Załącznik nr 2 AUTOREFERAT. Dr Agnieszka Waśkiewicz. Katedra Chemii. Wydział Technologii Drewna. Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu. Poznań 2013 r.

Transkrypt

1 Załącznik nr 2 AUTOREFERAT Dr Agnieszka Waśkiewicz Katedra Chemii Wydział Technologii Drewna Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Poznań 2013 r.

2 1. IMIĘ I NAZWISKO Agnieszka Waśkiewicz 2. POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE - mgr chemii, specjalizacja - chemia organiczna, Wyższa Szkoła Pedagogiczna w Kielcach, dr nauk rolniczych, w zakresie technologii żywności i żywienia, Wydział Technologii Żywności, Akademia Rolnicza w Poznaniu, INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU obecnie - adiunkt, Katedra Chemii, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu asystent, Katedra Chemii, Akademia Rolnicza w Poznaniu asystent, Katedra Podstaw Chemii, Akademia Rolnicza we Wrocławiu 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.): a) tytuł osiągnięcia naukowego/artystycznego: Interdyscyplinarna charakterystyka nowych źródeł fumonizyn w żywności I. Waśkiewicz A, Irzykowska L, Bocianowski J, Karolewski Z, Kostecki M, Weber Z, Goliński P Occurrence of Fusarium fungi and mycotoxins in marketable asparagus spears. Polish Journal of Environmental Studies 49 (4): II. Waśkiewicz A, Goliński P, Karolewski Z, Irzykowska L, Bocianowski J, Kostecki M, Weber Z Formation of fumonisins and other secondary metabolites by Fusarium oxysporum and F. proliferatum: a comparative study. Food Additives and Contaminants 27 (5): III. Waśkiewicz A, Beszterda M, Goliński P Occurrence of fumonisins in food an interdisciplinary approach to the problem. Food Control 26: IV. Waśkiewicz A, Stępień Ł Mycotoxins biosynthesized by plant-derived Fusarium isolates. Archives of Industrial Hygiene and Toxicology 63: V. Waśkiewicz A, Irzykowska L, Bocianowski J, Karolewski Z, Weber Z, Goliński P Fusariotoxins in asparagus their biosynthesis and migration. Food Additives and Contaminants 30: , DOI: /

3 VI. Waśkiewicz A, Stępień Ł, Wilman K, Kachlicki P Diversity of pea-associated F. proliferatum and F. verticillioides populations revealed by FUM1 sequence analysis and fumonisin biosynthesis. Toxins 5: VII. Stępień Ł, Koczyk G, Waśkiewicz A Diversity of Fusarium species and mycotoxins contaminating pineapple. Journal of Applied Genetics 52: VIII. Waśkiewicz A, Beszterda M, Bocianowski J, Goliński P Natural occurrence of fumonisins and ochratoxin A in some herbs and spices commercialized in Poland analyzed by LC-MS/MS method. Food Microbiology 36: Łącznie: Impact factor 15,781 Punkty MNiSzW b) omówienie celu naukowego w/w prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania Wprowadzenie Bioróżnorodność zarówno grzybów obecnych w płodach rolnych jak i samych roślin wraz z ich modyfikacją genetyczną (naturalną lub indukowaną) sprawiają, że nieustannie zmienia się profil toksycznych metabolitów przez grzyby mikroskopijne tworzonych. To z kolei pociąga za sobą konieczność nieustannego weryfikowania wiedzy na temat patogenów grzybowych, powstających mikotoksyn, warunków biosyntezy tych związków i ich szkodliwości dla ludzi, zwierząt i roślin. Obecność substancji niepożądanych w żywności związana jest z zanieczyszczeniem środowiska przez substancje zarówno pochodzenia naturalnego jak i antropogenicznego. Ważną grupę związków należących do zanieczyszczeń naturalnych stanowią mikotoksyny toksyczne metabolity grzybów mikroskopijnych, powstające w wielu płodach rolnych począwszy od fazy rozwoju i wzrostu roślin, poprzez okres zbiorów, obróbki, magazynowania i transportu gotowego produktu. Szerokie spektrum działań toksycznych i zazwyczaj wysoka odporność na temperaturę sprawiają, że obecność mikotoksyn w żywności niesie ze sobą poważne zagrożenie zdrowia ludzi i zwierząt. W chwili obecnej problematyka występowania mikotoksyn w artykułach żywnościowych i ich oddziaływania na organizm ludzki została dość dobrze poznana lecz monitoring oparty na stosownych rozporządzeniach, normach, regulacjach prawnych i rozwiniętej sieci laboratoriów analitycznych jest skoncentrowany głównie na obecności tych ksenobiotyków w zbożach i ich przetworach. 2

4 Pojawiające się w ostatnich latach doniesienia o obecności mikotoksyn w produktach żywnościowych oraz w roślinach innych niż zboża np. fumonizyn w szparagach, fasoli, ziarnie kakao, figach, orzeszkach, serach a także w niektórych fermentowanych produktach np. w sosie sojowym, wskazują na kolejne - dotychczas nie objęte normami - ważne z punktu widzenia konsumenta, źródła zanieczyszczeń żywności. Publikacja: Waśkiewicz A, Beszterda M, Goliński P Occurrence of fumonisins in food an interdisciplinary approach to the problem. Food Control 26: Fumonizyny, w porównaniu z innymi ksenobiotykami, stanowią stosunkowo niedawno wykrytą i opisaną grupę mikotoksyn. Pomimo, że zidentyfikowano 28 pokrewnych analogów fumonizyn i wciąż przybywa nowych, opisanych struktur to jak dotychczas - tylko trzy z nich występują w znaczących ilościach, stanowiąc naturalne zanieczyszczenie żywności, są to fumonizyny B 1, B 2 i B 3 (odpowiednio FB 1, FB 2 i FB 3 ). Większość procesów związanych z przetwarzaniem żywności nie wpływa w sposób istotny na redukcję ich zawartości z racji odporności na wysoką temperaturę (150 C). Ponadto, produkty rozpadu fumonizyn są zazwyczaj znacznie bardziej toksyczne niż wyjściowe toksyny. Najważniejszymi źródłami tych ksenobiotyków są zboża, w tym głównie kukurydza. W komercyjnie dostępnych, oczyszczonych produktach kukurydzianych przeznaczonych do spożycia przez człowieka (rozdrobnione ziarno kukurydzy, mąka kukurydziana, kasza kukurydziana, polenta, semolina, płatki kukurydziane i kukurydza cukrowa) zanieczyszczenie zwykle nie przekracza poziomu 1000 g kg -1, aczkolwiek w niektórych krajach osiąga wartości wyższe. Działania niepożądane wynikają z podobieństwa w strukturze chemicznej fumonizyny B 1 do sfingozyny i sfinganiny substratów syntetazy ceramidowej będącej kluczowym enzymem w biosyntezie sfingolipidów. FB 1 jako specyficzny inhibitor tego enzymu hamuje również wytwarzanie sfingolipidów, prowadząc do spadku ich zawartości w komórkach eukariotycznych a także w surowicy, nerkach, wątrobie oraz w moczu. Zahamowanie biosyntezy sfingozyny i wzrost stężenia sfinganiny jest najczulszym wskaźnikiem stopnia narażenia na fumonizyny. Przerwanie metabolizmu sfingolipidów prawdopodobnie wyjaśnia także ważne biologiczne skutki wywołane przez te toksyny m. in. zaburzenia w cyklu komórkowym, wzrost stresu oksydacyjnego, apoptozę komórek, z następującą ich nekrozą. Nie został dotąd w pełni wyjaśniony wpływ fumonizyn na organizm ludzki. W rejonach, gdzie spożycie produktów kukurydzianych jest bardzo wysokie, stwierdzono zwiększoną częstotliwość zachorowań na nowotwory przełyku i wątroby. Ostatnio przeprowadzone badania wykazały wyraźną zależność pomiędzy spożyciem artykułów zanieczyszczonych fumonizynami a wystąpieniem zmian w cewach nerwowych czy problemami z układem sercowo-naczyniowym. 3

5 Na postawie licznych danych dotyczących zanieczyszczenia fumonizynami płodów rolnych i wywołanych przez nie chorób, Międzynarodowa Agencja ds. Badań nad Rakiem w 2002 zaklasyfikowała fumonizynę B 1 do substancji prawdopodobnie kancerogennych dla ludzi (klasa 2B). Ponadto w 2007 roku w Rozporządzeniu Komisji WE, Nr 1126/2007 zostały zaktualizowane dla krajów Unii Europejskiej najwyższe, dopuszczalne poziomy stężeń dla dwóch najistotniejszych fumonizyn B 1 i B 2 obecnych w kukurydzy i jej przetworach. Pojawiające się w ostatnich latach doniesienia o kolejnych, nowych źródłach tych ksenobiotyków a także dynamiczny rozwój technik molekularnej identyfikacji toksynotwórczych patogenów czy też nowoczesnych narzędzi analitycznych stawiają kolejne wyzwania zmierzające do zbadania genetycznych podstaw biosyntezy fumonizyn przez różne gatunki grzybów rodzaju Fusarium oraz opracowania wyrafinowanych technicznie metod analitycznych służących do ich detekcji w zróżnicowanych i złożonych matrycach roślinnych. Celem monotematycznego cyklu publikacji było: Wyjaśnienie źródeł powstawania i rozmieszczenia mikotoksyn w różnych częściach jadalnych wypustek szparaga Ocena wpływu warunków środowiska (temperatura) na wydajność biosyntezy mikotoksyn przez izolaty Fusarium proliferarum i Fusarium oxysporum Zbadanie możliwości migracji fumonizyn z korzeni i karp do jadalnych części szparaga w warunkach infekcji sztucznej toksynotwórczymi izolatami Fusarium proliferatum i Fusarium oxysporum Określenie profilu tworzonych metabolitów i potencjału toksynotwórczego grzybów rodzaju Fusarium wyizolowanych z różnych matryc roślinnych Poszukiwanie nowych, dotychczas nie opisanych źródeł fumonizyn w roślinach jadalnych zarówno z objawami fuzariozy jak i wolnych od symptomów tej choroby Opracowanie techniki separacji oraz oznaczeń jakościowych jak i ilościowych fumonizyn w nowych matrycach roślinnych przy wykorzystaniu nowoczesnej metody chromatograficznej - UPLC/MS/MS Wyniki Dla zrealizowania powyższych zadań wykonano szereg badań polowych, szklarniowych i laboratoryjnych, które zaowocowały w latach ogłoszeniem drukiem licznych prac naukowych oraz prezentacją uzyskanych wyników w trakcie konferencji krajowych i zagranicznych, 4

6 zarówno w formie referatów jak i posterów. Spośród nich wybrano osiem stanowiących monotematyczny cykl publikacji. Publikacja: Waśkiewicz A, Irzykowska L, Bocianowski J, Karolewski Z, Kostecki M, Weber Z, Goliński P Occurrence of Fusarium fungi and mycotoxins in marketable asparagus spears. Polish Journal of Environmental Studies 49 (4): W pierwszym etapie badań w ramach interdyscyplinarnego grantu MNiSzW (NN ) Biosynteza mikotoksyn i stres oksydacyjny w szparagu (Asparagus officinalis L.) jako wynik zróżnicowania patogenów rodzaju Fusarium przeprowadzono analizę komercyjnie dostępnych, jadalnych wypustek szparaga bielonego pod kątem obecności w nich produktów metabolizmu (mikotoksyn) tworzonych przez wcześniej zidentyfikowane i potwierdzone metodami molekularnymi grzyby Fusarium oxysporum i Fusarium proliferatum. Znajomość gatunków grzybów zasiedlających wypustki szparaga wraz z oceną ich zdolności toksynotwórczych jest szczególnie istotna z punktu widzenia konsumenta jako, że w Polsce, z racji zakwalifikowania szparaga do upraw małoobszarowych, brak jest ciągle aktualnego programu ochrony tego gatunku przed chorobami grzybowymi i szkodnikami. Stosując nowoczesne techniki chromatograficzne (LC-FLD) stwierdzono obecność fumonizyny B 1 w zakresie stężeń 0,2-152,7 ng g -1 zarówno w wypustkach z widocznymi symptomami porażenia jak i w zdrowych, nie wykazujących objawów fuzariozy. Oprócz fumonizyny B 1 wykorzystując odpowiedni detektor - oznaczono także chromatograficznie (LC-PDA) obecność moniliforminy (15,3-585,0 ng g -1 ) metabolitu jednocześnie tworzonego przez wyizolowane patogeny. Tylko 10% analizowanych wypustek wolnych było od mikotoksyn. Biorąc pod uwagę szkodliwość tych ksenobiotyków dla organizmu ludzkiego podjęto w kolejnych doświadczeniach próbę wyjaśnienia przyczyn ich obecności w zdrowych, wolnych od patogenicznych grzybów wypustkach szparaga oraz zbadania możliwości ich biosyntezy przez grzyby rodzaju Fusarium w różnych warunkach temperaturowych. Badania te stanowiły znaczne poszerzenie istniejącego już stanu wiedzy dotyczącego chorób fuzaryjnych szparaga i obecności substancji niepożądanych obniżających jakość tej rośliny. Publikacja: Waśkiewicz A, Goliński P, Karolewski Z, Irzykowska L, Bocianowski J, Kostecki M, Weber Z Formation of fumonisins and other secondary metabolites by Fusarium oxysporum and F. proliferatum: a comparative study. Food Additives and Contaminants 27 (5): W kolejnym etapie badań, wykorzystując izolaty F. oxysporum i F. proliferatum pozyskane ze szparagów, określono wpływ temperatury (18, 24 i 32 C) na wydajność biosyntezy mikotoksyn, głównie fumonizyn B 1 i B 2 a także moniliforminy (dla F. oxysporum) oraz bowerycyny i moniliforminy 5

7 (w przypadku F. proliferatum) na podłożu ryżowym. Oznaczono również poziom stężenia ergosterolu będącego selektywnym indykatorem wzrostu biomasy grzybowej. Stosując technikę chromatografii cieczowej z odpowiednim rodzajem detektora umożliwiającym indentyfikację wymienionych zwiazków wyznaczono dla nich limity detekcji, parametry rozdziału, krzywe kalibracji wraz z odzyskiem tych związków w stosowanej metodzie. Najwyższą wydajność biosyntezy (w µg g -1 ) fumonizyn (B 1 i B 2 ) uzyskano w temperaturze 18 C zarówno dla izolatów F. proliferatum ( FB 1 oraz FB 2 ) jak i F. oxysporum (1,7-4,7 FB 1 oraz 0,3-1,6 FB 2 ), z istotnie wyższym poziomem stężeń toksyn tworzonych przez F. proliferatum. Najwyższą wydajność biosyntezy pozostałych mikotoksyn przez badane izolaty obu gatunków Fusarium obserwowano w temperaturze 32 C (moniliformina) oraz 25 C (bowerycyna). Ponadto wykazano istotny wpływ (p 0,001) temperatury i rodzaju izolatu na poziom stężenia ergosterolu i tworzonych mikotoksyn. Badania te potwierdziły również, że uznawany dotąd za nietoksynotwórczy Fusarium oxysporum w tej matrycy i w krajowych warunkach uprawy szparagów jest zdolny do biosyntezy fumonizyn przy czym podkreślić należy, że jego wydajność biosyntezy była dużo niższa względem F. proliferatum czy F. verticillioides uznanych za mikroorganizmy intensywnie tworzące te związki. Publikacja: Waśkiewicz A, Irzykowska L, Bocianowski J, Karolewski Z, Weber Z, Goliński P Fusariotoxins in asparagus their biosynthesis and migration. Food Additives and Contaminants 30: Celem wyjaśnienia możliwości przemieszczania się (transportu) fumonizyn z części podziemnych szparaga (korzeni i karp) do wyższych partii rośliny (wypustki bądź łodygi) zaplanowano doświadczenie szklarniowe wykorzystując do badań jednoroczne rośliny odmiany Andreas. Izolaty Fusarium oxysporum i Fusarium proliferatum, o zbadanej wcześniej toksynotwórczości, użyto do inokulacji trzech różnych części rośliny (korzeń, karpa, nasada łodygi). Doświadczenia zaplanowano w układzie niezależnym dla każdego izolatu i każdej części rośliny, natomiast grupę kontrolną stanowiły rośliny nieinokulowane. Fumonizynę B 1 dla każdej z kombinacji niezależnie od miejsca inokulacji - analizowano techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w nadziemnej części rośliny. Najwyższy poziom fumonizyny B 1 dla obu gatunków (F. proliferatum i F. oxysporum) stwierdzono w przypadku inokulacji karpy i wynosił odpowiednio w granicach (w ng g -1 ): 207,5-234,5 oraz 40,2-60,7, natomiast najniższe stężenia tej toksyny odnotowano w przypadku infekcji sztucznej korzeni szparaga w zakresie: 50,45-61,77 (F. proliferatum) i 28,5-31,9 (F. oxysporum), co korespondowało z absencją patogenów w części nadziemnej. Z przeprowadzonych badań wynika, że w karpie, która stanowi bazę dla wyrastających wypustek i łodyg, patogen znajduje najlepsze warunki do wzrostu, rozwoju i tworzenia mikotoksyn, a przeprowadzone wcześniej doświadczenia wskazują 6

8 na temperaturę 18 C jako optymalną do biosyntezy fumonizyn. Uzyskane wyniki potwierdzają wcześniejsze przypuszczenia o migracji ksenobiotyków wraz z przepływem soku floemowego, głównie z karp, do jadalnych wypustek i stąd ich obecność nawet w zdrowych roślinach bez objawów porażenia Fusarium. Taka sytuacja uzmysławia potrzebę poprzez intensywne badania monitoringowe - wprowadzenia stosownych norm i regulacji prawnych dotyczących dopuszczalnych poziomów obecności fumonizyn w szparagu roślinie, która nawet w zdrowo wyglądających wypustkach może zawierać ksenobiotyki istotnie pogarszające jej jakość. Publikacja: Waśkiewicz A, Stępień Ł Mycotoxins biosynthesized by plant-derived Fusarium isolates. Archives of Industrial Hygiene and Toxicology 63: Kolejnym etapem badań prowadzonych w ramach projektu finansowanego przez MNiSzW (NN ) Zróżnicowanie genów FUM u różnych gatunków Fusarium i jego związek z efektywnością wytwarzania fumonizyn było określenie potencjału toksynotwórczego (na podłożu ryżowym) kolekcji 34 zidentyfikowanych molekularnie (geny odpowiedzialne za biosyntezę fumonizyn) nowych izolatów Fusarium pozyskanych z tkanek dziesięciu różnych gatunków roślin (ananas, banan, papryka, szparag, kukurydza, pszenica, ryż, rabarbar, czosnek, storczyk), u których, w wielu przypadkach, nie było widocznych objawów infekcji. Opracowując warunki rozdziału chromatograficznego dla poszczególnych matryc roślinnych oznaczono profil najistotniejszych mikotoksyn. Dominującym gatunkiem był F. proliferatum (21 izolatów) pozyskany z tkanek ośmiu gospodarzy, o bardzo zróżnicowanych zdolnościach toksynotwórczych: aż 57% z nich charakteryzowało się bardzo wysoką wydajnością biosyntezy fumonizyn (B 1, B 2 i B 3 ) zdecydowanie powyżej 1000 µg g -1 (w zakresie od 1187 do 3299), natomiast pozostałe izolaty tworzyły metabolity na poziomie stężeń od 119 do 996 µg g -1. U 15 izolatów (44,1%) stwierdzono ponadto zdolność do jednoczesnej biosyntezy (oprócz fumonizyn) moniliforminy i bowerycyny, przy czym gatunki F. proliferatum charakteryzowały się najwyższym potencjałem toksynotwórczym (0,4-41,1 µg g -1 bowerycyna i 0,1-158,5 µg g -1 moniliformina) w porównaniu z F. ananatum, F. concentricum, F. oxysporum czy F. verticillioides. Większość z wykorzystanych w doświadczeniu gatunków roślin (gospodarzy badanych izolatów) jest ważna rolniczo i uprawiana, niezależnie od warunków klimatycznych, na całym świecie, co potwierdza charakter kosmopolityczny grzybów rodzaju Fusarium i ich zdolność do kolonizacji szerokiego wachlarza roślin uprawnych. 7

9 Publikacja: Stępień Ł, Koczyk G, Waśkiewicz A Diversity of Fusarium species and mycotoxins contaminating pineapple. Journal of Applied Genetics 52: Powyższe badania wskazały na możliwość tworzenia mikotoksyn przez F. proliferatum w owocach ananasa. Nieliczne informacje dotyczące nowych patogenów i ich metabolitów u tej rośliny sprawiły, że dokonano kompleksowej oceny ryzyka występowania ksenobiotyków (głównie fumonizyn) zarówno w skórce owocu jak i w soku ananasowym. Analizowano handlowo dostępne owoce pochodzące z krajów Ekwador i Costa Rica. Również i w tych badaniach dominującymi gatunkami Fusarium wyizolowanymi z ananasa i potwierdzonymi metodami molekularnymi były kolejno F. proliferatum i F. ananatum. Wykazano, że wszystkie izolaty tych gatunków były zdolne do biosyntezy mikotoksyn na podłożu ryżowym, przy bardzo zróżnicowanym poziomie stężeń (w µg g -1 ): 3,6-2125,4 FB 1 ; 0,5-481,9 FB 2 ; 0,1-189,5 FB 3 ; 0,01-97,4 moniliformina oraz 1,3-53,9 bowerycyna. W kolejnym etapie, dostosowując precyzyjne warunki rozdziału chromatograficznego do nowych, złożonych matryc roślinnych stwierdzono we wszystkich próbkach zliofilizowanych skórek ananasa i w soku z tego owocu obecność mikotoksyn, z dominującym udziałem fumonizyny B 1 (25,7-247,7 µg g -1 skórka oraz 8,2-23,7 µg ml -1 - sok). Biorąc pod uwagę obowiązujące normy unijne określające dopuszczalne poziomy fumonizyn w nieprzetworzonej i przetworzonej kukurydzy (Rozporządzenie Komisji WE, Nr 1126/2007) i porównując z nimi uzyskane wartości stężeń tych ksenobiotyków, szczególnie w przeznaczonym do konsumpcji soku z ananasa wyraźnie widać alarmująco przekroczone ich poziomy. Regularne spożywanie takich dawek fumonizyn wraz z wciąż rosnącą gamą nowych ich źródeł może prowadzić u ludzi do problemów zdrowotnych ze zmianami nowotworowymi włącznie. Publikacja: Waśkiewicz A, Stępień Ł, Wilman K, Kachlicki P Diversity of pea-associated F. proliferatum and F. verticillioides populations revealed by FUM1 sequence analysis and fumonisin biosynthesis. Toxins 5: Kolejną rośliną, w nasionach której po raz pierwszy stwierdzono obecność fumonizyn był groch stanowiący bogate źródło białka roślinnego, błonnika i witamin z grupy B. Cykl badań nad tą rośliną rozpoczęto od morfologicznej i molekularnej identyfikacji nowych, dotychczas nie utożsamianych z grochem jako gospodarzem - grzybów rodzaju Fusarium: F. proliferatum i F. verticillioides. Według wcześniejszych danych literaturowych, choroby obniżające plon i jakość nasion grochu przeznaczonego na cele spożywcze związane były głównie z grzybami takimi jak Ascochyta i Alternaria, natomiast grzyby rodzaju Fusarium odgrywały raczej marginalną rolę, a wśród nich najczęściej stwierdzanymi patogenami były: F. oxysporum, F. solani, F. avenaceum czy F. poae. 8

10 Z dwunastu odmian grochu uprawianego w dwóch lokalizacjach Centralnej Polski (Radzików i Wiatrowo), do ilościowych i jakościowych analiz chromatograficznych fumonizyn, wyselekcjonowano tylko te, u których stwierdzono patogeny odpowiedzialne za ich biosyntezę odmianę Turnia (F. proliferatum) i odmianę Eureka (F. verticillioides). Zanieczyszczenie tej rośliny fumonizynami z grupy B stwierdzono na niskim poziomie stężeń we wszystkich próbkach obu odmian pochodzących zarówno z lokalizacji Radzików jak i Wiatrowo. Najwyższe i najniższe stężenia fumonizyn odnotowano dla próbek grochu odmiany Turnia z Radzikowa odpowiednio 1,72 µg g -1 i 0,63 µg g -1, które stanowiły IV i I polowe powtórzenie. Ponadto, fumonizyna B 1 była toksyną dominującą i stanowiła więcej niż 90% sumy trzech fumonizyn B 1, B 2 i B 3. Warto przy tym zaznaczyć, że w przypadku analizowanych nasion grochu nie zostały przekroczone dopuszczalne poziomy fumonizyn (wg przyjętych norm dla kukurydzy Rozporządzenie Komisji WE, Nr 1126/2007). Publikacja: Waśkiewicz A, Beszterda M, Bocianowski J, Goliński P Natural occurrence of fumonisins and ochratoxin A in some herbs and spices commercialized in Poland analyzed by LC-MS/MS method. Food Microbiology 36: Ukoronowaniem prac badawczych nad fumonizynami było opracowanie chromatograficznej metody rozdziału tych związków z grupy B z wykorzystaniem najnowocześniejszej aparatury badawczej ultrasprawnego chromatografu cieczowego sprzężonego z detektorem masowym (potrójny kwadrupol - TQD). Matrycę stanowiły różne rodzaje ziół i przypraw jako materiał dotychczas nie analizowany pod tym kątem w naszym kraju. Niewątpliwą zaletą opracowanej metody jest możliwość identyfikacji ksenobiotyków bez konieczności przeprowadzania reakcji ich derywatyzacji, która była niezbędna w powszechnie dotąd stosowanej detekcji fluorymetrycznej. Dla trzech najistotniejszych fumonizyn B 1, B 2 i B 3, stosując jonizację typu electrospray w trybie jonów dodatnich, wyznaczono jony molekularne i fragmentacyjne przy optymalnych wartościach energii kolizji. Określono granice oznaczalności i wykrywalności dla analizowanych ksenobiotyków oraz odzysk metody w zakresie 82,7-97,3% obliczony przy trzech poziomach stężeń każdej z fumonizyn: 0,1; 0,5 i 2,0 ng g -1, które w znanej i określonej ilości - dodawano do próbek wolnych od mikotoksyn (pieprz czarny i liść laurowy). Dla oznaczeń ilościowych uzyskano wysokie wartości współczynnika regresji: 0,9899 (FB 1 ); 0,9991 (FB 2 ) i 0,9979 (FB 3 ) odpowiadające krzywym kalibracyjnym wyznaczonym z sześciu punktów pomiarowych, w zakresie stężeń 0,1-4,0 ng g -1. Warto zaznaczyć, że opracowana metoda chromatograficzna z powodzeniem może być stosowana do innych złożonych matryc roślinnych. 9

11 Spośród najpopularniejszych ziół i przypraw wybranych do doświadczenia najbardziej zanieczyszczone fumonizynami okazały się kolejno pieprz cayenne (62,78 ng g -1 ), pieprz czarny ziarnisty (18,96 ng g -1 ) oraz czosnek granulowany (16,26 ng g -1 ) co korespondowało z wysokim poziomem ergosterolu dla tych próbek. Ponadto, analiza chromatograficzna ochratoksyny A (produktu metabolizmu grzybów przechowalniczych) wykazała w 25% przypadków przekroczony dopuszczalny poziom stężenia dla ziół i przypraw (15 ng g -1 ) co może świadczyć o niewłaściwych warunkach suszenia i przechowywania materiału roślinnego. Wolne od fumonizyn były próbki ośmiu rodzajów przypraw (ziele angielskie, liść laurowy, goździki, estragon, słonecznik, cynamon, gorczyca, gałka muszkatołowa), charakteryzujące się również niską zawartością ergosterolu indykatora rozwoju biomasy grzybowej. Na postawie dostępnej literatury powyższe badania są pierwszym raportem dotyczącym występowania fumonizyn w tak szerokiej gamie ziół i przypraw powszechnie używanych w kuchni europejskiej, w szczególności takich jak tymianek, rozmaryn, bazylia czy majeranek. Ubiegając się o stopień doktora habilitowanego nauk rolniczych (zgodnie z art. 16 ust. 2 Ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595, z późniejszymi zmianami)), za moje największe osiągnięcie naukowe uważam cykl ośmiu oryginalnych publikacji kompleksowo przedstawiających problematykę nowych źródeł zanieczyszczeń żywności toksycznymi metabolitami z grupy fumonizyn oraz opracowaną metodę analizy chemicznej mikotoksyn pozwalającą na istotne obniżenie poziomu wykrywalności tych metabolitów przy zdecydowanym podwyższeniu wiarygodności uzyskiwanych wyników potwierdzonych jonami molekularnymi i fragmentacyjnymi wyznaczonymi dla poszczególnych związków. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Od 1996 roku jestem zaangażowana w działalność naukowo-badawczą pracując - najpierw przez okres jednego roku - na stanowisku asystenta w zespole naukowym kierowanym przez Pana prof. zw. dr. hab. Czesława Wawrzeńczyka w Katedrze Podstaw Chemii Akademii Rolniczej we Wrocławiu i realizując tematykę będącą kontynuacją i rozszerzeniem zagadnień poruszanych w mojej pracy magisterskiej z zakresu syntezy nowych syntonów krzemowych i ich wykorzystania w reakcji Wittiga. Następnie, od 1997 roku zatrudniona na etacie asystenta w Katedrze Chemii Akademii Rolniczej w Poznaniu, rozpoczęłam swoją działalność naukową w zespole Pana prof. zw. dr hab. Piotra Golińskiego w tematyce dotyczącej identyfikacji - występujących w płodach rolnych i ich 10

12 produktach - metabolitów grzybowych zwanych mikotoksynami. Nowe zagadnienia wymagały ode mnie poznania i opanowania prawidłowych technik ekstrakcji i oczyszczania związków pochodzących z różnych matryc roślinnych a także zdobycia umiejętności obsługi chromatografów cieczowych wykorzystywanych do analiz jakościowych i ilościowych tych metabolitów. Było to możliwe dzięki m.in. uczestnictwu w stażach i szkoleniach naukowych odbytych w kraju w Katedrze Fitopatologii Leśnej, Katedrze Biochemii i Analizy Żywności oraz Katedrze Biochemii i Biotechnologii Akademii Rolniczej w Poznaniu i za granicą w Faculty of Food Analysis, University of Gent, Belgia (załącznik 5: III L 1, III L 2, III L 3, III Q 1). Od roku rozpoczęłam studia doktoranckie przy Wydziale Technologii Żywności realizując pod kierunkiem promotora mojej pracy doktorskiej Pana prof. zw. dr. hab. Piotra Golińskiego zagadnienia dotyczące oceny zależności pomiędzy obecnością mikotoksyn w żywności i paszach a ich pozostałością w tkankach ludzkich i zwierzęcych. Pozyskanie materiału doświadczalnego i przeprowadzanie tak skomplikowanych analiz było możliwe dzięki nawiązaniu współpracy m.in. z Państwowym Instytutem Weterynarii, Akademią Medyczną czy też Instytutem Genetyki Roślin PAN w Poznaniu. Efektem badań naukowych z tego okresu było ogłoszenie drukiem 6 publikacji i monografii oraz zaprezentowanie uzyskanych wyników w formie 5 referatów i posteru na krajowych i międzynarodowych konferencjach (załącznik 5: II A 1, II A 2, II A 3, II D 1, II D 2, II D 3, II D 18, II K 1, II K 2, II K 3, II K 4, II K 11, III B 54). Po uzyskaniu stopnia doktora nauk rolniczych w zakresie technologii żywności i żywienia oraz po zatrudnieniu od roku na stanowisku adiunkta zdobyte we wcześniejszym okresie doświadczenie pozwoliło mi wypracować własny warsztat badawczy i ukształtować nowe zainteresowania naukowe, których realizacja była możliwa dzięki zakwalifikowanym do finansowania aplikacjom grantowym i szerokiej współpracy z wiodącymi ośrodkami badawczymi (załącznik 5: II I 1, II I 2, II I 3, II I 4, II I 5, II I 6, II I 7, II I 8, II I 9, II I 10, II I 11). Ponadto, uczestnicząc w szkoleniach i kursach, nieustannie udoskonalałam swój warsztat badawczy sukcesywnie rozbudowywany najnowocześniejszymi chromatografami sprzężonymi z detektorami mas, wprowadzając nowe techniki do bogatego zaplecza aparaturowego. Celem sprawdzenia własnych umiejętności analitycznych i potwierdzenia wiarygodności uzyskiwanych wyników czterokrotnie uczestniczyłam w edycjach Badań biegłości laboratoriów analitycznych w zakresie oznaczania zawartości mikotoksyn organizowanych przez Państwowe Centrum Akredytacji (załącznik 5: III Q 2, III Q 3, III Q 5, III Q 6, III Q 7, III Q 8). W tym okresie moje zainteresowania badawcze poszerzyłam o zagadnienia związane z patogenami kukurydzy i ich zdolnościami toksynotwórczymi, które realizowałam w ramach grantu MNiSzW (NN ) Znaczenie populacji Fusarium verticillioides w etiologii fuzariozy kolb 11

13 kukurydzy w Polsce - charakterystyka czynników modyfikujących biosyntezę i akumulację mikotoksyn we współpracy z Katedrą Fitopatologii SGGW w Warszawie oraz Instytutem Hodowli i Aklimatyzacji Roślin w Radzikowie. Badania obejmowały trzyletnie doświadczenia polowe z czterema botanicznymi odmianami kukurydzy inokulowanymi izolatami F. verticillioides o zróżnicowanej toksynotwórczości. Analizując kinetykę tworzenia fumonizyn i bowerycyny poprzez cotygodniowy pobór próbek począwszy od dnia inokulacji aż do pełnej dojrzałości rośliny wykazano istotną zależność pomiędzy stężeniem mikotoksyn a zawartością ergosterolu w ziarniakach kukurydzy. Badano również poziom ksenobiotyków w rdzeniu kukurydzy wykazując istotnie niższe ich stężenie w tej części kolby w porównaniu z ziarniakami. Podczas biosyntezy mikotoksyn, w trakcie dojrzewania ziarna zaobserwowano również zmiany w zawartości amylozy, skrobi i aktywności wody. W warunkach laboratoryjnych zbadano ponadto potencjał toksynotwórczy 22 izolatów F. verticillioides na różnych podłożach roślinnych (kukurydza, ryż, pszenica, jęczmień, owies) wskazując podłoże ryżowe i kolejno kukurydziane jako najbardziej wydajne. W ramach cyklu doświadczeń analizowałam również zmienność stężeń form nadtlenkowych kwasów tłuszczowych jako wczesnych indykatorów zmian - wywołanych rozwojem patogena - zachodzących w roślinie. Wykorzystując wcześniejsze moje doświadczenia uczestniczyłam także w badaniach dotyczących wpływu suplementacji gleby różnymi formami nawozów azotowych na poziom fumonizyn w ziarnie różnych odmian mieszańców kukurydzy wykazując najwyższe ich stężenie przy braku nawożenia azotem, a najniższe przy nawożeniu saletrą amonową i mocznikiem z udziałem 50% każdego z nawozów w całkowitej dawce azotu. Ponadto, w latach brałam udział w badaniach odporności 100 elitarnych linii wsobnych kukurydzy na fuzariozę kolb i obecność mikotoksyn w ziarnie wykazując duże ich zróżnicowanie w doświadczeniach infekcyjnych kolb patogenami F. verticillioides i F. culmorum pod kątem potencjału toksynotwórczego (0-59,9 ng g -1 zearalenon, 0-90,5 ng g -1 deoksynivalenol, 112,4-1190,3 ng g -1 fumonizyna B 1 ). Uzyskane wyniki z doświadczeń dotyczących kukurydzy zostały ogłoszone drukiem w renomowanych czasopismach naukowych o zasięgu światowym i zaprezentowane na licznych konferencjach (załącznik 5: II A 6, II A 17, II A 19, II D 7, II D 10, II D 11, II D 12, II D 20, II K 8, II K 9, II K 16, II K 22, II K 25, III B 3, III B 6, III B 7, III B 13, III B 20, III B 25, III B 26, III B 27, III B 42, III B 43, III B 44, III B 59, III B 61, III B 62, III B 65, III B 67, III B 68, III B 70, III B 72, III B 74, III B 75, III B 80, III B 82, III B 84, III B 88, III B 89). W ramach projektu MNiSzW (NN ) realizowanego we współpracy z Katedrą Fitopatologii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu oraz Zakładem Fizyki Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu uczestniczyłam w doświadczeniach polowych, szklarniowych i laboratoryjnych mających na celu określenie zależności pomiędzy stopniem porażenia rożnych odmian szparaga grzybami rodzaju Fusarium, stężeniem mikotoksyn a indykatorami stresu 12

14 oksydacyjnego i poziomem wolnych rodników. Rezultatem tych badań były liczne publikacje, które ukazały się drukiem w czasopismach głównie z bazy JCR (załącznik 5: II A 5, II A 11, II A 12, II A 15, II A 21, II D 5, II D 6) oraz doniesienia konferencyjne w formie referatów i posterów (załącznik 5: II K 5, III B 1, III B 4, III B 9, III B 12, III B 15, III B 16, III B 17, III B 57, III B 80). Kolejnym wątkiem badawczym realizowanym we współpracy z Instytutem Genetyki Roślin PAN w Poznaniu i Katedrą Fitopatologii Uniwersytetu Przyrodniczego w Lublinie w ramach interdyscyplinarnego projektu MNiSzW (NN ), w którym uczestniczyłam w latach były trzyletnie doświadczenia polowe dotyczące podatności 10 ważnych rolniczo odmian pszenicy ozimej na patogeny o wysokiej zdolności toksynotwórczej i charakterystyczne dla naszej strefy klimatycznej: F. culmorum, F. graminearum i F. avenaceum. Dla zobrazowania istotnego wpływu warunków klimatycznych na rozwój patogenów i biosyntezę mikotoksyn doświadczenia przeprowadzono w dwóch rejonach kraju w Wielkopolsce i na Lubelszczyźnie. Powtarzający się w każdym roku schemat doświadczeń gwarantował rzetelność uzyskanych wyników, które opierały się na jakościowych i ilościowych oznaczeniach mikotoksyn (zearalenon, deoksyniwalenol, moniliformina) w następujących frakcjach ziarniaków pszenicy: HLK (health looking kernels bez symptomów choroby) i FDK (Fusarium damaged kernels z objawami fuzariozy) oraz w plewach. Trzyletnie doświadczenia polowe pozwoliły wytypować odmiany mało podatne na fuzariozę (zróżnicowane w badanych rejonach Polski), określić profil tworzonych metabolitów przez poszczególne patogeny oraz zbadać zmienność poziomów poszczególnych mikotoksyn. Liczne publikacje z bazy JCR oraz doniesienia konferencyjne są potwierdzeniem wagi poruszanego problemu (załącznik 5: II A 4, II A 8, II A 10, II D 4, II D 14, II D 19, II K 6, II K 7, II K 10, II K 12, II K 13, II K 17, II K 27, III B 2, III B 10, III B 11, III B 14, III B 19, III B 21, III B 24, III B 34, III B 35, III B 69). W 2011 roku opierając się na zdobytej wiedzy i doświadczeniu w tej tematyce podjęłam się kierowania projektem (NN ) dotyczącym oceny podatności chlebowych odmian pszenicy ozimej na fuzariozę kłosa w warunkach sztucznej i naturalnej infekcji grzybami rodzaju Fusarium oraz idącą za tym biosyntezę mikotoksyn a w konsekwencji na jakość ziarna i wartość technologiczną uzyskanej mąki, i ostatecznie chleba w aspekcie zdrowia konsumentów. Obecnie realizowane są zaawansowane trzyletnie zadania badawcze dotyczące m.in. wytypowania spośród przebadanych chlebowych odmian pszenicy ozimej tych mało podatnych na porażenie kłosów przez Fusarium spp. i akumulację mikotoksyn w ziarnie (czyli genotypów bardziej przydatnych w produkcji rolniczej na cele żywnościowe) oraz określenia wpływu procesów technologicznych na zawartość poszczególnych toksyn zarówno w surowcu (mące) jak i produkcie (pieczywie). Dotychczasowe badania zaprezentowano w formie publikacji oraz doniesień konferencyjnych (załącznik 5: II D 13, III B 39, III B 40, III B 41, III B 45, III B 51, III B 86). 13

15 Innymi zagadnieniami, w których realizację jestem zaangażowana wykorzystując nowoczesny warsztat analityczny - to sprawdzenie zdolności wybranych grzybów oraz bakterii do rozkładu toksyn fuzaryjnych. Grzybami o właściwościach nadpasożytniczych względem grzybów rodzaju Fusarium wybranymi do badań były: Trichoderma i Clonostachys w przypadku, których wykazano zróżnicowaną zdolność inhibicji biosyntezy mikotoksyn fuzaryjnych i ich dekompozycji. W badaniach modelowych in vitro symulujących układ pokarmowy ssaków bakterie propionowe wykazały zdolność unieczynnienia mikotoksyn, natomiast dodane do paszy dla zwierząt znacznie redukowały ich poziom, poprawiając tym samym jakość pasz i przydatność do spożycia. Obecnie uczestniczę także w badaniach (NN ) oceniających zdolność biosyntezy ochratoksyny A, cytryniny i kwasu peniciliowego na różnych podłożach biologicznych (w trzech temperaturach) grzybów rodzajów Aspergillus i Penicillium obserwowanych w przechowalnictwie ziarna zbóż. W ramach projektu przeanalizowano także wpływ aktywności wody w ziarnie i temperatury na tempo rozwoju powyższych mikroorganizmów i tworzenie mikotoksyn w ekosystemie magazynowanego ziarna jęczmienia. Uzyskane wyniki posłużą do zaplanowania kolejnego eksperymentu mającego na celu wyznaczenie modelu matematycznego dotyczącego dopuszczalnego czasu pożniwnej konserwacji ziarna jęczmienia i rzepaku (załącznik 5: II A 7, II K 15, II K 19, II K 26, III B 5, III B 29, III B 30, III B 31, III B 32, III B 46, III B 54). Powszechność występowania grzybów rodzaju Fusarium i ich metabolitów w polskich uprawach zbóż skłoniła nasz Zespół do poszukiwania tych patogenów na bazie najnowszych doniesień literaturowych - w środowisku wodnym. Złożona aplikacja grantowa MNiSzW zakończona finansowaniem (NN Zearalenon i jego pochodne w elementach ekosystemu wodnego jako efekt zanieczyszczenia środowiska wywołanego obecnością w roślinach grzybów toksynotwórczych i produktów ich metabolizmu mikotoksyn estrogennych ) pozwoliła dogłębnie zbadać ten problem i jego skalę w warunkach naszego kraju. Na postawie trzyletniego cyklu doświadczeń wykazano sezonową zmienność stężenia zearalenonu w wodach powierzchniowych znajdujących się w bezpośrednim sąsiedztwie pól uprawnych, z powtarzającą się tendencją najwyższych poziomów tego ksenoestrogenu roślinnego w miesiącach jesiennych, czyli w okresie pożniwnym. Zbadano również poziom zeralenonu w zbożach i glebie by potwierdzić hipotezę o migracji mikotoksyn (ich wymywanie wodą opadową z zainfekowanych kłosów, roślin i resztek pożniwnych) wraz z ich spływem powierzchniowym do zbiorników wodnych. Uzyskane wyniki badań przedstawiono w publikacjach oraz na w wystąpieniach konferencyjnych (załącznik 5: II A 9, II A 16, II A 18, III B 8, III B 18, III B 22, III B 23, III B 28). Wykorzystując najnowsze techniki molekularne służące do identyfikacji gatunków Fusarium, u których nie stwierdzono dotychczas zdolności do biosyntezy mikotoksyn - w ramach współpracy 14

16 z Instytutem Genetyki Roślin PAN w Poznaniu - badałam ich profil metaboliczny i potencjał toksynotwórczy. Cel jaki tym badaniom przyświecał to zbadanie genetycznych podstaw biosyntezy poszczególnych związków przez różne gatunki grzybów, a także poznanie elementów wpływających na aktywację tych szlaków metabolicznych. Wykazano, że zdolne do wytwarzania eniatyn i bowerycyny z bardzo zróżnicowaną wydajnością okazały się grzyby F. acuminatum, F. ananatum, F. anthophilum, F. concentricum, F. nygamai, F. oxysporum, F. poae czy F. temperatum wyizolowane z piętnastu różnych gospodarzy roślinnych. Te interdyscyplinarne badania znalazły swe odzwierciedlenie w licznych publikacjach i doniesieniach konferencyjnych (załącznik 5: II A 13, II A 14, II A 20, II K 14, II K 18, II K 20, II K 21, III B 33, III B 58, III B 64, III B 65, III B 78, III B 82, III B 88). Chociaż podjęta tematyka badawcza w ramach projektu finansowanego ze środków Unii Europejskiej ( Biotechnologiczna konwersja glicerolu do polioli i kwasów dikarboksylowych ) nie była głównym nurtem moich zainteresowań to brałam udział i nadal uczestniczę w realizacji trzech zadań badawczych wykorzystując nowoczesne narzędzia chromatograficzne - dotyczących walidacji analitycznych metod oraz oznaczeń jakościowych i ilościowych profilu związków organicznych obecnych w biopaliwach pochodzących z różnych rafinerii wykorzystywanych w procesie przekształcania glicerolu do polioli i kwasów karboksylowych (załącznik 5: III B 60, III B 71, III B 79). Obecnie, współpracując z Katedrą Prewencji Weterynaryjnej i Higieny Pasz Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie, realizuję także badania dotyczące wpływu mikotoksykozy pojedynczej i mieszanej na układ pokarmowy i rozrodczy świń (grant rozwojowy - NR /2010). W doświadczeniach z warchlako-loszkami poddanymi 6-tygodniowej intoksykacji jednoczynnikowej (zearalenon lub deoksyniwalenol) lub mieszanej (zearalenon i deoksyniwalenol) analizowałam obecność podawanych mikotoksyn w próbkach krwi oraz próbkach pobranych z wątroby, różnych części jelita cienkiego (dwunastnica, jelito czcze, jelito biodrowe, jelito ślepe), i grubego (okrężnica wstępująca, poprzecznica, okrężnica zstępująca) a także układu rozrodczego (trzon macicy, jajniki, szyjka macicy). Badania wykazały istotne różnice w stężeniach deoksynivalenolu i zearalenonu w surowicy krwi zwierząt doświadczalnych. W przewodzie pokarmowym najwyższe stężenia zearalenonu stwierdzono w wątrobie, dwunastnicy i okrężnicy zstępującej, a deoksynivalenolu w jelicie biodrowym i okrężnicy wstępującej. Natomiast w obrębie układu rozrodczego najwyższy poziom zawartości obu mikotoksyn stwierdzono w jajnikach. Efektem wykonanych doświadczeń są publikacje i doniesienia konferencyjne (załącznik 5: II A 8, II A 9, II D 21, II D 22, II K 23, II K 24, III B 49, III B 52). Ponadto, w okresie byłam opiekunem praktyk studenckich oraz osób odbywających staż naukowy w Katedrze Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu, promotorem 6 15

17