przełomie XIX i XX wieku, doprowadziła do zanieczyszczenia środowiska oraz powstania antropogenicznych terenów metalonośnych hałd i zwałowisk. Przykładem takich terenów w Polsce jest obszar hałd w Bolesławiu, w okolicy Olkusza, powstały w wyniku wydobycia złóż rud Zn-Pb. W wyniku procesów adaptacyjnych wykształciła się tam flora galmanowa (termin wyjaśniono na stronie 31) [38-41]. 15

16 3.2 Hałdy pokopalniane W południowej części Polski, między innymi w regionie Olkuskim, wielowiekowa działalność wydobywcza w charakterystyczny sposób ukształtowała krajobraz [39]. Hałdy pogórnicze, zawierające często duże zawartość metali, szczególnie cynku i ołowiu, stanowią zagrożenie dla środowiska poprzez pylenie, skażenie wód podziemnych i cieków wodnych. Zjawiska te są szczególnie istotne wtedy, gdy hałdy są pozbawione roślinności [42]. Hałdy cynkowo-ołowiowe w okolicy Bolesławia, odległe od Olkusza około 10 km, to hałdy różnowiekowe. Najstarsza hałda, ponad 100-letnia, porośnięta jest zwartą murawą i pojedynczymi drzewami i krzewami. Sąsiadują z nią hałdy młodsze, kilkunastoletnie o szkieletowym podłożu i niewielkim pokryciu roślinnością oraz hałdy świeżo powstałe, prawie całkowicie pozbawione roślinności [43]. Część tych młodych, pozbawionych gleby hałd, została przed kilku laty zadrzewiona sosną i brzozą. Jenak konsekwencją trudnych warunków siedliskowych (teren pozbawiony prawie gleby, bardzo niska wilgotność lub susza podłoża) jest bardzo słaby wzrost drzew lub ich obumieranie. Mimo tego, że na hałdzie panują ekstremalne warunki siedliskowe: silne nasłonecznienie, niska wilgotność podłoża, niska zawartość składników odżywczych i wysoka zawartość metali w glebie, można tam znaleźć kilkadziesiąt gatunków roślin, co świadczy o bogactwie florystycznym tego terenu [44]. Najbardziej stałą i najobficiej występującą grupą są rośliny ciepłolubne i gatunki tolerujące metale (metalofity) [43] Występowanie metali w glebach hałdy i porastającej ją roślinności. Odczyn hałdy jest zasadowy (ph > 7,6), a w górnych jej warstwach (0 5 cm) stwierdzono obecność około 5% cynku i 0,3% ołowiu. Teren ten cechuje również wysoka zawartość metali pierwszej i drugiej grupy układu okresowego (szczególnie Ca 8%, Mg 2%, K 2%) [45]. Należy jednak podkreślić, że wysoka całkowita zawartość metali nie jest jednoznaczna ze wzrostem stężenia tych pierwiastków w roślinach. Dla roślin dostępne są jedynie rozpuszczalne formy metali. Odczyn gleb hałdy bolesławskiej jest alkaliczny, dzięki czemu formy rozpuszczalne metali występują w niewielkim tylko procencie ogólnej ich zawartości. Na podstawie badań modelowych stwierdzono, że zawartość form 16

17 rozpuszczalnych cynku, ołowiu i niklu waha się w granicach 10% 16% całkowitej ich zawartości [46]. Znane są również badania, w których autorzy podają, że zawartość form rozpuszczalnych kadmu i cynku nie przekracza, odpowiednio 4% i 0,1% [45]. Warto również podkreślić, że rośliny pobierają jedynie część dostępnych, rozpuszczalnych form danego pierwiastka. 3.3 Pobieranie jonów metali przez rośliny Elementy budowy roślin wyższych Korzeń i pęd to dwa podstawowe organy roślin wyższych. Pęd składa się z dwóch zasadniczych organów: łodygi i liści, z których w toku rozwoju ewolucyjnego wykształciły się pączki, kwiaty i owoce. Korzenie i łodygi pełnią wegetatywne funkcje odżywiania i wzrostu rośliny. Natomiast kwiaty wytwarzają owoce z nasionami, które powstają w wyniku procesów płciowych - pełnią przede wszystkim funkcje generatywną. Liście to wyrastające z węzłów końcowe elementy rozgałęzień pędu, wyodrębniające się ze względu na funkcję i budowę od łodygi (nie mają np. zdolności do nieprzerwanego wzrostu). Liście pełnią głównie funkcje odżywcze i z tego powodu mają zwykle dużą powierzchnię umożliwiającą ekspozycję na promieniowanie słoneczne. Poza tym liście biorą udział w transpiracji (czynne parowanie wody z nadziemnych części roślin), gutacji (zjawisko wydzielania kropel wodnych roztworów soli) i wymianie gazowej. Zjawisko zróżnicowania liści w obrębie jednej rośliny nazywane jest heterofilią (różnolistnością), a opis tego zróżnicowania zwany jest spektrum liściowym. Łodyga to nadziemna część rośliny, która wraz z liśćmi, kwiatami (lub pąkami) i ewentualnymi owocami tworzy pęd. Łodyga pełni liczne funkcje, przede wszystkim podtrzymuje liście, kwiaty, owoce, wznosząc je na wysokość umożliwiającą skuteczniejsze korzystanie ze światła, zapylanie, rozsiewanie itp. Ponadto przewodzi wodę i sole mineralne z korzenia, a asymilaty z liści do pozostałych organów. Dodatkowo magazynuje substancje odżywcze, wodę i sole mineralne, a łodygi zielone (niezdrewniałe) biorą udział w procesie fotosyntezy. 17

18 Warunki bytowania determinują w znacznej mierze funkcje łodygi, w tym głównie stosunek funkcji mechanicznej do transportowej, np. układ mechaniczny łodyg roślin wodnych jest przystosowany do falowania i prądów, brak lub znacznie ograniczony jest natomiast transportu wody; w przypadku łodyg podziemnych (kłącza, rozłogi) zarówno funkcja mechaniczna jak i transportowa jest znacznie ograniczona. Łodygi nadziemne (zarówno pnące, jak i wolno stojące) muszą być przystosowane zarówno do sprawnego transportu wody i substancji organicznych, jak i do znoszenia naprężeń, wygięć i skręceń mechanicznych [47-48]. Rysunek 2 Elementy budowy roślin wyższych na przykładzie Plantago lanceolata. Korzeń to część rośliny, która dostarcza roślinom wodę i substancje odżywcze (sole mineralne), utrzymuje rośliny na podłożu i służy do gromadzenia substancji zapasowych. Korzenie tworzą silnie rozczłonkowany układ penetrujący podłoże, nazywany systemem korzeniowym. Korzeń często mylony jest z kłączem stanowiącym podziemny fragment pędu. Korzenie w odróżnieniu od pędu nie wykształcają liści i rosną w dół (geotropizm), zwykle są niezielone, choć niektóre korzenie powietrzne mogą zawierać chlorofil [48]. Najważniejsze i najczęściej spotykane funkcje korzeni to dostarczanie roślinie wody wraz z substancjami odżywczymi oraz przytwierdzenie rośliny. Czasem pełnią one dodatkowo funkcję magazynową, służą do rozmnażania wegetatywnego, rzadko odgrywają ważną rolę w układzie wentylacyjnym roślin, ale czasami pełnią funkcję asymilacyjną. Korzenie stosunkowo rzadko odgrywają istotną rolę w rozmnażaniu wegetatywnym. Rośliny potomne mogą powstawać z odrostów korzeniowych (np. u osiki i robinii akacjowej), z bulw korzeniowych (np. dalia), czasem przystosowanych do rozmnażania w formie łatwo odpadających od rośliny macierzystej rozmnóżek (np. ziarnopłon wiosenny). Inaczej jest

19 w przypadku działalności ogrodniczej, podczas której wykorzystywana jest powszechnie zdolność wytwarzania korzeni z fragmentów pędów do tworzenia sadzonek [49] Elementy budowy komórki roślinnej Komórka roślinna jest podstawową jednostką strukturalną i funkcjonalną budującą organizm rośliny, mającą zdolność przetwarzania materii i jej wymiany z otoczeniem [50]. Komórki roślinne są bardzo zróżnicowane pod względem kształtu i rozmiarów, a kształt komórki zależy od funkcji, jaką pełni i od rodzaju tkanki, której jest elementem. Kształt nadaje komórkom roślinnym ściana komórkowa i tylko nieliczne są jej pozbawione. Zazwyczaj komórki roślinne są wielościanami, o liczbie ścian odpowiadającej liczbie miejsc styku z komórkami przyległymi. Do najważniejszych elementów komórki należy zaliczyć: - ściana komórkowa - błona komórkowa, - mitochondriom, - aparat Golgiego, - wakuola, - siateczka śródplazmatyczna, - jądro komórkowe, - cytoplazma. Na rysunku 3 przedstawiono schemat budowy komórki roślinnej i zaznaczono jej podstawowe elementy. 19

20 Rysunek 3 Schemat budowy komórki roślinnej. Źródło: zadane.pl Poniżej omówiono wybrane (ściana i błona komórkowa, wakuola, cytoplazma i jądro komórkowe) elementy budowy komórki, ważne z punku widzenia mechanizmów transportu jonów metali i mechanizmów tolerancji, opisanych w dalszej części pracy. Cytoplazma jest częścią każdej żywej komórki, leżącą poza jądrem komórkowym. Komórka eukariotyczna (posiadająca jądro) składa się z organelli komórkowych, oraz cytoplazmy (hialoplazmy, cytozolu). Cytoplazma jest koloidem białkowym, którego większą część stanowi woda (60%-90%), a wśród rozpuszczonych, lub rozproszonych związków chemicznych: białka (ok. 50%), cukry (15%-20%) i lipidy (13%-25%), oraz różne sole mineralne. W obrębie cytoplazmy zachodzą niektóre procesy metaboliczne, np. dezaminacja aminokwasów, synteza nukleotydów i biosynteza białka. Synteza większości białek zachodzi na wolnych rybosomach w cytoplazmie, a błony wewnątrzkomórkowe stanowią selektywnie przepuszczalne bariery; z tego powodu komórka wykształciła mechanizmy, dzięki którym białkowe molekuły mogą dotrzeć do odpowiednich organelli aby tam spełniać swoje biologiczne funkcje. Wakuole występują licznie w komórkach merystematycznych. Wraz z różnicowaniem się komórek dochodzi do zlewania się wakuol i w komórce w pełni wyrośniętej zwykle 20

21 znajduje się jedna wakuola zajmująca ponad 90% jej objętości [50]. Wyróżniane są dwa typy wakuol. Pierwsze to wakuole lityczne (wegetatywne), zawierające enzymy z grupy hydrolaz, esteraz i peroksydaz. Wakuole lityczne umożliwiają odzyskiwanie składników wewnątrzkomórkowych. Drugi typ to wakuole gromadzące materiały zapasowe. W jednej komórce mogą występować jednocześnie oba typu wakuol. Każda wakuola otoczona jest pojedynczą błoną, tonoplastem, wypełnioną sokiem wakuolarnym. Tonoplast charakteryzuje się większą płynnością od błony komórkowej. Wewnątrz wakuol gromadzone są antocyjany, flawonoidy nadające barwę organom roślinnym, a także jony organiczne i nieorganiczne, metabolity wtórne (np. nikotyna, kokaina, morfina, strychnina), garbniki, sacharydy, aminokwasy, białka zapasowe. W wakuolach znajdują się również dojrzałe tanosomy zawierające taniny. Wakuole mogą powstawać przez podział istniejącej, z pęcherzyków diktiosomalnych, z błon siateczki śródplazmatycznej, z pęcherzyków endocytotyczneych a także de novo. Gromadzenie w wakuolach metabolitów wtórnych jest jednym z mechanizmów obronnych roślin. Substancje te mogą nadawać roślinom właściwości trujące lub tylko powodować, że stają się niesmaczne dla roślinożerców. Mogą być też toksyczne dla mikroorganizmów [50]. Zgodnie z dzisiejszym stanem wiedzy rośliny są najważniejszą grupą odpowiedzialną za przenoszenie metali z gleby do organizmów zwierzęcych i organizmu człowieka [51]. To właśnie spożywając pokarmy roślinne wprowadzamy do organizmu największe dawki metali i ich związków. Proces pobieranie metali przez roślinę możemy podzielić na trzy zasadnicze etapy [52]. Pierwszy to zwiększenie mobilności jonów metali w glebie (obecność rozpuszczalnych w wodzie form danego pierwiastka), drugi to ich pobieranie z gleby (przenoszenie danej cząsteczki lub jonu z roztworu glebowego przez ścianę korzenia do wnętrza komórek), a trzeci to transport do miejsc w roślinie, w których pierwiastki mogą być magazynowane. Zawartość metali w poszczegónych częściach rośliny z reguły maleje w szeregu [53]: korzeń > łodyga > liść > owoc > nasiono. Warto podkreślić, że korzenie roślin mogą wydzielać substancje zdolne do uwalniania metali z ich trudnorozpuszczalnych (w roztworze glebowym) połączeń, a tym samym zwiększać efektywność ich pobierania z podłoża. Najczęściej wydzielane są kwasy organiczne i związki chelatujące metale. Podobną rolę spełnia ATP (Adenozyno-5 -trifosforan nukleotyd adeninowy), które pozwala na obniżenie ph gleby oraz na zmianę stopnia utlenienia niektórych metali (np. żelazo, mangan) do postaci lepiej rozpuszczalnych, a tym samym lepiej przyswajalnych przez roślinę. 21

22 W błonach komórek roślinnych nie ma specyficznych transporterów metali (np. Mg, Ca, K). W związku z tym kationy metali takich jak kadm, czy ołów, są transportowane w taki sam sposób jak kationy niezbędne dla wzrostu roślin. Warto podkreślić, że ściana komórkowa komórek korzenia zachowuje się jak wymieniacz jonowy, jest ona jednak przy tym mało selektywna. Konsekwencją tego faktu jest wnikanie do wnętrza rośliny różnych jonów, również tych, które nie są pożądane. Po wniknięciu do komórki jony nie pozostają w stanie wolnym, są szybko chelatowane i otaczane specjalnymi białkami, zapobiegającymi dalszej agregacji (białka opiekuńcze ang. cheparones). Drugą grupą białek uczestniczących w transporcie metali do wakuoli jest CDF (Cation Diffusion Facilifactor). Mogą one uczestniczyć w transporcie takich metali jak cynk, kobalt, czy kadm. Jednym z białek należących do tej grupy jest ZAT (zinc transporter of Arabidopsis thaliana). Zwiększa ono wprawdzie akumulację cynku, ale również zwiększa tolerancję rośliny na jego obecność [52]. Oznacza to, że roślina może pobierać więcej cynku bez wystąpienia objawów nadmiaru tego pierwiastka. Najważniejszą grupę związków uczestniczących w zewnątrzkomórkowym transporcie matali są metalotioneiny. Podzielono je na trzy klasy: dwie pierwsze odpowiadają za transport metali w organizmach zwierząt i człowieka; trzecią grupę metalotionein stanowią fitochelatyny (PC), które są odpowiedzialne za transport wielu metali w roślinach. Podstawowa rola, jaką przypisuje się fitochelatynom polega na wahadłowym transporcie większości kationów dwuwartościowych z cytoplazmy do wakuoli. W wakuoli, w warunkach niskiego ph (około 5,4), kompleksy te ulegają dysocjacji. Wnikanie metali do roślin z atmosfery jest dość mocno utrudnione, ze względu na fakt, że pokrywająca liście kutikula i warstwa woskowa jest słabo przepuszczalna dla większości metali. Ponadto niektóre z nich mogą ulegać adsorpcji na powierzchni liści (np. ołów). Dlatego zdecydowana większość metali pobierana jest z gleby, poprzez korzeń. 3.4 Toksyczność metali i ich wpływ na rośliny Reakcja rośliny na metale jest w dużym stopniu cechą gatunkową, a nawet populacyjną. Zależy ona od rodzaju pierwiastka, od stężenia i formy jego występowania w otoczeniu i od czasu oddziaływania. Można wyróżnić kilka typowych reakcji rośliny. Najbardziej narażone na obecność metali są komórki korzenia rośliny. Ich reakcje można podzielić na dwie grupy [52]: 22

23 a) morfologiczne: - obniżenie biomasy komórek korzeniowych, - stymulacja rozwoju korzeni bocznych (wzrost zagęszczenia systemu korzeniowego), - hamowanie wzrostu wydłużeniowego korzenia, - grubienie wierzchołkowej części korzenia, - zmniejszenie gęstości włośników lub ich przedwczesne zamieranie, - brązowienie korzeni lub inne przebarwienia, - strukturalne zmiany hipodermy, endodermy i perycyklu. b) fizjologiczne: - uszkodzenia błony komórkowej, będącej pierwotnym miejscem toksycznego działania jonów metali, - zmniejszenie przepuszczalności błony komórkowej dla wody i zmniejszenie pobierania wody przez rośliny, co objawia się plazmolizą, - zmniejszenie oddychania korzeniowego. Metale niezablokowane w korzeniu przedostają się do pozostałych organów, zakłócając procesy fizjologiczne i metaboliczne roślin [53-54]. Zbyt duże stężenie metali w roślinie powoduje tak zwany stres wodny, czyli obniżenie zawartości wody o około 10%-15%. Zarówno obniżenie zawartości wody, jak i wysokie stężenie metali mogą istotnie zaburzać fotosyntezę. Obniża się poziom CO2, a ATP i NADPH (odpowiednio adenozyno-5'-trifosforan i dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) ulegają akumulacji. Ponadto metale mogą bezpośrednio hamować działanie enzymów zaangażowanych w syntezę chlorofilu. Kolejnym skutkiem nadmiernego stężenia metali w roślinie jest zaburzenie metabolizmu białek poprzez obniżenie aktywności nitrogenez u roślin żyjących w symbiozie z roślinami motylkowymi. Obecność metali powodują też zaburzenia w transporcie i magazynowaniu niezbędnych dla rośliny pierwiastków (deficyt wtórny), co, jak już wcześniej podano, wynika z tego, że pobieranie metali przez korzeń jest procesem nieselektywnym. Ponadto obserwuje się wpływ obecności metali na fizyczne i chemiczne właściwości błon plazmatycznych oraz na procesy oddychania rośliny [54]. Toksyczność niektórych pierwiastków polega na ich interakcji z tiolowymi grupami funkcyjnymi szeregu enzymów, w tym również antyoksydacyjnych, hamowaniu lub zakłócaniu funkcji np. polimerazy DNA, RNA, ATPazy, enzymów syntezy kwasu 23

24 jabłkowego i wielu innych [55-57]. Toksyczność Cu, Cr, Ni, Cd, Co, Pb raz Zn polega także na zastępowaniu przez nie innych metali w strukturach białek i w innych biocząsteczek (cząsteczek związku biologicznie aktywnego) poprzez np. zastąpienie magnezu w chlorofilu, oraz na ich preferencyjnym łączeniu się z tlenem, azotem i siarką; na ich interakcjach z grupami funkcyjnymi, np. z fosforanowymi ADP i ATP lub z grupami karboksylowymi. W konsekwencji zaburza to funkcjonowanie biocząsteczek, negatywnie wpływa na metabolizm białek, biosyntezę barwników fotosyntetycznych czy biosyntezę hemu. Obecność metali powoduje hydrolizę chlorofilu, zamykanie aparatów szparkowych, spadek liczby i objętości chloroplastów, spadek produkcji ATP, czy wzrost sztywności ścian komórkowych. Metale obecne w komórce w nadmiernych ilościach modyfikują ultrastrukturę komórki oraz negatywnie wpływają na fotosyntezę, oddychanie czy transpirację [37, 57-59]. W warunkach naturalnych o optymalnej strukturze i zasobności gleby, wykorzystywane są komórkowe, naturalne mechanizmy utrzymujące prawidłowy poziom jonów w różnych przedziałach komórek. Równowaga ta zostaje zaburzona, gdy roślina pobiera duże ilości metali, a mechanizmy naprawcze nie są wystarczająco efektywne do unieszkodliwienia nadmiernej ich ilości. Może to prowadzić do zahamowania wzrostu, a nawet obumarcia wrażliwych osobników [60-61]. Mimo powszechnego przypisywania wielu metalom, efektów toksycznych, znane są sytuacje, iż niewielkie ilości generują efekty pozytywne. Stymulujący wpływ niewielkich ilości metali na takie procesy jak wzrost, kwitnienie czy kiełkowanie nasion nosi nazwę hormesis. Przykładowo, znane są doniesienia, że małe ilości Cu, Cd, Zn i Ni powodowały stymulację wzrostu roślin [62]. Stężenie metalu w komórkach rośliny, odpowiadające optymalnemu wzrostowi rośliny, a także zakresy niedoboru i toksyczności, zależą od pierwiastka i gatunku roślin. Typowe jest, że w warunkach niedoboru obserwuje się obniżenie wzrostu roślin. Następnie, wraz ze wzrostem dawki do punktu krytycznego obserwuje się wzrost plonowania, po którym wraz z dalszym wzrostem dawki plon jest wysoki i nie zmienia się. Jest to poziom tolerancji danego gatunku na badany pierwiastek, obserwowany aż do punktu toksyczności (krytycznego), od którego następuje, wraz ze wzrostem dawki spadek produkcji biomasy, mogący prowadzić przy bardzo wysokich dawkach pierwiastka do śmierci rośliny [37, 62-63] (rysunek 4). 24

25 Rysunek 4 Zależność pomiędzy plonem a stężeniem pierwiastka w tkance rośliny. Źródło: L. Taiz, E. Zeiger Plant Physiology. Wydanie piąte, Wiadomo jest, że różne organelle komórkowe wykazują różne zapotrzebowanie na określone jony metali. Większość cząsteczek aktywnych biologicznie zawierających Fe, Zn lub Cu, jest zlokalizowana poza cytozolem, dlatego też dostarczenie odpowiedniej ilości jonów metali do tych przedziałów jest konieczne dla zachowania homeostazy w komórce [64-65]. Szczególne znaczenie odgrywa gromadzenie jonów metali w wakuoli, która u roślin pełni funkcje organellum gromadzącego zbędne i toksyczne substancje w komórce. Proces ten ma również kluczowe znaczenie w detoksyfikacji rośliny z jonów metali. Uważa się, że rodzaj ligandu determinuje kierunek transportu jonów metali w roślinie. I tak, jony metali przeznaczone do magazynowania w wakuolach komórek korzenia mogą być kompleksowane przez metalotioneiny [66], a jony kierowane do transportu w ksylemie mogą być kompleksowane przez histydynę, nikotianaminę [67-68]. 3.5 Przystosowania roślin do wysokich zawartości metali w podłożu Szereg gatunków i populacji (m. in. rośliny hałdowe) wykształciło mechanizmy adaptacyjne, które pozwalają im na utrzymanie prawidłowego funkcjonowania komórki i całego organizmu. Rośliny te wykształciły dwie przeciwstawne strategie odporności. Jedna polega na unikaniu pobierania metalu (ang. stress avoidance), druga opiera się na pobieraniu metali i unieszkodliwianiu ich w komórkach, poprzez wytworzenie specyficznych cech fizjologicznych [69-70]. 25

26 Główna różnica między tymi dwoma procesami odporności jest taka, że celem wszystkich mechanizmów unikania jest zapobieganie wniknięciu metali do wnętrza komórki, natomiast mechanizmy tolerancji stanowią odpowiedź na obecność metalu we wnętrzu komórki Unikanie czynnika stresu Strategia ta polega na wykształceniu mechanizmów zewnątrzkomórkowych zabezpieczających przed dostaniem się metali do cytoplazmy. W tym przypadku roślina ogranicza pobieranie metali przez korzenie, ich gromadzeniu w ścianie komórkowej, lub przestworach międzykomórkowych (apoplaście), oraz modyfikowaniu struktury ściany komórkowej[41]. Ponadto w przypadku tej strategii często dochodzi do: - zmianie ph (najczęściej obserwowany jest wzrost wartości ph) w ryzosferze, - wydzielaniu przez korzenie do gleby kwasów organicznych, które mogą wiązać, a tym samym obniżać dostępność metali, - produkcji i wydzielaniu śluzów w szczytowych partiach korzeni, stanowiących barierę mechaniczną, - mikoryzie, w której komponent grzybowy wiąże i detoksyfikuje roślinę z metali. Należy podkreślić, że po przekroczeniu określonego stężenia metalu, mechanizm ten może zostać zaburzony i metale przenikają do organów roślinnych [55,69]. Przykładowo, w populacji Agrostis capillaris, wykazującej tolerancję na wysokie stężenia cynku, metal ten akumulowny był w większym stopniu w ścianach komórkowych korzeni niż w przypadku roślin populacji Agrostis capillaris niewykazującej podwyższonej tolerancji na Zn. Zwiększoną akumulację cynku w korzeniach roślin populacji wykazującej tolerancję na wysokie stężenia cynku w porównaniu z populacją wrażliwą stwierdzono również u Silene vulgaris [70]. 26

27 3.5.2 Wykształcenie mechanizmów tolerancji na nadmiar metali w cytoplazmie Mechanizmy tolerancji polegają na skutecznym unieszkodliwianiu jonów metali dostających się w ilościach toksycznych, ponadprogowych, do cytoplazmy. Zapewniają tym samym ochronę procesów metabolicznych oraz błon biologicznych przed uszkodzeniami. Mechanizmy te polegają na: - syntetyzowaniu szeregu związków w odpowiedzi na pojawienie się metali w komórce (metalotioneiny, fitochelatyny, białka opiekuńcze, kwasy organiczne i nieorganiczne, fityniany, aminokwasy i ich pochodne) i ich wiązaniu z metalami, co umożliwia prawidłowy przebieg procesów metabolicznych, - deponowaniu kompleksów biocząsteczka-metal w docelowych miejscach nieaktywnych metabolicznie, głównie w wakuolach, gdzie są magazynowane lub wydalane z komórki, - aktywacji systemu antyoksydacyjnego, wiążącego wolne rodniki i reaktywne formy tlenu [60, 70-74]. Transport jonów do cytoplazmy, ich wiązanie i transport do wakuol jest istotnym etapem detoksyfikacji roślin. Jak już wcześniej wspomniano, istotnym mechanizmem tolerancji na metale jest zdolność ich wiązania w obrębie cytoplazmy, a następnie oddzielenie od pozostałych organelli komórkowych poprzez gromadzenie w wakuolach. Duże złogi metalu w wakuolach, to typowy obraz ultrastruktury komórek roślinnych traktowanych ołowiem i kadmem. W wakuolach i ścianach komórkowych Armeria maritima ssp. halleri stwierdzono akumulację nawet do 96 % ogólnej puli metali [75]. Heumann, przy zastosowaniu zastosowaniu autometalografii, zaobserwował duże złogi cynku w wakuolach tkanek korzeni oraz liści [76]. W przypadku dużej dawki metali, aktywność enzymów antyoksydacyjnych może być zahamowana. Aktywność systemu antyoksydacyjnego w odpowiedzi na toksyczne metale (np. Zn) stwierdzono m.in. u Pistia stratiotes, Arabidopsis thaliana, Brassica juncea, Cajanus cajan [59, 74, 77-79]. Wykształcenie mechanizmów tolerancji wiąże się bezpośrednio z uruchamianiem wewnątrzkomórkowych mechanizmów detoksyfikacji. Biologiczny koszt 27

28 wytworzenia takiej odporności jest duży, przejawia się słabszym tempem wzrostu i niższą produkcją biomasy u roślin z podwyższoną tolerancją na metale. W wyniku przekroczenia określonego stężenia lub czasu ekspozycji, mechanizmy obronne mogą zostać zahamowane i wówczas dochodzi do anormalności struktur komórkowych a nawet do śmierci komórki [37],[69] Kompartmentacja w wakuoli Kompartmentację - czyli gromadzenie metali ciężkich w miejscach, gdzie nie stanowią zagrożenia dla komórek roślinnych, np.: w ścianach komórkowych i przestworach międzykomórkowych oraz w wakuolach [80]. Podwyższona tolerancja na obecność metalu może być efektem utrudnienia jego kontaktu z metabolicznie aktywnymi substancjami obecnymi w komórce. Najczęściej strategia ta jest realizowana przez kompartmentację w wakuoli. Brookes zaobserwował, że w przypadku badanych przez niego roślin, rośliny populacji wykazującej podwyższoną tolerancję na cynk transportowały i odkładały w wakuolach dużo większe ilości cynku, niż rośliny populacji wrażliwej [80]. Brune, badając liście jęczmienia, zauważył że narażenie rośliny na duże stężenia cynku powodowało początkowo wzrost stężenia cynku w cytoplazmie, następnie efektywny transport tego metalu do wakuoli i przywrócenie homeostazy cytoplazmy [81]. Prace Wanga, oparte na komputerowym modelowaniu wpływu Zn na N. tabacum potwierdziły, że to właśnie wakuola jest najbardziej prawdopodobnym miejscem w komórce, do którego trafiają metale, gdzie są unieszkodliwiane [82]. Tylko nieliczne prace [83] podważają rolę wakuoli w tolerancję rośliny na metale, natomiast w przypadku cynku i kadmu rola ta wydaje się niepodważalna [84] Kompleksowanie przez metalotioneiny Metalotioneiny to grupa niskocząsteczkowych białek bogatych w cysteinę [85, 86]. Prawdopodobnie ich rola w komórce obejmuje regulowanie poziomu niezbędnych pierwiastków i unieszkodliwianie tych, które wykazują toksyczność [87]. Metalotioneiny zostały początkowo wykryte u zwierząt, a następnie poszukiwano ich u roślin [86]. 28

29 Na podstawie badań wykazano, że rola metalotionein u roślin jest znacznie mniejsza, niż u organizmów zwierzęcych [86-87]. Brak jest jednoznacznego potwierdzenia ich wkładu w procesy zapewniające tolerancje na metale u roślin [60] Kompleksowanie przez fitochelatyny Fitochelatyny to bogate w cysteinę peptydy wytwarzane przez rośliny [60, 88]. Uważa się, że synteza tych związków jest jednym z podstawowych elementów odpowiedzi rośliny w warunkach skażenia metalami [71]. Związki te składają się z charakterystycznego, powtarzającego się od 2 do 11 krotne dipeptydu Glu Cys, są powszechnie spotykane w komórkach roślinnych. Spośród nich najbardziej rozpowszechnione są fitochelatyny należące do grupy o strukturze ( Glu Cys ) n będące pochodnymi glutationu. Uważa się, że to właśnie te fitochelatyny odgrywają najważniejszą rolę w procesach detoksyfikacyjnych. Synteza fitochelatyn odbywa się na drodze enzymatycznej przy udziale enzymu Glu Cys dipeptydyltranspeptydazy (syntazy fitochelatynowej), która jest aktywowana przez jony: Cd (II), Ag (I), Bi (III), Pb (II), Zn (II), Cu (II), Hg(I) oraz Au (I) [89]. Rola fitochelatyn w detoksyfikacji polega na wiązaniu metali w kompleksy, dzięki czemu grupy tiolowe (SH) oraz histydylowe białek komórkowych są chronione przed bezpośrednim oddziaływaniem z jonami metali. Kompleksy PCS-metal są następnie transportowane do wakuoli, gdzie metal ulega oddzieleniu od pozostałych organelli komórkowych, a w konsekwencji jest unieszkodliwiany. Mechanizm ten jest istotny w procesach detoksyfikacji miedzi i kadmu. Kompleksy tworzone przez fitochelatyny z cynkiem i ołowiem nie są stabilne [90]. Wprawdzie wykazano, że niedobór fitochelatyn u roślin jest skorelowany z ich hiperwrażliwością na obecność kadmu, miedzi i arsenu [91], to jednak zdolność rośliny do syntezy fitochelatyn oraz ich zwiększona zawartość nie determinują poziomu tolerancji na metale [92]. Pośrednie dowody na wpływ fitochelatyn na tolerancję roślin na metale pochodzą z badań z wykorzystaniem sulfoksyiminy butioniny (BSO), inhibitorem syntezy fitochelatyn [93]. Dodatek BSO do pożywki skutkował znacznym wzrostem wrażliwości brzozy (Betula pendula R.) na obecność kadmu [94] oraz N. tabacum na obecność miedzi i cynku [95]. Wyniki te mogą świadczyć o roli fitochelatyn w mechanizmie tolerancji roślin. 29

30 Uważa się, że na poziom tolerancji rośliny na dany metal, w odniesieniu do fitochelatyn, ma wpływ zdolność do tworzenia kompleksów przez istniejący system fitochelatyn z danym metalem, zdolność do syntezy różnych rodzajów fitochelatyn o różnej długości łańcucha (gatunki wrażliwe syntetyzują mało fitochelatyn i o małej różnorodności w budowie łańcucha), wydłużanie łańcucha fitochelatynowego, oraz szybkość transportu kompleksów PCS metal do wakuoli [96] Kompleksowanie jonów metali przez kwasy organiczne i aminokwasy Kwasy organiczne odgrywają ważną rolę w syntezie ATP z węglowodanów, w metabolizmie azotu i równowadze jonowej. Z tego względu zaburzenia w ich poziomie natychmiast odbijają się na tych procesach [97]. Z jednej strony, podwyższone stężenie kwasów organicznych może wspomagać wytworzenie mechanizmów tolerancji na metal, z drugiej strony, w odpowiedzi na stres wywołany dużą ilością jonów metali dochodzi do zaburzenia metabolizmu polegającego na nadmiernym wytwarzaniu kwasów organicznych, [84]. Ze względu na swoją budowę, kwasy organiczne: cytrynowy, jabłkowy, szczawiowy mogą być potencjalnymi ligandami jonów metali. Przypuszcza się, że kwasy te uczestniczą w transporcie metali do wakuoli oraz w transporcie ksylemowym (zabezpieczają metal przed adsorbcją na ścianach komórkowych). Kwas cytrynowy prawdopodobnie ma udział w mechanizmie tolerancji rośliny na obecność kadmu, niklu i cynku, natomiast kwas jabłkowy ma wpływ na tolerancję roślin na obecność cynku [90]. W badaniach Brookesa, nad populacjami roślin D. caespitosa wykazującymi zwiększoną tolerancję na cynk zauważono, że wytwarzanie kwasu jabłkowego było zwiększone proporcjonalnie do wzrostu stężenia cynku w pożywce [98]. Komórki rośliny Nicotina plumbaginifolia (odmiana tytoniu), odpornej na wysokie stężenia cynku i miedzi, wytwarzały od 3 do 12 razy więcej kwasu cytrynowego i mlekowego, niż komórki populacji niewykazującej podwyższonej tolerancji [99]. Harrington prowadził badania, w których Festuca rubra (Kostrzewa czerwona gatunek niskiej trawy) była hodowana w obecności dużych zawartości cynku i kadmu. W obecności cynku wytwarzanie jabłczanów przez populacje odporną na wysokie stężenia cynku wzrosło, natomiast w przypadku populacji wrażliwej właściwie nie uległo zmianie. W przypadku narażenia na kadm wytwarzanie 30

31 jabłczanów spadło w obu przypadkach, co może świadczyć o odmiennych mechanizmach tolerancji na te pierwiastki [100]. Warto dodać, że wyniki cytowanej już wcześniej pracy Wanga, w której wykorzystano komputerowe modelowanie wpływu Zn i Cd na N. tabacum wskazują, że cytryniany i szczawiany są głównymi ligandami kompleksującymi jony cynku w komórce, natomiast kwasy organiczne mają znikomą rolę w detoksyfikacji komórki z kadmu [101, 102]. Wspomnieć należy, że również aminokwasy pełnić rolę ligandów dla jonów metali. Ich rola w procesach związanych z tolerancją roślin na metale polega na ich chelatowaniu na obszarze cytozolu. Głównymi ligandami dla miedzi są asparaginian i histydyna, natomiast dla niklu histydyna, glutaminian i prolina [90]. Innymi ligandami kompleksującym jony cynku w komórce roślinnej mogą być fityniany. Znacznie większe ilości cynku w połączeniu z fitynianami znajdowano w przypadku populacji tolerancyjnych na duże ilości tego metalu takich gatunków jak: D.caespitosa, G. max, L.sativa, czy Z. mays [103]. Ten sam autor nie potwierdził natomiast wpływu kadmu na powstawanie fitynianów w komórkach wyżej wymienionych gatunków Mechanizm wykluczenia z pędów i gromadzenia w pędach Innym mechanizmem tolerancji jest wykluczanie lub gromadzenie metali w pędach. Tak zwane wykluczanie z pędów (ang. shoot exclusion) polega na pobieraniu i kumulowaniu metali w korzeniach oraz na utrzymaniu stałej, niskiej zawartości metali w pędach, co może być skuteczne aż do pewnej krytycznej dawki metali w glebie. Strategię tę stwierdzono w odpornych na metale (Zn, Ni, Cd, Pb, Tl) populacjach Silene maritima, S. cucubalus, S. vulgaris, Hordeum murinum, Achillea nobilis, Erysimum crepidifolium, Solanum tuberosum, Brassica oleracea, Armeria maritima, Plantago lanceolata, Thlaspi praecox, Medicago lupulina [41, 53, ].Rośliny mogą również gromadzić metale w pędach w ilościach wyższych niż zawartość w korzeniach. Jest to możliwe, gdyż wykształciły one szereg mechanizmów detoksyfikacyjnych pozwalających na pobieranie dużych ilości metali i równocześnie na utrzymanie niskiej ich zawartości w cytoplazmie, w obszarach aktywnych metabolicznie. Taką strategię przystosowania do wysokich zawartości metali w podłożu (Cu, Zn, Fe, Tl, Pb) wykształciły rośliny uprawne, np. marchew, brukiew, buraki 31

32 pastewne i cukrowe, oraz Silene armeria, Dianthus carthusianorum, Biscutella laevigata [53,106] Rośliny hiperakumulujące Rośliny gromadzące metale w pędach w ilościach ponadprogowych określane są mianem hiperakumulatorów. Stężenia progowe (wyrażone jako zawartość pierwiastka w suchej masie próbki) metali w liściach, po przekroczeniu których roślina uważana jest za hiperakumulatora są różne dla poszczególnych pierwiastków. Przykładowo, dla rtęci stężenie progowe wynosi 0,01 mg/g, dla kadmu wynosi 0,1 mg/g, dla ołowiu, kobaltu, miedzi, arsenu, selenu i niklu wynosi 1 mg/g, natomiast dla manganu i cynku 10 mg/g; wszystkie wartości odnoszą się do suchej masy. Innym sposobem oceny efektywności hiperakumulacji jest stosunek zawartości metali w pędach do zawartości w korzeniach oraz stosunek zawartości metalu w pędach do jego zawartości w glebie. W przypadku gdy obie wartości są większe od 1, mamy do czynienia z hiperakumulacją. Znanych jest blisko 400 gatunków hiperakumulatorów, z czego 75% stanowią gatunki akumulujące nikiel [41]. W populacjach roślin hiperakumulujących, mechanizmy związane z absorpcją jonów z gleby, transportem z korzeni do części nadziemnych, w końcu z detoksyfikacją są bardziej efektywne niż te same procesy w populacjach niebędących hiperakumulatorami. Populacje T. Caerulescens hiperakumulujące Zn i Cd wydzielały do ryzosfery związki obniżające ph środowiska oraz związki zwiększające biodostępność jonów i wzrost ich pobierania przez korzenie. W populacjach T. careulescens i C. halleri stwierdzono większą liczbę transporterów (ZNT1, ZIP1-4, IRT1, LCT1, z rodziny AtNramp) na jednostkę powierzchni błony komórkowej korzeni oraz pędów. Zwiększona liczba transporterów związana była z wyższą ekspresją genów kodujących powyższe nośniki jonów, co powodowało szybsze pobierania jonów Zn, Cd, Fe i innych metali oraz ich transportu do pędów i ich sekwestracji w wakuolach [41]. Typową cechą hiperakumulatorów jest niska produkcja biomasy, co tłumaczy się dużym zużyciem energii na procesy związane z sekwestracją i detoksyfikacją pędów z metali. Koszty wytworzenia tolerancji związane z zużywaniem dużej ilości energii na detoksyfikację rośliny z wolnych jonów metali objawiają się wolniejszym wzrostem roślin i ich mniejszą biomasą, karłowatością, rozbudowaną strefą korzeniową, ograniczonym 32

33 wzrostem pędów oraz mniejszymi kwiatami u ekotypów tolerancyjnych w porównaniu z wrażliwymi [41, 107]. W literaturze [108] opisano również przypadki, gdzie zmiany w populacjach hałdowych wielu roślin nie były związane bezpośrednio z mechanizmami tolerancji na metale, a innymi kluczowymi aspektami wzrostu na hałdzie, na przykład ze wzrostem w warunkach suszy (niedoboru wody). Wierzbicka zauważyła, że populacje hałdowe Silene vulgaris, Dianthus carthusianorum i Biscutella laevigata przystosowały się do warunków suszy oraz braku związków pokarmowych w podłożu. Natomiast kwestia ewentualnych mechanizmów tolerancji tych roślin na metale ciężkie uznała za odrębne zagadnienie [108]. Cechy morfologiczne hałdowych populacji roślin, różniące je od populacji naturalnych tych gatunków wynikały, w przypadku trzech wymienionych wyżej gatunków, z przystosowań do deficytu wody. Cechy te były utrwalone genetycznie i występowały na tym samym poziomie istotności statystycznej w trzech kolejnych pokoleniach roślin, mimo ich hodowli w glebie niezanieczyszczonej, w optymalnych warunkach, na podłożu pozbawionym metali ciężkich i przy dostatku wilgoci. Ponadto u gatunków Silene vulgarisi Dianthus carthusianorum stwierdzono strategię życiową polegającą na tym, że zmniejszenie biomasy roślin było rekompensowane przez zwiększenie płodności roślin. Tak więc, wśród populacji hałdowych badanych gatunków roślin, na drodze procesów mikroewolucyjnych, dochodzi do wykształcenia odrębnych, galmanowych form tych roślin [108]. Roślinność galmanowa zbiorowiska roślinne porastające gleby charakteryzujące się wysoką zawartością związków cynku i ołowiu. W Polsce spotykane są w okolicy Olkusza i Bolesławia na starych hałdach rud metali ciężkich (głównie cynku). Na hałdzie w Bolesławiu roślinność galmanowa reprezentowana jest przez m.in. następujące gatunki metalofitów: zawciąg nadmowrski Armeria maritima, rzeżusznik piaskowy Arabidopsis arenosa, goździk kartuzek Dianthus carthusianorum, lepnica rozdęta Silene vulgaris. Obok nich na hałdzie można znaleźć babką lancetowatą Plantago lanceolata. 33

34 4 Metody instrumentalne stosowane w badaniu specjacji metali w próbkach roślinnych 4.1 Wstęp Problematyka związana z badaniem form występowania pierwiastków w poszczególnych częściach roślin jest niezmiernie ważną dziedziną nowoczesnej analityki specjacyjnej. Badania takie dostarczają niezwykle cennych informacji dotyczących metabolizmu metali w roślinach; ogólnego wpływu tych pierwiastków na rośliny, sposobu ich pobierania i transportu, jak również umożliwiają ocenę wykształconych przez różne populacje, czy gatunki roślin mechanizmów tolerancji na metale. Ponadto wyniki analizy specjacyjnej metalu w tkance rośliny umożliwiają ocenę przydatności danej rośliny jako fitoremedianta, czy też produktu umożliwiającego wzbogacanie diety zwierząt i ludzi w niezbędne mikroelementy (żywność funkcjonalna). Potrzeba badań specjacyjnych wynika głównie z tego, że różne formy danego pierwiastka w różniy sposób wpływają na organizmy [109]. Co więcej, tylko odpowiednie dawki (stężenia) poszczególnych form pierwiastków zapewniają odpowiedni rozwój organizmów. Jasne wydaje się zatem, że określenie całkowitej zawartości danego pierwiastka nie jest informacją wystarczającą i często może prowadzić do błędnych wniosków. Na przykład mięso ryb północnoatlantyckich jest bogate w nietoksyczne dla ludzkiego organizmu organiczne formy arsenu. Opierając się tylko na wynikach określenia całkowitej zawartości arsenu w mięsie nie można rozstrzygnąć, czy jest ono bogate w wyżej wspomniane związki organiczne i może być spożywane, czy też zawiera bardzo szkodliwe formy nieorganiczne i nie powinno być dopuszczone do spożycia. Wybór odpowiednich technik rozdzielenia i identyfikacji związków obecnych w badanym obiekcie jest równie istotny, jak opisany w rozdziale 2.2 proces przygotowania próbki. Obecnie chemicy analitycy dysponują szerokim wachlarzem czułych i selektywnych metod badania specjacji, co powoduje że dużą sztuką jest wybranie odpowiedniego zestawu 34

35 technik do założonego celu analizy. Poniżej opisano wybrane techniki używane w badaniach specjacji. 4.2 Ekstrakcja związków cynku Ekstrakcja to uniwersalna metoda rozdzielania składników mieszanin poprzez wymywanie rozpuszczalnikiem wybranych składników próbki stałej lub ciekłej. W niniejszej pracy wykorzystano ekstrakcję w układzie ciecz-ciało stałe. Do wymycia związków cynku ze świeżego materiału roślinnego użyto różnego rodzaju rozpuszczalników: od wody, poprzez wodne roztwory buforowe, mieszaniny wodno-organiczne, na rozpuszczalnikach organicznych kończąc (metanol). Optymalizując proces ekstrakcji konieczne jest używanie różnorodnych ekstrahentów i porównywanie otrzymanych ekstraktów pod kątem całkowitej zawartości cynku, jak i różnorodności jego form specjacyjnych. Różne rozpuszczalniki wymywają poszczególne grupy związków z różną efektywnością, która zależy od cech fizykochemicznych rozpuszczalnika. Do najważniejszych z cech należy zaliczyć polarność i ph. Zgodnie z regułą mówiącą, że podobne związki mają do siebie powinowactwo, niepolarne rozpuszczalniki organiczne są stosowane do wymywania niepolarnych związków, natomiast wodne roztwory buforowe z większą efektywnością wymywają związki jonowe [110]. Woda jest traktowana jako neutralny i jednocześnie uniwersalny rozpuszczalnik, ponieważ stanowi ona podstawowe środowisko wewnętrzne dużej grupy organizmów roślinnych [111], a więc większość ekstrahowanych związków biologicznie czynnych powinno być dobrze rozpuszczalnych w wodzie. W niniejszej pracy zastosowano dodatkowo ekstrahenty (wodne roztwory buforowe) imitujące pod względem ph środowisko wakuoli i cytozolu. Zakładano, że dzięki temu uda się efektywniej ekstrahować związków cynku obecne w tych przedziałach komórkowych. W literaturze często wymieniane są również roztwory enzymów, NaOH oraz HCl jako ekstrahenty wykorzystywane w analizie specjacyjnej. Zastosowanie enzymów z reguły ma na celu poprawienie dostępu ekstrahenta do wymywanych związków, na przykład poprzez rozkład błon komórkowych (proteazy), jak również ma spowodować hydrolizę enzymatyczną białek. Wodorotlenek sodu stosowany jest, jako ekstrahent związków wielkocząsteczkowych (powyżej j.m.a.) [ ]. Do ekstrakcji wykorzystywany jest również kwas solny, który powinien wymywać niskocząsteczkowe, polarne związki, oraz 35

36 powodować hydrolizę kwasową białek. W efekcie (podobnie jak w przypadku hydrolizy enzymatycznej) dochodzi do wymywania aminokwasów wchodzących w skład białek [ ]. 4.3 Metody rozdzielania związków chemicznych stosowane w analizie specjacyjnej Wybór odpowiedniej techniki rozdzielenia związany jest z właściwościami fizykochemicznymi związków chemicznych występujących w badanym obiekcie. Najbardziej uniwersalna pod tym względem wydaje się być chromatografia cieczowa i to właśnie ta technika jest bezsprzecznie najczęściej stosowaną metodą rozdzielania związków metali w analizie specjacyjnej. Wśród odmian chromatografii cieczowej bardzo powszechnie stosowana jest chromatografia wykluczania. Połączenie chromatografii wykluczania z atomową spektrometrią mas jest powszechnie stosowanym sposobem, pozwalającym rozstrzygnąć czy metal w ekstrakcie z rośliny występuje w postaci związanej, czy w postaci absorbującej się na złożu kolumny (wolne jony metalu, proste połączenia organiczne) [ ]. Ze względu na ograniczoną rozdzielczość i wpływ wymiany jonowej na rozdzielenie metoda ta nie pozwala na określenie, z jakimi ligandami związany jest dany metal. Duże trudności związane są również z określeniem mas cząsteczkowych rozdzielanych indywiduów [114, 116]. Z powyższych powodów chromatografia wykluczania często stosowana jest, jako pierwszy krok w badaniach specjacji, pozwalający na wyodrębnienie frakcji wysoko i niskocząsteczkowych, oszacowanie ich mas cząsteczkowych, a także w razie potrzeby oczyszczenie próbki przed dalszymi badaniami [114]. Często, jako kolejny krok do rozdzielenia form specjacyjnych badanego pierwiastka wykorzystywana jest chromatografia jonowymienna [117], czy chromatografia oddziaływań hydrofilowych (HILIC) [118]. Często uzyskane w ten sposób rozdzielenie chromatograficzne umożliwia już identyfikację form specjacyjnych na podstawie porównania ich czasów retencji z wzorcami, lub zastosowanie specyficznych cząsteczkowo technik spektrometrii mas [118]. Możliwa jest również sytuacja, że mnogość i fizykochemiczne podobieństwo form specjacyjnych uniemożliwia ich rozdzielenie i indywidualną identyfikację [119]. Wspomnieć należy również o zastosowaniu chromatografii par jonowych. Wyjątkową cechą, którą zmieniając można manipulować rozdzielczością jest dobór odpowiedniego przeciwjonu. 36

37 Stwierdzono, że jest to szybka technika pozwalająca na rozdzielenie zarówno kationowych, jak i anionowych form specjacyjnych arsenu [120] i selenu [121]. Chromatografia gazowa (GC) jest często stosowana ze względu na wysoką sprawności i lepszą powtarzalność w porównaniu z chromatografią cieczową. Ograniczeniem tej techniki jest możliwość rozdzielania jedynie lotnych związków, co często wiąże się z koniecznością przekształcania obecnych w próbce indywiduów w ich lotne pochodne. Chromatografia gazowa jest bardzo dobrym narzędziem między innymi w analizie alkilowych form rtęci, cyny, czy ołowiu w analizie żywności, a także wody [ ]. W przypadku związków wielkocząsteczkowych (które często pełnią kluczową rolę w transporcie i metabolizmie metali w roślinach) popularne jest zastosowanie technik elektroforezy żelowej lub kapilarnej. W trakcie izolowania białek z tkanki otrzymuje się złożoną mieszaninę białek różniących się szeregiem cech fizykochemicznych. W elektroforezie żelowej mieszanina białek nanoszona jest na żel, gdzie poszczególne białka są rozdzielane ze względu na swój rozmiar, a następnie ładunek. Ostatecznie otrzymuje się dwuwymiarowy obraz, na którym każda z plamek odpowiada określonemu białku [10]. Do identyfikacji rozdzielonych w ten sposób białek najczęściej stosuje się metody cząsteczkowej spektrometrii mas z jonizacją przez elektrorozpylenie (ESI), desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), bombardowanie szybkimi atomami lub jonami [ ]. Ważnym elementem analizy specjacyjnej układów białkowych jest możliwość poznania połączeń pierwiastków aktywnych biologicznie z odpowiednimi białkami (m. in. Fe, Se, Pt, Co, Ni). W przypadku elektroforezy żelowej do określenia czy dane białko jest związane z badanym metalem możliwe jest zastosowanie mikropróbkowania laserowego. Pobrana przez odparowanie laserowe niewielka ilość żelu przenoszona jest następnie do plazmy spektrometru mas. Po jonizacji atomów wchodzących w skład białka, powstałe jony wprowadzana do analizatora mas [124, 126]. Kolejna technika separacyjna, elektroforeza kapilarna (ang. Capillary Electrophoresis, CE), jest szeroko stosowana w analizie specjacyjnej. Jako zalety tej techniki wymienić należy: małe zużycie próbki, krótki czas oraz wysoka efektywność rozdzielania i niskie koszty analizy. Zwrócić uwagę należy również na brak wypełnienia kapilary używanej w tej technice. Ogranicza to możliwość reakcji, lub silnego oddziaływania wypełnienia z metalami, co z kolei ma duży wpływ na równowagi reakcji kompleksowania [ ]. Jest to metoda uważana za alternatywną dla HPLC i często wyniki uzyskiwane przy zastosowaniu obu metod mogą stanowić wzajemne 37

38 uzupełnienie [130]. W ostatnich latach wzrosło zainteresowanie wykorzystania CE w analizie specjacyjnej [131]. 4.4 Techniki łączone stosowane w analizie specjacyjnej Techniki łączone są obecnie najszerzej stosowanymi narzędziami w badaniach specjacji. Z reguły zestaw łączony składa się z układu pozwalającego na rozdzielenie poszczególnych form badanego pierwiastka i układu pozwalającego na ich detekcję. Ważną grupę detektorów używanych w układach łączonych stanowią spektrometry cząsteczkowe. Mimo tego, że chemicy analitycy dysponują obecnie bardzo czułymi technikami cząsteczkowej spektrometrii mas, umożliwiającymi ustalenie struktury związków chemicznych, etap rozdzielenia pozostaje krokiem niezbędnym. Fakt ten związany jest ze sposobem prowadzenia analiz przy użyciu metod spektrometrii cząsteczkowej, w których porównuje się otrzymane widmo, z widmem wzorca. Otrzymanie widma, które może być podstawą wiarygodnych wyników wymaga wprowadzania kolejnych związków do analizatora mas pojedynczo. Rysunek 5 Wybrane techniki rozdzielenia i detekcji stosowane w badaniach specjacji 38

39 Drugą grupę układów detekcyjnych stosowanych w technikach łączonych stanowią detektory pierwiastkowe. Detektory te są czułe jedynie na badany pierwiastek, bez względu na formę jego występowania. W tym przypadku identyfikacja związków pierwiastka możliwa jest jedynie na podstawie porównania czasów retencji odpowiednich form badanego pierwiastka z dostępnymi wzorcami, a więc również w tym przypadku etap rozdzielenia pozostaje niezbędny. Należy zwrócić uwagę, że to czas retencji jest w tym przypadku parametrem charakterystycznym, a detektor dostarcza jedynie odpowiedzi na pytanie czy w cząsteczce wymywanego związku znajduje się interesujący nas pierwiastek. W ciągu ostatnich lat można zaobserwować znaczny wzrost zainteresowania technikami łączonymi. Połączenie metod rozdzielania ze spektrometrycznymi technikami identyfikacji pozwala na jakościowe, a w niektórych przypadkach również ilościowe analizy nieznanych materiałów o złożonym składzie [122, 132] HPLC ICP MS Połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej jest techniką bardzo powszechnie stosowaną w badaniach specjacji. Połączenie tych technik nie wymaga żadnego dodatkowego oprzyrządowania, gdyż typowe przepływy stosowane w HPLC są zgodne z wymaganiami odnośnie wprowadzania próbki do plazmy w układzie ICP MS. Dzięki temu wyciek z kolumny chromatograficznej może być kierowany jest bezpośrednio do rozpylacza palnika plazmowego. Układ HPLC ICP MS pozwala na monitorowanie zmian ilości analizowanego pierwiastka w eluacie. W badaniach specjacji wykorzystuje się porównanie czasów retencji poszczególnych form specjacyjnych z czasami retencji odpowiednich wzorców. Zastosowanie metody rozdzielenia chromatograficznego jest w tym przypadku niezbędne, ponieważ detektor MS nie umożliwia rozróżniania form pierwiastków. Jest to detektor elementarny, a wiec czuły na jony poszczególnych atomów (właściwie izotopów), a nie ich związki. W plazmie indukcyjnej zachodzi atomizacja i jonizacja składników próbki, a źródłem sygnału są jony atomów zakłada się, że procesy zachodzące w plazmie niwelują różnorodność specjacyjną. Największa zaletą układu pomiarowego HPLC ICP MS jest jego bardzo wysoka czułość, niedostepna w przypadku detektorów UV Vis, czy spektrometrów cząsteczkowych 39

40 [133]. Poza tym atrakcyjny pozostaje fakt, że detektor elementarny pozostaje czuły tylko na cząsteczki zawierające interesujący nas pierwiastek, gdy wspomniane detektory są czułe na wiele innych związków, niezależnie czy zawierają one badany pierwiastek. Wielu autorów twierdzi, że zastosowanie elucji gradientowej w HPLC ICP MS bywa problematyczne, ze względu na zmianę składu eluentu w czasie [133]. Fakt ten może mieć wpływ na zmianę czułości w trakcie trwania analizy oraz znaczący dryft linii bazowej rozwijanego chromatogramu. Poza tym fazy ruchome o zawartości soli powyżej 2% powodują ich osadzanie na powierzchniach łącznika między plazmą a analizatorem mas, co również wpływa na zmianę czułości [134]. Konieczne jest również zapewnienie bardzo wysokiej czystości chemicznej składników eluenta. Problematyczne okazuje się zastosowanie rozpuszczalników organicznych, jako składników faz ruchomych. Przykładowo, już niewielka zawartość acetonitrylu czy metanolu może powodować zmianę efektywności rozpylania eluatu, powstawanie cienkiej warstwy rozpuszczalnika organicznego na ściankach rozpylacza i komory mgielnej (co zmienia efektywność jonizacji niektórych pierwiastków), jak również osadzanie się węgla na powierzchni stożka próbkującego [133]. Inni autorzy [ ] przekonują, że obecność rozpuszczalników organicznych zmienia mechanizmy jonizacji wielu pierwiastków w plazmie. Opisane wyżej zjawiska powodują, że ilościowe oznaczenia techniką HPLC ICP MS wymagają szczegółowej kontroli warunków pomiarowych. Mimo przedstawionych ograniczeń, HPLC ICP MS jest metodą chętnie stosowaną w badaniach specjacji metali w roślinach. W licznych publikacjach opisano jej wykorzystanie w badaniach wpływu metali (Cd, As) na syntezę fitochelatyn i innych tioli [ ]. Liczne publikacje opisują zastosowanie HPLC ICP MS w badaniu specjacji arsenu i selenu, gdzie wykorzystuje się chromatografię jonowymienną [140]. Układy HPLC ICP MS stosowane są również w badanich specjacji platyny w roślinach [141]. W wielu zastosowaniach rozdzielenie chromatograficzne prowadzone jest z zastosowaniem chromatografii wykluczania i chromatografii jonowymiennej. W badanich specjacji cynku w roślinach stosowano z powodzeniem technikę HPLC ICP MS. Caruso i współ. [112] przeprowadzili frakcjonowanie związków cynku występujących w jadalnych orzechach, stosując do tego celu połączenie chromatografii wykluczania z detektorem ICP MS. Potwierdzono występowanie trzech frakcji o masach cząsteczkowych około 12,5 kda, w zakresie 3,5 kda 3,9 kda i frakcji o masie cząsteczkowej 1,3 kda. Autorzy 40

41 podkreślili wpływ ph ekstrahenta na profil poszczególnych frakcje i wykazali, że jedynie ekstrahent o odczynie zasadowym pozwalał na obserwację frakcji o masach około 3,5 kda i 12,5 kda. W warunkach kwasowych możliwa była identyfikacja jedynie frakcji o masie 1,3 kda. Co prawda autorzy nie przeprowadzili dalszego rozdzielenia i identyfikacji składników poszczególnych frakcji, jednak otrzymane wyniki pozwalają potwierdzić, w przeciwieństwie do publikacji wielu innych autorów, że formy występowania cynku w roślinach nie ograniczają się tylko do małych cząsteczek (tj. cytyniany, jabłaczany, szczawiany, kompleksy z nikotynoaminą i formy nieorganiczne) [142] GC MS i techniki kapilarne Chromatografia gazowa jest najczęściej łączona z różnymi atomowymi układami detekcyjnymi. W tego typu połączeniach rolę detektora często pełnią optyczne spektrometry emisyjne (ICP OES) [143], a także spektrometry mas ICP MS [122]. Możliwe jest też łączenie chromatografu gazowego ze spektrometrami absorpcji atomowej (AAS), fluorescencji atomowej (AFS) [144], a także spektrometrami emisyjnymi ze wzbudzeniem w plazmie mikrofalowej (MP OES) [145]. Wspólną cechą tych układów jest uniknięcie etapu rozpylania próbki, gdyż jest ona w fazie gazowej i może być transportowana bezpośrednio do źródła atomów, bądź jonów. W związku z tym efektywność transportu składników próbki do detektora jest znacznie większa, co korzystnie wpływa na czułość pomiarów. Kolejną grupę technik łączonych stanowią te, w których w procesie rozdzielenia wykorzystuje się techniki kapilarne. W porównaniu do technik klasycznych, charakteryzują się one z reguły większą efektywnością i krótszym czasem rozdzielania i mniejszym zużyciem próbki. Do tej grupy należy zaliczyć przede wszystkim kapilarną chromatografię cieczową (CLC), elektroforezę kapilarna (CE) oraz elektrochromatografię kapilarną (CEC) [122]. Za względu na konieczność zapewnienia stałego natężenia prądu oraz różnicę w rzeczywistej szybkości przepływu eluentu w kapilarze względem tej wymaganej do zasilenia plazmy, takie połączenie stosowane jest niezmiernie rzadko, a układy takie nie są dostępne komercyjnie [122]. Popularne jest natomiast łączenie technik kapilarnych z cząsteczkowymi spektrometrami mas, szczególnie z jonizacją typu ESI. Połączenie takie umożliwia określenie struktury związków rozdzielonych za pomocą elektroforezy kapilarnej [146], czy elektrochromatografii [147]. Zauważyć należy, że w przypadku tej drugiej techniki 41

42 konieczne jest doprowadzenie uzupełniającej cieczy zwiększającej przepływ eluentu z nl/min do µl/min, co w konsekwencji pogarsza granice oznaczalności za względu na konieczność rozcieńczenia eluat [148] LC MS Cząsteczkowa spektrometria mas jest techniką, której początków należy szukać jeszcze w XIX wieku. Mimo tego, dopiero wprowadzenie odpowiednich źródeł jonizacji w latach 80 XX wieku umożliwiło efektywne połączenie spektrometru mas z chromatografem cieczowym. Wysoka czułość detektorów MS oraz ich specyficzność spowodowały lawinowy rozwój i wzrost zainteresowania technikami HPLC MS. Należy jednak pamiętać, że analizator mas umożliwia oznaczenie jedynie zjonizowanych cząsteczek (bądź atomów), występujących w fazie gazowej. Funkcją źródła jonów jest przeprowadzenie analitów z roztworu do fazy gazowej oraz ich jonizacja. Obecnie w cząsteczkowej spektrometrii mas połączonej z chromatografią cieczową stosowane są dwa źródła jonów: jonizacja przez elektrorozpylenie - ESI (Electro Spray Ionisation), oraz jonizacja chemiczna pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation). Wprowadzenie źródła typu ESI stał się przełomem w dziedzinie łączenia technik spektrometrii i chromatografii cieczowej, umożliwiając analizę rozdzielonych chromatograficznie białek i peptydów, polisacharydów, a także większości szerokiej grupy cząsteczek o małych masach cząsteczkowych [140]. Zauważyć należy, że nowoczesne źródła ESI umożliwiają efektywną jonizację analitów przy typowych przepływach używanych obecnie w HPLC i UPLC, a więc z reguły niewymagane jest dzielenie strumienia, lub jego pokolumnowe wzbogacanie eluentem, co w obu przypadkach prowadzi do podwyższenia granic wykrywalności oznaczanych indywiduów. Warto podkreślić, że ESI jest zaliczane do miękkich technik jonizacji, to znaczy że jonizowana cząsteczka nie uzyskuje w źródle żadnej dodatkowej energii, która mogłaby powodować jej fragmentację. Dlatego też podstawowym produktem jonizacji cząsteczki jest jon molekularny o m/z odpowiadającemu masie cząsteczkowej (z dokładnością do masy protonu, w zależności od trybu jonizacji). Źródło APCI, podobnie jak ESI, powoduje miękką jonizację. Fragmentacji cząsteczek w źródle zachodzi w również w niewielkim stopniu, jednak nieco większym, niż w przypadku ESI. 42

43 W układach łączonych z chromatografią cieczową stosuje się analizatory mas różniące się rozdzielczością i dokładnością pomiaru. Rozdzielczość analizatora opisuje iloraz M/ΔM, gdzie M odpowiada stosunkowi m/z cząsteczki, a ΔM oznacza różnicę m/z między tym jonem a najbliższym rozdzielonym sygnałem. Czyli jeżeli analizator rozróżnia jon o m/z = 500 od jonu o m/z = 501, to rozdzielczość analizatora wynosi 500. Wynika z tego, że rozdzielczość jest zależna od m/z badanej cząsteczki. Dokładność pomiaru masy jonów jest określona jako odchylenie masy zmierzonej od masy obliczonej teoretycznie i podawana w częściach na milion (ppm). Dokładność pomiaru masy jest związana z rozdzielczością analizatora [149]. Dokładność pomiaru masy cząsteczkowej ma olbrzymie znaczenie w analizie specjacyjnej, szczególnie wtedy, gdy nie dysponujemy wzorcami badanych substancji. Im większa jest dokładność pomiaru masy, tym mniej złożony będzie możliwy skład izotopowy danej cząsteczki, a w konsekwencji mniej możliwych wzorów sumarycznych odpowiadających jej dokładnej masie. Przykładowo, używając analizatora umożliwiającego określenie masy z dokładnością do jednej jednostki masy atomowej niemożliwe jest rozróżnienie jonu CH4 + i NH2 + (masy cząsteczkowe odpowiednio 16,03 j.m.a. i 16,02 j.m.a.) ponieważ oba te jony mają masę 16 j.m.a. Przy użyciu analizatora umożliwiającego określenie masy z dokładnością do setnych części j.m.a. omawiane jony zostaną rozróżnione przez analizator mas. Dzięki temu zmniejszy się liczba potencjalnych struktur zaproponowanych przez oprogramowanie. W literaturze opisano liczne zastosowania technik łączonych HPLC ESI MS w analizie specjacyjnej metali w roślinach. Typowe podejście to stosowaniu chromatografii wykluczania, co umożliwia wyodrębnienie frakcji o określonych masach cząsteczkowych [150, ]. Należy zauważyć, że w przypadku nowoczesnych metod cząsteczkowej spektometrii mas jakość rozdzielenia chromatograficznego ma coraz mniejsze znaczenie. Nie jest wymagana bardzo dobra rozdzielczość pików, ważne jest natomiast, aby do analizatora mas nie było wprowadzane jednocześnie wiele związków chemicznych [151]. Z tego względu użycie tylko chromatografii wykluczania bywa wystarczające do uzyskania odpowiedniej jakości widm mas i identyfikacji związków badanego pierwiastka [142, 153]. W niektórych przypadkach zastosowanie chromatografi wykluczanie okazuje się niewystarczające i konieczne staje się zastosowanie kolejnej techniki chromatograficznej [118, 121]. 43

44 4.5 Elektrochemiczne techniki badania specjacji Jak opisano powyżej, w badaniach specjacji najczęściej stosowane są techniki łączone. Istnieje jednak szereg sytuacji, w których możliwe jest zastosowanie znacznie tańszych i prostszych pod względem instrumentalnym metod woltamperometrycznych. Podstawą tych oznaczeń jest badanie zależności natężenia prądu płynącego przez układ pomiarowy w funkcji napięcia przykładanego do elektrod. Najczęściej stosowaną techniką woltamperometryczną jest technika inwersyjna, ponieważ pozwala ona na osiągnięcie zadowalających czułości na skutek wstępnego zatężania analitu na powierzchni stacjonarnej elektrody pracującej [154]. Następnie rejestrowane są prądy będące skutkiem anodowego utleniania analitu. Dzięki możliwości zatężania analitu na powierzchni elektrody woltamperometria inwersyjna należy do najczulszych metod analitycznych i jest z powodzeniem stosowana w badaniach specjacji. Znane są ciekawe zastosowania woltamperometrii inwersyjnej do badania specjacji arsenu. W literaturze opisano sposoby selektywnego oznaczania nieorganicznych form As(III) i As(V) w roztworach kwasów nieorganicznych z użyciem wiszącej kroplowej elektrody rtęciowej [ ]. W tym przypadku jedynie nieorganiczne formy arsenu (III) były aktywne elektrochemicznie. Po zarejestrowaniu sygnału dla jonow As (III), nieorganiczne związki arsenu (V) zostały zredukowane do As (III), a następnie ponownie rejestrowano synal woltamperometryczny. W celu określenia zawartości organicznych związków arsenu, do roztworu dodano nadtlenku wodoru, co pozwoliło na przeprowadzeniu ich w formy nieorganiczne. W literaturze opisano również sposoby selektywnego oznaczania związków selenu [ ], chromu [ ]. Wspomnieć należy również o tym, że woltamperometria może być z powodzeniem stosowana do oznaczania labilnych form elektroaktywnych pierwiastków w wodach naturalnych. W warunkach pomiaru, przy określonej wartości potencjału, reakcji elektrodowej ulegają tylko wolne, uwodnione jony bądź ich labilne kompleksy [163]. W świetle tego, co dyskutowane było w rozdziale 2, opisane w cytowanej literaturze działania pozwalają na frakcjonowanie związków badanego pierwiastka, a nie poznanie jego szczegółowej specjacji. Jedną z popularnych i bardzo przydatnych metod bezpośredniego oznaczania przynajmniej wybranych form specjacyjnych jest metoda potencjometryczna wykorzystująca elektrody jonoselektywne. Takie pomiary są wykonywane rutynowo na przykład 44

45 w medycynie do określania stężenia wolnych jonów magnezu, czy wapnia we krwi i surowicy krwi, co ma istotne znaczenie w diagnostyce medycznej. Przy użyciu elektrod jonoselektywnych oznacza się jedną formę specjacyjną, a całkowitą zawartość można określić odpowiednią techniką analizy pierwiastkowej [163]. 4.6 Bezpośrednie metody badania specjacji W rozdziale III podkreślano kluczową rolę etapu przygotowania próbki w analizie specjacyjnej. Oczywiste wydaje się, że im prostszy sposób przygotowania próbki tym mniej możliwości zaburzenia oryginalnych równowag chemicznych w badanym obiekcie. W tym kontekście wydaje się, że najbardziej pożądaną byłaby możliwość rezygnacji z procesu przygotowania próbki, tak aby badanie specjacji było prowadzone bezpośrednio w obiekcie, bez potrzeby prowadzenia jakichkolwiek operacji fizycznych, czy chemicznych. Wszystkie metody badania specjacji, na potrzeby których konieczne jest nawet najprostsze przygotowanie próbki, są obarczone są niepewnością, odnośnie tego, na ile przygotowanie próbki zmieniło oryginalną specjację. Nadrzędnym celem analizy specjacyjnej jest uzyskanie wyników umożliwiających opis oryginalnego stanu badanego obiektu, a więc oryginalnej specjacji. Nietrwałość wielu związków i unikalność równowag ustalających się w badanych obiektach powodują konieczność poszukiwania takich procedur pomiarowych, które nie naruszają obrazu pierwotnej specjacji. Do bezpośrednich metod badania specjacji możemy zaliczyć niektóre metody elektrochemiczne, gdzie zastosowanie elektrody czułej na określoną substancję pozwala na jej oznaczenie bezpośrednio w roztworze [ ]. W wielu przypadkach nie jest konieczne przygotowywanie próbki, a tylko zanurzenie elektrody w badanym roztworze (dotyczy to próbek w stanie ciekłym). Inny sposób postępowania ma miejsce przypadku analizy specjacyjnej próbek stałych. W tym przypadku możliwe do uzyskania są informacje dotyczące rozmieszczenia oznaczanych składników. Takie informacje mogą okazać się cenne w badaniu rozmieszczenia metali w roślinach [166], ponieważ dostarczają istotnych danych dotyczących transportu i ścieżek metabolizmu pierwiastka w roślinie. Do bezpośredniego badania obiektów stałych stosowane są metody typowe dla badań ciał stałych: spektroskopia fotoelektronowa (ESCA, XPS), fluorescencja 45

46 rentgenowska (XRF), spektroskopia mas jonów wtórnych (SIMS), spektrometria mas z laserowym odparowaniem (LA ICP MS), oraz dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego (XRD). Wymienione metody pozwalają na badanie powierzchniowego rozmieszczenia pierwiastków, bądź ich rozmieszczenia w warstwach podpowierzchniowych. Należy podkreślić, że są to metody pierwiastkowe, pozwalające na określenie składu pierwiastkowego próbki, nie umożliwiają one jednak określenia form ich występowania. Do metod umożliwiających poznanie form specjacyjnych poprzez poznanie stopnia utleniania, oraz chemicznego otoczenia jądra danego pierwiastka należą spektroskopia Mössbauera [167] oraz spektrometria rentgenowska w obszarze bliskim progu absorpcji (XANES) [168]. Bulska i współ. [169] opisali użycie metod µ-xanes i µ-xrf do bezpośredniego badania form specjacyjnych w selenu w tkankach cebuli. W celu poznania metabolizmu selenu cebule były hodowane na pożywce zawierającej seleniany (IV) lub seleniany (VI). Wszystkie pomiary wykonano in vivo bez cięcia tkanek rośliny. Wykazano, że opisywane metody można z powodzeniem stosować do badania specjacji selenu w żywej tkance rośliny. Co więcej połączenie metody badania specjacji (XANES), z pierwiastkowo czułą metodą XRF pozwoliło nie tylko na określenie specjacji, ale również wykonanie mapowania rozmieszczenia selenu w badanych tkankach, co dostarczyło informacji na temat metabolizmu i ścieżek transportu tego pierwiastka w roślinie. Interesujące wyniki dotyczące specjacji Zn otrzymano przy zastosowaniu EXAFS (ang. Extended X-Ray Absorption Fine Structure) [ ]. Widma EXAFS wskazują na to, że cynk jest głównie wiązany przez grupy COOH i OH, od 40 do 80% całkowitej zawartości cynku występującego w korzeniach [170]. Autorzy przypuszczają, że duża część z tej puli cynku jest wiązana przez kwasy organiczne, takie jak kwas cytrynowy, czy jabłkowy. Specjację cynku badano w odpadach stalowniczych metodami wykorzystującymi promieniowania X (XRF, XANES, EXAFS) [169], jak też w próbkach geologicznych (skały, gleby) [173]. Analiza polegała na porównywaniu widm wzorców (n.p. ZnO, Zn5(CO3)2(OH)6, ZnFe2O4, ZnSO4 * 7H2O, różnych minerałów cynku) z uzyskanymi sygnałami dla poszczególnych fragmentów próbek. Należy podkreślić, że podejście takie jest uzasadnione w przypadku stosunkowo prostych cząsteczek i trudno byłoby adaptować je na potrzeby analizy próbek biologicznych, gdzie formy występowania pierwiastków są z reguły bardziej złożone. 46

47 Próby badania specjacji cynku w roślinach technikami XANES i EXAFS jednak podjęto, potwierdzając obecność wielu niskocząsteczkowych związków cynku, takich jak: fityniany, szczawiany, fosforany, cytryniany, a także połączenia cynku z cysteiną i histydyną [142, 174]. 47

48 II. CEL PRACY Celem niniejszej pracy było określenie możliwości analitycznych procedur pomiarowych w szczególności technik łączonych HPLC ICP MS i HPLC ESI MS - w badaniu specjacji cynku w materiale roślinnym. Cynk wybrano ze względu na jego znaczącą rolę w organizmach roślinnych i zwierzęcych (omawianą szeroko w części literaturowej), fakt że różne dawki tego pierwiastka wywołują zarówno negatywne, jak i pozytywne skutki, a także ze względu na liczne trudności związane z oznaczaniem tego pierwiastka w próbkach roślinnych i brak opisanych w literaturze udanych prób zbadania specjacji cynku w roślinach (wyłączając frakcjonowanie z użyciem SEC). Pierwiastek ten jest uważany za trudny analitycznie, co wynika z jego rozpowszechnienia w środowisku laboratoryjnym (ryzyko kontaminacji próbki), jak również interferencji spektralnych, którymi obarczone są techniki spektrometrii absorpcyjnej i spektrometrii mas. W związku z tym pożądane są rozwiązania pomiarowe umożliwiające ograniczenie wpływu kontaminacji oraz interferencji i dostarczające rzetelnych i dokładnych wyników. Najważniejszym problemem, z którym mierzono się w ramach badań był brak wzorców biologicznie aktywnych związków cynku. Zdecydowana większość procedur pomiarowych zakłada porównanie sygnału analitycznego (widmo, czas retencji) próbki i wzorca. Dysponując wzorcami i materiałami odniesienia chemicy analitycy czują się komfortowo i z reguły mogą podążać utartymi ścieżkami. Gdy takiego odniesienia nie ma, konieczne staje się zastosowanie specyficznych procedur pomiarowych umożliwiających wielowymiarowe rozdzielenie badanych związków i ostatecznie ich identyfikację. Głównym celem pracy było opracowanie scenariusza analitycznego umożliwiającego badanie specjacji cynku bez odnoszenia się do substancji wzorcowych. Wykorzystując chromatografię dwuwymiarową z pierwiastkowo specyficznym detektorem ICP MS planowano opracować metodę rozdzielania związków cynku i sposób przypisania sygnałów do poszczególnych form tego pierwiastka. Następnie zakładano optymalizację metody chromatograficznego rozdzielenia form cynku do pracy z cząsteczkowym detektorem ESI MS, 48

49 umożliwiającym określenie mas cząsteczkowych, następnie struktur rozdzielonych form cynku. Obiektem badań była Plantago lanceolata L. (babka lancetowata), popularna roślina lecznicza, której zasięg występowania obejmuje niemal całą północną półkulę Ziemi. Roślina ta wykazuje przystosowanie do wzrostu na terenach zanieczyszczonych metalami (m. in. cynkiem). Prawdopodobnie wykształciła ona mechanizmy obronne, pozwalające unieszkodliwiać i akumulować metale w jej tkankach. Ważnym aspektem badań była próba porównania dwóch populacji rośliny Plantago lanceolata L. różniących się tolerancją na cynk. W ten sposób szukano dowodów wpływu wytworzonych przez roślinę mechanizmów tolerancji na specjację cynku w jej poszczególnych częściach. Nasiona roślin populacji badanej w niniejszej pracy zostały pozyskane z hałd pokopalnianych, terenów o bardzo dużej zawartości takich pierwiastków jak: cynk, ołów, kadm i tal (populacja hałdowa). Dla porównania badaniom poddano również rośliny hodowane z nasion pochodzących z terenów niezanieczyszczonych (populacja naturalna). Podstawą podjęcia badań było to, że rośliny z badanej populacji roślin hałdowych wykazują wyższą tolerancję na cynk, w porównaniu do populacji z terenów niezanieczyszczonych. Ze względu na interdyscyplinarność podjętej tematyki część literaturowa niniejszej pracy zawiera obszerny materiał dotyczący biologicznych aspektów tego zagadnienia. 49

50 III. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA 5 Aparatura i odczynniki 5.1 Aparatura i sprzęt laboratoryjny Kwadrupolowy spektrometr mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej wyposażony w komorę reakcyjną, Elan 6100 DRC (Perkin Elmer Sciex, USA); Wysokorozdzielczy spektrometr mas z jonizacją przez elektrorozpylenie (ESI) z analizatorami typu pułapka jonowa i Orbitrap, Thermo Fusion (Thermo, USA) Wysokosprawny chromatograf cieczowy, Agilent 1200 (Agilent, USA); Anionowymienna kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej, Hamilton PRPX100 (250 mm x 4,6 mm (Hamilton USA)); Kolumna do wysokosprawnej chromatografii wykluczania, GF-250 (250 mm x 4,6 mm (Agilent Technologies, USA)); Kolumna do wysokosprawnej chromatografii wykluczania, SEC-5 (250 mm x 4,6 mm (Agilent Technologies, USA)); Kolumna do wysokosprawnej chromatografii kationowymiennej, Zorbax 300-SCX (250 mm x 4,6 mm (Agilent Technologies, USA)); Mineralizator mikrofalowy, Multiwave Anton Paar (Anton Paar, Austria); Bomby teflonowe (Anton Paar, Austria); Mieszadło magnetyczne z podgrzewaczem, MS 11 HS (Wigo, Polska); Płuczka ultradźwiękowa, Sonic 2 (Polsonik, Polska); Pehametr S47 SevenMulti (Mettler Toledo, Szwajcaria); Suszarka laboratoryjna SML-30/250 (ZALMED, Polska); Waga analityczna Radwag 220 AX (Radwag, Radom, Polska); Mikropipety o pojemności od 5 ml do 1000 ml Eppendorf (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Niemcy); Filtry 0,45 μm (Supelco, USA); 50

51 Filtry strzykawkowe 0,45 μm (Milex, Francja); Filtry strzykawkowe 0,20 μm (Milex, Francja); Szklany i plastikowy sprzęt laboratoryjny; 5.2 Odczynniki Kwas azotowy(v) 65%, Suprapur, (Merck, Niemcy); Kwas solny 37 %, ultraczysty (Merck, Niemcy); 2-amino-2-hydroksymetylo-1,3propanodiol (Tris) (Sigma, USA); Wielopierwiatkowy wzorzec Merck VI do ICP MS (Merck, Niemcy); Octan amonu. cz.d.a., (POCh, Polska); Triton X-100 (Sigma, USA); 2-amino-2-hydroksymetylo-1,3propanodiol (Tris) (Sigma, USA); Wodorowęglan sodu (Sigma Ultra, Niemcy); Wodorotlenek sodu (Merck, Niemcy); Kwas cytrynowy (Sigma Aldrich, Niemcy); Kwas octowy (Sigma Aldrich, Niemcy); Metanol (Sigma Aldrich, Niemcy); Acetonitryl (POCH, Polska); Kwas mrówkowy >98% Suprapur (Merck, Niemcy) 5.3 Roztwory wzorcowe Wszystkie roztwory wzorcowe zostały przygotowane przy użyciu wody dejonizowanej z systemu mili-q (Milipore, USA): Wielopierwiastkowe roztwory wzorcowe do kalibrowania układu ICP MS otrzymane przez odpowiednie rozcieńczenie wzorca Merck VI w 1% HNO3. Wzorce masy do chromatografii wykluczania: witamina B12 (1360 j.m.a.), kazeina (24000 j.m.a.), transferyna (78600 j.m.a.), tlenek polietylenu (średnia masa j.m.a.), tyroglobulina ( j.m.a.). Wszystkie substancje wyprodukowane przez Sigma Aldrich, USA. 51

52 Dibenzyloditiokarbaminian cynku, British Drug House Laboratory Reagent, Anglia. Dietylodikarbaminian cynku, Polskie Odczynniki Chemiczne, Polska 5.4 Materiały odniesienia Materiał odniesienia NIST 1643e Trace Elements in Water (NIST, Canada). Certyfikowane stężenie cynku 76,5 µg/l. Materiał używano do sprawdzenia dokładności metody oznaczania cynku w roztworach wodnych. Materiał odniesienia SPS SW 1 Woda powierzchniowa (Spectrapure Standards, Norway). Certyfikowane stężenie cynku 20 µg/l. Materiał używano do sprawdzenia dokładności metody oznaczania cynku w roztworach wodnych. Materiał odniesienia SPS SW 2 Woda powierzchniowa (Spectrapure Standards, Norway). Certyfikowane stężenie cynku 100 µg/l. Materiał używano do sprawdzenia dokładności metody oznaczania cynku w roztworach wodnych. Materiał odniesienia INCT-MPH-2 Mieszanka ziół polskich (Instytut Chemii i Techniki Jądrowej, Polska). Certyfikowana zawartość cynku 33,5 mg/kg. Materiał używano do sprawdzenia dokładności metody oznaczania cynku suchym materiale roślinnym. 5.5 Gazy Argon - 99,9% (Air Products, Polska); Azot - 99,9995% (Multax, Polska); Hel - 99,9995% (Multax, Polska); 52

53 6 Materiał badawczy 6.1 Hodowla roślin Plantago lanceolata L. jest popularną roślina leczniczą obejmującą swym zasięgiem niemal całą północną półkulę Ziemi. Wykazuje przystosowanie do wzrostu i rozwoju na terenach skażonych metalami, na przykład na hałdach pogórniczych. W związku z tym postrzegana jest jako roślina, która wykształciła odpowiednie mechanizmy tolerancji na przykład mechanizm akumulacji. Ziarna populacji Plantago, badanej w niniejszej pracy, pochodzą z bądź z hałd pokopalnianych w okolicy Bolesławia (południowa Polska), bądź z niezanieczyszczonych (populacja naturalna) obszarów centralnej polski. Ziarna obu populacji były kiełkowane w warunkach laboratoryjnych, w komorze wzrostowej przez jeden tydzień. Następnie siewki przeniesiono na podłoże perlitowe i podlewano pożywką Knoppa 50%. Pożywka Knoppa to roztwór soli mineralnych o tak dobranym stężeniu, aby zapewnić roślinie optymalny wzrost. Taką pożywkę stosuje się po to, aby reakcje roślin, badanych w warunkach laboratoryjnych, były konsekwencją działania związanego czynnika (w przypadku niniejszej pracy było to podwyższone stężenie cynku), a nie wynikały z niedoboru składników odżywczych. W tabeli 1 zestawiono związki chemiczne wchodzące w skład pożywki. Tabela 1 Skład jakościowy pożywki Knoppa. Azotan (V) wapnia Azotan (V) potasu Dihydroksy fosforan potasu Chlorek potasu Siarczan (VI) magnezu Wersenian żelaza (III) Chlorek litu Chlorek manganu (II) Nazwa związku Siarczan (VI) cynku Siarczan (VI) glinu Azotan (V) kobaltu Siarczan (VI) miedzi Siarczan (VI) niklu Jodek potasu Bromek potasu Kwas borowy 53

54 Po pojawieniu się pierwszych liści, wybraną grupę roślin podlewano pożywką wzbogaconą w azotan (V) cynku w stężeniu 100 mg/l. Pozostałą grupę roślin podlewano nadal 50% pożywką Knoppa (kontrola). Rośliny uprawiano w szklarni, aż do ich pełnego rozwoju. Hodowlą roślin zajmował się zespół prof. dr hab. Małgorzaty Wierzbickiej (Wydział Biologii UW). 6.2 Różnice morfologiczne pomiędzy populacjami W trakcie hodowli roślin w obecności soli cynku zaobserwowano morfologiczne różnice pomiędzy populacjami: w porównaniu do populacji hałdowej, populacja naturalna miała mniej liści, były one mniejsze, a rośliny cechowały się mniejszą biomasą i nie wykształciły części generatywnych (rysunek 6). Rysunek 6 Rośliny hodowane w warunkach laboratoryjnych w obecności soli cynku, po osiągnięciu pełnego rozwoju. Populacja naturalna wykazała większą wrażliwość na wysoką zawartość cynku w porównaniu do populacji hałdowej. 54

55 7 Procedura określania całkowitej zawartości cynku w materiale roślinnym techniką ICP MS 7.1 Optymalizacja układu ICP MS W celu określenia całkowitej zawartości cynku w tkankach roślinnych zastosowano spektrometrię mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP MS). Na podstawie analizy certyfikowanych materiałów odniesienia dokonano wyboru izotopów cynku. Kryteriami wyboru były dokładność i precyzja wyniku otrzymanego dla danego izotopu, a więc odpowiednio zgodność otrzymanego wyniku z wartością certyfikowaną i odchylenie standardowe tego wyniku. Do kalibracji układu pomiarowego zastosowano serię roztworów wzorcowych o wzrastającym stężeniu cynku. Jako wzorzec wewnętrzny stosowano rod, obecny w roztworze w takim stężeniu, aby otrzymana liczba zliczeń dla izotopu 103 Rh mieściła się w zakresie od do jednostek. Podstawowym kryterium, które musi spełniać wzorzec wewnętrzny jest to, że nie występuje w badanym materiale. Poza tym ważne jest, aby wzorzec wewnętrzny miał podobną masę atomową i potencjał jonizacji, co oznaczany pierwiastek. Masa atomowa i potencjał jonizacji w dużym stopniu decydują bowiem o mechanizmach jonizacji, którym podlega dane indywiduum chemiczne w plazmie, a także o miejscu występowania stref plazmy najbogatszych w pojedynczo naładowane jony. Tabela 2 Parametry pomiarowe układu ICP MS. Spektrometr Perkin Elmer Elan 6100 DRC Komora mgielna Cyklonowa Rozpylacz Szklany typu Meinharda Moc plazmy 1050 W Przepływ gazu rozpylającego 0,82 L/min Przepływ gazu plazmowego 16 L/min Monitorowane izotopy 66 Zn, 67 Zn, 68 Zn 55

56 W celu otrzymania dokładnych i precyzyjnych wyników pomiarów konieczna jest optymalizacja układu ICP MS przed każdą serią pomiarową. Podczas takiej optymalizacji sprawdzana jest czułość przyrządu, a także poziom potencjalnych interferencji (tlenków, czy jonów podwójnie naładowanych). Sprawdzany jest również poziom szumów aparaturowych poprzez pomiar sygnału dla niewystępujących w rzeczywistości mas atomowych (8,5 i 220 j.m.a.). Proces optymalizacji prowadzi się przy użyciu roztworu zawierającego pierwiastki o masach atomowych z całego zakresu pomiarowego. Często wybierane są następujące pierwiastki: Be, Mg, In, Ba, Ce, Pb, U, każdy w stężeniu 10 μg/l. Następnie mierzy się liczbę zliczeń dla każdego z izotopów i porównuje otrzymany wynik z zaleceniami producenta. 7.2 Interferencje izobaryczne i wieloatomowe przy oznaczaniu cynku techniką ICP MS Spektrometria mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej polega na pomiarze stosunku masy do ładunku indywiduów chemicznych otrzymanych w plazmie. Oczywiste jest, że różne jony mogą mieć ten sam, lub podobny stosunek masy do ładunku. W konsekwencji dochodzi do zafałszowania wyniku pomiaru interesującego nas izotopu, ponieważ analizator mas (np. kwadrupol) nie jest w stanie rozróżnić jonów o zbliżonej wartości m/z, a w konsekwencji detektor zlicza zarówno jony interferujące, jak i jony analitu. Zasadniczym problemem jest stosunkowo niewielka rozdzielczość analizatora kwadrupolowego, przez co nie jest on w stanie rozróżnić np. izotopów 64 Zn i 64 Ni (interferencje izobaryczne), czy jonu 32 S 16 O2 + (interferencje wieloatomowe). W przypadku pierwiastków posiadających więcej niż jeden izotop, kluczowy jest wybór takiego izotopu, dla którego prawdopodobieństwo występowania jonów interferujących jest najmniejsze. Nie jest to jednak jedyne kryterium. Wybierając izotop przede wszystkim należy kierować się jego rozpowszechnieniem, ponieważ wysoka abundancja korzystnie wpływa na czułość pomiaru. Kolejno należy rozważyć potencjalne interferenty i możliwość ich występowania w próbce o danej matrycy. Z dużą dozą krytycyzmu należy stosować korekcję matematyczną, której celem jest rachunkowe uwzględnienie wpływu danego interferenta. Należy pamiętać, że tego typu równania zostały wprowadzone dla konkretnych typów matryc i mogą nie działać poprawnie, jeżeli skład badanego roztworu różni się zasadniczo. 56

57 W Tabeli 3 zestawiono wartości na temat rozpowszechnienia izotopów cynku, oraz najczęściej spotykanymi dla nich jonami o podobnej wartości m/z. Tabela 3 Rozpowszechnienie i wybrane interferencje izobaryczne i wieloatomowe w technice ICP MS dla cynku. (Dane producenta: Perkin Elmer, Elan 6100 DRC). Korzystając z informacji przedstawionych w tabeli 3, początkowo wybrano trzy najbardziej rozpowszechnione izotopy cynku, tj. 64 Zn, 66 Zn i 68 Zn. Następnie na podstawie pomiaru liczby zliczeń dla potencjalnych interferentów (S, Ni, Ca, Ba) oszacowano możliwość wystąpienia interferencji w roztworach stosowanych w niniejszej pracy. Dodatkowo przeprowadzono pomiar zawartości Zn w roztworze zawierającym CuSO4, wykazując wpływ siarki (w postaci jonu 32 S 16 O2 + ) na sygnał izotopu 64 Zn. Na tej podstawie podjęto decyzję, że izotop 64 Zn nie jest wolny od interferencji. Warto podkreślić, że pomimo faktu, że zgodnie z teorią zderzeń aktywnych prawdopodobieństwo powstawania trójatomowych indywiduów chemicznych jest znacznie mniejsze, niż powstawanie indywiduów dwuatomowych, jon 32 S 16 O2 + stanowi zasadniczą interferencje wieloatomową przy oznaczaniu izotopu 64 Zn. Kolejnym krokiem była analiza certyfikowanego matrycowego materiału odniesienia INCT- MPH-2, a także oszacowanie niepewności, jaką obarczony jest ostateczny wynik określenia zawartości Zn w tym materiale. W tabeli 3 przedstawiono wyniki oznaczenia Zn w materiale odniesienia INCT-MPH-2. Materiał ten był poddawany mineralizacji, w taki sam sposób, jak badane tkanki rośliny Plantago, co pozwoliło na walidację procedury określania całkowitej zawartości Zn w tkankach roślin. Procedurę tę opisano szczegółowo w rozdziale

58 Tabela 4 Wyniki oznaczenia Zn w certyfikowanym matrycowym materiale odniesienia INCT-MPH-2 Mieszanka ziół polskich. Izotop Wartość certyfikowana ± U Wartość zmierzona ± U [mg/kg] dla k=2 [mg/kg] dla k=2 66 Zn 33,5 ± 2,1 33,2 ± 1,9 68 Zn 33,5 ± 2,1 34,2 ± 1,9 Na podstawie danych z tabeli 4 i początkowo przyjętych kryteriów zdecydowano, że pomiary będą prowadzone dla izotopów 66 Zn i 68 Zn, a jako wynik ostateczny przyjmowana będzie wartość średniej arytmetycznej. Poza tym wykazano, że zaproponowana procedura pomiarowa pozwala na określenie zawartości cynku w suszonym materiale roślinnym. 7.3 Określenie całkowitej zawartości Zn w próbkach roślinnych Suszenie i mineralizacja Wyhodowane w warunkach laboratoryjnych rośliny podzielono na dwie części, liście i korzenie, które następnie suszono w temperaturze około 60 o C przez 3 dni. Suchy materiał homogenizowano ręcznie i dzielono na próbki o masie około 0,1 grama. Mineralizację wysuszonych próbek materiału roślinnego przeprowadzono w systemie zamkniętym z wykorzystaniem energii mikrofalowej. Użyto programu mineralizacji, w którym przez pierwsze 5 minut moc promieniowania mikrofalowego rosła liniowo do 800 W, a następnie przez 15 minut w naczyniach była utrzymywana temperatura 260 C i ciśnienie 60 barów. Po tym czasie układ chłodzony był do temperatury pokojowej, a ciśnienie w nim panujące spadało do wartości bliskiej ciśnieniu atmosferycznemu. Przed przystąpieniem do właściwej mineralizacji próbek, naczynia służące do mineralizacji były starannie czyszczone. W tym celu do każdego z naczyń wlano 8 ml 65% kwasu azotowego (V) (Merck Suprapur ) i uruchomiono program mineralizacji. Po zakończeniu procesu wylano zawartość naczyń, kilkakrotnie przemyto je wodą destylowaną i pozostawiono do wyschnięcia. Kolejnym etapem było przygotowanie ślepych prób. Do ponumerowanych naczyń mineralizacyjnych wlano około 8 ml 65% kwasu azotowego (V) i uruchomiono program 58

59 mineralizacji. Po zakończeniu procesu, zawartość naczyń przeniesiono do odpowiednio oznakowanych pojemników odpowiadającym numerom bomb teflonowych. Otrzymane roztwory posłużyły, jako ślepe próby podczas określenia całkowitej zawartości cynku. Następnie mineralizacji poddano około 0,1 g próbki, umieszczając ją w naczyniu teflonowym, z dodatkiem około 8 ml 65% kwasu azotowego (V). Otrzymane roztwory przeniesiono do odpowiednio oznakowanych pojemników, uwzględniając przy tym również numer naczynia, w którym zachodziła mineralizacja. Dzięki temu do każdej próbki przypisano roztwór ślepej próby, pochodzący z tej samej bomby teflonowej Zawartość cynku w suchym materiale roślinnym W niniejszym rozdziale omówiono badania poświęcone ocenie całkowitej zawartości cynku w tkankach Plantago lanceolata. Wykorzystano suchy materiał roślinny, który podzielono na części nadziemne i podziemne. Celem tych badań była ocena efektywności pobierania i transportowania cynku przez roślinę. W Tabeli 4 przedstawiono wyniki określenia całkowitej zawartości cynku w suchym materiale roślinnym. Badanie prowadzono dla następujących próbek: 1. części nadziemne (L) roślin hałdowych (H) hodowanych na pożywce zawierającej 100 mg/kg Zn(NO3)2 kod: HZn100L 2. części nadziemne (L) roślin pochodzących z terenów niezanieczyszczonych (N) hodowanych na pożywce zawierającej 100 mg/kg Zn(NO3)2 - kod: NZn100L 3. części podziemne (K) roślin pochodzących z terenów niezanieczyszczonych (N) hodowanych na pożywce zawierającej 100 mg/kg Zn(NO3)2 kod: NZn100K 4. części nadziemne (K) roślin hałdowych (H) hodowanych na pożywce zawierającej 100 mg/kg Zn(NO3)2 kod: HZn100L 5. części nadziemne (L) roślin pochodzących z terenów niezanieczyszczonych (N) hodowanych na pożywce niezawierającej dodatku Zn(NO3)2 kod: NK_L 6. części nadziemne (L) roślin hałdowych (H) hodowanych na pożywce niezawierającej dodatku Zn(NO3)2 kod: HK_L 7. certyfikowany materiał odniesienia Mixed Polish Herbs kod: MPH 59

60 W dalszej części pracy rośliny populacji hałdowej nazywane są roślinami hałdowymi, a rośliny pochodzące z terenów niezanieczyszczonych roślinami naturalnymi. Tabela 5 Całkowita zawartość cynku w badanym materiale roślinnym. Kod próbki Stężenie ± U [mg/kg] HZn100L 4530 ± 589 NZn100L 3544 ± 425 HZn100K ± 902 NZn100K ± 688 HK_L 283 ± 23 NK_L 144 ± 37 MPH 35 ± 3 Na postawie danych zamieszczonych w tabeli 5 można stwierdzić, że: - rośliny hałdowe i naturalne hodowane na pożywce wzbogaconej w cynk akumulują w korzeniach podobne ilości tego pierwiastka 1, - zawartość cynku w liściach roślin obu populacji nie różni się statystycznie 1, - w przypadku pożywki niewzbogaconej w cynk rośliny hałdowe akumulują w liściach więcej cynku, niż rośliny naturalne 1. Wprawdzie obie populacje roślin (hałdowa i naturalna) akumulują cynk w tkankach, jednak nie można zaliczyć ich do hiperakumulatorów, ponieważ nie akumulują powyżej 1% cynku w suchej masie części nadziemnej rośliny. Porównując dane zamieszczone w tabeli 5 można również zauważyć, iż w częściach podziemnych Plantago znajduje się prawie 8 razy więcej cynku, niż w częściach nadziemnych. W Tabeli 5 umieszczono również wynik oznaczenia cynku w certyfikowanym materiale odniesienia MPH. Analiza materiału odniesienia została wykonana w celu sprawdzenia poprawności stosowanej procedury. Całkowita zawartości cynku wynosi (35 ± 3) mg/kg i jest to wartość zgodna w granicach niepewności z wartością certyfikowaną: (33,5 ± 2,1) mg/kg. 1 Do analizy danych zastosowano procedurę opisaną w: W.Hyk, Z.Stojek Analiza statystyczna w laboratorium chemicznym, Komitet Chemii Analitycznej PAN, Warszawa 2000, strony

61 7.4 Podsumowanie Na podstawie przedstawionych wyników można potwierdzić, że metoda ICP MS umożliwia uzyskanie wiarygodnych danych dotyczących zawartości cynku w materiale roślinnym. W pracy zwrócono uwagę na interferencje spektralnie i wieloatomowe, przede wszystkim pochodzące od siarki oraz podkreślono konieczność doboru izotopu, lub izotopów, dla których prowadzone są pomiary. W celu potwierdzenia wiarygodności wyników oznaczano cynku w certyfikowanym materiale odniesienie INCT-MPH-2 Mieszanka Ziół Polskich, a uzyskane wyniki były zgodne w zakresie niepewności z wartością certyfikowaną. Wyniki określenia całkowitej zawartości cynku w tkankach roślin pochodzących z dwóch populacji wskazują, że rośliny populacji hałdowej akumulują nieco więcej cynku w swoich tkankach. Jak wynika z danych w tabeli 3 rośliny populacji hałdowej akumulowały więcej cynku w liściach zarówno w przypadku grupy badanej, jak i grupy kontrolnej. W przypadku części podziemnych zawartość cynku w przypadku roślin obu populacji jest porównywalna. Zaobserwowano, że rośliny obu populacji kumulowały więcej cynk w częściach podziemnych, niż nadziemnych. Warto zwrócić uwagę, że mimo kumulowania większych ilości cynku w tkankach rośliny populacji hałdowej, nie obserwowano negatywnego wpływu tego pierwiastka na wzrost tych roślin. Należy również pamiętać, że w przypadku organizmów roślinnych występuje duża zmienność osobnicza i badana cecha może diametralnie się zmieniać pomiędzy osobnikami tej samej populacji. 61

62 8 Badanie specjacji selenu z wykorzystaniem układu HPLC ICP MS 8.1 Optymalizacja procedur ekstrakcji Ekstrakcja jednoetapowa W celu przeniesienia obecnych w próbce związków cynku do roztworu, materiał roślinny poddany został procesowi ekstrakcji. W niniejszej pracy wybrano jednoetapową ekstrakcję ciało stałe ciecz. W każdym przypadku ekstrakcję prowadzono ze świeżego materiału (na podstawie wyników eksperymentów uzyskanych w ramach wcześniejszych prac w Pracowni zrezygnowano z suszenia materiału [ ]. Suszenie powodowało zmiany specjacji i obniżenie wydajności ekstrakcji). Zaproponowano i sprawdzono różne warianty prowadzenia ekstrakcji. Próbowano między innymi ekstrakcji z suszonego materiału, ekstrakcji wspomaganej ultradźwiękowo, lub mechanicznie [ ]. Próbowano również jako ekstrahenta używać rozpuszczalników organicznych (metanol) [ ]. Używano również homogenizatorów typu Bead Beater [177]. Ostatecznie zdecydowano zastosować dwa sposoby: - jednoetapowa ekstrakcja roztworami buforowymi o różnym ph ze świeżego materiału roślinnego poddanego homogenizacji z użyciem ciekłego azotu, - ekstrakcja CO2 w stanie nadkrytycznym. Opracowanie procedury badania specjacji cynku w materiale roślinnym związane jest z optymalizacją sposobu ekstrakcji, która jest etapem niezbędnym i ma istotny wpływ na otrzymane wyniki. W analizie specjacyjnej, warunki ekstrakcji powinny być tak dobrane aby zachowany był kompromis pomiędzy uzyskaniem jak najlepszej wydajności a zapewnieniem niezmienności form specjacyjnych. 62

63 8.1.2 Ekstrakcja po homogenizacji ciekłym azotem Około 0,1 grama świeżej tkanki roślinnej obmyto wodą destylowaną, umieszczono w probówce typu Eppendorf i zalano nadmiarem ciekłego azotu. Następnie materiał roślinny ucierano czystą szklaną bagietką, po czym dodano 1 ml roztworu ekstrahenta (stosowano różne roztwory buforowe w zakresie ph od około 4 do 10). Następnie próbki były wytrząsane przez 60 minut w temperaturze 4 o C i wirowane przez 4 minuty (13000 rpm, 4 o C). Oddzielony roztwór filtrowano przez filtr 0,45 µm (0,2 µm w przypadku analizy ESI MS) i poddano analizie w ciągu 90 minut. Jako ekstrahentów użyto: Bufor octanowy o ph 4,1; Bufor octanowy o ph 5,5; Bufor TrisHCL o ph 7,4; Bufor węglanowy o ph 10,0. Zestaw ekstrahentów został dobrany tak aby bufor o ph 5,5 imitował ph wakuoli, a bufor o ph 7,4 odpowiadał typowemu ph cytozolu. Zakładano, że stosując roztwór o zbliżonym ph uzyska się odpowiednią efektywność ekstrakcji substancji występujących w wakuolach lub w cytozolu, bez naruszenia równowagi chemicznej a tym samym bez zmian specjacji. Pozostałe dwa roztwory (ph 4,1 oraz 10,0) użyto w celu rozszerzenia zakresu ph i uzyskania pełniejszego obrazu wpływu ph ekstrahenta na wydajność ekstrakcji Ekstrakcja CO2 w stanie nadkrytycznym Ekstrakcja CO2 w stanie nadkrytycznym została wybrana z kilku powodów. Pierwszym z nich jest fakt, że CO2 w stanie nadkrytycznym penetruje materiał bardziej efektywnie, niż ciekły ekstrahent. Co ważniejsze, po zakończeniu ekstrakcji i powrocie do warunków pokojowych ekstrahent ulega niemal całkowitemu odparowaniu, przez co zachodzi zatężenie składników ekstraktu. Trzeci powód związany jest ze stosunkowo dużym powinowactwem CO2 w stanie nadkrytycznym do związków stosunkowo małopolarnych i wysokocząsteczkowych. Badanie właśnie tej grupy związków wydaje się szczególnie interesujące, mimo że nie było do tej pory opisane w literaturze. 63

64 Ze względu na małą masę części podziemnych, ekstrakcję CO2 w stanie nadkrytycznym prowadzono tylko z liści. Świeże liście homogenizowano ręcznie. Próbkę o masie około 158 gramów umieszczono w reaktorze. Otrzymane ekstrakty stanowiły gęstą zawiesinę, a cząstki fazy rozproszonej ulegały rozpuszczeniu w wodzie dodanej w celu rozcieńczenia ekstraktu. Końcowa objętość ekstraktu nie przekraczała 10 ml. W tabeli 6 przedstawiono dane dotyczące masy próbki i masy otrzymanego ekstraktu dla dwóch stosowanych sposobów ekstrakcji. Ekstrakcję przeprowadzili pracownicy Zakładu Technologii Organicznej i Procesów Rozdziału Instytutu Chemii Przemysłowej w Warszawie. Tabela 6 Stosunek masy próbki do masy otrzymanego ekstraktu dla dwóch sposobów ekstrakcji. Ekstrakcja Masa próbki (M) Objętość otrzymanego ekstraktu (m) CO2 w stanie nadkrytycznym 158 gramów Około 10 gramów 15,8 Ekstrakcja jednoetapowa po ucieraniu próbki w 0,1 grama 1,0 gram 0,1 ciekłym azocie Analizując dane z tabeli 6 należy zauważyć, że w przypadku ekstrakcji w stanie nadkrytycznym używamy prawie 1600 razy większej masy próbki, a otrzymujemy zaledwie 10 razy więcej ekstraktu, Można spodziewać się (przy założeniu porównywalnej wydajności ekstrakcji), że roztwory otrzymane z zastosowaniem ekstrakcji nadkrytycznej będą znacznie bogatsze w związki cynku Określenie wydajności ekstrakcji. Próbki ekstraktów otrzymanych w wyżej opisany sposób poddano wspomaganej mikrofalowo mineralizacji w stężonym kwasie azotowym (V), w układzie zamkniętym. Następnie określono w nich całkowitą zawartość Zn techniką ICP MS w sposób analogiczny, jak w przypadku roztworów otrzymanych po mineralizacji tkanek roślinnych (rozdział 7.3). Wydajność ekstrakcji została wyznaczona poprzez odniesienie zawartości cynku 64

65 w ekstraktach do całkowitej zawartości cynku w materiale roślinnym. Tak jak opisano wyżej, ekstrakty otrzymano ze świeżego materiału roślinnego, a całkowitą zawartość cynku określono w próbkach wysuszonych. W związku z tym konieczne było przeliczenie zawartości cynku w próbce na suchą masę rośliny. Było to możliwe, dlatego że próbki świeżych roślin użyte do określenia całkowitej zawartości cynku były ważone przed suszeniem. Dzięki temu możliwe było przeliczenie zawartości cynku zarówno na suchą, jak i na świeżą masę. Wydajność ekstrakcji przedstawiono w tabeli 7. Tabela 7 Wydajność ekstrakcji cynku (w przeliczeniu na całkowitą zawartość) z materiału roślinnego homogenizowanego z użyciem ciekłego azotu. Ekstrahent Wydajność ekstrakcji [%] ± odchylenie standardowe [%] Analizując dane z tabeli 7 należy zauważyć wzrost wydajności ekstrakcji wraz z obniżeniem ph ektrahenta. Analizując zawartość cynku Bufor o ph = 10,0 3 ± 1 w ekstraktach otrzymanych z użyciem CO2 w stanie nadkrytycznym zaobserwowano, Bufor o ph = 7,4 Bufor o ph = 5,5 6 ± 1 12 ± 2 że ogólna wydajność ekstrakcji nie różni się zasadniczo od wydajności prezentowanych w tabeli 6 (wynosi średnio 8%). Natomiast stężenie Zn w ekstraktach otrzymanych Bufor o ph = 4,1 18 ± 4 z użyciem CO2 w stanie nadkrytycznym jest od 30 do 100 razy wyższe, niż w przypadku Ekstrakt CO2 8 ± 1 ekstrakcji z materiału homogenizowanego z użyciem ciekłego azotu. Sytuacja ta związana jest zapewne z faktem, że do ekstrakcji z użyciem CO2 użyto bardzo dużej (w porównaniu do ekstrakcji z ciekłym azotem) odważki próbki, a końcowa objętość ekstraktu wynosiła około 10 ml (tabela 6). Doszło zatem do wielokrotnego zatężenia składników ekstraktu. 65

66 9 Analiza specjacyjna cynku w próbkach roślinnych 9.1 Wstęp Istotnym problemem w badaniu specjacji cynku jest brak dostępnych wzorców, co powoduje, ze konieczne jest opracowanie specyficznych scenariuszy analitycznych umożliwiających identyfikację związków cynku występujących w ekstraktach roślinnych. W celu rozdzielenia związków cynku wyekstrahowanych z rośliny zaproponowano dwa mechanizmy rozdzielenia chromatograficznego: chromatografię wykluczenia oraz chromatografię kationowymienną. W celu rozdzielenia i detekcji wyekstrahowanych z tkanek Plantago związków cynku, zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową w połączeniu ze spektrometrią mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (HPLC ICP MS). W układzie tym spektrometr mas posłużył jako detektor elementarny, dzięki któremu możliwe było monitorowanie czasów retencji związków zawierających cynk. W przypadku analizy specjacyjnej monitorowano tylko jeden izotop cynku ( 66 Zn) ponieważ chromatogramy uzyskane dla obu wcześniej wybranych izotopów ( 66 Zn i 68 Zn) były niemal identyczne. Izotop 66 Zn wybrano, ponieważ jest on niemal dwukrotnie bardziej rozpowszechniony niż 68 Zn. Dodatkowo zastosowano detektor UV Vis z matrycą fotodiodową (DAD) w celu przeprowadzenia kalibracji kolumny do chromatografii wykluczania. Aby rozdzielić związki cynku obecne w ekstraktach i jednocześnie uzyskać więcej komplementarnych informacji o cechach rozdzielanych związków zastosowano chromatografię dwuwymiarową. Podejście to polegało na frakcjonowaniu związków Zn w pierwszym wymiarze (chromatografia wykluczania, lub anionowymienna), zbieraniu poszczególnych frakcji do osobnych naczyń, a następnie rozdzielaniu składników indywidualnych frakcji z użyciem innego mechanizmu rozdzielenia chromatograficznego (chromatografia kationowymienna). Postępowanie to pozwoliło na znaczną poprawę rozdzielczości i rozdzielenie związków ulegających koelucji w pierwszym wymiarze. 66

67 9.2 Chromatografia wykluczania Warunki chromatograficzne Zastosowanie chromatografii wykluczania w połączeniu z detekcją ICP MS umożliwiło oszacowanie mas cząsteczkowych związków zawierających cynk. Na podstawie wyników wcześniej prowadzonych badań w Pracowni Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej Wydziału Chemii Uniwersytetu Warszawskiego [ ], oraz danych z optymalizacji układu HPLC ICP MS, ustalono parametry i warunki eksperymentalne - tabela 8. Tabela 8 Parametry rozdzielenia i detekcji związków cynku przy wykorzystaniu chromatografii wykluczania w połączeniu ze spektrometrią mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej. Kolumna Agilent SEC-5 Faza ruchoma 25mM bufor TrisHCl ph=7,4 Typ elucji izokratyczna Szybkość przepływu fazy ruchomej 0,35 ml/min Objętość próbki 100μl Detektor UV Vis, ICP MS Monitorowany izotop ⁶⁶Zn Zastosowana szybkość przepływu fazy ruchomej (0,35 ml/min), optymalna dla chromatograficznego rozdzielenia związków obecnych w próbce, jest zbyt niska dla detektora ICP MS. Z tego względu pomiędzy chromatografem cieczowym, a spektrometrem mas zamontowano trójnik łączący kolumnę z rozpylaczem. Umożliwiał on wprowadzenie do plazmy dodatkowej porcji cieczy (1% HNO3), pompowanej przez pompę perystaltyczną. W ten sposób szybkość przepływu cieczy docierającej do spektrometru mas została zwiększona na tyle, aby zachować stabilność pracy plazmy. 67

68 9.2.2 Kalibracja kolumny wykluczania W celu oszacowania mas cząsteczkowych związków cynku obecnych w badanych ekstraktach, wykonano kalibrację kolumny wykluczania. W tym celu określono czasy retencji wybranych substancji o znanych masach cząsteczkowych (tabela 8). Wykreślenie zależności logarytmu masy od czasu retencji daje możliwość oszacowania masy danego związku na podstawie jego czasu retencji. W tabeli 9 zestawiono związki wykorzystane do kalibracji kolumny wykluczania. Tabela 9 Związki wykorzystane podczas kalibracji kolumny wykluczenia wraz z czasami retencji na detektorze UV-Vis i masami cząsteczkowymi. Nazwa związku Czas retencji [s] Masa cząsteczkowa Logarytm [j.m.a.] cząsteczkowej Tyreoglobulina ,8 Politlenek etylenu ,6 Transferyna ,9 Kazeina ,3 Witamina B ,1 masy Rejestracja czasów retencji związków przedstawionych w tabeli 9 wykonana została przy zastosowaniu detektora UV Vis z matrycą fotodiodową (DAD) przy długości fali 214 nm. Na rysunku 7 przedstawiono zależność kalibracyjną dla kolumny wykluczania. 68

69 Rysunek 7 Zależność kalibracyjna kolumny wykluczania (Agilent SEC 5). Analizując zależność zaprezentowaną na rysunku 7 należy zwrócić uwagę na stosunkowo niski współczynnik korelacji liniowej (R= 0,9910) otrzymanej prostej. Fakt ten związany jest z kilkoma czynnikami. Niektóre z nich wynikają z mechanizmu rozdzielenia z zastosowaniem chromatografii wykluczania. Po pierwsze w kolumnach tego typu nie ma ściśle określonych miejsc oddziaływania rozdzielanej substancji z fazą stacjonarną. Zróżnicowanie czasów retencji uzyskuje się na skutek tego, że w zależności od masy cząsteczki, związki penetrują porowate wypełnienie kolumny (fazę stacjonarną) w różnym stopniu. Efektywność penetracji dodatkowo warunkuje geometria cząsteczki. Należy pamiętać, że kształt cząsteczki nie zawsze koreluje z jej masą. Po drugie mechanizm rozdzielenia chromatograficznego zakłada w tym przypadku, brak oddziaływania rozdzielanych cząsteczek z fazą stacjonarną, co jest w praktyce niemożliwe. Dodatkowo należy uwzględnić występowanie niepożądanych efektów w trakcie oddziaływania rozdzielanych substancji z fazą ruchomą (np. agregacja, lub strącanie). Odrębny problem stanowi fakt, że producenci odczynników chemicznych z reguły deklarują masę cząsteczkową dużych związków ze stosunkowo małą dokładnością, a w przypadku niektórych grup związków można mówić tylko o średniej masie cząsteczkowej (np. polimery, niektóre grupy białek). Opisane wyżej czynniki sprawiają, że chromatografia wykluczania, choć z założenia prosta w sensie procesu rozdzielenia, bywa niekiedy problematyczna w opisie. Dlatego też często zdarza się, że cząsteczki o mniejszej masie są wymywane z kolumny szybciej, niż cząsteczki o większej masie. 69

70 Należy również zauważyć, że otrzymana zależność kalibracyjna obejmuje zakres od logarytmu masy cząsteczkowej wynoszącego około 3,2 (co odpowiada masie cząsteczkowej około 1400 j.m.a.). Wynika to z faktu, że dla cząsteczek o mniejszej masie cząsteczkowej nie udało się uzyskać liniowej zależności czasu retencji od logarytmu masy cząsteczkowej. Przebiegu takiego należało się spodziewać na podstawie zakresu mas, jakie rozdziela zastosowana kolumna chromatograficzna Wyniki Zastosowanie chromatografii wykluczenia podczas analizy ekstraktów roślinnych pozwoliło na frakcjonowanie związków na postawie ich masy cząsteczkowej. Użycie spektrometru mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP MS) dało możliwość rejestracji czasów retencji związków zawierających cynk. Kalibracja kolumny wykluczenia została wykonana z użyciem detektora UV-Vis, natomiast chromatogramy związków cynku zostały zarejestrowane przy użyciu detektora ICP MS. W związku z tym, podczas określania mas cząsteczkowych analizowanych substancji wzięto pod uwagę opóźnienie, z jakim próbka trafiła do detektora ICP MS. Opóźnienie to zostało wyznaczone poprzez rejestrację sygnałów dla selenometioniny, związku dającego sygnał analityczny dla obu używanych detektorów (w tym przypadku monitorowano izotop 82 Se). Kolejnym krokiem było zbadanie wpływu ekstrahenta na specjację cynku oraz na intensywność otrzymanych sygnałów analitycznych dla poszczególnych frakcji związków cynku wyekstrahowanych z nadziemnych części rośliny Plantago. W obu przypadkach zaobserwowano wpływ ekstrahenta. Na rysunku 8 przedstawiono chromatogramy otrzymane dla czterech ekstrahentów z badanego zakresu ph. Ujednolicono etykiety osi rzędnych, aby widoczne były różnice intensywności sygnałów. 70

71 ph 4, ph 5, Intensywnosc (zliczenia) ph 7,4 ph 10, Czas (s) Rysunek 8 Porównanie chromatogramów wykluczania dla ekstraktów części nadziemnych rośliny Plantago. Badano ekstrakty w zakresie ph od 4,1 do 10,0. Na rysunku 9 przedstawiono dodatkowo chromatogramy dla roztworów otrzymanych stosując bufor octanowy o ph 4,1 lub bufor TrisHCl o ph 10,0 z przypisanymi masami cząsteczkowymi. Wybrano te dwa chromatogramy, ponieważ różniły się one między sobą najbardziej. 71

72 Intensywnosc (zliczenia) Intensywnosc (zliczenia) j.m.a. ~ j.m.a <1360 j.m.a j.m.a Czas (s) Rysunek 9 Porównanie chromatogramów wykluczania dla dwóch ekstraktów części nadziemnych rośliny Plantago. Na dole chromatogram dla ekstraktu buforem octanowym o ph 4,1, na górze chromatogram dla ekstraktu buforem wodorowęglanowym o ph 10,0. Analizując chromatogramy na rysunkach 8 i 9 widać, że ekstrakty zawierają rożne związki cynku. W przypadku ekstraktów o ph 7,4 i 10,0 zaobserwowano sygnał od wielkocząsteczkowej frakcji związków cynku (HMW czas retencji około 400 sekund), oraz sygnał od frakcji związków cynku o masach cząsteczkowych j.m.a.(lmw czas retencji około 700 sekund). Nie zaobserwowano sygnału pochodzącego od związków cynku o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a. W przypadku chromatogramu otrzymanego dla ekstraktu o ph 4,1 nie zarejestrowano sygnału od frakcji wielkocząsteczkowej, intensywność frakcji LMW uległa znacznemu obniżeniu, natomiast zarejestrowano bardzo intensywny sygnał od związków cynku o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a. Dla ekstraktu o ph 5,5 (ph wakuoli) zarejestrowano tylko jeden sygnał pochodzący od frakcji LMW. Należy zauważyć, że sygnały uzyskane dla ekstraktów o ph = 7,4 (ph cytozolu) i ph = 10,0 różnią się właściwie tylko intensywnością. Kolejnym krokiem było powtórzenie całego eksperymentu używając fazy ruchomej o ph około 4,0 (25mM bufor octanowy). W ten sposób próbowano sprawdzić, który z czynników ma wpływ na specjację 72

73 cynku. Czy możliwe jest, że do zmian specjacji dochodzi już po połączeniu się próbki ze strumieniem fazy ruchomej. Poniżej (rysunek 10) przedstawiono porównanie dwóch chromatogramów otrzymanych dla tej samej próbki ekstrakt o ph 7,4. Jeden z chromatogramów otrzymano stosując fazę ruchomą o ph około 4,0, drugi dla fazy ruchomej o ph 7,4. Intensywnosc (zliczenia) Eluent o ph = 4, Eluent o ph = 7, Czas (s) Rysunek 10 Porównanie chromatogramów SEC dla ekstraktu o ph = 7,4 wymywanych fazami ruchomymi o różnym ph. Należy zauważyć, że obniżenie ph eluenta nie umożliwiło rejestracji sygnału od najlżejszej frakcji związków cynku (spodziewany czas retencji około 950 sekund). Obniżenie ph spowodowało natomiast zanik sygnału od frakcji wielkocząsteczkowej (HMW przy czasie retencji około 400). Następnie przeprowadzono rejestrację chromatogramów dla ekstraktów CO2 w stanie nadkrytycznym. Ponieważ ekstrakty CO2 w stanie nadkrytycznym były bardzo stężone ograniczono objętość nastrzyku do 10µL i monitorowano izotop 67 Zn, w celu obniżenia czułości detektora ICP MS. 73

74 Zn Intensywnosc (zliczenia) Czas (s) Rysunek 11 Chromatogram wykluczania uzyskany dla ekstraktu CO2 w stanie nadkrytycznym. Objętość próbki wprowadzonej na kolumnę 10 µl, monitorowany izotop 67 Zn. Analizując chromatogram przedstawiony na rysunku 11 należy zauważyć bardzo szeroki sygnał przy czasie retencji od około 650 do 850 sekund. Sygnał ten może świadczyć o obecności w próbce wielu związków cynku o zbliżonych masach cząsteczkowych. Mimo, że otrzymany sygnał jest rozmyty, to jego czas retencji odpowiada mniej więcej czasowi retencji jednej z frakcji obserwowanej w przypadku analizy ekstraktów buforami wodnymi (rysunki 8 i 9). W przypadku ekstraku CO2 w stanie nadkrytycznym kształt sygnału może wynikać z tego, że wraz ze związkami cynku wymywa się bardzo dużo związków niezawierających cynku (na które ICP MS nie jest czuły), ale mających podobne masy cząsteczkowe. W konsekwencji, mimo stosunkowo małej intensywności sygnału może dochodzić do przebicia złoża kolumny i zaburzenia mechanizmów retencji, czego konsekwencją jest rozmycie piku. Jak już wspomniano na początku rozdziału ograniczono objętość dozowanej próbki do 10 µl i monitorowano izotop 67 Zn, w celu obniżenia czułości, ostatecznie próbowano również rozcieńczenia próbki fazą ruchomą. Niestety żaden z tych 74

75 kroków nie skutkował ograniczeniem rozmycia piku chromatograficznego. Należy wspomnieć, że gdy monitorowano izotop 66 Zn zarejestrowano sygnał od frakcji HMW, natomiast sygnał LMW spowodował wysycenie detektora ICP MS, a w konsekwencji wyznaczenie jego intensywności okazało się niemożliwe Podsumowanie Zastosowanie chromatografii wykluczania (SEC) w połączeniu ze spektrometrią mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej (ICP MS) umożliwiło analizę ekstraktów z nadziemnych części rośliny Plantago. Celem tego eksperymentu było wybranie medium pozwalającego na uzyskanie ekstraktu o największej różnorodności związków cynku i wysokiej intensywności sygnałów. Jednocześnie możliwe było określenie wpływ ph ekstrahenta na specjację cynku. Mimo że osiągnięto założony cel, to jednak wskazanie konkretnego sposobu ekstrakcji związków cynku z materiału roślinnego nie jest jednoznaczne. Zaobserwowano, że dla materiału ucieranego w ciekłym azocie rodzaj ekstrahenta ma istotny wpływ zarówno na wydajność ekstrakcji, jak i różnorodność ekstrahowanych związków cynku. Wykazano również wpływ ph ekstrahenta na specjację cynku; wraz ze wzrostem ph zwiększał się udział wielkocząsteczkowej frakcji w całkowitej puli związków cynku, natomiast malał udział frakcji związków o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a. Tylko w roztworach o ph 7,4 i 10,0 rejestrowano sygnał dla frakcji HMW, natomiast w przyapdku ph 4,1 zarejestrowano sygnał od frakcji związków cynku o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a. Dla ekstrahenta o ph = 5,5 zarejestruwano tylko sygnał od frakcji LMW. Na tym etapie badań zastanawiano się nad wpływem procesu chromatograficznego na równowagę chemiczną w badanym roztworze. W celu oceny tego wpływu przeprowadzono frakcjonowanie związków cynku z użyciem eluenta o ph 4,0. Otrzymano nieco inne wyniki. Różnice polegały na tym, że dla ekstraktów o ph 7,4 i 10,0 nie zarejestrowano sygnału od frakcji HMW. Jednocześnie obniżenie ph fazy ruchomej nie spowodowało pojawienia się sygnału od frakcji związków cynku o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a. Oznacza to, że prawdopodobnie zachodzi zmiana 75

76 specjacji już po nastrzyknięciu próbki na kolumnę, czego efektem jest brak sygnałów od frakcji HMW. W przypadku analizy ekstraktów otrzymanych przy użyciu ekstrakcji CO2 w stanie nadkrytycznym okazało się, że początkowe założenie by otrzymać próbki możliwie jak najbardziej stężone okazało się nie do końca właściwe. Możliwe jest, że duża zawartość związków niezawierających cynku, na które nieczuły jest detektor ICP MS powoduje przebicie złoża kolumny i zaburzenie retencji związków cynku. Efekt ten próbowano ograniczyć zmniejszając objętość dozowanej próbki ze 100 µl do 10 µl. Natomiast aby przeciwdziałać wysyceniu detektora ICP MS zaproponowano monitorowanie mniej rozpowszechnionego izotopu cynku 67 Zn. Gdy oba te sposoby zawiodły, ostatecznie spróbowano podać do kolumny próbkę rozcieńczoną fazą ruchomą. Żaden ze sposobów nie wyeliminował całkowicie niekorzystnego zjawiska, a jedynie je ograniczył. Otrzymano nieznaczną poprawę kształtu piku, ale ze cenę znacznego spadku jego intensywności. Założono, że ograniczenie wpływów matrycy będzie miało miejsce przy zastosowaniu kolejnego mechanizmu rozdzielenia chromatograficznego. Analizując chromatogram otrzymany dla ekstraktu CO2 w stanie nadkytycznym pod kątem jakościowym wstępnie zidentyfikowano te same frakcje, co w przypadku ekstraktów o ph 7,4 i 10,0, tj. frakcję HMW i LMW. Podkreślić należy, że dla ekstraktu CO2 w stanie nadkytycznym zawartość frakcji HMW w stosunku do frakcji LMW jest znacznie niższa, niż dla ekstraktów o ph 7,4, czy 10,0. Dla ekstraktów CO2 nie zarejestrowano sygnału od frakcji związków cynku o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a. 76

77 9.3 Chromatografia kationowymienna Warunki chromatograficzne W celu rozdzielenia związków cynku będących składnikami frakcji otrzymanych przy użyciu chromatografii wykluczania (SEC) zastosowano chromatografię kationowymienną. Optymalizacji poddano warunki rozdzielenia chromatograficznego, które podsumowano w tabeli 10. Tabela 10 Parametry rozdzielenia i detekcji związków cynku przy wykorzystaniu chromatografii kationowymiennej w połączeniu ze spektrometrią mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej. Kolumna Agilent Zorbax 300-SCX Szybkość przepływu fazy ruchomej 1,00 ml/min Typ elucji Gradientowa Skład fazy ruchomej 0-4 min 5 mm bufor octanowy, ph 6,0 4 7 min liniowy gradient po 7 min 100 mm bufor octanowy ph 4,7 Objętość próbki 100μl Detektor ICP MS Monitorowany izotop ⁶⁶Zn Ze względu na duże różnice w polarności rozdzielanych związków cynku zastosowano elucję gradientową, zwiększając moc elucyjną fazy ruchomej poprzez obniżenie ph i podwyższenie mocy jonowej. 77

78 9.3.2 Wyniki Po zoptymalizowaniu warunków rozdzielenia chromatograficznego zaproponowano dwa tryby pracy: - w trybie wykluczania-kationowymiennym każda frakcja rozdzielona przy użyciu SEC została zebrana do osobnego naczynia, a następnie wprowadzona na kolumnę kationowymienną, -w trybie kationowymiennym-wykluczania każda frakcja rozdzielona z użyciem chromatografii kationowymiennej była pojedynczo wprowadzana na kolumnę SEC. Przykładowe chromatogramy uzyskane w trybie wykluczania-kationowymiennym przedstawiono na rysunku 12. Oba tryby zostały zastosowane do dalszej oceny wpływu ph ekstrahenta na specjację cynku. Dla każdego w ektrahentów w zakresie ph od 4,1 do 10,0 przeprowadzono frakcjonowanie z użyciem SEC. Otrzymane frakcje zbierano do osobnych naczyń chromatograficznych, a następnie pojedynczo wprowadzano na kolumnę kationowymienną. Zestawienie chromatogramów otrzymanych w trybie wykluczania-kationowymiennym dla próbek o różnym ph przedstawiono na rysunku

79 Rysunek 12 Składniki ekstraktu frakcjonowano używając chromatografii wykluczania. Otrzymane frakcje (IC1 i IC2) zebrano do pojedynczych naczyń i sekwencyjnie analizowano z użyciem chromatografii kationowymiennej otrzymując chromatogramy IC1 i IC2. 79

80 Rysunek 13 Tryb wykluczania-kationowymienny zastosowany do ekstraktów w zakresie ph 4,1-10,0: a) chromatogram SEC dla ph 4,1, w drugim wymiarze otrzymano dwie frakcje LMW (i), oraz frakcję lekką, poniżej 1360 j.m.a. (e). b) chromatogram SEC dla ph 5,5, w drugim wymiarze otrzymano tylko frakcję LMW (f). c) chromatogram SEC dla ph 7,4. W drugim wymiarze otrzymano frakcję LMW (g) i HMW (j). d) chromatogram SEC dla ph 10,0. W drugim wymiarze otrzymano frakcję LMW (h) i HMW (k). 80

81 Analizując chromatogramy przedstawione na rysunku 13 należy zauważyć, że w przypadku ekstraktu o ph 4,1 zaobserwowano trzy sygnały. Dwa z nich stanowiły składniki frakcji LMW (i). Uzyskano również bardzo intensywny sygnał przy długim czasie retencji, pochodzący od związków cynku o masach cząsteczkowych poniżej 1360 j.m.a(e). Dla ekstraktu o ph 5,5 otrzymano dwa sygnały, pochodzące od składników frakcji LMW (f). Dla ekstraktów o ph 7,4 (c) i 10,0 (d) otrzymano po trzy sygnały: po jednym od frakcji wysokocząsteczkowej (j) i (k), oraz po dwa od składników frakcji LMW (g) i (h). Należy podkreślić, że w przypadku chromatografii kationowymiennej otrzymano intensywny sygnał przy czasie retencji około 850 sekund, niezależnie od ph ekstrahenta, którym przeprowadzano ekstrakcję. Pominięto to na rysunkach 12 i 13 w celu poprawy jego czytelności. Opisano w rozdziale (rysunek 14) Przypisanie sygnałów poszczególnym związkom cynku Dzięki zastosowaniu trybu wykluczania-kationowymiennym wykazano, że frakcja LMW składa się z co najmniej dwóch związków różniących się polarnością, stosując rozdzielenie z zastosowaniem chromatografii kationowymiennej otrzymano dwa sygnały o czasach retencji 145 s i 195 sekund. W przypadku HMW otrzymano jeden sygnał przy czasie retencji 115 sekund. W trybie kationowymiennym-wykluczania próbka ekstraktu roślinnego została najpierw poddana rozdzielaniu na kolumnie kationowymiennej, a następnie zebrane frakcje pojedynczo były rozdzielane na kolumnie SEC. W tym przypadku, frakcje te spełniały rolę wzorców. Otrzymano pełną zgodność czasów retencji w obu trybach. Na uwagę zasługuje fakt, że w przypadku IC frakcja związków cynku o masie cząsteczkowej mniejszej niż 1360 j.m.a. była obserwowana niezależnie od ph użytego ekstrahenta. Poniżej przedstawiono (Rysunek 10) sposób realizacji obu trybów. Jako przykład wybrano ekstrakt o ph 7,4. 81

82 Rysunek 14 Schemat rozdzielenia chromatograficznego w trybie wykluczania-kationowymiennym i kationowymiennym-wykluczania. 82

83 W trybie kationowymiennym-wykluczania cały ekstrakt poddano rozdzieleniu z zastosowaniem chromatografii kationowymiennej (chromatogram na górze rysunku). Poszczególne frakcje zebrano do pojedynczych naczyń i nastrzyknięto na kolumnę SE (chromatogramy SEC1, SEC2, SEC3 i SEC4). W trybie wykluczania-kationowymiennym cały ekstrakt poddano rozdzieleniu SEC (chromatogram na dole). Poszczególne frakcje zebrano do pojedynczych naczyń i nastrzyknięto na kolumnę IC (chromatogramy IC1 i IC2). W trybie wykluczania-kationowymiennym poszczególne frakcje (IC1 i IC2) rozdzielone z użyciem chromatografii wykluczania (chromatogram na dole rysunku) były zbierane do pojedynczych naczyń i osobno wprowadzano na kolumnę kationowymienną (chromatogramy po lewej stronie rysunku IC1 i IC2). Dla wielkocząsteczkowej frakcji IC1, dającej w SEC sygnał przy 380 sekund, otrzymano w chromatografii kationowymiennej jeden sygnał o czasie retencji 115 sekund, dla frakcji IC2 (czas retencji SEC 700 sekund) otrzymano w chromatografii kationowymiennej dwa sygnały o czasach retencji 150 i 200 sekund. W trybie kationowymiennym-wykluczania frakcje (SEC1, SEC2, SEC3, SEC4) otrzymane przy użyciu chromatografii kationowymiennej (chromatogram na górze rysunku), zebrano do pojedynczych naczyń. Następnie pojedynczo nastrzykiwano na kolumnę wykluczania (chromatogramy z prawej strony rysunku). Frakcja SEC1 zebrana przy 115 sekundach dała sygnał SEC przy 380 sekundach. Frakcje SEC2 i SEC3 (czas retencji w chromatografii kationowymiennej odpowiednio 150 i 200 sekund) dały sygnały przy czasie retencji SEC 700 sekund. Frakcja SEC4, zebrana przy czasie retencji około 860 sekund nie dała sygnału w chromatografii wykluczania. Otrzymano zatem pełną zgodność czasów retencji w obu trybach, co pozwoliło na przypisanie mas cząsteczkowych związkom rozdzielonym za pomocą chromatografii kationowymiennej. Przykładowy chromatogram przedstawiono na rysunku

84 Rysunek 15 Chromatogram SEC ekstraktu o ph 7,4; masay cząsteczkowe przypisane do poszczególnych sygnałów Podsumowanie Obecne w ekstraktach związki zawierające cynk były frakcjonowane ze względu na ich masę cząsteczkową (SEC), a następnie rozdzielane ze względu na różnicę w ich polarności (IC). Oba mechanizmy były stosowane w różnej sekwencji, co pozwoliło na zidentyfikowanie trzech frakcji zawierających związki cynku: Frakcja o masie cząsteczkowej poniżej j.m.a. Frakcja LMW o masie cząsteczkowej od do j.m.a. Frakcja HMW o masie około j.m.a. Składnikami frakcji o masie cząsteczkowej poniżej j.m.a. mogą być nieorganiczne związki cynku, takie jak: azotany (V), siarczany (VI) i (IV), chlorki, hydratowane jony cynku, a także połączenia cynku z popularnymi anionami kwasów organicznych, tj.: jabłczany, cytryniany, octany. W skład frakcji o masach cząsteczkowych od 3000 do 4000 j.m.a. mogą wchodzić fitochelatyny, peptydy i kompleksy cynku z nikotianaminą, a także kompleksy metali 84

85 z flawonoidami. Wykazano, że frakcja o masie cząsteczkowej około j.m.a. (LMW) zawiera przynajmniej dwa związki różniące się polarnością. Składnikami najcięższej frakcji mogą być duże białka, enzymy i duże kompleksy fitochelatyn [178]. Zaobserwowano, że tylko przy zastosowaniu ekstrahenta o odpowiednio niskim ph (4,1) frakcja związków cynku o masie cząsteczkowej < j.m.a. jest wymywana z kolumny SEC. Jednocześnie obniżenie ph ekstrahenta, lub fazy ruchomej do około 4,0 uniemożliwia rejestrację sygnału analitycznego od frakcji HMW (HMW). W przypadku chromatografii kationowymiennej, niezależnie od ph ekstrahenta pojawiał się intensywny sygnał od związków cynku o kationowym charakterze. Jest to frakcja związków cynku o masach atomowych poniżej 1360 j.m.a. 85

86 9.4 Chromatografia anionowymienna w połączeniu z chromatografią kationowymienną W dalszych badaniach w pierwszym wymiarze użyto chromatografii anionowymiennej, w celu frakcjonowania związków cynku. Następnie składniki otrzymanych frakcji rozdzielano z użyciem chromatografii kationowymiennej. W ten sposób dążono do porównania specjacji cynku w ekstraktach otrzymanych po ucieraniu świeżej rośliny w ciekłym azocie i po ekstrakcji nadkrytycznej. Poniżej przedstawiono porównanie dla ekstrahenta o ph 7,4 i CO2 w stanie nadkrytycznym. Do badań wybrano ekstrakt o ph 7,4 ze względu na stosunkowo dużą różnorodność form specjacyjnych cynku Warunki chromatograficzne Analiza ekstraktów liści babki lancetowatej przy użyciu chromatografii anionowymiennej pozwoliła na rozdzielenie związków obecnych w próbce na podstawie różnic w ich polarności. Zastosowanie jako detektora spektrometru mas z jonizacją w plazmie indukcyjnie sprzężonej pozwoliło monitorować czasy retencji związków zawierających cynk. Badano roztwór otrzymany przez ekstrakcję buforem TrisHCl o ph=7,4 po uprzednim homogenizowaniu tkanki roślinnej przez ucieranie w ciekłym azocie oraz próbkę otrzymaną w wyniku ekstrakcji dwutlenkiem węgla w stanie nadkrytycznym. W tabeli 11 podsumowano warunki rozdzielenia chromatograficznego i detekcji. 86

87 Tabela 11 Parametry rozdzielenia i detekcji związków cynku przy wykorzystaniu chromatografii jonowymiennej w połączeniu z ICP MS. Chromatografia anionowymienna (pierwszy wymiar) Chromatografia kationowymienna (drugi wymiar) Kolumna Hamilton PRP X100 Agilent Zorbax 300-SCX Typ elucji Gradientowa Izokratyczna Faza ruchoma 5mM octan sodu ph=6 0 4 min 5mM octan sodu ph=6 Liniowa zmiana składu fazy ruchomej 4 7 min 100mM bufor octanowy ph=4, min Szybkość 1,0 ml/min 1,0 ml/min przepływu fazy ruchomej Objętość 100μl 100μl próbki Detektor ICP MS ICP MS Monitorowany izotop ⁶⁶Zn ⁶⁶Zn Wyniki W trakcie analizy z zastosowaniem chromatografii anionowymiennej zostały zebrane następujące frakcje (rysunek 16 i 17): - frakcja AEC 1 była zbierana w przedziale od 360 sekund do 390 sekund, -frakcja AEC 2 w przedziale od 530 sekund do 585 sekund. Tak oznaczone frakcje zostały zebrane do osobnych naczyń chromatograficznych, a następnie poddane rozdzieleniu z wykorzystaniem chromatografii kationowymiennej w warunkach opisanych w tabeli

88 Zn Intensywnosc (zliczenia) Czas (s) Rysunek 16 Chromatografia anionowymienna. Chromatogram ekstraktu o ph = 7,4 otrzymany przy warunkach opisanych w tabeli 11. Frakcja AEC 1 o czasie retencji 370 sekund i AEC 2 o czasie retencji 570 sekund. 88

89 Zn Intensywnosc (zliczenia) Czas (s) Rysunek 17 Chromatografia anionowymienna. Chromatogram ekstraktu CO2 otrzymany przy warunkach opisanych w tabeli 11. Frakcja AEC 1 o czasie retencji 370 sekund i AEC 2 o czasie retencji 560 sekund. Analizując chromatogramy na rysunkach 16 i 17 należy zauważyć zgodność czasów retencji frakcji AEC1 i AEC2. Podkreślić natomiast należy zdecydowaną różnicę w intensywności sygnałów (w przypadku ekstraktu CO2 monitorowano izotop 67 Zn) Na rysunku 18 przedstawiono chromatogramy uzyskane przy analizie frakcji AEC1 i AEC2 z wykorzystaniem chromatografii kationowymiennej. 89

90 FRAKCJE AEC 1 FRAKCJE AEC CO CO Intensywnosc (zliczenia) ph = 7,4 ph = 7, Czas (s) Rysunek 18 Analiza z użyciem chromatografii kationowymiennej (drugi wymiar) frakcji zebranych po rozdzieleniu z użyciem chromatografii anionowymiennej (pierwszy wymiar). Analizując chromatogramy umieszczone na rysunku 1 należy zauważyć, że dla frakcji otrzymanych po rozdzieleniu ekstraktów CO2 w stanie nadkrytycznym otrzymano pięć sygnałów o czasach retencji odpowiednio, 115, 150, i 200 sekund. Dla ekstraktu o ph 7,4 trzy sygnały, przy czasach retencji 150, 184 i 200 sekund. W obu przypadkach widać wyraźne ogonowanie piku przy czasie retencji 200 sekund, co może świadczyć o tym, że zachodzi koelucja różnych związków prawdopodobnie zawierających cynku. 90

91 9.4.3 Podsumowanie Zastosowanie chromatografii anionowymiennej w pierwszym wymiarze umożliwiło zaobserwowanie większej liczby sygnałów, w porównaniu do trybu wykluczaniakationowymiennego. Oprócz związków o czasach retencji 115, 150 i 200 sekund, które obserwowano już wcześniej, zarejestrowano sygnały przy czasie retencji 175 i 184 sekundy. Należy zauważyć, że zmieniając mechanizm rozdzielenia chromatograficznego w poszczególnych wymiarach można szukać optymalnej dla danego zastosowania konfiguracji, a także zbierać komplementarne informacje o rozdzielanych związkach, co jest szczególnie istotne w sytuacji braku substancji wzorcowych. Związki o czasach retencji 150 sekund i 200 sekund (w chromatografii kationowymiennej) w trybie wykluczaniakationowymiennym znajdowały się w jednej frakcji. Ponieważ dawały one bardzo intensywne sygnały, uniemożliwiły tym samym obserwację mniej intensywnych sygnałów pochodzących od związków o czasach retencji 175 sekund i 184 sekund. W przypadku, gdy w pierwszym wymiarze zastosowano chromatografię anionowymienną, związki o czasach retencji 150 sekund i 200 sekund (w chromatografii kationowymiennej) od razu znalazły się w odrębnych frakcjach, przez co linia bazowa w zakresie czasów retencji od 170 sekund do 185 sekund umożliwiła obserwację dodatkowych sygnałów w tym zakresie. W kolejnym etapie badań spróbowano zastosować zaproponowany scenariusz analityczny do badania różnic w specjacji cynku pomiędzy częściami nadziemnymi i podziemnymi roślin Plantago, a także pomiędzy populacją hałdową i naturalną. 91

92 10 Porównanie specjacji cynku w dwóch populacjach rośliny Plantago lanceolata L Wprowadzenie Poznanie wytworzonych przez rośliny mechanizmów umożliwiających przetrwanie w nieprzyjaznych warunkach stanowi cel wielu badań. Bardzo dobrym przykładem organizmów przystosowanych do niekorzystnych warunków otoczenia są rośliny hałdowe, które nie tylko kumulują metale (np. cynk), ale także wykształciły mechanizmy chroniące je przed niekorzystnym wpływem otoczenia. Poznanie form, w jakich występują pierwiastki w poszczególnych częściach rośliny może być kluczowe w wyjaśnieniu procesów pozwalających roślinom hałdowym na wzrost w warunkach zanieczyszczenia metalami. Celem prowadzonych w ramach niniejszej pracy doktorskiej badań było poznanie form chemicznych cynku w tkankach roślin, a tym samym poznanie mechanizmów tolerancji roślin hałdowych (Plantago lanceolata L.) na metale (cynk), poprzez porównanie specjacji cynku w częściach nadziemnych i podziemnych dwóch populacjach rośliny Plantago lanceolata L.: hałdowej, tj. pochodzącej hałd pokopalnianych silnie zanieczyszczonych terenów południowej Polski oraz populacji naturalnej, pochodzącej z niezanieczyszczonych terenów środkowej Polski. W badaniach zastosowano opisany w poprzednim rozdziale scenariusz analityczny wykorzystujący chromatografię 2D w połączeniu z spektrometrią mas z jonizacją w plazmie sprzężonej indukcyjnie Wyniki Przygotowanie tkanek roślinnych Żywa roślina została podzielona na części nadziemne (pędy i liście) i podziemne (korzenie). Poszczególne części roślin podzielono na próbki o masie około 0,1 grama i zalano 92

93 ciekłym azotem. Następnie postępowano zgodnie z opisem przedstawionym w rozdziale Ekstrakcja z materiału po homogenizacji ciekłym azotem Porównanie specjacji cynku w częściach podziemnych obu populacji. Tryb wykluczania-kationowymienny został zastosowany w analizie specjacyjnej cynku w korzeniach obu populacji rośliny Plantago lanceolata L. Ze względu na bardzo małą masę pozyskanych korzeni konieczny był wybór tylko jednego ekstrahenta i jednego sposobu ekstrakcji. Biorąc pod uwagę to, że ekstrakcja z użyciem CO2 w stanie nadkrytycznym wymaga bardzo dużej masy próbki (około 150 gramów) i została odrzucona. W związku z tym zdecydowano się na ekstrakcję buforem Tris-HCl o ph 7,4 po homogenizacji próbki w ciekłym azocie. Poniżej (rysunek 19) przedstawiono chromatogramy dla ekstraktów korzeni obu populacji otrzymane przy użyciu chromatografii wykluczania haldowa Intensywnosc (zliczenia) naturalna Czas (s) Rysunek 19 Chromatogramy otrzymane podczas frakcjonowania związków cynku wyekstrahowanych z korzeni obu populacji rośliny Plantago. Ekstrahent: buforu Tris-HCl o ph 7,4. Ekstrakcję prowadzono po homogenizacji w ciekłym azocie. 93

94 Dla obu chromatogramów przedstawionych na rysunku 19 charakterystyczne jest pojawienie się rozmytych sygnałów przy czasie retencji od około 620 do 750 sekund Powodem tego może być koelucja przynajmniej dwóch związków, o zbliżonych masach cząsteczkowych, zawierających cynk. Należy zauważyć, że w przypadku populacji naturalnej intensywności obu składowych (o czasach retencji 650 i 700 sekund) sygnału są zbliżone, natomiast w przypadku korzeni populacji hałdowej dominuje składowa o krótszym czasie retencji (650 sekund). W przypadku korzeni nie zaobserwowano wielkocząsteczkowej frakcji związków zawierających cynk (którą obserwowano przypadku części nadziemnych), wymywającej się w tych warunkach chromatograficznych przy czasie retencji poniżej 400 sekund. Następnie porównano sygnały otrzymane w analogiczny sposób dla ekstraktów z części nadziemnych. Odpowiednie chromatogramy przedstawiono na rysunku haldowa Intensywnosc (zliczenia) naturalna Czas (s) Rysunek 20 Chromatogramy otrzymane przy frakcjonowaniu związków cynku wyekstrahowanych z liści obu populacji rośliny Plantago. Jako ekstrahenta użyto buforu Tris-HCl o ph 7,4. Ekstrakcję prowadzono po homogenizacji w ciekłym azocie. 94

95 Analizując chromatogramy przedstawione na rysunku 20 należy zauważyć dwie zasadnicze różnice pomiędzy chromatogramami otrzymanymi dla części nadziemnych i podziemnych. W przypadku części nadziemnych zarejestrowano sygnał odpowiadające wielkocząsteczkowej frakcji związków cynku (HMW). Porównując chromatogramy otrzymane dla korzeni i części nadziemnych należy zauważyć, że intensywność sygnał o czasie retencji 650 sekund uległa znacznemu obniżeniu. Odwrotna sytuacja ma miejsce dla sygnału przy czasie retencji 700, jego intensywność znacząco wzrasta w przypadku części nadziemnych. Frakcje uzyskane w wyniku rozdzielenia z użyciem chromatografii wykluczania zebrano do osobnych naczyń chromatograficznych i poddano analizie z zastosowaniem chromatografii kationowymiennej. Warunki chromatograficzne były takie, jak opisano w rozdziale Na rysunku 21 przedstawiono chromatogramy dla korzeni obu populacji otrzymane przy użyciu chromatografii kationowymiennej haldowa Intensywnosc (zliczenia) naturalna Czas (s) Rysunek 21 Chromatogramy otrzymane przy rozdzielaniu związków cynku wyekstrahowanych z korzeni obu populacji rośliny Plantago. Jako ekstrahenta użyto buforu Tris-HCl o ph 7,4. Ekstrakcję prowadzono po homogenizacji w ciekłym azocie. 95

96 Analizując chromatogramy przedstawione na rysunku 21 należy zauważyć przede wszystkim wysoką intensywność sygnału przy czasie retencji około 200 sekund dla ekstraktu populacji naturalnej, w porównaniu do tego sygnału w przypadku populacji hałdowej. Poniżej (rysunek 22) przedstawiono w powiększeniu fragment chromatogramu, gdzie występują mało intensywne sygnały od związków cynku. Celowo ujednolicono na nich skalę osi rzędnych haldowa Intensywnosc (zliczenia) naturalna Czas (s) Rysunek 22 Porównanie chromatogramów otrzymanych przy rozdzielaniu związków cynku wyekstrahowanych z korzeni obu populacji rośliny Plantago. Jako ekstrahenta użyto buforu Tris-HCl o ph 7,4. Ekstrakcję prowadzono po homogenizacji w ciekłym azocie. Analizując chromatogramy na rysunku 18 należy zauważyć dużą różnicę w intensywnościach sygnałów. Dla populacji hałdowej, oba sygnały przy czasie retencji około 150 i 200 mają podobną intensywność, natomiast w przypadku populacji naturalnej zdecydowanie dominuje sygnał przy czasie retencji około 200 sekund. Widoczny jest również słaby sygnał przy czasie retencji około 130 sekund, nierejestrowany do tej pory w żadnym 96

97 z analizowanych ekstraktów z części nadziemnych (opisywanych w poprzednim rozdziale). Tak, jak spodziewano się na podstawie wyników uzyskanych z użyciem chromatografii wykluczania, nie zarejestrowano sygnału od wielkocząsteczkowych związków cynku, które wymywają się przy czasie retencji około 115 sekund. Na chromatogramach na rysunku 22 przedstawiono tą część, w której zachodziły największe różnice w sygnałach (do 250 sekund) Kolejnym krokiem było porównanie sygnałów otrzymanych w analogiczny sposób dla ekstraktów z części nadziemnych. Odpowiednie chromatogramy przedstawiono na rysunku haldowa Intensywnosc (zliczenia) naturalna Czas (s) Rysunek 23 Porównanie chromatogramów otrzymanych przy frakcjonowaniu związków cynku wyekstrahowanych z liści obu populacji rośliny Plantago. Jako ekstrahenta użyto buforu Tris-HCl o ph 7,4. Ekstrakcję prowadzono po homogenizacji w ciekłym azocie. Analizując chromatogramy otrzymane dla części nadziemnych obu populacji należy stwierdzić, że są one bardzo podobne. Intensywności sygnałów od związków o czasach 97

98 retencji około 150 i 200 sekund są zbliżone, natomiast przeciwnie, niż w przypadku korzeni, intensywność sygnału przy czasie retencji 150 jest znacznie wyższa dla roślin populacji hałdowej. Zarówno w przypadku populacji hałdowej, jak i naturalnej można zaobserwować sygnał od wielkocząsteczkowej frakcji cynku, przy czasie retencji około 115 sekund. Obecność tej frakcji potwierdzono również przy użyciu chromatografii wykluczania Podsumowanie Wprawdzie chromatogramy otrzymane dla ekstraktów nadziemnych i podziemnych części rośliny Plantago lanceolata L. mają podobny przebieg, niemniej widoczne są istotne różnice zarówno pomiędzy populacjami, jak i pomiędzy częściami nadziemnymi i podziemnymi w każdej z populacji. Pierwszą różnicą, widoczną już na chromatogramach otrzymanych przy użyciu SEC jest brak wielkocząsteczkowej frakcji (HMW) w częściach podziemnych. Obserwację tą potwierdzają chromatogramy otrzymane dla części podziemnych za pomocą chromatografii kationowymiennej gdzie widoczne są trzy sygnały przy czasach retencji odpowiednio 150, 200 i 860 sekund. Dodatkowo, dla korzeni populacji naturalnej, zaobserwowano dodatkowy sygnał, przy czasie retencji około 130 sekund. Na podstawie danych uzyskanych za pomocą trybu wykluczania-kationowymiennego wykazano, że związek ten jest składnikiem frakcji LMW o masie od 3000 do 4000 j.m.a. Kolejna różnica pomiędzy chromatogramami dla korzeni obu populacji związana jest z różnymi wzajemnymi intensywnościami poszczególnych sygnałów. W przypadku populacji naturalnej pik przy czasie retencji 200 sekund zdecydowanie dominuje nad pikiem przy czasie retencji 150 sekund. Dla populacji hałdowej sygnał przy czasie retencji 200 sekund jest również bardziej intensywny, niż sygnał przy czasie retencji 150 sekund, natomiast różnica intensywności jest niewielka (rysunek 24). Biorąc pod uwagę znaczne różnice pomiędzy populacjami w intensywności sygnału przy czasie retencji 200 sekund można przypuszczać, że populacja hałdowa wykształciła mechanizm polegający na wykluczeniu tego związku, lub związków cynku z korzeni. Takiego mechanizmu nie wykształciła natomiast populacja naturalne, stąd wyższa zawartość tych związków w korzeniach roślin tej populacji. Wykres obrazujący względne intensywności poszczególnych sygnałów przedstawiono na rysunk 24. Pominięto sygnały przy czasie retencji 850 sekund, ze powodu ich bardzo dużej intensywność względem pozostałych sygnałów. 98

99 Rysunek 24 Znormalizowane intensywności sygnałów od poszczególnych form cynku dla ekstraktów z części podziemnych. Rysunek 25 Znormalizowane intensywności sygnałów od poszczególnych form cynku dla ekstraktów z części nadziemnych. Analizując chromatogramy otrzymane dla części nadziemnych, przede wszystkim należy zauważyć obecność frakcji wielkocząsteczkowej (HMW), dającej sygnał w SEC przy czasie retencji około 380 sekund i w chromatografii kationowymiennej 115 sekund. Chromatogramy zarejestrowane przy użyciu chromatografii wykluczania są niemal jednakowe dla obu populacji, różnice można natomiast zauważyć analizując chromatogramy uzyskane przy użyciu chromatografii kationowmiennej, ale ograniczają się one do różnic 99

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedra Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 4 i 5 OCENA EKOTOKSYCZNOŚCI TEORIA Chemia zanieczyszczeń środowiska

Bardziej szczegółowo

Zadanie 2. (1 pkt) Uzupełnij tabelę, wpisując wzory sumaryczne tlenków w odpowiednie kolumny. CrO CO 2 Fe 2 O 3 BaO SO 3 NO Cu 2 O

Zadanie 2. (1 pkt) Uzupełnij tabelę, wpisując wzory sumaryczne tlenków w odpowiednie kolumny. CrO CO 2 Fe 2 O 3 BaO SO 3 NO Cu 2 O Test maturalny Chemia ogólna i nieorganiczna Zadanie 1. (1 pkt) Uzupełnij zdania. Pierwiastek chemiczny o liczbie atomowej 16 znajduje się w.... grupie i. okresie układu okresowego pierwiastków chemicznych,

Bardziej szczegółowo

Substancje o Znaczeniu Biologicznym

Substancje o Znaczeniu Biologicznym Substancje o Znaczeniu Biologicznym Tłuszcze Jadalne są to tłuszcze, które może spożywać człowiek. Stanowią ważny, wysokoenergetyczny składnik diety. Z chemicznego punktu widzenia głównym składnikiem tłuszczów

Bardziej szczegółowo

STAN WŁAŚCIWOŚCI AGROCHEMICZNYCH GLEB I ZANIECZYSZCZEŃ METALAMI CIĘŻKIMI GRUNTÓW NA UŻYTKACH ROLNYCH STAROSTWA POWIATOWEGO RACIBÓRZ W GMINIE NĘDZA

STAN WŁAŚCIWOŚCI AGROCHEMICZNYCH GLEB I ZANIECZYSZCZEŃ METALAMI CIĘŻKIMI GRUNTÓW NA UŻYTKACH ROLNYCH STAROSTWA POWIATOWEGO RACIBÓRZ W GMINIE NĘDZA STAN WŁAŚCIWOŚCI AGROCHEMICZNYCH GLEB I ZANIECZYSZCZEŃ METALAMI CIĘŻKIMI GRUNTÓW NA UŻYTKACH ROLNYCH STAROSTWA POWIATOWEGO RACIBÓRZ W GMINIE NĘDZA Opracowanie wyników i sprawozdania z wykonanych badań

Bardziej szczegółowo

OFERTA TEMATÓW PROJEKTÓW DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ

OFERTA TEMATÓW PROJEKTÓW DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ OFERTA TEMATÓW PROJEKTÓW DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ Badania kinetyki utleniania wybranych grup związków organicznych podczas procesów oczyszczania

Bardziej szczegółowo

Nowoczesne metody analizy pierwiastków

Nowoczesne metody analizy pierwiastków Nowoczesne metody analizy pierwiastków Techniki analityczne Chromatograficzne Spektroskopowe Chromatografia jonowa Emisyjne Absorpcyjne Fluoroscencyjne Spektroskopia mas FAES ICP-AES AAS EDAX ICP-MS Prezentowane

Bardziej szczegółowo

Nr zad. Prawidłowe odpowiedzi Punktacja Uwagi

Nr zad. Prawidłowe odpowiedzi Punktacja Uwagi Nr zad. KLUCZ ODPOWIEDZI konkurs biologiczny ETAP SZKOLNY Max punktów 1. 3 pkt. A. Wpływ niedoboru pierwiastków/ N, P, K na wzrost/ rozwój tytoniu w kulturze wodnej. Prawidłowe odpowiedzi Punktacja Uwagi

Bardziej szczegółowo

Komórka - budowa i funkcje

Komórka - budowa i funkcje Komórka - budowa i funkcje Komórka - definicja Komórka to najmniejsza strukturalna i funkcjonalna jednostka organizmów żywych zdolna do przeprowadzania wszystkich podstawowych procesów życiowych (takich

Bardziej szczegółowo

Recenzja pracy doktorskiej: Badania ekstrakcji sekwencyjnej wybranych metali i ich mobilności w popiołach przemysłowych

Recenzja pracy doktorskiej: Badania ekstrakcji sekwencyjnej wybranych metali i ich mobilności w popiołach przemysłowych UNIWERSYTET MARII CURIE SKŁODOWSKIEJ, WYDZIAŁ CHEMII 20-031 Lublin, PL MC Skłodowskiej 2; e-mail: majdan.marek8@gmail.com tel.: 81 537 57 29 lub 81 537 57 65 Lublin 16.08.2013 Recenzja pracy doktorskiej:

Bardziej szczegółowo

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Czas trwania lekcji: 2x 45 minut Cele lekcji: 1. Ogólny zapoznanie

Bardziej szczegółowo

TEST Z CYTOLOGII GRUPA II

TEST Z CYTOLOGII GRUPA II TEST Z CYTOLOGII GRUPA II Zad. 1 (4p.) Rysunek przedstawia schemat budowy pewnej struktury komórkowej. a/ podaj jej nazwę i określ funkcję w komórce, b/ nazwij elementy oznaczone cyframi 2 i 5 oraz określ

Bardziej szczegółowo

Kierunek i poziom studiów: Biotechnologia, pierwszy Sylabus modułu: Chemia ogólna (1BT_05)

Kierunek i poziom studiów: Biotechnologia, pierwszy Sylabus modułu: Chemia ogólna (1BT_05) Uniwersytet Śląski w Katowicach str. 1 Kierunek i poziom studiów: Biotechnologia, pierwszy Sylabus modułu: Chemia ogólna (1BT_05) 1. Informacje ogólne koordynator modułu/wariantu rok akademicki 2014/2015

Bardziej szczegółowo

2.1. Charakterystyka badanego sorbentu oraz ekstrahentów

2.1. Charakterystyka badanego sorbentu oraz ekstrahentów BADANIA PROCESU SORPCJI JONÓW ZŁOTA(III), PLATYNY(IV) I PALLADU(II) Z ROZTWORÓW CHLORKOWYCH ORAZ MIESZANINY JONÓW NA SORBENCIE DOWEX OPTIPORE L493 IMPREGNOWANYM CYANEXEM 31 Grzegorz Wójcik, Zbigniew Hubicki,

Bardziej szczegółowo

CHEMIA klasa 1 Wymagania programowe na poszczególne oceny do Programu nauczania chemii w gimnazjum. Chemia Nowej Ery.

CHEMIA klasa 1 Wymagania programowe na poszczególne oceny do Programu nauczania chemii w gimnazjum. Chemia Nowej Ery. CHEMIA klasa 1 Wymagania programowe na poszczególne oceny do Programu nauczania chemii w gimnazjum. Chemia Nowej Ery. Dział - Substancje i ich przemiany WYMAGANIA PODSTAWOWE stosuje zasady bezpieczeństwa

Bardziej szczegółowo

Metody chemiczne w analizie biogeochemicznej środowiska. (Materiał pomocniczy do zajęć laboratoryjnych)

Metody chemiczne w analizie biogeochemicznej środowiska. (Materiał pomocniczy do zajęć laboratoryjnych) Metody chemiczne w analizie biogeochemicznej środowiska. (Materiał pomocniczy do zajęć laboratoryjnych) Metody instrumentalne podział ze względu na uzyskane informację. 1. Analiza struktury; XRD (dyfrakcja

Bardziej szczegółowo

ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 13 lipca 2010 r. w sprawie komunalnych osadów ściekowych. (Dz. U. z dnia 29 lipca 2010 r.

ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 13 lipca 2010 r. w sprawie komunalnych osadów ściekowych. (Dz. U. z dnia 29 lipca 2010 r. Dz.U.10.137.924 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 13 lipca 2010 r. 2), 3) w sprawie komunalnych osadów ściekowych (Dz. U. z dnia 29 lipca 2010 r.) Na podstawie art. 43 ust. 7 ustawy z dnia 27

Bardziej szczegółowo

HORT INTEGRA. Ogólnopolska Konferencja Integrowana Produkcja Roślin - Aspekty Praktyczne i Perspektywy, Kielce, 28 XI 2014

HORT INTEGRA. Ogólnopolska Konferencja Integrowana Produkcja Roślin - Aspekty Praktyczne i Perspektywy, Kielce, 28 XI 2014 HORT INTEGRA Ogólnopolska Konferencja Integrowana Produkcja Roślin - Aspekty Praktyczne i Perspektywy, Kielce, 28 XI 2014 Nawożenie integrowanych upraw sadowniczych prof. dr hab. Barbara Wiśniowska-Kielian

Bardziej szczegółowo

Zapytanie ofertowe nr 1/2014 ( dotyczy zamówienia badań )

Zapytanie ofertowe nr 1/2014 ( dotyczy zamówienia badań ) Zdrochem Sp. z o.o. Warszawa, 27 stycznia 2014 r. tel. +48 223900990, 609 019 283 fax. +48 223507490 info@zdrochem.pl www.zdrochem.pl I. ZAMAWIAJĄCY Zdrochem Sp. z o.o. NIP: 7010333468 REGON: 145983792

Bardziej szczegółowo

Cukry właściwości i funkcje

Cukry właściwości i funkcje Cukry właściwości i funkcje Miejsce cukrów wśród innych składników chemicznych Cukry Z cukrem mamy do czynienia bardzo często - kiedy sięgamy po białe kryształy z cukiernicy. Większość z nas nie uświadamia

Bardziej szczegółowo

Jakość plonu a równowaga składników pokarmowych w nawożeniu

Jakość plonu a równowaga składników pokarmowych w nawożeniu Jakość plonu a równowaga składników pokarmowych w nawożeniu Jan Łabętowicz, Wojciech Stępień 1. Względność pojęcia jakości plonu 2. Miejsce nawożenia w kształtowaniu jakości plonów 3. Azot jako główny

Bardziej szczegółowo

Chemia kryminalistyczna

Chemia kryminalistyczna Chemia kryminalistyczna Wykład 2 Metody fizykochemiczne 21.10.2014 Pytania i pomiary wykrycie obecności substancji wykazanie braku substancji identyfikacja substancji określenie stężenia substancji określenie

Bardziej szczegółowo

SILVIT. Składniki pokarmowe [g/l lub g/kg] K2O SO3 B Zn SiO2 Aminokwasy 100 25 1,25 0,25 150 +

SILVIT. Składniki pokarmowe [g/l lub g/kg] K2O SO3 B Zn SiO2 Aminokwasy 100 25 1,25 0,25 150 + SILVIT Biosytmulatory i antystresanty płynne. Preparat nawozowy o właściwościach stymulujących, zawiera aktywny krzem w pełni przyswajalny przez rośliny. Składniki pokarmowe [g/l lub g/kg] K2O SO3 B Zn

Bardziej szczegółowo

Ana n l a i l za z a i ns n tru r men e t n al a n l a

Ana n l a i l za z a i ns n tru r men e t n al a n l a Analiza instrumentalna rok akademicki 2014/2015 wykład: prof. dr hab. Ewa Bulska prof. dr hab. Agata Michalska Maksymiuk pracownia: dr Marcin Wojciechowski Slide 1 Analiza_Instrumentalna: 2014/2015 Analiza

Bardziej szczegółowo

Jak powstają nowe gatunki. Katarzyna Gontek

Jak powstają nowe gatunki. Katarzyna Gontek Jak powstają nowe gatunki Katarzyna Gontek Powstawanie gatunków (specjacja) to proces biologiczny, w wyniku którego powstają nowe gatunki organizmów. Zachodzi na skutek wytworzenia się bariery rozrodczej

Bardziej szczegółowo

Wymagania programowe na poszczególne oceny. Chemia Kl.1. I. Substancje chemiczne i ich przemiany

Wymagania programowe na poszczególne oceny. Chemia Kl.1. I. Substancje chemiczne i ich przemiany Wymagania programowe na poszczególne oceny Chemia Kl.1 I. Substancje chemiczne i ich przemiany Ocena dopuszczająca [1] zna zasady bhp obowiązujące w pracowni chemicznej nazywa sprzęt i szkło laboratoryjne

Bardziej szczegółowo

I. Biologia- nauka o życiu. Budowa komórki.

I. Biologia- nauka o życiu. Budowa komórki. I. Biologia- nauka o życiu. Budowa komórki. Zaznacz prawidłową definicję komórki. A. jednostka budulcowa tylko bakterii i pierwotniaków B. podstawowa jednostka budulcowa i funkcjonalna wszystkich organizmów

Bardziej szczegółowo

Równowaga kwasowo-zasadowa. Zakład Chemii Medycznej PUM

Równowaga kwasowo-zasadowa. Zakład Chemii Medycznej PUM Równowaga kwasowozasadowa Zakład Chemii Medycznej PUM Teorie kwasów i zasad Teoria dysocjacji elektrolitycznej Arheniusa: podczas rozpuszczania w wodzie wodzie kwas: dysocjuje z odszczepieniem kationu

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS

OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS OZNACZANIE ŻELAZA METODĄ SPEKTROFOTOMETRII UV/VIS Zagadnienia teoretyczne. Spektrofotometria jest techniką instrumentalną, w której do celów analitycznych wykorzystuje się przejścia energetyczne zachodzące

Bardziej szczegółowo

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab CZĄSTECZKA I RÓWNANIE REKCJI CHEMICZNEJ potrafi powiedzieć co to jest: wiązanie chemiczne, wiązanie jonowe, wiązanie

Bardziej szczegółowo

BIOTECHNOLOGIA W KOSMETOLOGII SŁAWOMIR WIERZBA

BIOTECHNOLOGIA W KOSMETOLOGII SŁAWOMIR WIERZBA BIOTECHNOLOGIA W KOSMETOLOGII SŁAWOMIR WIERZBA TREŚĆ WYKŁADÓW Budowa i biologia skóry. Typy skóry. Funkcje skóry. Układ odpornościowy skóry. Starzenie się skóry. Przenikanie przez skórę. Absorpcja skórna.

Bardziej szczegółowo

O/100 g gleby na rok, czyli około 60 kg K 2

O/100 g gleby na rok, czyli około 60 kg K 2 POTAS niezbędny składnik pokarmowy rzepaku kształtujący wielkość i jakość plonu Potas w glebach Całkowita zawartość potasu w glebach wynosi od 0,1 do 3 % i z reguły jest tym niższa, im gleba jest lżejsza.

Bardziej szczegółowo

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13

1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 Spis treści Przedmowa 11 1. Biotechnologia i inżynieria genetyczna zagadnienia wstępne 13 1.1. Wprowadzenie 13 1.2. Biotechnologia żywności znaczenie gospodarcze i społeczne 13 1.3. Produkty modyfikowane

Bardziej szczegółowo

Biznes Mixer w ramach Forum Inicjowania Rozwoju 2014

Biznes Mixer w ramach Forum Inicjowania Rozwoju 2014 Biznes Mixer w ramach Forum Inicjowania Rozwoju 2014 Oferta rozwiązań naukowych dla biznesu i innych partnerów InnoDoktorant, VI edycja Magdalena Śliwińska prof. dr hab. inż. Waldemar Wardencki dr. inż.

Bardziej szczegółowo

INFORMACJE O ZASTOSOWANYCH PREPARATACH NOURIVIT I NOURIVIT PLUS

INFORMACJE O ZASTOSOWANYCH PREPARATACH NOURIVIT I NOURIVIT PLUS 1 INFORMACJE O ZASTOSOWANYCH PREPARATACH NOURIVIT I NOURIVIT PLUS Nourivit jest produkowany w kilku etapach z naturalnych składników mineralnych w kontrolowanym procesie kruszenia i sortowania bez użycia

Bardziej szczegółowo

Metody poprawy jakości nasion buraka cukrowego

Metody poprawy jakości nasion buraka cukrowego Metody poprawy jakości nasion buraka cukrowego Podlaski Sławomir Jubileusz 90-lecia urodzin Prof. dr hab. B. Geja i 90-lecia powstania Katedry Fizjologii Roślin Budowa handlowego nasienia buraka cukrowego

Bardziej szczegółowo

POWTÓRZENIE TREŚCI NAUCZANIA Z BIOLOGII KLASY III ROZPISKA POWTÓRZEŃ ROK 2007/2008 Klasa I Treści programowe Dział powtórzeniowy Przewidziana data

POWTÓRZENIE TREŚCI NAUCZANIA Z BIOLOGII KLASY III ROZPISKA POWTÓRZEŃ ROK 2007/2008 Klasa I Treści programowe Dział powtórzeniowy Przewidziana data POWTÓRZENIE TREŚCI NAUCZANIA Z BIOLOGII KLASY III ROZPISKA POWTÓRZEŃ ROK 2007/2008 Klasa I Treści programowe Dział powtórzeniowy Przewidziana data 1. Struktura organizmu i funkcje, jakim ona służy ( komórki,

Bardziej szczegółowo

Ostateczna postać długotrwałych zmian w określonych warunkach klimatyczno-geologicznych to:

Ostateczna postać długotrwałych zmian w określonych warunkach klimatyczno-geologicznych to: WYDZIAŁ: GEOLOGII, GEOFIZYKI I OCHRONY ŚRODOWISKA KIERUNEK STUDIÓW: OCHRONA ŚRODOWISKA RODZAJ STUDIÓW: STACJONARNE I STOPNIA ROK AKADEMICKI 2014/2015 WYKAZ PRZEDMIOTÓW EGZAMINACYJNYCH: I. Ekologia II.

Bardziej szczegółowo

Metale i niemetale. Krystyna Sitko

Metale i niemetale. Krystyna Sitko Metale i niemetale Krystyna Sitko Substancje proste czyli pierwiastki dzielimy na : metale np. złoto niemetale np. fosfor półmetale np. krzem Spośród 115 znanych obecnie pierwiastków aż 91 stanowią metale

Bardziej szczegółowo

WYBRANE SKŁADNIKI POKARMOWE A GENY

WYBRANE SKŁADNIKI POKARMOWE A GENY WYBRANE SKŁADNIKI POKARMOWE A GENY d r i n ż. Magdalena Górnicka Zakład Oceny Żywienia Katedra Żywienia Człowieka WitaminyA, E i C oraz karotenoidy Selen Flawonoidy AKRYLOAMID Powstaje podczas przetwarzania

Bardziej szczegółowo

METODY CHEMOMETRYCZNE W IDENTYFIKACJI ŹRÓDEŁ POCHODZENIA

METODY CHEMOMETRYCZNE W IDENTYFIKACJI ŹRÓDEŁ POCHODZENIA METODY CHEMOMETRYCZNE W IDENTYFIKACJI ŹRÓDEŁ POCHODZENIA AMFETAMINY Waldemar S. Krawczyk Centralne Laboratorium Kryminalistyczne Komendy Głównej Policji, Warszawa (praca obroniona na Wydziale Chemii Uniwersytetu

Bardziej szczegółowo

Źródła błędów i ich eliminacja w technice ICP.

Źródła błędów i ich eliminacja w technice ICP. Źródła błędów i ich eliminacja w technice ICP. Irena Jaroń Centralne Laboratorium Chemiczne Państwowy Instytut Geologiczny, Rakowiecka 4, 05-975 Warszawa Atomowa spektrometria emisyjna ze wzbudzeniem w

Bardziej szczegółowo

V KONKURS CHEMICZNY 23.X. 2007r. DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW WOJEWÓDZTWA ŚWIĘTOKRZYSKIEGO Etap I ... ... czas trwania: 90 min Nazwa szkoły

V KONKURS CHEMICZNY 23.X. 2007r. DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW WOJEWÓDZTWA ŚWIĘTOKRZYSKIEGO Etap I ... ... czas trwania: 90 min Nazwa szkoły V KONKURS CHEMICZNY 23.X. 2007r. DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW WOJEWÓDZTWA ŚWIĘTOKRZYSKIEGO Etap I...... Imię i nazwisko ucznia ilość pkt.... czas trwania: 90 min Nazwa szkoły... maksymalna ilość punk. 33 Imię

Bardziej szczegółowo

ARKUSZ 1 POWTÓRZENIE DO EGZAMINU Z CHEMII

ARKUSZ 1 POWTÓRZENIE DO EGZAMINU Z CHEMII ARKUSZ 1 POWTÓRZENIE DO EGZAMINU Z CHEMII Zadanie 1. Na rysunku przedstawiono fragment układu okresowego pierwiastków. Dokoocz zdania tak aby były prawdziwe. Wiązanie jonowe występuje w związku chemicznym

Bardziej szczegółowo

Typy pustyń: 1. Kamienista (wsch. Tien-Szan) 2. Żwirowa (Mongolska) 3. Piaszczysta (pn. Sahara) 4. Pylasta (Szatt al- Dżarid) (1) (2) (3) (4)

Typy pustyń: 1. Kamienista (wsch. Tien-Szan) 2. Żwirowa (Mongolska) 3. Piaszczysta (pn. Sahara) 4. Pylasta (Szatt al- Dżarid) (1) (2) (3) (4) Pustynia teren o znacznej powierzchni, pozbawiony zwartej szaty roślinnej wskutek małej ilości opadów i przynajmniej okresowo wysokich temperatur powietrza, co sprawia, że parowanie przewyższa ilość opadów.

Bardziej szczegółowo

Warszawa, dnia 25 lutego 2015 r. Poz. 257 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 6 lutego 2015 r. w sprawie komunalnych osadów ściekowych

Warszawa, dnia 25 lutego 2015 r. Poz. 257 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 6 lutego 2015 r. w sprawie komunalnych osadów ściekowych DZIENNIK USTAW RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ Warszawa, dnia 25 lutego 2015 r. Poz. 257 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA ŚRODOWISKA 1) z dnia 6 lutego 2015 r. 2), 3) w sprawie komunalnych osadów ściekowych Na podstawie

Bardziej szczegółowo

Zastosowanie materiałów odniesienia

Zastosowanie materiałów odniesienia STOSOWANIE MATERIAŁÓW ODNIESIENIA W PRAKTYCE LABORATORYJNEJ 1 Piotr KONIECZKA Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. G. Narutowicza 11/1 80-33 GDAŃSK e-mail:piotr.konieczka@pg.gda.pl

Bardziej szczegółowo

Test diagnostyczny. Dorota Lewandowska, Lidia Wasyłyszyn, Anna Warchoł. Część A (0 5) Standard I

Test diagnostyczny. Dorota Lewandowska, Lidia Wasyłyszyn, Anna Warchoł. Część A (0 5) Standard I strona 1/9 Test diagnostyczny Dorota Lewandowska, Lidia Wasyłyszyn, Anna Warchoł Część A (0 5) Standard I 1. Przemianą chemiczną nie jest: A. mętnienie wody wapiennej B. odbarwianie wody bromowej C. dekantacja

Bardziej szczegółowo

Klucz odpowiedzi i kryteria oceniania etap szkolny 2014/2015 Biologia

Klucz odpowiedzi i kryteria oceniania etap szkolny 2014/2015 Biologia Klucz i kryteria oceniania etap szkolny 2014/2015 Biologia 1. Litera Nazwa sposobu ułożenia liści na Przykład rośliny łodydze A naprzeciwległe jasnota/ fuksja B skrętolegle krwawnik/ trzykrotka C okółkowe

Bardziej szczegółowo

Wykaz metod badawczych stosowanych w Pracowni w Szczecinie:

Wykaz metod badawczych stosowanych w Pracowni w Szczecinie: Wykaz metod badawczych stosowanych w Pracowni w Szczecinie: L.p. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 Badane obiekty/ grupy obiektów Środki Ŝywienia zwierząt Badane cechy i metody badawcze Zawartość białka

Bardziej szczegółowo

Streszczenie projektu badawczego

Streszczenie projektu badawczego Streszczenie projektu badawczego Dotyczy umowy nr 2014.030/40/BP/DWM Określenie wartości predykcyjnej całkowitej masy hemoglobiny w ocenie wydolności fizycznej zawodników dyscyplin wytrzymałościowych Wprowadzenie

Bardziej szczegółowo

TYPY REAKCJI CHEMICZNYCH

TYPY REAKCJI CHEMICZNYCH 1 REAKCJA CHEMICZNA: TYPY REAKCJI CHEMICZNYCH REAKCJĄ CHEMICZNĄ NAZYWAMY PROCES, W WYNIKU KTÓREGO Z JEDNYCH SUBSTANCJI POWSTAJĄ NOWE (PRODUKTY) O INNYCH WŁAŚCIWOŚCIACH NIŻ SUBSTANCJE WYJŚCIOWE (SUBSTRATY)

Bardziej szczegółowo

KLUCZ ODPOWIEDZI I PUNKTACJA ARKUSZ I CZĘŚĆ I ZADANIA ZAMKNIĘTE

KLUCZ ODPOWIEDZI I PUNKTACJA ARKUSZ I CZĘŚĆ I ZADANIA ZAMKNIĘTE KLUCZ ODPOWIEDZI I PUNKTACJA ARKUSZ I CZĘŚĆ I ZADANIA ZAMKNIĘTE Nr zadania Poprawne odpowiedzi Liczba punktów Nr zadania Poprawne odpowiedzi Liczba punktów D 0-4 A 0-2 C 0-5 B 0-3 D 0-6 B 0-4 C 0-7 C 0-5

Bardziej szczegółowo

Zadania na listopad. Zadanie 1 Meksyk położony jest od Buenos Aires na A. północny wschód B. południowy wschód C. północny zachód D.

Zadania na listopad. Zadanie 1 Meksyk położony jest od Buenos Aires na A. północny wschód B. południowy wschód C. północny zachód D. Zadania na listopad Zadania z geografii Meksyk położony jest od Buenos Aires na A. północny wschód B. południowy wschód C. północny zachód D. południowy zachód Zadanie 2 Jeżeli w Lagos jest godzina 12.00

Bardziej szczegółowo

Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO)

Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO) Rośliny modyfikowane genetycznie (GMO) Organizmy modyfikowane genetycznie Organizm zmodyfikowany genetycznie (międzynarodowy skrót: GMO Genetically Modified Organizm) to organizm o zmienionych cechach,

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Aparatura

Spis treści. Aparatura Spis treści Aparatura I. Podstawowe wyposażenie laboratoryjne... 13 I.I. Probówki i naczynia laboratoryjne... 13 I.II. Pipety... 17 I.II.I. Rodzaje pipet automatycznych... 17 I.II.II. Techniki pipetowania...

Bardziej szczegółowo

2. Metody, których podstawą są widma atomowe 32

2. Metody, których podstawą są widma atomowe 32 Spis treści 5 Spis treści Przedmowa do wydania czwartego 11 Przedmowa do wydania trzeciego 13 1. Wiadomości ogólne z metod spektroskopowych 15 1.1. Podstawowe wielkości metod spektroskopowych 15 1.2. Rola

Bardziej szczegółowo

1. WSTĘP... 3 2. METODYKA BADAŃ... 3. 2.1. Miejsca i sposób pobierania próbek wody z akwenów portowych... 3. 2.2. Metody analityczne...

1. WSTĘP... 3 2. METODYKA BADAŃ... 3. 2.1. Miejsca i sposób pobierania próbek wody z akwenów portowych... 3. 2.2. Metody analityczne... SPIS TREŚCI 1. WSTĘP... 3 2. METODYKA BADAŃ... 3 2.1. Miejsca i sposób pobierania próbek wody z akwenów portowych... 3 2.2. Metody analityczne... 6 3. WYNIKI BADAŃ... 6 4. WNIOSKI... 12 SPIS TABEL 1. Współrzędne

Bardziej szczegółowo

Laboratorium Ochrony Środowiska

Laboratorium Ochrony Środowiska ALWERNIA S. A. ul. K. Olszewskiego 25 32-566 Alwernia OFERTA LABORATORIUM Nasze laboratorium funkcjonuje w ramach firmy Alwernia S.A. Jesteśmy dostawcą usług badawczych w zakresie pomiarów czynników szkodliwych

Bardziej szczegółowo

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 883

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 883 ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 883 wydany przez POLSKIE CENTRUM AKREDYTACJI 01-382 Warszawa, ul. Szczotkarska 42 Wydanie nr 13 Data wydania: 13 stycznia 2016 r. Nazwa i adres AB 883 ENEA

Bardziej szczegółowo

KARTA KURSU. Kod Punktacja ECTS* 2

KARTA KURSU. Kod Punktacja ECTS* 2 KARTA KURSU Nazwa Nazwa w j. ang. BIOCHEMIA BIOCHEMISTRY Kod Punktacja ECTS* 2 Koordynator Prof. dr hab. Maria Filek Zespół dydaktyczny dr Anna Barbasz dr Elżbieta Rudolphi-Skórska dr Apolonia Sieprawska

Bardziej szczegółowo

niezbędny składnik pokarmowy zbóż

niezbędny składnik pokarmowy zbóż POTAS niezbędny składnik pokarmowy zbóż kształtujący wielkość i jakość plonu ziarna Dostępność glebowych zasobów potasu dla roślin zbożowych Gleby zawierają duże zasoby potasu (K), nawet do 50 t/ha w warstwie

Bardziej szczegółowo

Profil metaboliczny róŝnych organów ciała

Profil metaboliczny róŝnych organów ciała Profil metaboliczny róŝnych organów ciała Uwaga: tkanka tłuszczowa (adipose tissue) NIE wykorzystuje glicerolu do biosyntezy triacylogliceroli Endo-, para-, i autokrynna droga przekazu informacji biologicznej.

Bardziej szczegółowo

Zadania maturalne z biologii - 3

Zadania maturalne z biologii - 3 Koło Biologiczne Liceum Ogólnokształcące nr II w Gliwicach 2015-2016 Zadania maturalne z biologii - 3 Zadania: Zad. 1(Wiktoria Wnuk, Weronika Żak, Tomasz Gojowy 2D) Na podstawie wykresu odpowiedz na pytania.

Bardziej szczegółowo

1.8. Funkcje biologiczne wody wynikają z jej właściwości fizycznych i chemicznych. Oceń

1.8. Funkcje biologiczne wody wynikają z jej właściwości fizycznych i chemicznych. Oceń 1 1.8. Funkcje biologiczne wody wynikają z jej właściwości fizycznych i chemicznych. Oceń każdą podaną w tabeli informację, wybierając Prawdę, jeśli jest ona prawdziwa, lub, jeśli jest fałszywa. 1) Ilość

Bardziej szczegółowo

Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej 1. Jak wpłynie 50% dodatek MeOH do wody na retencję kwasu propionowego w układzie faz odwróconych? 2. Jaka jest kolejność retencji kwasów mrówkowego, octowego

Bardziej szczegółowo

Poprawa odporności roślin na stres biotyczny poprzez właściwe odżywienie w bieżącej fazie rozwojowej

Poprawa odporności roślin na stres biotyczny poprzez właściwe odżywienie w bieżącej fazie rozwojowej Poprawa odporności roślin na stres biotyczny poprzez właściwe odżywienie w bieżącej fazie rozwojowej Optymalne odżywienie roślin jest jednym z podstawowych czynników decydujących o prawidłowej odporności

Bardziej szczegółowo

Dz.U. 199 Nr 72 poz. 813

Dz.U. 199 Nr 72 poz. 813 Kancelaria Sejmu s. 1/1 Dz.U. 199 Nr 72 poz. 813 ROZPORZĄDZENIE MINISTRA OCHRONY ŚRODOWISKA, ZASOBÓW NATURALNYCH I LEŚNICTWA z dnia 11 sierpnia 1999 r. w sprawie warunków, jakie muszą być spełnione przy

Bardziej szczegółowo

Zapisz równanie zachodzącej reakcji. Wskaż pierwiastki, związki chemiczne, substraty i produkty reakcji.

Zapisz równanie zachodzącej reakcji. Wskaż pierwiastki, związki chemiczne, substraty i produkty reakcji. test nr 2 Termin zaliczenia zadań: IIIa - 29 października 2015 III b - 28 października 2015 zad.1 Reakcja rozkładu tlenku rtęci(ii) 1. Narysuj schemat doświadczenia, sporządź spis użytych odczynników,

Bardziej szczegółowo

Wymagania na poszczególne oceny z chemii w klasie III VII. Węgiel i jego związki z wodorem

Wymagania na poszczególne oceny z chemii w klasie III VII. Węgiel i jego związki z wodorem Wymagania na poszczególne oceny z chemii w klasie III VII. Węgiel i jego związki z wodorem 1 Uczeń: wyjaśnia, czym zajmuje się chemiaorganiczna (2) definiuje pojęcie węglowodory (2) wymienia naturalne

Bardziej szczegółowo

ph roztworu (prawie) się nie zmieniło. Zawiesina soi ma ph obojętne (lekko kwaśne). Zapach nie zmienił się.

ph roztworu (prawie) się nie zmieniło. Zawiesina soi ma ph obojętne (lekko kwaśne). Zapach nie zmienił się. Ureaza - dodatek krajowy 1. Odniesienie do podstawy programowej (starej) Kształcenie w zakresie podstawowym Odżywianie się człowieka - budowa i funkcja układu pokarmowego, główne składniki pokarmowe i

Bardziej szczegółowo

Relacje człowiek środowisko przyrodnicze

Relacje człowiek środowisko przyrodnicze 138 SPRAWDZIANY LEKCJI Sprawdzian z działu Relacje człowiek środowisko przyrodnicze Grupa I Zadanie 1 (0 4 p.) Każdemu terminowi przyporządkuj odpowiadającą mu definicję. 1. Zasoby przyrody A. Zasoby mające

Bardziej szczegółowo

WYSOKOŚĆ OPŁAT POBIERANYCH ZA ZADANIA WYKONYWANE PRZEZ OKRĘGOWE STACJE CHEMICZNO-ROLNICZE

WYSOKOŚĆ OPŁAT POBIERANYCH ZA ZADANIA WYKONYWANE PRZEZ OKRĘGOWE STACJE CHEMICZNO-ROLNICZE WYSOKOŚĆ OPŁAT POBIERANYCH ZA ZADANIA WYKONYWANE PRZEZ OKRĘGOWE STACJE CHEMICZNO-ROLNICZE Lp. Nazwa zadania Jednostka Kwota w zł I. Analizy fizyczne, fizykochemiczne i chemiczne gleb mineralnych oraz organicznych

Bardziej szczegółowo

WSPÓŁCZESNE TECHNIKI ZAMRAŻANIA

WSPÓŁCZESNE TECHNIKI ZAMRAŻANIA WSPÓŁCZESNE TECHNIKI ZAMRAŻANIA Temat: Denaturacja białek oraz przemiany tłuszczów i węglowodorów, jako typowe przemiany chemiczne i biochemiczne zachodzące w żywności mrożonej. Łukasz Tryc SUChiKL Sem.

Bardziej szczegółowo

Projekty realizowane w ramach Programu Operacyjnego Rozwój j Polski Wschodniej

Projekty realizowane w ramach Programu Operacyjnego Rozwój j Polski Wschodniej Projekty realizowane w ramach Programu Operacyjnego Rozwój j Polski Wschodniej dr inż. Cezary Możeński prof. nadzw. Projekty PO RPW Wyposażenie Laboratorium Wysokich Ciśnień w nowoczesną infrastrukturę

Bardziej szczegółowo

Toksykologia SYLABUS A. Informacje ogólne

Toksykologia SYLABUS A. Informacje ogólne Toksykologia SYLABUS A. Informacje ogólne Elementy sylabusu Nazwa jednostki prowadzącej kierunek Nazwa kierunku studiów Poziom kształcenia Profil studiów Forma studiów Kod przedmiotu Język przedmiotu Rodzaj

Bardziej szczegółowo

TMT 15. Ekologiczne oddzielanie metali ciężkich od ścieków

TMT 15. Ekologiczne oddzielanie metali ciężkich od ścieków TMT 15 Ekologiczne oddzielanie metali ciężkich od ścieków TMT 15 Ekologiczne oddzielanie metali ciężkich od ścieków Problem: Metale ciężkie zawarte w ściekach Rozwiązniem problemu jest: Strącanie za pomocą

Bardziej szczegółowo

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego

Przykładowe zadania. przygotowujące do egzaminu maturalnego Przykładowe zadania z BIOLOGii przygotowujące do egzaminu maturalnego Prezentowane zadania są zgodne z podstawą programową kształcenia ogólnego w zakresie rozszerzonym i podstawowym. Prócz zadań, które

Bardziej szczegółowo

TAF TEMPERATURE ADAPTED FEEDS. - Odpowiednia pasza na daną porę roku TEMPERATURE ADAPTED FEEDS TM

TAF TEMPERATURE ADAPTED FEEDS. - Odpowiednia pasza na daną porę roku TEMPERATURE ADAPTED FEEDS TM TEMPERATURE ADAPTED FEEDS - Odpowiednia pasza na daną porę roku TEMPERATURE ADAPTED FEEDS - Odpowiednia pasza na daną porę roku Ryby to organizmy zmiennocieplne. Temperatura środowiska wpływa na pobieranie

Bardziej szczegółowo

Zadanie 2. Przeprowadzono następujące doświadczenie: Wyjaśnij przebieg tego doświadczenia. Zadanie: 3. Zadanie: 4

Zadanie 2. Przeprowadzono następujące doświadczenie: Wyjaśnij przebieg tego doświadczenia. Zadanie: 3. Zadanie: 4 Zadanie: 1 Do niebieskiego, wodnego roztworu soli miedzi wrzucono żelazny gwóźdź i odstawiono na pewien czas. Opisz zmiany zachodzące w wyglądzie: roztworu żelaznego gwoździa Zadanie 2. Przeprowadzono

Bardziej szczegółowo

Księgarnia PWN: Renata Bednarek, Helena Dziadowiec, Urszula Pokojska, Zbigniew Prusinkiewicz Badania ekologiczno-gleboznawcze

Księgarnia PWN: Renata Bednarek, Helena Dziadowiec, Urszula Pokojska, Zbigniew Prusinkiewicz Badania ekologiczno-gleboznawcze Księgarnia PWN: Renata Bednarek, Helena Dziadowiec, Urszula Pokojska, Zbigniew Prusinkiewicz Badania ekologiczno-gleboznawcze CZĘŚĆ PIERWSZA Podstawowe wiadomości o glebach. Gleby i procesy glebotwórcze

Bardziej szczegółowo

Roślinne kultury tkankowe in vitro hodowla roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w sterylnych warunkach.

Roślinne kultury tkankowe in vitro hodowla roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w sterylnych warunkach. Roślinne kultury tkankowe in vitro hodowla roślin, części roślin, tkanek lub pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w sterylnych warunkach. TOTIPOTENCJA Zdolności do odtworzenia poszczególnych organów,

Bardziej szczegółowo

Mineralne stymulatory w ogrodnictwie

Mineralne stymulatory w ogrodnictwie Mineralne stymulatory w ogrodnictwie W ogrodnictwie w ostatnich latach rośnie zainteresowanie różnego rodzaju preparatami mającymi korzystny wpływ na kondycję roślin zwłaszcza w stresowych warunkach uprawy

Bardziej szczegółowo

Wymagania edukacyjne z chemii dla klasy drugiej

Wymagania edukacyjne z chemii dla klasy drugiej Na ocenę dopuszczającą uczeń: Wymagania edukacyjne z chemii dla klasy drugiej odczytuje wartościowość pierwiastka z układu okresowego pierwiastków chemicznych; nazywa tlenki zapisane za pomocą wzoru sumarycznego;

Bardziej szczegółowo

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 888

ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 888 ZAKRES AKREDYTACJI LABORATORIUM BADAWCZEGO Nr AB 888 wydany przez POLSKIE CENTRUM AKREDYTACJI 01-382 Warszawa, ul. Szczotkarska 42 Wydanie nr 8 Data wydania: 27 marca 2014 r. Nazwa i adres: AB 888 ZAKŁAD

Bardziej szczegółowo

1. Od czego i w jaki sposób zależy szybkość reakcji chemicznej?

1. Od czego i w jaki sposób zależy szybkość reakcji chemicznej? Tematy opisowe 1. Od czego i w jaki sposób zależy szybkość reakcji chemicznej? 2. Omów pomiar potencjału na granicy faz elektroda/roztwór elektrolitu. Podaj przykład, omów skale potencjału i elektrody

Bardziej szczegółowo

Opłaty za przekroczenie warunków wprowadzania ścieków przemysłowych do urządzeń kanalizacyjnych

Opłaty za przekroczenie warunków wprowadzania ścieków przemysłowych do urządzeń kanalizacyjnych Opłaty za przekroczenie warunków wprowadzania ścieków przemysłowych do urządzeń kanalizacyjnych Podstawa prawna: 1. Rozporządzenie Ministra Budownictwa z dnia 28 czerwca 2006 roku w sprawie określenia

Bardziej szczegółowo

EKOLOGISTYKA Z A J Ę C I A 2 M G R I N Ż. M A G D A L E N A G R A C Z Y K

EKOLOGISTYKA Z A J Ę C I A 2 M G R I N Ż. M A G D A L E N A G R A C Z Y K EKOLOGISTYKA Z A J Ę C I A 2 M G R I N Ż. M A G D A L E N A G R A C Z Y K ĆWICZENIA 2 Charakterystyka wybranej działalności gospodarczej: 1. Stosowane surowce, materiały, półprodukty, wyroby ze szczególnym

Bardziej szczegółowo

Biostymulator rizosfery Weź to, co najlepsze dla korzeni. explorer 21

Biostymulator rizosfery Weź to, co najlepsze dla korzeni. explorer 21 Biostymulator rizosfery Weź to, co najlepsze dla korzeni. 21 Działaj już od siewu Sukces w uprawie kukurydzy jest budowany już od pierwszych stadiów rozwoju. riorytetem jest stworzenie warunków do jak

Bardziej szczegółowo

Opracowała: mgr inż. Ewelina Nowak

Opracowała: mgr inż. Ewelina Nowak Materiały dydaktyczne na zajęcia wyrównawcze z chemii dla studentów pierwszego roku kierunku zamawianego Inżynieria Środowiska w ramach projektu Era inżyniera pewna lokata na przyszłość Opracowała: mgr

Bardziej szczegółowo

protos (gr.) pierwszy protein/proteins (ang.)

protos (gr.) pierwszy protein/proteins (ang.) Białka 1 protos (gr.) pierwszy protein/proteins (ang.) cząsteczki życia materiał budulcowy materii ożywionej oraz wirusów wielkocząsteczkowe biopolimery o masie od kilku tysięcy do kilku milionów jednostek

Bardziej szczegółowo

Atomowa spektrometria absorpcyjna i emisyjna

Atomowa spektrometria absorpcyjna i emisyjna Nowoczesne techniki analityczne w analizie żywności Zajęcia laboratoryjne Atomowa spektrometria absorpcyjna i emisyjna Cel ćwiczenia: Celem ćwiczenia jest oznaczenie zawartości sodu, potasu i magnezu w

Bardziej szczegółowo

METODY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO POMIARU STOSUNKÓW IZOTOPOWYCH PIERWIASTKÓW LEKKICH. Spektrometry IRMS akceptują tylko próbki w postaci gazowej!

METODY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO POMIARU STOSUNKÓW IZOTOPOWYCH PIERWIASTKÓW LEKKICH. Spektrometry IRMS akceptują tylko próbki w postaci gazowej! METODY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO POMIARU STOSUNKÓW IZOTOPOWYCH PIERWIASTKÓW LEKKICH Spektrometry IRMS akceptują tylko próbki w postaci gazowej! Stąd konieczność opracowania metod przeprowadzania próbek innych

Bardziej szczegółowo

FIZYKA I CHEMIA GLEB. Literatura przedmiotu: Zawadzki S. red. Gleboznastwo, PWRiL 1999 Kowalik P. Ochrona środowiska glebowego, PWN, Warszawa 2001

FIZYKA I CHEMIA GLEB. Literatura przedmiotu: Zawadzki S. red. Gleboznastwo, PWRiL 1999 Kowalik P. Ochrona środowiska glebowego, PWN, Warszawa 2001 FIZYKA I CHEMIA GLEB Literatura przedmiotu: Zawadzki S. red. Gleboznastwo, PWRiL 1999 Kowalik P. Ochrona środowiska glebowego, PWN, Warszawa 2001 Tematyka wykładów Bilans wodny i cieplny gleb, właściwości

Bardziej szczegółowo

Suplementy. Wilkasy 2014. Krzysztof Gawin

Suplementy. Wilkasy 2014. Krzysztof Gawin Suplementy Wilkasy 2014 Krzysztof Gawin Suplementy diety - definicja Suplement diety jest środkiem spożywczym, którego celem jest uzupełnienie normalnej diety, będący skoncentrowanym źródłem witamin lub

Bardziej szczegółowo

Analiza ilościowa. Kompleksometria Opracowanie: mgr inż. Przemysław Krawczyk

Analiza ilościowa. Kompleksometria Opracowanie: mgr inż. Przemysław Krawczyk Analiza ilościowa. Kompleksometria Opracowanie: mgr inż. Przemysław Krawczyk Kompleksometria to dział objętościowej analizy ilościowej, w którym wykorzystuje się reakcje tworzenia związków kompleksowych.

Bardziej szczegółowo

Interdyscyplinarny charakter badań równoważności biologicznej produktów leczniczych

Interdyscyplinarny charakter badań równoważności biologicznej produktów leczniczych Interdyscyplinarny charakter badań równoważności biologicznej produktów leczniczych Piotr Rudzki Zakład Farmakologii, w Warszawie Kongres Świata Przemysłu Farmaceutycznego Łódź, 25 VI 2009 r. Prace badawczo-wdrożeniowe

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Wprowadzenie: Większość lądowych organizmów kręgowych część jonów amonowych NH + 4, produktu rozpadu białek, wykorzystuje w biosyntezie

Bardziej szczegółowo

XXI Regionalny Konkurs Młody Chemik FINAŁ część I

XXI Regionalny Konkurs Młody Chemik FINAŁ część I Katowice, 16.12.2009 XXI Regionalny Konkurs Młody Chemik FINAŁ część I ZADANIE 1. KRZYśÓWKA ZWIĄZKI WĘGLA I WODORU (9 punktów) RozwiąŜ krzyŝówkę. Litery z wyszczególnionych pól utworzą hasło nazwę węglowodoru:

Bardziej szczegółowo

Materiały pochodzą z Platformy Edukacyjnej Portalu www.szkolnictwo.pl

Materiały pochodzą z Platformy Edukacyjnej Portalu www.szkolnictwo.pl Materiały pochodzą z Platformy Edukacyjnej Portalu www.szkolnictwo.pl Wszelkie treści i zasoby edukacyjne publikowane na łamach Portalu www.szkolnictwo.pl mogą byd wykorzystywane przez jego Użytkowników

Bardziej szczegółowo