Przegląd metod oznaczania wybranych sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Przegląd metod oznaczania wybranych sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych"

Transkrypt

1 Przegląd metod oznaczania wybranych sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych STRESZCZENIE Sfingolipidy są to bioaktywne cząsteczki wchodzące w skład błony komórkowej, które biorą udział w przekazywaniu sygnałów i regulacji wielu procesów wewnątrzkomórkowych tj. wzrost i proliferacja komórek, apoptoza, angiogeneza czy procesy zapalne. Istnieje kilka opublikowanych technik i metod analitycznych służących oznaczeniu stężenia i konwersji sfingolipidów m.in. znakowanie radioaktywne, metoda enzymatyczna, MS, RP-HPLC, ESI LC-MS/MS, UPLC-MS/MS. W niniejszym artykule opisujemy rozwój i walidacje metod analitycznych oraz sposobów ekstrakcji wybranych sfingolipidów w rożnych materiałach biologicznych. WPROWADZENIE Sfingolipidy są ważnymi składnikami błon komórkowych biorącymi udział w regulacji licznych procesów komórkowych. Są to związki, których wspólnym elementem strukturalnym jest aminoalkohol, u ssaków jest to najczęściej 18 węglowa sfingozyna (Sph) lub jej nasycona pochodna, sfinganina (Sa). Cząsteczką prekursorową wszystkich tych związków jest ceramid (Cer), z którego enzym ceramidaza uwalnia sfingozynę. Kinaza sfingozyny katalizuje reakcję fosforylacji sfingozyny do sfingozyno-1-fosforanu (), związku odgrywającego olbrzymią rolę w wielu procesach komórkowych. W wyniku estryfikacji grupy hydroksylowej ceramidu fosforanem choliny lub fosforanem etanoloaminy powstaje podklasa sfingolipidów tzw. sfingomieliny (SM), które wraz z fosfolipidami, glikolipidami, cholesterolem i białkami błonowymi pełnią rolę strukturalnych elementów błon biologicznych [1] (Ryc. 1). Historia badań nad biologiczną rolą sfingolipidów jest relatywnie krótka. Badania nad tymi związkami uległy jednak intensyfikacji, szczególnie po wykazaniu ich udziału w strukturze i funkcji tzw. błonowych tratw lipidowych. Ponadto biocząsteczki z tej rodziny biorą udział w szeregu procesów biologicznych, głównie jako cząsteczki sygnałowe. Pełnią także wiele innych funkcji, mających duże znaczenie dla procesów fizjologicznych i biochemicznych, wpływają m.in. na wzrost i proliferację komórek, apoptozę, angiogenezę czy procesy zapalne [2,3]. Grupa tych związków może odgrywać również istotną rolę w procesach patologicznych. Znane są choroby dziedziczne będące wynikiem mutacji w ob- Marta Budkowska 1,2,* Barbara Dołęgowska 1,2 1 Zakład Analityki Medycznej, Wydział Lekarsko-Biotechnologiczny i Medycyny Laboratoryjnej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Szczecin 2 Zakład Fizjologii, Pracownia Fizjologii i Biochemii Komórki Macierzystej, Pomorski Uniwersytet Medyczny w Szczecinie, Szczecin * Zakład Analityki Medycznej, Pomorski Uniwersytet Medyczny, Al. Powstańców Wielkopolskich 72, Szczecin; tel. (91) , Artykuł otrzymano 1 kwietnia 2014 r. Artykuł zaakceptowano 24 czerwca 2014 r. Słowa kluczowe: sfingolipidy, ekstrakcja sfingolipidów, RP-HPLC, LC-MS/MS Wykaz skrótów: ALP fosfataza alkaliczna; FMOC-CL chloromrówczan 9-fluorenylometylu; FTY fingolimod; LC-MS/MS chromatografia cieczowa połączoną z tandemową spektrometrią mas; NDA aldehyd naftaleno-2,3-dikarboksylowy; OPA dialdehyd o-ftalowy; RP-HPLC wysokosprawna chromatografia cieczowa w układzie odwróconych faz; sfingozyno-1-fosforan; Sph sfingozyna; UPLC-MS/MS ultrasprawna chromatografia cieczowa w połączeniu z tandemową spektrometrią mas CERAMIDO-1-FOSFORAN Kinaza ceramidu Fosfataza C1P Desaturaza dihydroceramidu Syntaza sfingomieliny DIHYDROCERAMID CERAMID SFINGOMIELINA Sfingomielinaza Syntaza diceramidowa Diceramidaza Ceramidaza Syntaza ceramidu SFINGANINA SFINGOZYNA Kinaza sfingozyny Fosfataza SFINGOZYNO-1-FOSFORAN Rycina 1. Metabolizm sfingolipidów. Postępy Biochemii 60 (3)

2 Materiał biologiczny (np. hodowane komórki, homogenaty tkankowe, surowica) + chloroform : 1M NaCl (1:1, v/v) + 3M NaOH (10000 rpm, 3 minuty) Reekstrakcja górnej warstwy Połączenie 3 wyekstrahowanych faz + chloroform + woda alkaiczna + 2 NH 4 OH Trzykrotna ekstrakcja Inkubacja (37ºC, 60 minut) + 0,15M KOH Połączenie obu faz zawierających i inne sfingolipidy Suszenie w strumieniu ciekłego azotu ANALIZA HPLC + etanol Inkubacja (67ºC, 25 minut) + OPA Inkubacja (temp. pokojowa, 20 minut) Rycina 2. Ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [10]) oparta na enzymatycznej defosforylacji, analizie HPLC z derywatyzacją za pomocą mieszaniny OPA. rębie genów związanych z metabolizmem sfingolipidów [4]. Sfingolipidami wywierającymi największy wpływ na procesy komórkowe są sfingozyna, sfingozyno-1-fosforan, ceramid oraz sfingomielina [5]. Z w/w punktów widzenia jak najlepsze poznanie udziału tytułowych związków w funkcjonowaniu komórkowych struktur błonowych jak i ich roli sygnałowej ma kluczową rolę w poznaniu funkcjonowania organizmów (szczególnie wyższych) jako takich. CHARAKTERYSTYKA OGÓLNA WYBRANYCH SFINGOLIPIDÓW Sfingozyna (Sph) jest to 18-węglowy, jednonienasycony aminoalkohol. W cząsteczce do grupy hydroksylowej Sph przyłączona jest reszta fosforanowa [6]. Sph działa wielokierunkowo (efekt plejotropowy) na kinazy białkowe. Wpływa również na cytoszkielet aktynowy, proces endocytozy, cykl komórkowy, apoptozę, a także na wzrost komórek. Jest prekursorem dla [1,7]. Sfingozyno-1-fosforan () to bioaktywny sfingolipid syntetyzowany między innymi w płytkach krwi i komórkach tucznych [8]. Jest związkiem o właściwościach amfipatycznych, nie przechodzącym przez hydrofobowe błony komórkowe z powodu obecności w cząsteczce polarnej głowy fosforanowej. Na komórki docelowe wpływa za pośrednictwem zlokalizowanych na ich powierzchni receptorów sprzężonych z białkiem G [6]. Stężenia tego lipidu różnią się nie tylko między gatunkami, ale także między różnymi osobnikami tego samego gatunku [9]. Stężenie jest ponadto zależne od rodzaju komórek i ich kondycji [10]. występuje w ludzkim osoczu w stężeniach nanomolowych [11]. Pełni on istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, wpływa między innymi na wzrost i przeżycie komórek, na proliferację i migrację komórek śródbłonka, odgrywa rolę w cyrkulacji limfocytów oraz formowaniu się naczyń krwionośnych w procesie angiogenezy [12]. Wzrost syntezy zaobserwowano w wielu stanach patologicznych związanych z rozwojem nowotworów, alergii, miażdżycy, a także chorób autoimmunologicznych [13]. Ceramid (Cer) zajmuje centralną pozycję w metabolizmie wszystkich sfingolipidów, jest integralną częścią podwójnej warstwy lipidowej, stanowiącej podstawowy element strukturalny błony komórkowej. Cer jest zaangażowany w regulację procesów transdukcji sygnałów (zapoczątkowuje zatrzymanie cyklu komórkowego i promuje proces apoptozy). Pełni ważną rolę w regulacji autofagii (degradacji wielkocząsteczkowych składników cytoplazmy), różnicowaniu i przeżywalności komórek. Głównym metabolitem ceramidu jest ceramido-1-fosforan (C1P), który jest syntetyzowany z ceramidu w wyniku jego fosforylacji katalizowanej 372

3 + 1M NaCl mieszadło Materiał biologiczny (np. tkanki, surowica, osocze) + metanol + 18,5% HCl + chloroform (50 rpm, 3 minuty) (1900 g, 3 minuty) Połączenie obu faz zawierających i inne sfingolipidy wirówka próżniowa (50ºC, 50 minut) + dioksan + 70 mm K 2 HPO 4 + FMOC-Cl Inkubacja (temp. pokojowa, 20 minut) ANALIZA HPLC Rycina 3. Jednostopniowa ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [20]) metodą HPLC z wykorzystaniem FMOC-CL do derywatyzacji. przez kinazę ceramidu. Istnieje coraz więcej dowodów, że C1P może regulować proliferację komórek i apoptozę oraz że jest silną cząsteczką o działaniu prozapalnym. C1P odgrywa również ważną rolę w fagocytozie, jak również jest kluczowym czynnikiem biorącym udział w regulacji chemotaksji makrofagów [14]. Sph i Cer hamują wzrost komórek oraz ich apoptozę w przeciwieństwie do i C1P, które stymulują wzrost, migrację i przeżywalność komórek. Wzajemne stosunki ilościowe pomiędzy tymi lipidami decydują o losie komórek, ich proliferacji lub programowanej śmierci komórki [15]. Sfingomielina (SM) jest zlokalizowana głównie w zewnętrznej warstwie błony komórkowej, występuje w tkance nerwowej (jest jej szczególnie dużo w ośrodkowym układzie nerwowym) oraz we krwi. SM może być hydrolizowana przez fosfodiesterazę sfingomielinową (sfingomielinazę) do ceramidu i fosfocholiny. Wraz z ceramidem cząsteczka ta jest zaangażowana w regulację wzrostu, różnicowania i/ lub śmierci komórek. Wrodzony niedobór kwaśnej sfingomielinazy wpływa na zaburzenia pamięci i towarzyszy rozwojowi choroby Niemanna-Picka u ludzi [16]. METODY EKSTRAKCJI WYBRANYCH SFINGOLIPIDÓW Z RÓŻNYCH MATERIAŁÓW BIOLOGICZNYCH Doniesienia dotyczące stężeń sfingolipidów w surowicy, osoczu, elementach morfotycznych krwi czy ekstraktach komórkowych/tkankowych różnią się istotnie w zależności od zastosowanej przez autorów metody ich ekstrakcji, a następnie oznaczania [17]. Ze względu na potencjalne możliwości jonizacji cząsteczek sfingolipidów oraz na możliwe przenoszenie zanieczyszczeń, wiele metod służących do analizy podstawowych sfingolipidów nie daje możliwości porównania ich stężeń [18]. Większość z nich opiera się na złożonej, podwójnej (kwas/zasada) procedurze ekstrakcji [19]. Min i wsp. opisali metodę jednoczesnego pomiaru i innych sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych (Ryc. 2). Metoda ta polega na enzymatycznej defosforylacji przez fosfatazę zasadową (ALP) oraz analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), w której do uzyskania pochodnych sfingolipidów wykorzystuje się mieszaninę dialdehydu o-ftalowego (OPA) [10]. Andréani i wsp. [20] zaproponowali nową uproszczoną metodę ekstrakcji dla sfingolipidów (Ryc. 3), w wyniku której ekstrahowane są formy sfingolipidów zarówno z przyłączoną, jak i nie przyłączoną grupą fosforanową, które poddawane są analizie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Hanel i wsp. [9] opisali jednostopniową metodę oznaczania stężenia w erytrocytach, surowicy i osoczu w postaci pochodnych chloromrówczanu 9-fluorenylometylu (FMOC-CL) i analizowanych techniką HPLC (Ryc. 4). Postępy Biochemii 60 (2)

4 + 1M NaCl mieszadło Materiał biologiczny (np. erytrocyty, surowica, osocze) + metanol + stęż. HCl + chloroform (50 rpm, 3 minuty) (1900 g, 3 minuty) Połączenie obu faz zawierających i inne sfingolipidy wirówka próżniowa (48ºC, 45 minut) + dioksan + 70 mm K 2 HPO 4 + FMOC-Cl Inkubacja (temp. pokojowa, 20 minut) ANALIZA HPLC Rycina 4. Zmodyfikowana jednostopniowa ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [9]) z wykorzystaniem analizy metodą HPLC z derywatyzacją za pomocą mieszaniny NDA na podstawie [20]. Materiał biologiczny (np. osocze, lizaty komórkowe i tkankowe) + chloroform : metanol (1:2, v/v) + 1M NaCl + chloroform + stęż HCl Reekstrakcja dolnej warstwy (chloroform, stęż. HCl) Połączenie obu faz zawierających (13000 g, 2 minuty) wirówka próżniowa (48ºC, 45 minut) + etanol + NDA ANALIZA HPLC Rycina 5. Ekstrakcja jednostopniowa wybranych sfingolipidów (wg [19]) z wykorzystaniem sonifikacji i analizy HPLC z derywatyzacją za pomocą mieszaniny NDA. 374

5 Materiał biologiczny (np. osocze, lizaty komórkowe i tkankowe) + chloroform : metanol (1:2, v/v) + 1M NaCl + chloroform + 3M NaOH Reekstrakcja dolnej warstwy (chloroform, steż. HCl) Połączenie obu faz zawierających (13000 g, 2 minuty) + chloroform + stęż. HCl ANALIZA HPLC (13000 g, 2 minuty) + etanol + NDA Przeniesienie dolnej fazy zawierającej do nowej probówki wirówka próżniowa (48ºC, 45 minut) Rycina 6. Ekstrakcja dwustopniowa wybranych sfingolipidów (wg [19]) z wykorzystaniem sonifikacji i anlizy HPLC z derywatyzacją za pomocą mieszaniny NDA. He i wsp. opracowali prostszą, jednostopniową metodę ekstrakcji (Ryc. 5) i porównali ją z dwustopniową procedurą ekstrakcji (Ryc. 6) wykorzystując jako źródło lipidów lizaty komórkowe. Derywatyzację przeprowadzili aldehydem naftaleno-2,3-dikarboksylowym (NDA). Uzyskane pochodne analizowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz (RP-HPLC) [19]. Zarówno Hanel i wsp. jak i He i wsp. uzyskali wyniki zgodne z wcześniejszymi doniesieniami, wskazujące na duże stężenia we krwi i małe stężenia w ekstraktach komórkowych [10,21]. He i wsp. opracowali również metodę RP-HPLC z derywatyzacją za pomocą NDA do jednoczesnego ilościowego oznaczania stężenia Cer i Sph w próbkach biologicznych. Aby oznaczyć stężenie tych lipidów wykorzystano dwie różne metody ekstrakcji: metodę,,grzania oraz metodę,,rozpuszczalnika (Ryc. 7). W wyniku przeprowadzenia tych doświadczeń nie zaobserwowano znaczących różnic między tymi dwiema metodami ekstrakcji, co sugeruje, że Cer i Sph mogą być ekstrahowane przez detergenty i można pominąć stosowanie rozpuszczalników organicznych. Opracowane metody ekstrakcji trwają zaledwie 5 minut, co umożliwia oznaczanie wielu próbek w krótkim czasie [7]. Metoda opracowana przez He i wsp. umożliwia jednoczesne oznaczanie ceramidu i sfingozyny, przy czym do oznaczeń używane są znacznie mniejsze stężenie NDA i NaCN w porównaniu z wcześniejszymi metodami [7,22]. Bode i wsp. opisali metodę ekstrakcji wykorzystywaną do oznaczania stężenia tego lipidu w erytrocytach i w osoczu. Jest to metoda jednostopniowa, w której otrzymywane są pochodne FMOC-CL (Ryc. 8) i analizowane metodą RP-HPLC, metodą pozytywnej jonizacji przez elektrorozpylanie w polu elektrycznym (ESI) oraz metodą chromatografii cieczowej połączonej z tandemową spektrometrią mas LC-MS/MS [23]. Lan i wsp. opracowali jednoetapową procedurę ekstrakcji przy użyciu metanolu. Pozwala ona skutecznie odzyskać sfingolipidy z próbek biologicznych (Ryc. 8), a ich analiza z wykorzystaniem metody pozytywnego ESI LC- -MS/MS umożliwia jednoczesne oznaczenie stężenia i Sph z wykorzystaniem C17-Sph i C17- jako wzorców wewnętrznych. Metanol, wykorzystywany zarówno jako faza ruchoma jak i rozpuszczalnik dla próbek sprawia, że można je bezpośrednio wstrzykiwać do systemu LC-MS/ MS, zwiększa również ich selektywność i poprawia kształty pików [24]. Cutignano i wsp. opracowali i przeprowadzili walidacje metody ekstrakcji lipidów z osocza krwi opartą na klasycznej metodzie Folcha. Wprowadzając niewielkie modyfikacje wykorzystali ją do oznaczenia stężenia i dihydrosfingo- Postępy Biochemii 60 (3)

6 Metoda grzania Metoda rozpuszczalnika Ogrzewanie materiału badanego w obecności 0,2% Igepal CA-630 Materiał badany + chloroform : metanol (1:2, v/v) + 1M NaOH (5000 g, 2 minuty) ANALIZA HPLC Przeniesienie dolnej warstwy zawierającej do nowej probówki Wirówka próżniowa (48ºC, 45 minut) + 7,5% n-oktylo-β-glukopiranozyd + 5mM kardiolipina + 1mM DTPA + NDA Rycina 7. Ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [7]) z wykorzystaniem detergentów metodą,,grzania oraz metodą,,rozpuszczalnika z wykorzystaniem analizy metodą HPLC z derywatyzacją za pomocą mieszaniny NDA. Metoda grzania Metoda rozpuszczalnika Ogrzewanie materiału badanego w obecności 0,2% Igepal CA-630 Materiał badany + chloroform : metanol (1:2, v/v) + 1M NaOH (5000 g, 2 minuty) ANALIZA HPLC Przeniesienie dolnej warstwy zawierającej do nowej probówki Wirówka próżniowa (48ºC, 45 minut) + 7,5% n-oktylo-β-glukopiranozyd + 5mM kardiolipina + 1mM DTPA + NDA Rycina 8. Jednostopniowa ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [23]) oraz analizy metodą RP-HPLC, ESI lub LC-MS/MS z wykorzystaniem FMOC-CL do derywatyzacji. 376

7 Materiał biologiczny (np. osocze) + standard wewnętrzny C17-Sp / C17- + metanol (12000 rpm, 5 minut) ANALIZA LC- MS/MS Przeniesienie górnej warstwy do nowej probówki Rycina 9. Jednostopniowa ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [10]) z wykorzystaniem metanolu oraz analizy metodą LC-MS/MS. + chloroform Materiał biologiczny (np. osocze) + nasycony NaPO 3 rozpuszczony w metanolu (3600 rpm, 20 minut, 4ºC) Suszenie w strumieniu ciekłego azotu Połączenie obu faz zawierających + metanol + acetonitryl : woda (8:2, v/v) Wirowanie (1000 rpm, 30 sekund) ANALIZA ESI-LC-MS/MS (kolumna UPLC) Rycina 10. Ekstrakcja wybranych sfingolipidów (wg [25]) w oparciu o zmodyfikowaną metodę Folcha i analizy UPLC-MS/MS. zyno-1-fosforanu (DH-) metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej w połączeniu z tandemową spektrometrią mas (UPLC-MS/MS) z negatywną ESI (Ryc. 10) [25]. TECHNIKI STOSOWANE DO ANALIZY STĘŻENIA WYBRANYCH SFINGOLIPIDÓW W RÓŻNYCH MATERIAŁACH BIOLOGICZNYCH Analiza jakościowa i ilościowa sfingolipidów w próbkach biologicznych jest trudna ze względu na wyjątkowy charakter fizykochemiczny tych cząsteczek oraz występowanie wielu z nich w niewielkich stężeniach w badanych materiałach biologicznych [26]. Do oznaczenia wewnątrzkomórkowego czy zewnątrzkomórkowego stężenia sfingolipidów niezbędne są metody czułe i specyficzne [20,27]. Yatomi i wsp. jako jeden z pierwszych opisał metodę oznaczania stężenia opartą na jego modyfikacji chemicznej polegającą na acetylowaniu znakowanym bezwodnikiem octowym. Powstający radioaktywny, acetylowany Postępy Biochemii 60 (3)

8 jest rozdzielany metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC), a jego stężenie jest oznaczane techniką cieczowej spektroskopii scyntylacyjnej. Jest to metoda o dość dużej czułości, jednakże w obecności związków o podobnej strukturze takich jak: sfinganino-1-fosforan (Sa1P) i, nie jest możliwe oznaczenie stężenia związków Sph i dihydro- -sfingozyny (DH-Sph), czy DH- [10,11,17,20]. Ponadto procedura opisana przez Yatomi i wsp. jest uciążliwa i pracochłonna, wymaga zastosowania radioaktywnych czynników i specjalistycznej aparatury. Jej słabym punktem jest również to, że nie mierzy bezpośrednio endogennego [26]. Rok później pojawiły się doniesienia Edsall i wsp, którzy do oznaczenia wykorzystali metodę enzymatyczną, w której był hydrolizowany do sfingozyny przez ALP, a następnie fosforylowany przez rekombinowaną kinazę sfingozyny z wykorzystaniem znakowanego [gamma- 32 P]ATP. Badacze donosili, że jest to metoda prosta, specyficzna, czuła, którą można wykorzystać do pomiaru stężenia w surowicy, komórkach i tkankach [28]. Kolejną metodą, wykorzystywaną do oznaczeń ilościowych sfingolipidów w osoczu, surowicy, czy płytkach krwi, dającą także możliwość pomiaru aktywności kinazy sfingozyny w różnych próbkach biologicznych jest RP-HPLC [20]. Metoda ta stanowi ważne narzędzie dla badaczy zajmujących się wyjaśnieniem roli sfingolipidów w przekazywaniu sygnału, wzrostu i różnicowania komórek oraz patogenezy i leczenia wielu chorób [19]. Metoda RP-HPLC jest wykorzystywana do oznaczenia stężenia Sph i Sa w moczu, tkankach szczurów i ludzi [29] oraz stężenia w ludzkim osoczu, surowicy, płytkach krwi, a także w drożdżach Saccharomyces cerevisae z mutacją genu odpowiedzialnego za metabolizm sfingolipidów [30]. Tabela 1. Czasy retencji (Rt) wybranych sfingolipidów w zależności od ph fazy ruchomej (wg [30]). Sfingolipid Rt [min] faza ruchoma ph 5,5 Rt [min] faza ruchoma ph = 5,5 Sfingozyno-1-fosforan 13,8 16,3 Sfinganino-1-fosforan 21,5 26,0 4D-hydroksysfinganina 13,9 13,7 Sfingozyna 23,0 22,6 Sfinganina 38,0 37,5 Analiza metodą RP-HPLC jest poprzedzana derywatyzacją sfingolipidów za pomocą różnych związków (OPA, NDA, FMOCL-CL). Uzyskane pochodne różnią się stabilnością. Caligan i wsp. stwierdzili, że głównym czynnikiem mającym wpływ na stabilność mieszaniny OPA jest temperatura. Okres półtrwania tego związku w temperaturze pokojowej wynosi maksymalnie 4h. Pochodne OPA zachowują stabilność około 10 godzin w temperaturze 4 C. Na poprawę stabilności OPA wpływa EDTA dodawany do mieszaniny reakcyjnej [30]. Caligan i wsp. z dużą wydajnością (85%) ekstrahowali próbki osocza i surowicy standardową procedurą opisaną przez Yatomi i wsp [17]. Ekstrakty następnie suszono w wirówce próżniowej i rozpuszczano w 200 µl metanolu, do którego dodawano 0,1 M KOH w celu usunięcia glicerolipidów. Próby inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37 C, a następnie dodawano mieszaninę OPA. Uzyskane pochodne analizowano metodą RP-HPLC przy użyciu kolumny LiChroprep RP-18. Ustalona przez badaczy optymalna szybkość przepływu przez kolumnę wynosiła 2 ml/min, a wprowadzenie przez nich fazy ruchomej o ph 5,5 umożliwiało przesunięcie czasu retencji, co zapobiegło nakładaniu się pików innych sfingolipidów takich jak 4-D-hydroksysfinganiny na i Sa1P na Sph (Tab. 1, Ryc. 11, Ryc. 12). Stężenie analizowano na podstawie porównania ze standardem wewnętrznym. Metoda RP-HPLC opracowana przez Caligana i wsp. jest szybsza, bardziej czuła i bardziej wydajna niż wcześniej opisane metody. Pozwala na oznaczenie stężenia sfingolipidów w materiałach biologicznych zawierających ich duże stężenia (szczególnie ) [30]. Rok później Ruwisch i wsp. zaproponowali szybką metodę oznaczania i innych sfingolipidów opartą na analizie RP-HPLC w stężeniach pikomolowych nawet w złożonych układach biologicznych [27]. Dla oddzielenia od innych sfingolipidów wykorzystano zmodyfikowaną dwustopniową metodę ekstrakcji, która została wcześniej opisana przez Yatomi i wsp [17], a następnie wykorzystana przez Caligana i wsp. [30]. Modyfikacja tej metody ekstrakcji opierała się na wykorzystaniu do alkalizacji wodorotlenku sodu [27]. Zmiana odczynnika przyczyniła się do zwiększenia odzy- Rycina 11. Chromatogramy dostępnych komercyjnie standardów analizowanych metodą RP-HPLC (faza ruchoma ph 5,5). Wykres pokazuje profile wymywania pochodnych OPA na kolumnie HPLC z odwróconą fazą. Objaśnienia skrótów: (4-HO-Sa) 4-hydroksysfinganina, () sfingozyno-1-fosforan, (Sph) sfingozyna, (Sa1P) sfinganino-1-fosforan, (Sa) sfinganina. Na podstawie [30]. 378

9 Tabela 2. Zalety i wady wykorzystywania metody RP-HPLC do oznaczania bioaktywnych sfingolipidów (wg [10,26,27,31]). Zalety RP-HPLC możliwość użycia jako wzorca wewnętrznego, C17-, który zwiększa dokładność ilościowej analizy duża powtarzalność wyników, szczególnie przy niewielkich stężeniach sfingolipidów brak konieczności stosowania specjalistycznych odczynników np. radioaktywnych izotopów czy rekombinowanej kinazy sfingozyny metoda bezpieczna, nie wymaga bardzo zaawansowanego sprzętu laboratoryjnego Wady RP-HPLC sfingolipidy mogą ulec kontaminacji w fazie wodnej procedura nie jest odpowiednia dla oznaczania w niektórych tkankach, w których zawartość jest bardzo duża przygotowanie próbek do analizy wymaga dużego nakładu pracy wymaga dużych objętości rozpuszczalników sków z 24 ± 2% do 55 ± 7%. Jako standard wewnętrzny wykorzystano DH-, którego stężenie w hodowlach komórkowych jest niemal zerowe, a w pozostałych próbkach biologicznych bardzo małe. Do derywatyzacji wykorzystano OPA, za optymalny czas derywatyzacji uznano 15 minut. Pochodne OPA przechowywano w temperaturze 4 C. Próbki rozdzielano metodą HPLC. Prowadzono elucję gradientową z wykorzystaniem metanolu i 0,07 M buforu K 2 HPO 4. Procedura ta pozwoliła na uzyskanie powtarzalnego pomiaru stężenia w szerokim zakresie od 0,5 pmol do 0,2 nm. Zastosowany w tej metodzie siarczan tetrabutyloamoniowy (TBHS) powoduje przesunięcie czasów retencji, między innymi: i DH- (nie zmienia ich powierzchni). Dzięki wykorzystaniu ALP wykluczono nakładanie się pików Sph i Sa (powstających w wyniku konwersji enzymatycznej). Stężenie zostało oznaczone w różnych próbkach biologicznych takich jak surowica, płytki krwi, wczesne keratynocyty i w kilku podstawowych liniach komórkowych (Tab. 3) [27]. Zawartość w płytkach była bardzo zbliżona do zawartości oznaczonej meto- Tabela 3. Stężenia wybranych sfingolipidów analizowanych metodą RP-HPLC (derywatyzacja za pomocą OPA lub NDA). Sfingolipid Rodzaj materiału biologicznego Odczynnik zastosowany do derywatyzacji Stężenie oznaczanego związku Piśmiennictwo Cer osocze mysie (EDTA) 0,15 [pmol/µg białka] NDA Sph osocze mysie (EDTA) 0,37 [pmol/µg białka] surowica płodowa bydlęca ± 21.6 [pmol/mg białka] surowica płodowa cielęca ± 4.8 [pmol/mg białka] surowica końska ± 16.5 [pmol/mg białka] surowica płodowa bydlęca 9.5 ± 6.4 [pmol/mg białka] Sa1P surowica płodowa cielęca 24.6 ± 0.4 [pmol/mg białka] surowica końska 48.9 ± 7.0 [pmol/mg białka] OPA surowica płodowa bydlęca 72.6 ± 5.3 [pmol/mg białka] Sph surowica płodowa cielęca 47.8 ± 2.8 [pmol/mg białka] surowica końska 15.2 ± 0.6 [pmol/mg białka] surowica płodowa bydlęca 12.3 ± 0.4 [pmol/mg białka] Sa surowica płodowa cielęca 8.1 ± 1.5 [pmol/mg białka] surowica końska 8.3 ± 1.5 [pmol/mg białka] osocze ludzkie 450 [pmol/ml] osocze końskie NDA 250 [pmol/ml] osocze mysie 123 [pmol/ml] surowica ludzka 982 ± 89 [pmol/ml] płytki krwi ludzkie OPA 84 ± 15 [pmol/10 8 komórek] DH- płytki krwi ludzkie < 5 [pmol/10 8 komórek] surowica ludzka 1130 ± 140 [pmol/ml] osocze ludzkie (EDTA) 473 ± 87 [pmol/ml] OPA płytki krwi ludzkie 5.2 ± 0.2 [nmol/10 8 komórek] Sa1P płytki krwi ludzkie 8.0 ± 1.1 [nmol/10 8 komórek] krew pełna ludzka 1155 [pmol/ml] osocze ludzkie 153 [pmol/ml] erytrocyty ludzkie OPA 589 [pmol/ml] płytki krwi ludzki 341 [pmol/ml] Sph krew pełna ludzka 79 [pmol/ml] [14] [10] [19] [27] [30] [32] Postępy Biochemii 60 (3)

10 Rycina 12. Chromatogramy dostępnych komercyjnie standardów analizowanych metodą RP- HPLC (faza ruchoma ph = 5,5). Wykres pokazuje profile wymywania pochodnych OPA na kolumnie HPLC z odwróconą fazą z użyciem metanolu, jako eluentu (rozpuszczalnika). Objaśnienia skrótów: (4-HO-Sa) 4-hydroksysfinganina, () sfingozyno-1-fosforan, (Sph) sfingozyna, (Sa1P) sfinganino-1-fosforan, (Sa) sfinganina. Na podstawie [30]. dą radioaktywną opisaną przez Yatomi i wsp. [17]. Ruwish i wsp. stwierdzili, że wielkość odzysku nie zależy od rodzaju materiału biologicznego. Metoda ta jest bardziej czuła i specyficzna, w porównaniu z wieloma wcześniej opisywanymi [29,30]. Daje ona możliwość oznaczenia zawartości w komórkach i ekstraktach komórkowych, a także na ocenę zmian zawartości wewnątrzkomórkowej po ich stymulacji agonistą [27]. Min i wsp. opisali metodę, która w sposób powtarzalny pozwoliła na ocenę stężenia podstawowych sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych, takich jak surowica, hodowle komórkowe czy homogenaty tkankowe szczura, w szerokim zakresie stężeń od 0,5 do 100,0 pmol. Do jednoczesnego pomiaru stężenia i innych sfingolipidów Min i wsp. wykorzystali metodę analityczną, na którą składały się dwa etapy, enzymatyczna defosforylacja przez ALP ułatwiająca rozpuszczanie sfingolipidów w warstwie chloroformowej, a następnie derywatyzacja z wykorzystaniem OPA i analiza HPLC. Wzorcami wewnętrznymi w metodzie Min i wsp. były C17- (Rt = 6,4 min) i C17-Sph (Rt = 5,6 min) (Ryc. 13). Jest to metoda prosta, czuła, szczególnie przydatna do jednoczesnego oznaczania i innych sfingolipidów w surowicy krwi, tkankach biologicznych i w hodowlach różnych linii komórkowych. Badacze zwracają uwagę na wiele zalet tej techniki, ale także opisują jej wady Rycina 13. Chromatogramy dostępnych komercyjnie standardów analizowanych metodą RP- HPLC. Wykres pokazuje profile wymywania pochodnych OPA na kolumnie HPLC z odwróconą fazą z użyciem 90% acetonitrylu, jako eluentu (rozpuszczalnika). (A) Ekstrakcja poprzedzona defosforylacją sfingolipidów za pomocą fosfatazy alkalicznej (ALP). (B) Ekstrakcja sfingolipidów bez ich defosforylacji ALP. Objaśnienia skrótów: (4-HO-) 4-fitosfingozyno-1-fosforan, (C17- ) C17-sfingozyno-1-fosforan, () sfingozyno-1-fosforan, (Sa1P) sfinganino-1-fosforan. Na podstawie [10]. (Tab. 2), przede wszystkim ostrzegają przed możliwością zawyżenia poziomu w wyniku użycia ALP podczas ekstrakcji [10]. Butter i wsp. opisali metodę analityczną, w której do oznaczania w osoczu wykorzystali ekstrakcję do fazy stałej (SPE), walidacja tej metody potwierdziła jej użyteczność. Czas retencji dla wzorca wewnętrznego C17- wynosi 5,4 min, a dla 7,2 minuty. Czasy retencji innych sfingolipidów, które mogą pojawić się podczas rozdziału nie przeszkadzają w pomiarze stężenia powyżej 1000 ng/ml. Wykorzystanie kolumn SPE w metodzie Butter a i wsp. jest mniej czasochłonne w porównaniu z metodami ekstrakcji typu,,ciecz-ciecz, daje to możliwość oznaczania stosunkowo dużej liczby próbek w krótkim czasie [11]. Ze względu na małą stabilność OPA w warunkach derywatyzacji He i wsp. zaproponowali metodę RP-HPLC, służącą do określenia poziomu w różnych materiałach biologicznych, która opiera się na derywatyzacji stabilnym i bardzo czułym fluorogennym odczynnikiem NDA. W metodzie tej granica wykrywalności (LOD) dla wynosiła 20,9 fmol (12,6 nm), natomiast granica oznaczalności (LOQ) 69,6 fmol (41,7 nm). Odzysk wynosił około 98%. Średnie 380

11 względne odchylenie standardowe (RSD) zarówno w serii jak i pomiędzy seriami wynosił odpowiednio 4,1% i 7,7%. Czas analizy dla jednej próbki został skrócony do 7 minut. Metoda ta nie wymaga dwuetapowych procedur ekstrakcji, defosforylacji, czy użycia radioaktywnego znakowania. Aby potwierdzić skuteczność tej metody oznaczono stężenie w ludzkim, końskim i mysim osoczu. Średnie wartości wynosiły odpowiednio 0,45, 0,25, 1,23 μm. Technikę tę zastosowano również do określenia ilości w tkankach myszy oraz w hodowlach komórkowych neuronów szczura przed i po podaniu sfingozyny. Zastosowanie NDA podczas derywatyzacji powoduje wyraźne zróżnicowanie czasów retencji dla Sph (5,2 min) i (2,5 min) (Ryc. 14). W tkankach myszy i hodowlach komórkowych neuronów szczura wykazano niewielkie stężenie i Sph. Metoda z NDA może zapewnić szybkie, wydajne i powtarzalne oznaczanie ilości. Może być także stosowana do określania aktywności kinazy sfingozyny. Jej zaletą jest fakt, że analiza jest znacznie skrócona w porównaniu z innymi metodami, dlatego też może być zautomatyzowana i dostosowana do większości laboratoriów [19]. He i wsp. wykorzystali metodę RP-HPLC z derywatyzacją za pomocą NDA do ilościowego oznaczania poziomu Cer i Sph w próbkach biologicznych. W metodzie tej wykorzystywana jest oczyszczona ludzka, rekombinowana kwaśna ceramidaza, która całkowicie hydrolizuje Cer do Sph. Cer i Sph oznaczono w osoczu EDTA mysim, leukocytach oraz w hemoglobinie. Jest to metoda prosta, czuła i powtarzalna. Może być wykorzystywana do jednoczesnego oznaczania stężenia obydwu lipidów. Może być również dostosowana do ilościowego oznaczania poziomu sfingomieliny (SM) i. W przyszłości może okazać się ważnym narzędziem dla badaczy badających rolę metabolizmu Cer i Sph w transdukcji sygnału, wzrostu i różnicowania komórek oraz patogenezy i leczenia raka [7]. Lee i wsp. opisali metodę opierającą się na szczególnym rodzaju chromatografii powinowactwa do jonów metali (IMAC), polegającą na selektywnym wiązaniu cząsteczek i DH- z Fe 3+. Wymywana z kolumny powinowactwa cząsteczka jest następnie defosforylowana, poddawana derywatyzacji z użyciem OPA i analizowana metodą RP-HPLC. Wzorcem wewnętrznym wykorzystywanym w tej metodzie jest C17-. Zakres liniowości dla tej metody obejmuje stężenia od 10 do 100 pmol. Została ona wykorzystana do oznaczenia zawartości i DH- w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Wykazano, że poziom w tych komórkach jest stosunkowo niewielki i nie zawierają DH-. Połączenie chromatografii metalopowinowactwa z techniką RP-HPLC może być wykorzystywane do wykrywania i oznaczania niewielkich ilości i DH- w płynach biologicznych oraz w hodowlach komórkowych. Jest to metoda prosta, szybka i czuła. Badania wskazują, że może być z powodzeniem wykorzystywana do oznaczania także innych lipidów, takich jak: kwas lizofosfatydowy, kwas fosfatydowy czy ceramido-1-fosforan [26]. Doniesienia dotyczące stężeń sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych analizowanych metodą RP- -HPLC różnią się istotnie w zależności od zastosowanej przez autorów metody ekstrakcji czy odczynnika wykorzystywanego do derywatyzacji (Tab. 3). Rycina 14. Chromatogramy dostępnych komercyjnie standardów analizowanych metodą RP- HPLC. Wykres pokazuje profile wymywania pochodnych NDA na kolumnie HPLC z odwróconą fazą z użyciem metanolu, jako eluentu (rozpuszczalnika). (A) etanol, (B) Sph sfingozyna, (C) sfingozyno-1-fosforan. Na podstawie [19]. Jednym z głównych problemów podczas oznaczeń sfingolipidów jest ich zróżnicowana rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych oraz w wodzie. Jest to jedna z przyczyn utraty częściowej ilości tych lipidów podczas ekstrakcji, szczególnie 2-etapowej [24]. Van Veldhoven i wsp. opisali metodę, w której ulega reakcji z N-fenylo-3-karbaminianem i uzyskana pochodna jest analizowana z wykorzystaniem Postępy Biochemii 60 (3)

12 Tabela 4. Stężenia wybranych sfingolipidów analizowanych metodami chromatografii cieczowej połączonymi ze spektrometrią masową (LC-MS/MS). Sfingolipid Rodzaj materiału biologicznego Zastosowana technika Stężenie badanego związku Piśmiennictwo osocze ludzkie 212 ± 59 [pmol/ml] osocze mysie 205 ± 28 [pmol/ml] LC-MS/MS osocze ludzkie 46 ± 15 [pmol/ml] DH- osocze mysie 46 ± 15 [pmol/ml] osocze ludzkie pozytywne ESI 243 ± 68 [pmol/ml] erytrocyty ludzkie LC-MS/MS 2,313 ± 522 [pmol komórek ] osocze (heparyna) ludzkie 75,6 ± 4,1 [ng/mg białka] LC-MS/MS Sph osocze (heparyna) ludzkie 10,5 ± 0,9 [ng/mg białka] osocze (EDTA) ludzkie 176,7 ± 54,0 [ng/ml] osocze (EDTA) mysie 201,0 ± 72,0 [ng /ml] UPLC-MS/MS osocze (EDTA) ludzkie 81,2 ± 23,3 [ng/ml] Sa1P osocze (EDTA) mysie 96,5 ± 20,1 [ng /ml] osocze ubogopłytkowe ludzkie 590,8 ± 42,1 [pmol/mg białka] surowica płodowa bydlęca pozytywne ESI 141,7 ± 4,6 [pmol/mg białka] osocze ubogopłytkowe ludzkie LC-MS/MS 130,7 ± 20,7 [pmol/mg białka] DH- surowica płodowa bydlęca 0,6 ± 0,2 [pmol/mg białka] osocze ludzkie 703 ± 41 [pmol/ml] osocze mysie 1,310 ± 190 [pmol/ml] negatywne ESI MS/MS osocze ludzkie 327 ± 34 [pmol/ml] DH- osocze mysie 670 ± 40 [pmol/ml] [20] [23] [24] [25] [31] [34] spektrometru mas (MS) [32]. W ostatnich latach coraz większym zainteresowaniem cieszy się metoda analizy sfingolipidów typu,,shotgun, gdzie próbki wprowadzane są bezpośrednio do spektrometru masowego. Metody te są prostsze i bardziej czułe w porównaniu z metodami HPLC [33]. Metody typu,,shotgun wymagają jednak wieloetapowych procesów ekstrakcji, w celu zminimalizowania zakłóceń izobarycznych i efektów matrycy, co czyni te metody pracochłonnymi i czasochłonnymi [24]. W ostatnich latach za metody o największej czułości i specyficzności wykorzystywane do analizy jakościowej i ilościowej sfingolipidów oraz ich metabolitów są uznawane metody skojarzone takie jak chromatografia cieczowa połączoną ze spektrometrią masową (LC-MS), a szczególnie chromatografia cieczowa połączona z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) [13]. Jest to jedna z najbardziej zaawansowanych technik służących do ilościowego oznaczania sfingolipidów. Połączenie LC-MS/ MS z ESI (jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym) i/lub z MRM (wielkokrotne monitorowanie reakcji) są w ostatnich czasach w wielu laboratoriach uznawane za metody z wyboru przy oznaczaniu sfingolipidów [31]. Ze względu na różną zdolność sfingolipidów do jonizacji oraz ze względu na pojawiające się efekty maskujące zanieczyszczenia, także i w tych metodach napotyka się na różne trudności podczas oznaczania stężeń różnych sfingolipidów [20]. Szczególnie jest to widoczne przy pozytywnym ESI-LC-MS/MS, podczas którego obserwuje się szumy i możliwe jest zanieczyszczenie analitów z kolejnych wstrzyknięć. Aby wyeliminować z próbki zbyt duże tło podczas analizy, a także aby uniknąć znacznego efektu kontaminacji naukowcy wykorzystują przede wszystkim negatywne ESI LC-MS/MS [31]. Wartości dotyczące stężeń sfingolipidów w różnych materiałach biologicznych różnią się istotnie w zależności zastosowanej techniki, metody ekstrakcji czy mieszaniny do derywatyzacji (Tab. 4). Andreani i wsp. opracowali nowatorską metodę oznaczania sfingolipidów opartą na LC-MS/MS, w której uprościli sposób ekstrakcji tych lipidów z materiału biologicznego (wyekstrahowano zarówno formy sfingolipidów z przyłączoną i nie przyłączoną grupą fosforanową). Do derywatyzacji wykorzystano FMOC-CL, co umożliwiło oznaczenie ilości fingolimodu (FTY) i jego analogu z przyłączoną grupą fosforanową (FTY-P), które nie wchodzą w reakcje z OPA. Zastosowanie FMOC-CL zwiększyło czułość metody oraz pozwoliło na przesunięcie dolnej granicy wykrywalności do 20 fmol. Dzięki możliwości oznaczenia stężenia FTY, FTY-P,, Sph czy DH-Sph metoda ta sprzyja śledzeniu ważnych konwersji sfingolipidów, fosforylacji, defosforylacji, hydrolizacji i dehydrolizacji. Metoda ta ma kilka zalet w stosunku do innych metod opisanych w piśmiennictwie. Jej wydajność wynosiła 100%. Mimo, że jest to metoda kosztowna i pracochłonna możliwość jej zastosowania pozwala przede wszystkim na jednoczesne oznaczenie sfingolipidów oraz ich analogów w sposób dokładny i rutynowy wielu materiałach biologicznych m.in. w osoczu, surowicy, komórkach i tkankach [20]. Bode i wsp. analizowali zawartość i innych metabolitów sfingolipidów w erytrocytach metodą pozytywnej ESI LC-MS/MS (Tab. 4) [23]. Opisali również prostą metodę wykrywania i oznaczania ilości, a także innych sfingolipidów (DH-, DH-Sph, Cer, SM) w różnych materiałach biologicznych takich jak: homogenaty tkankowe, krew pełna i osocze krwi. Wzorcami wewnętrznymi były C17-Sph oraz C15-Cer. Lipidy ekstra- 382

13 Rycina 15. Reprezentatywne chromatogramy wybranych sfingolipidów (Sph, ) i komercyjnie dostępnych standardów wewnętrznych (C17-Sph, C17 ) analizowanych metodą pozytywnego ESI LC-MS/MS w komórkach HEK 293. Objaśnienia skrótów: (C17-Sph) C17-sfingozyna, (Sph) sfingozyna (C17-) C17- sfingozyno-1-fosforan () sfingozyno-1-fosforan. Na podstawie [24]. howano w środowisku kwaśnym przy użyciu mieszaniny chloroformu i metanolu (procedura Folcha) [13]. Lan i wsp. opracowali jednoetapową procedurę ekstrakcji przy użyciu metanolu, która pozwala skutecznie odzyskać sfingolipidy z próbek biologicznych z minimalnym efektem matrycy. Do określenia stężenia i Sph wykorzystali metodę pozytywnego ESI LC-MS/MS. Aby uzyskać optymalną fazę ruchomą wykorzystano mieszaninę różnych rozpuszczalników: metanolu, acetonitrylu i wody. Stwierdzono, że acetonitryl może skrócić czas rozdziału każdej próbki nawet o 2,0 min, ale powoduje rozszerzenie szczytów piku. Z kolei zwiększenie zawartości metanolu nie ma wpływu na kształt piku nawet pomimo wydłużenia czasu analizy. Dodatek kwasu mrówkowego zwiększa czułość metody i poprawia kształty pików. W wyniku tych doświadczeń opracowano optymalną fazę ruchomą składająca się z 95% metanolu i 5% wody (zawierająca dodatkowo 0,1% kwasu mrówkowego). Czasy retencji dla poszczególnych oznaczanych cząsteczek Sph,, C17-Sph, C17- wynosiły odpowiednio 1,78 min, 3,29 min, 1,75 min, 3,03 min (Ryc. 15). Dolna granica wykrywalności 1 ng/ml dla Sph i 0,1 ng/ml dla. Odzysk w tej metodzie wahał się w granicach od 79,02-88,51% dla Sph i 76,36-89,84% dla, 86,52 ± 4,36% dla C17-Sph, a 81,62 ± 6,24% dla C17-. Metodę tę wykorzystano do określenia poziomu Sph i w nerkach myszy, ludzkim heparynizowanym osoczu oraz w hodowlach ludzkich komórek HEK 293 (Tab. 4). Wyniki jakie uzyskano wskazują, że technika ta połączona z prostą ekstrakcją metanolem jest bardzo szybka, czuła i specyficzna [24]. Berdyshev i wsp. opisali metodę negatywnego ESI LC- -MS/MS wykorzystując ją do oznaczania i DH- w ubogopłytkowym osoczu i surowicy bydła domowego. Metoda ta daje możliwość wykrywania i DH- wstrzykniętego na kolumnę na poziomie mniejszym od 50 fmol. Czas rozdziału i DH- na kolumnie w jej przypadku wynosi 10 min [31]. Jiang i wsp. do oznaczenia stężenia i DH- w ekstraktach lipidowych wykorzystali negatywną metodę ESI MS/MS wykorzystując technikę typu,,shotgun. ekstrahowano w środowisku kwaśnym, które sprzyja poprawie wydajności tego procesu. W celu uniknięcia wpływu kwasu octowego na jonizację zobojętniono go za pomocą stężonego wodorotlenku amonu (v/v). Wydajność wynosiła od 58 do 98%. Wykazano szeroki zakres liniowości dla tej metody [33]. Cutignano i wsp. opracowali metodę UPLC-MS/MS w oparciu o negatywną ESI. Metodę tę wykorzystali do określenia stężenia i Sa1P w osoczu pochodzącym z myszy i człowieka. Ekstrakcję lipidów z osocza krwi przeprowadzono z wykorzystaniem modyfikowanej metody Folcha. Następnie wykorzystano UPLC, stosując jako rozpuszczalniki bufory o wysokiej molarności poprawiające rozdzielczość i zapobiegające przenoszeniu pików. Zakres liniowości dla tej metody wynosił ng/ml, dolna granica oznaczalności wynosiła 5,0 ng/ml (~ 13 nm), a granica wykrywalności dla bioaktywnych lipidów poniżej 5 pg (~ 12 fmol). Współczynnik zmienności dla precyzji i dokładności wynosił <15%. Jest to pierwsza metoda, w której wykorzystano negatywną ESI-LC-MS/MS bez derywatyzacji anali- Postępy Biochemii 60 (3)

14 tów, czego efektem było wzmocnienie wrażliwości MS/MS, zmniejszenie granicy oznaczalności poniżej 7 nm. Podczas etapu ekstrakcji użyto metafosforanu, co pozwoliło uniknąć skomplikowanej procedury frakcjonowania i pozwoliło uzyskać próbkę do bezpośredniej analizy metodą UPLC-MS o dużej czystości. Metoda ta pozwala na oznaczenia sfingolipidów w bardzo małych próbkach badanych materiałów biologicznych [25]. PODSUMOWANIE W ciągu ostatnich kilkunastu lat nastąpił znaczny postęp w poznaniu roli sfingolipidów, jako cząsteczek biorących udział w wielu istotnych procesach komórkowych. Sfingolipidami wywierającymi największy wpływ na te procesy są sfingozyna, sfingozyno-1-fosforan, ceramid oraz sfingomielina. Do chwili obecnej opracowano wiele metod analitycznych, wykorzystywanych do oznaczeń bioaktywnych sfingolipidów, szczególnie w osoczu i surowicy krwi, jednakże ich ogromne zróżnicowanie jest przyczyną różnic w zakresach wartości prawidłowych podawanych przez autorów, co znacząco utrudnia porównanie uzyskanych wyników. Są to metody z wykorzystaniem radioizotopów, izolowanej spektrometrii mas, metody oparte na modyfikacjach metod chromatograficznych (RP-HPLC) z różnymi rodzajami detekcji (detekcją fluorescencyjną, RP HPLC-FLD, pojedynczą detekcją masową, RP HPLC/MS oraz podwójną detekcją masową, RP HPLC-MS/MS. Większość z nich nie została poddana procedurze walidacyjnej. Niewiele jest doniesień na temat oznaczania sfingolipidów w erytrocytach, czy też płytkach krwi, elementach morfotycznych krwi, w których większość z nich jest syntetyzowana i/lub przechowywana. Niewątpliwie największym problemem, a zarazem wyzwaniem jest opracowanie takich metod ekstrakcji dla erytrocytów i płytek krwi, która zapewnią możliwie jak najmniejsze straty oznaczanego lipidu (wysoki odzysk). Tak niewielka liczba doniesień, szczególnie w przypadku erytrocytów, prawdopodobnie jest związana z trudnościami wynikającymi z obecności hemoglobiny w ekstrakcie, która podczas analizy zanieczyszcza kolumnę. Nasze wstępne doświadczenia wskazują także, że dużym problemem w analizie stężenia sfingolipidów są używane w celu obliczania odzysku syntetyczne wzorce (stosowane jako wewnętrzne standardy), niestabilne w warunkach ekstrakcji oraz mieszaniny wykorzystywane do derywatyzacji, których stabilność zależy zarówno od czasu wykorzystania, jak i temperatury ich przechowywania. Nasz zespół porównał większość metod ekstrakcji (zarówno jedno jak i dwustopniowych) opisywanych w niniejszym artykule w oparciu o metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie odwróconych faz przy użycia detektora fluorescencyjnego (RP HPLC-FLD). Wykonane doświadczenia pozwoliły na wyodrębnienie jednej z nich, która zapewniła stosunkowo wysoki i powtarzalny odzysk badanych substancji. Była to metoda opisana przez Hanel i wsp. [9]. Do metody tej wprowadziliśmy 2 modyfikacje, które pozwoliły nam na uzyskanie jeszcze wyższego odzysku (około 80-85%) ekstrahowanych substancji. Modyfikacje polegały na zmianach objętości stosowanych odczynników i materiału badanego, a do derywatyzacji zaczęliśmy wykorzystywać mieszaninę OPA z dodatkiem EDTA zgodnie z doniesieniami Caligan i wsp. [30]. Metoda ta jest bardzo dobra do oznaczania stężenie zarówno, jak i Sph. Podczas wykonywanych doświadczeń nasz zespół przeprowadził również badania mające na celu przedłużenie trwałości stosowanych do analizy wzorców syntetycznych. Wzorcem wewnętrznym wykorzystywanym najczęściej do oznaczania w materiale biologicznym jest C17 (D-erytro-sfingozyna), która nie występuje w osoczu w warunkach fizjologicznych. jest cząsteczką, która jest transportowana w osoczu w połączeniu z albuminą czy lipoproteinami o wysokiej gęstości (HDL), dlatego też do roztworów syntetycznych wzorców dodawane były między innymi: albumina, roztwór wzorcowy białka całkowitego i/lub HDL w stężeniach zbliżonych do takich w jakich występują w fizjologicznym materiale biologicznym. Przeprowadzone doświadczenia niestety nie wpłynęły na jakość i trwałość stosowanych wzorców, co sugeruje, że ich nietrwałość najprawdopodobniej nie jest związana z brakiem czynników, z którymi naturalnie występujące sfingolipidy łączą się w osoczu. Nasz zespół zdaje sobie sprawę, że technika RP-HPLC nie jest jedną z najbardziej czułych i specyficznych spośród dostępnych technik wykorzystywanych do oznaczania sfingolipidów, z drugiej jednak strony jest metodą stosunkowo niedrogą i nie wymaga aż tak zaawansowanej i drogiej aparatury jak np. techniki RP-HPLC-MS/MS. Uważamy, że wskazana przez nas metoda daje zadawalający odzysk oraz dobrą powtarzalność w serii, jak i pomiędzy seriami, a więc pozwala w sposób precyzyjny określać stężenie sfingolipidów w osoczu i surowicy krwi ludzkiej. Jednakże metoda ta nie jest najlepszą z metod do określenia stężenia tych sfingolipidów w erytrocytach (pozostaje hemoglobina w ekstrakcie). Nasz zespół wciąż pracuje nad opracowaniem i optymalizacją metody ekstrahowania sfingolipidów z erytrocytów, które pozwoli na usunięcie hemoglobiny i jednocześnie nie wpłynie na stałość syntetycznych wzorców. PIŚMIENNICTWO 1. Olivera A, Kohama T, Tu Z, Milstien S, Spiegel S (1998) Purification and characterization of rat kidney sphingosine kinase. J Biol Chem 273: Ramstedt B, Slotte JP (2002) Membrane properties of sphingomyelins. FEBS Lett 531: Brizuela L, Cuvillier O (2012) Biochemical methods for quantifying sphingolipids: ceramid, spingosine, spingosine kinase-1-activity, and sphingosine-1-phospate. Methods Mol Biol 874: Dawkins JL, Hulme DJ, Brahmbhatt SB, Auer-Grumbach M, Nicholson GA (2001) Mutations in SPTLC1, encoding serine palmitoyltransferase, long chain base subunit-1, cause hereditary sensory neuropathy type I. Nat Genet 27: Hannun YA, Obeid LM (2008) Principles of bioactive lipid signalling: lessons from sphingolipids. Nat Rev Mol Cell Biol 9: Salata D, Budkowska M, Dołegowska B (2012) Sphingosine-1-phosphate--molecular maestro. Postepy Biochem 58: He X, Dagan A, Gatt S, Schuchman EH (2005) Simultaneous quantitative analysis of ceramide and sphingosine in mouse blood by naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde derivatization after hydrolysis with ceramidase. Anal Biochem 340: Olivera A, Rivera J (2005) Sphingolipids and the balancing of immune cell function: lessons from the mast cell. J Immunol 174: Hänel P, Andréani P, Gräler MH (2007) Erythrocytes store and release sphingosine 1-phosphate in blood. FASEB J 21: Min JK, Yoo HS, Lee EY, Lee WJ, Lee YM (2002) Simultaneous quantitative analysis of sphingoid base 1-phosphates in biological samples 384

15 by o-phthalaldehyde precolumn derivatization after dephosphorylation with alkaline phosphatase. Anal Biochem 303: Butter JJ, Koopmans RP, Michel MC (2005) A rapid and validated HPLC method to quantify sphingosine 1-phosphate in human plasma using solid-phase extraction followed by derivatization with fluorescence detection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 824: Bartke N, Hannun YA (2009) Bioactive sphingolipids: metabolism and function. J Lipid Res 50: Bode C, Gräler MH (2012) Quantification of sphingosine-1-phosphate and related sphingolipids by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Methods Mol Biol 874: Arana L, Gangoiti P, Ouro A, Trueba M, Gómez-Muñoz A (2010) Ceramide and ceramide-1-phosphate in health and disease. Lipids Health Dis 5: Mullen TD, Hannun YA, Obeid LM (2012) Ceramide synthases at the centre of sphingolipid metabolism and biology. Biochem J 441: He X, Chen F, Gatt S, Schuchman EH (2001) An enzymatic assay for quantifying sphingomyelin in tissues and plasma from humans and mice with Niemann-Pick disease. Anal Biochem 293: Yatomi Y, Ruan F, Ohta J, Welch RJ, Hakomori S, Igarashi Y (1995) Quantitative measurement of sphingosine 1-phosphate in biological samples by acylation with radioactive acetic anhydride. Anal Biochem 230: Merrill AH, Sullards MC, Allegood JC, Kelly S, Wang E (2005) Sphingolipidomics: high-throughput, structure-specific, and quantitative analysis of sphingolipids by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Methods 36: He X, Huang CL, Schuchman EH (2009) Quantitative analysis of sphingosine-1-phosphate by HPLC after napthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA) derivatization. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 877: Andréani P, Gräler MH (2006) Comparative quantification of sphingolipids and analogs in biological samples by high-performance liquid chromatography after chloroform extraction. Anal Biochem 358: Schwab SR, Pereira JP, Matloubian M, Xu Y, Huang Y, Cyster JG (2005) Lymphocyte sequestration through lyase inhibition and disruption of gradients. Science 309: Cho YH, Yoo HS, Min JK, Lee EY, Hong SP, Chung YB, Lee YM (2002) Comparative study of naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde and o- -phthalaldehyde fluorogenic reagents for chromatographic detection of sphingoid bases. J Chromatogr 977: Bode C, Sensken SC, Peest U, Beutel G, Thol F, Levkau B, Li Z, Bittman R, Huang T, Tölle M, van der Giet M, Gräler MH (2010) Erythrocytes serve as a reservoir for cellular and extracellular sphingosine 1-phosphate. J Cell Biochem 109: Lan T, Bi H, Liu W, Xie X, Xu S, Huang H (2011) Simultaneous determination of sphingosine and sphingosine 1-phosphate in biological samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 879: Cutignano A, Chiuminatto U, Petruzziello F, Vella FM, Fontana A (2010) UPLC-MS/MS method for analysis of sphingosine 1-phosphate in biological samples. Prostaglandins Other Lipid Mediat 93: Lee YM, Venkataraman K, Hwang SI, Han DK, Hla T (2007) A novel method to quantify sphingosine 1-phosphate by immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Prostaglandins Other Lipid Mediat 84: Ruwisch L, Schäfer-Korting M, Kleuser B (2001) An improved high- -performance liquid chromatographic method for the determination of sphingosine-1-phosphate in complex biological materials. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 363: Edsall LC, Spiegel S (1999) Enzymatic measurement of sphingosine- -1-phoshpate. Anal Biochem 272: Castegnaro M, Garren L, Gaucher I, Wild CP (1996) Development of a new method for the analysis of sphinganine and sphingosine in urine and tissues. Nat Toxins 4: Caligan TB, Peters K, Ou J, Wang E, Saba J, Merrill AH Jr (2000) A high-performance liquid chromatographic method to measure sphingosine 1-phosphate and related compounds from sphingosine kinase assays and other biological samples. Anal Biochem 281: Berdyshev EV, Gorshkova IA, Garcia JG, Natarajan V, Hubbard WC (2005) Quantitative analysis of sphingoid base-1-phosphates as bisacetylated derivatives by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Biochem 339: Van Veldhoven PP, De Ceuster P, Rozenberg R, Mannaerts GP, de Hoffmann E (1994) On the presence of phosphorylated sphingoid bases in rat tissues. A mass-spectrometric approach. FEBS Lett 350: Jiang X, Han X (2006) Characterization and direct quantitation of sphingoid base-1-phosphates from lipid extracts: a shotgun lipidomics approach. J Lipid Res 47: Overview of methods used for determination of selected sphingolipids in different biological materials Marta Budkowska 1,2,*, Barbara Dołęgowska 1,2 1 Department of Medical Analytics and 2 Department of Physiology, Laboratory of Physiology and Biochemistry of Stem Cell, Pomeranian Medical University, 72 Al. Powstańców Wielkopolskich, Szczecin, Poland * Key words: sphingolipids, sphingolipids extraction, RP-HPLC, LC-MS/MS ABSTRACT Sphingolipids are bioactive molecules, which constitute part of the cell membrane. They are involved in signaling and regulation of many cellular processes including cell growth and proliferation, apoptosis, angiogenesis or inflammatory processes. Several methods were described to determine the concentration and conversion of sphingolipids including radioactive labeling, enzymatic methods, MS, RP-HPLC, ESI LC-MS/ MS, UPLC-MS/MS. The development and validation of analytical and extraction methodology for the determination of selected sphingolipids in various biological materials are described in this paper. Postępy Biochemii 60 (3)

Cz. 5. Podstawy instrumentalizacji chromatografii. aparatura chromatograficzna w skali analitycznej i modelowej - -- w części przypomnienie -

Cz. 5. Podstawy instrumentalizacji chromatografii. aparatura chromatograficzna w skali analitycznej i modelowej - -- w części przypomnienie - Chromatografia cieczowa jako technika analityki, przygotowania próbek, wsadów do rozdzielania, technika otrzymywania grup i czystych substancji Cz. 5. Podstawy instrumentalizacji chromatografii aparatura

Bardziej szczegółowo

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedra Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 2 OPTYMALIZACJA ROZDZIELANIA MIESZANINY WYBRANYCH FARMACEUTYKÓW METODĄ

Bardziej szczegółowo

Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej

Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej Pytania z Wysokosprawnej chromatografii cieczowej 1. Jak wpłynie 50% dodatek MeOH do wody na retencję kwasu propionowego w układzie faz odwróconych? 2. Jaka jest kolejność retencji kwasów mrówkowego, octowego

Bardziej szczegółowo

Nowoczesne metody analizy pierwiastków

Nowoczesne metody analizy pierwiastków Nowoczesne metody analizy pierwiastków Techniki analityczne Chromatograficzne Spektroskopowe Chromatografia jonowa Emisyjne Absorpcyjne Fluoroscencyjne Spektroskopia mas FAES ICP-AES AAS EDAX ICP-MS Prezentowane

Bardziej szczegółowo

Chemia kryminalistyczna

Chemia kryminalistyczna Chemia kryminalistyczna Wykład 2 Metody fizykochemiczne 21.10.2014 Pytania i pomiary wykrycie obecności substancji wykazanie braku substancji identyfikacja substancji określenie stężenia substancji określenie

Bardziej szczegółowo

GraŜyna Chwatko Zakład Chemii Środowiska

GraŜyna Chwatko Zakład Chemii Środowiska Chromatografia podstawa metod analizy laboratoryjnej GraŜyna Chwatko Zakład Chemii Środowiska Chromatografia gr. chromatos = barwa grapho = pisze Michaił Siemionowicz Cwiet 2 Chromatografia jest metodą

Bardziej szczegółowo

OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM MASOWYM (HPLC-MS)

OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ SPRZĘŻONEJ ZE SPEKTROMETREM MASOWYM (HPLC-MS) KREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYC TKSYN PRZY ZASTSWANIU TECNIKI CRMATGRAFII CIECZWEJ SPRZĘŻNEJ ZE SPEKTRMETREM MASWYM (PLC-MS) Dr inż.agata Kot-Wasik Dr anna Mazur-Marzec Katedra Chemii Analitycznej, Wydział

Bardziej szczegółowo

CHROMATOGRAFIA W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH RP-HPLC

CHROMATOGRAFIA W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH RP-HPLC CHROMATOGRAFIA W UKŁADACH FAZ ODWRÓCONYCH RP-HPLC MK-EG-AS Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Gdańsk 2009 Chromatograficzne układy faz odwróconych (RP) Potocznie: Układy chromatograficzne, w których

Bardziej szczegółowo

HPLC? HPLC cz.1. Analiza chromatograficzna. Klasyfikacja metod chromatograficznych

HPLC? HPLC cz.1. Analiza chromatograficzna. Klasyfikacja metod chromatograficznych HPLC cz.1 ver. 1.0 Literatura: 1. Witkiewicz Z. Podstawy chromatografii 2. Szczepaniak W., Metody instrumentalne w analizie chemicznej 3. Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L. Practical HPLC Method Development

Bardziej szczegółowo

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych UNIWERSYTET GDAŃSKI Pracownia studencka Zakład Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 3 Oznaczanie witaminy E w oleju metodą HPLC ANALIZA PRODUKTÓW POCHODZENIA NATURALNEGO

Bardziej szczegółowo

Wykorzystanie chromatografii cieczowej z detektorem masowym (LC/MS) do oznaczania leków przeciwdepresyjnych we krwi*

Wykorzystanie chromatografii cieczowej z detektorem masowym (LC/MS) do oznaczania leków przeciwdepresyjnych we krwi* ARCH. MED. SĄD. KRYM., 2008, LVIII, 171-176 PRACE oryginalne Ewa Pufal, Marzena Sykutera Wykorzystanie chromatografii cieczowej z detektorem masowym (LC/MS) do oznaczania leków przeciwdepresyjnych we krwi*

Bardziej szczegółowo

Interdyscyplinarny charakter badań równoważności biologicznej produktów leczniczych

Interdyscyplinarny charakter badań równoważności biologicznej produktów leczniczych Interdyscyplinarny charakter badań równoważności biologicznej produktów leczniczych Piotr Rudzki Zakład Farmakologii, w Warszawie Kongres Świata Przemysłu Farmaceutycznego Łódź, 25 VI 2009 r. Prace badawczo-wdrożeniowe

Bardziej szczegółowo

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925

TaqNovaHS. Polimeraza DNA RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 RP902A, RP905A, RP910A, RP925A RP902, RP905, RP910, RP925 TaqNovaHS Polimeraza TaqNovaHS jest mieszaniną termostabilnej polimerazy DNA

Bardziej szczegółowo

POTWIERDZANIE TOŻSAMOSCI PRZY ZASTOSOWANIU RÓŻNYCH TECHNIK ANALITYCZNYCH

POTWIERDZANIE TOŻSAMOSCI PRZY ZASTOSOWANIU RÓŻNYCH TECHNIK ANALITYCZNYCH POTWIERDZANIE TOŻSAMOSCI PRZY ZASTOSOWANIU RÓŻNYCH TECHNIK ANALITYCZNYCH WSTĘP Spełnianie wymagań jakościowych stawianych przed producentami leków jest kluczowe dla zapewnienia bezpieczeństwa pacjenta.

Bardziej szczegółowo

Ana n l a i l za z a i ns n tru r men e t n al a n l a

Ana n l a i l za z a i ns n tru r men e t n al a n l a Analiza instrumentalna rok akademicki 2014/2015 wykład: prof. dr hab. Ewa Bulska prof. dr hab. Agata Michalska Maksymiuk pracownia: dr Marcin Wojciechowski Slide 1 Analiza_Instrumentalna: 2014/2015 Analiza

Bardziej szczegółowo

Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji

Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji Walidacja metod analitycznych Raport z walidacji Małgorzata Jakubowska Katedra Chemii Analitycznej WIMiC AGH Walidacja metod analitycznych (według ISO) to proces ustalania parametrów charakteryzujących

Bardziej szczegółowo

Selen, Se ŚLESIN. Toksyczność. Se 78.96. Konieczność. Niedobór

Selen, Se ŚLESIN. Toksyczność. Se 78.96. Konieczność. Niedobór Opracowanie metod analitycznych przeznaczonych do charakterystyki dodatków żywnościowych i pasz przygotowanych na bazie drożdży wzbogaconych w selen 2006 dr inż. Aleksandra Polatajko 1 15.05.06 Selen,

Bardziej szczegółowo

Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 Nowoczesne techniki analityczne

Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 Nowoczesne techniki analityczne Instrukcja ćwiczenia laboratoryjnego HPLC-2 Nowoczesne techniki analityczne 1) OZNACZANIE ROZKŁADU MASY CZĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW Z ASTOSOWANIEM CHROMATOGRAFII ŻELOWEJ; 2) PRZYGOTOWANIE PRÓBKI Z ZASTOSOWANIEM

Bardziej szczegółowo

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych

Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Deproteinizacja jako niezbędny etap przygotowania próbek biologicznych Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wstęp Określenie próbka biologiczna jest

Bardziej szczegółowo

WYKORZYSTANIE ZJAWISKA CHEMILUMINESCENCJI DO OZNACZANIA POLIFENOLI W UKŁADACH PRZEPŁYWOWYCH

WYKORZYSTANIE ZJAWISKA CHEMILUMINESCENCJI DO OZNACZANIA POLIFENOLI W UKŁADACH PRZEPŁYWOWYCH UNIWERSYTET W BIAŁYMSTOKU WYDZIAŁ BIOLOGICZNO-CHEMICZNY Edyta Monika Nalewajko-Sieliwoniuk WYKORZYSTANIE ZJAWISKA CHEMILUMINESCENCJI DO OZNACZANIA POLIFENOLI W UKŁADACH PRZEPŁYWOWYCH (streszczenie) Praca

Bardziej szczegółowo

Metody analizy jakościowej i ilościowej lipidów powierzchniowych i wewnętrznych owadów

Metody analizy jakościowej i ilościowej lipidów powierzchniowych i wewnętrznych owadów Metody analizy jakościowej i ilościowej lipidów powierzchniowych i wewnętrznych owadów Dr Marek Gołębiowski INSTYTUT OCHRONY ŚRODOWISKA I ZDROWIA CZŁOWIEKA ZAKŁAD ANALIZY ŚRODOWISKA WYDZIAŁ CHEMII, UNIWERSYTET

Bardziej szczegółowo

Problemy i wyzwania w analityce specjacyjnej z wykorzystaniem technik łączonych. Magdalena Jabłońska-Czapla

Problemy i wyzwania w analityce specjacyjnej z wykorzystaniem technik łączonych. Magdalena Jabłońska-Czapla Problemy i wyzwania w analityce specjacyjnej z wykorzystaniem technik łączonych Magdalena Jabłońska-Czapla Instytut Podstaw Inżynierii Środowiska PAN ul. M.Skłodowskiej-Curie 34 Zabrze Mobility of arsenic

Bardziej szczegółowo

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych. Ćwiczenie nr 2

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych. Ćwiczenie nr 2 UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII ZAKŁAD ANALIZY ŚRODOWISKA Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 2 Wykrywanie benzoesanu denatonium w skażonym alkoholu etylowym metodą wysokosprawnej chromatografii

Bardziej szczegółowo

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika

PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika PathogenFree DNA Isolation Kit Zestaw do izolacji DNA Instrukcja użytkownika Spis treści 1. Zawartość 2 1.1 Składniki zestawu 2 2. Opis produktu 2 2.1 Założenia metody 2 2.2 Instrukcja 2 2.3 Specyfikacja

Bardziej szczegółowo

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej

Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Oznaczanie mocznika w płynach ustrojowych metodą hydrolizy enzymatycznej Wprowadzenie: Większość lądowych organizmów kręgowych część jonów amonowych NH + 4, produktu rozpadu białek, wykorzystuje w biosyntezie

Bardziej szczegółowo

JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE

JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE JAK WYZNACZA SIĘ PARAMETRY WALIDACYJNE 1 Przykład walidacji procedury analitycznej Piotr KONIECZKA Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. G. Narutowicza 11/1 80-33 GDAŃSK

Bardziej szczegółowo

Jakość wyników specjacyjnego oznaczania pierwiastków techniką HPLC-ICP-MS

Jakość wyników specjacyjnego oznaczania pierwiastków techniką HPLC-ICP-MS Jakość wyników specjacyjnego oznaczania pierwiastków techniką HPLC-ICP-MS Danuta Barałkiewicz, Izabela Komorowicz, Barbara Pikosz, Magdalena Belter Pracownia Analizy Spektroskopowej Pierwiastków Wydział

Bardziej szczegółowo

l.dz. 239/TZ/DW/2015 Oświęcim, dnia 17.07.2015 r. Dotyczy: zaproszenie do złożenia oferty cenowej na dostawę urządzeń laboratoryjnych dla

l.dz. 239/TZ/DW/2015 Oświęcim, dnia 17.07.2015 r. Dotyczy: zaproszenie do złożenia oferty cenowej na dostawę urządzeń laboratoryjnych dla l.dz. 239/TZ/DW/2015 Oświęcim, dnia 17.07.2015 r. Dotyczy: zaproszenie do złożenia oferty cenowej na dostawę urządzeń laboratoryjnych dla Wyposażenia Laboratorium badawczo-rozwojowego środków ochrony roślin

Bardziej szczegółowo

2.1. Charakterystyka badanego sorbentu oraz ekstrahentów

2.1. Charakterystyka badanego sorbentu oraz ekstrahentów BADANIA PROCESU SORPCJI JONÓW ZŁOTA(III), PLATYNY(IV) I PALLADU(II) Z ROZTWORÓW CHLORKOWYCH ORAZ MIESZANINY JONÓW NA SORBENCIE DOWEX OPTIPORE L493 IMPREGNOWANYM CYANEXEM 31 Grzegorz Wójcik, Zbigniew Hubicki,

Bardziej szczegółowo

Przewaga klasycznego spektrometru Ramana czyli siatkowego, dyspersyjnego nad przystawką ramanowską FT-Raman

Przewaga klasycznego spektrometru Ramana czyli siatkowego, dyspersyjnego nad przystawką ramanowską FT-Raman Porównanie Przewaga klasycznego spektrometru Ramana czyli siatkowego, dyspersyjnego nad przystawką ramanowską FT-Raman Spektroskopia FT-Raman Spektroskopia FT-Raman jest dostępna od 1987 roku. Systemy

Bardziej szczegółowo

OFERTA TEMATÓW PROJEKTÓW DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ

OFERTA TEMATÓW PROJEKTÓW DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ OFERTA TEMATÓW PROJEKTÓW DYPLOMOWYCH (MAGISTERSKICH) do zrealizowania w Katedrze INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ Badania kinetyki utleniania wybranych grup związków organicznych podczas procesów oczyszczania

Bardziej szczegółowo

Chromatografia kolumnowa planarna

Chromatografia kolumnowa planarna Chromatografia kolumnowa planarna Znaczenie chromatografii w analizie i monitoringu środowiska lotne zanieczyszczenia organiczne (alifatyczne, aromatyczne) w powietrzu, glebie, wodzie Mikrozanieczyszczenia

Bardziej szczegółowo

Materiał obowiązujący do ćwiczeń z analizy instrumentalnej II rok OAM

Materiał obowiązujący do ćwiczeń z analizy instrumentalnej II rok OAM Materiał obowiązujący do ćwiczeń z analizy instrumentalnej II rok OAM Ćwiczenie 1 Zastosowanie statystyki do oceny metod ilościowych Błąd gruby, systematyczny, przypadkowy, dokładność, precyzja, przedział

Bardziej szczegółowo

Parametry krytyczne podczas walidacji procedur analitycznych w absorpcyjnej spektrometrii atomowej. R. Dobrowolski

Parametry krytyczne podczas walidacji procedur analitycznych w absorpcyjnej spektrometrii atomowej. R. Dobrowolski Parametry krytyczne podczas walidacji procedur analitycznych w absorpcyjnej spektrometrii atomowej. R. Dobrowolski Wydział Chemii Uniwersytet Marii Curie Skłodowskiej pl. M. Curie Skłodowskiej 3 0-03 Lublin

Bardziej szczegółowo

Rola materiałów odniesienia w zapewnieniu jakości wyników pomiarów chemicznych

Rola materiałów odniesienia w zapewnieniu jakości wyników pomiarów chemicznych Uniwersytet Warszawski Wydział Chemii Pasteura 1, 02-093 Warszawa Rola materiałów odniesienia w zapewnieniu jakości wyników pomiarów chemicznych Ewa Bulska ebulska@chem.uw.edu.pl Slide 1 Opracowanie i

Bardziej szczegółowo

Nowoczesne techniki analityczne w analizie specjacyjnej arsenu i chromu w próbkach środowiskowych Danuta Barałkiewicz Izabela Komorowicz, Karol Sęk

Nowoczesne techniki analityczne w analizie specjacyjnej arsenu i chromu w próbkach środowiskowych Danuta Barałkiewicz Izabela Komorowicz, Karol Sęk Nowoczesne techniki analityczne w analizie specjacyjnej arsenu i chromu w próbkach środowiskowych Danuta Barałkiewicz Izabela Komorowicz, Karol Sęk Pracownia Analizy Spektroskopowej Pierwiastków Wydział

Bardziej szczegółowo

Tabela potwierdzenia informacji rejestracyjnych przedsiębiorstwa produkcji importowanego mleka pasteryzowanego

Tabela potwierdzenia informacji rejestracyjnych przedsiębiorstwa produkcji importowanego mleka pasteryzowanego Tabela potwierdzenia informacji rejestracyjnych przedsiębiorstwa produkcji importowanego mleka pasteryzowanego 1. Podstawowe informacje na temat przedsiębiorstwa (wypełnia przedsiębiorstwo ubiegające się)

Bardziej szczegółowo

Spis treści. Aparatura

Spis treści. Aparatura Spis treści Aparatura I. Podstawowe wyposażenie laboratoryjne... 13 I.I. Probówki i naczynia laboratoryjne... 13 I.II. Pipety... 17 I.II.I. Rodzaje pipet automatycznych... 17 I.II.II. Techniki pipetowania...

Bardziej szczegółowo

WALIDACJA PROCESU MYCIA

WALIDACJA PROCESU MYCIA WALIDACJA PROCESU MYCIA Cleaning Validation Practices Using a One-Pot Processor Pharmaceutical Technology Europe February 2004 Barbara Budnik Maria Pulpińska One-Pot Processor mieszanie granulacja suszenie

Bardziej szczegółowo

Chromatografia. Chromatografia po co? Zastosowanie: Podstawowe rodzaje chromatografii. Chromatografia cienkowarstwowa - TLC

Chromatografia. Chromatografia po co? Zastosowanie: Podstawowe rodzaje chromatografii. Chromatografia cienkowarstwowa - TLC Chromatografia Chromatografia cienkowarstwowa - TLC Chromatografia po co? Zastosowanie: oczyszczanie wydzielanie analiza jakościowa analiza ilościowa Chromatogram czarnego atramentu Podstawowe rodzaje

Bardziej szczegółowo

NARZĘDZIA DO KONTROLI I ZAPEWNIENIA JAKOŚCI WYNIKÓW ANALITYCZNYCH. Piotr KONIECZKA

NARZĘDZIA DO KONTROLI I ZAPEWNIENIA JAKOŚCI WYNIKÓW ANALITYCZNYCH. Piotr KONIECZKA 1 NARZĘDZIA DO KONTROLI I ZAPEWNIENIA JAKOŚCI WYNIKÓW ANALITYCZNYCH Piotr KONIECZKA Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska ul. G. Narutowicza 11/12 80-952 GDAŃSK e-mail: kaczor@chem.pg.gda.pl

Bardziej szczegółowo

Bezpośrednia analiza pierwiastkowa próbek stałych metodą LA ICP-MS: moŝliwości i ograniczenia

Bezpośrednia analiza pierwiastkowa próbek stałych metodą LA ICP-MS: moŝliwości i ograniczenia Bezpośrednia analiza pierwiastkowa próbek stałych metodą LA ICP-MS: moŝliwości i ograniczenia Barbara Wagner, Ewa Bulska Pracownia Teoretycznych Podstaw Chemii Analitycznej Wydział Chemii Uniwersytet Warszawski

Bardziej szczegółowo

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska

Dane mikromacierzowe. Mateusz Markowicz Marta Stańska Dane mikromacierzowe Mateusz Markowicz Marta Stańska Mikromacierz Mikromacierz DNA (ang. DNA microarray) to szklana lub plastikowa płytka (o maksymalnych wymiarach 2,5 cm x 7,5 cm) z naniesionymi w regularnych

Bardziej szczegółowo

Renata Czeczko* ZASTOSOWANIE METOD CHROMATOGRAFICZNYCH DO OZNACZANIA POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W OWOCACH I WARZYWACH

Renata Czeczko* ZASTOSOWANIE METOD CHROMATOGRAFICZNYCH DO OZNACZANIA POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W OWOCACH I WARZYWACH Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych nr 48, 2011 r. Renata Czeczko* ZASTOSOWANIE METOD CHROMATOGRAFICZNYCH DO OZNACZANIA POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W OWOCACH I WARZYWACH APPLICATION OF CHROMATOGRAPHIC

Bardziej szczegółowo

Równowaga kwasowo-zasadowa. Zakład Chemii Medycznej PUM

Równowaga kwasowo-zasadowa. Zakład Chemii Medycznej PUM Równowaga kwasowozasadowa Zakład Chemii Medycznej PUM Teorie kwasów i zasad Teoria dysocjacji elektrolitycznej Arheniusa: podczas rozpuszczania w wodzie wodzie kwas: dysocjuje z odszczepieniem kationu

Bardziej szczegółowo

Hydrazyna. Numer CAS: 302-01-2 H 2 N NH 2

Hydrazyna. Numer CAS: 302-01-2 H 2 N NH 2 mgr ELŻBIETA DOBRZYŃSKA Centralny Instytut Ochrony Pracy Państwowy Instytut Badawczy 00-701 Warszawa ul. Czerniakowska 16 Podstawy i Metody Oceny Środowiska Pracy 2007, nr 4(54), s. 63 68 Hydrazyna metoda

Bardziej szczegółowo

Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006

Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus. 25 października 2006 Raport z badania Działanie wirusobójcze środka dezynfekującego wobec Feline calicivirus 25 października 2006 Dr Tobias J. Tuthill Wydział Nauk Biologicznych Uniwersytet Leeds Leeds LS2 9JT www.fbs.leeds.ac.uk

Bardziej szczegółowo

2. Ż. Bargańska, J. Namieśnik, Pesticide analysis of bee and bee product samples, Crit. Rev. Anal. Chem., 40 (2010) 159.

2. Ż. Bargańska, J. Namieśnik, Pesticide analysis of bee and bee product samples, Crit. Rev. Anal. Chem., 40 (2010) 159. Publikacje w czasopismach z Listy Filadelfilskiej: 1. A. Dołęga, K. Baranowska, Ż. Jarząbek, ((4-Hydroxymethyl-1H-imidazole-N3)bis(tritert-butoxysilanethiolato-2O,S)cadmium(II), Acta Crystal., E64 (2008)

Bardziej szczegółowo

ROLA WAPNIA W FIZJOLOGII KOMÓRKI

ROLA WAPNIA W FIZJOLOGII KOMÓRKI ROLA WAPNIA W FIZJOLOGII KOMÓRKI Michał M. Dyzma PLAN REFERATU Historia badań nad wapniem Domeny białek wiążące wapń Homeostaza wapniowa w komórce Komórkowe rezerwuary wapnia Białka buforujące Pompy wapniowe

Bardziej szczegółowo

Walidacja metody analitycznej podejście metrologiczne. Waldemar Korol Instytut Zootechniki-PIB, Krajowe Laboratorium Pasz w Lublinie

Walidacja metody analitycznej podejście metrologiczne. Waldemar Korol Instytut Zootechniki-PIB, Krajowe Laboratorium Pasz w Lublinie Walidacja metody analitycznej podejście metrologiczne Waldemar Korol Instytut Zootechniki-PIB, Krajowe Laboratorium Pasz w Lublinie Walidacja potwierdzenie parametrów metody do zamierzonego jej zastosowania

Bardziej szczegółowo

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA

Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Materiały do ćwiczeń z przedmiotu: BIOLOGIA MOLEKULARNA Zakład Biologii Molekularnej Wydział Farmaceutyczny, WUM ul. Banacha 1, 02-097 Warszawa IZOLACJA DNA Z HODOWLI KOMÓRKOWEJ.

Bardziej szczegółowo

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne

Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum. Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Scenariusz lekcji chemii w klasie III gimnazjum Temat lekcji: Białka skład pierwiastkowy, budowa, właściwości i reakcje charakterystyczne Czas trwania lekcji: 2x 45 minut Cele lekcji: 1. Ogólny zapoznanie

Bardziej szczegółowo

ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ W BIOTECHNOLOGII ŚRODOWISKOWEJ

ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ W BIOTECHNOLOGII ŚRODOWISKOWEJ Wstęp: ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ W BIOTECHNOLOGII ŚRODOWISKOWEJ Chromatografią cieczową nazywamy chromatografię, w której eluentem jest ciecz, zwykle rozpuszczalnik organiczny. HPLC (ang. High

Bardziej szczegółowo

Kwas trichlorooctowy

Kwas trichlorooctowy Podstawy i Metody Oceny Środowiska Pracy 2012, nr 1(71), s. 105 109 Kwas trichlorooctowy metoda oznaczania dr inż. ANNA JEŻEWSKA Centralny Instytut Ochrony Pracy Państwowy Instytut Badawczy 00-701 Warszawa

Bardziej szczegółowo

Zasady wykonania walidacji metody analitycznej

Zasady wykonania walidacji metody analitycznej Zasady wykonania walidacji metody analitycznej Walidacja metod badań zasady postępowania w LOTOS Lab 1. Metody badań stosowane w LOTOS Lab należą do następujących grup: 1.1. Metody zgodne z uznanymi normami

Bardziej szczegółowo

Wymagania dotyczące badania czynników chemicznych w środowisku pracy w normach europejskich. dr Marek Dobecki - IMP Łódź

Wymagania dotyczące badania czynników chemicznych w środowisku pracy w normach europejskich. dr Marek Dobecki - IMP Łódź Wymagania dotyczące badania czynników chemicznych w środowisku pracy w normach europejskich dr Marek Dobecki - IMP Łódź 1 DOSTĘPNE NORMY EUROPEJSKIE: BADANIA POWIETRZA NA STANOWISKACH PRACY PN-EN 689:2002

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie 4. Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne

Ćwiczenie 4. Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne Klasyczna Analiza Jakościowa Organiczna, Ćw. 4 - Identyfikacja wybranych cukrów Ćwiczenie 4 Identyfikacja wybranych cukrów w oparciu o niektóre reakcje charakterystyczne Zagadnienia teoretyczne: 1. Budowa

Bardziej szczegółowo

ZASTOSOWANIE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ DO OZNACZANIA BENZOESANU SODU W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH

ZASTOSOWANIE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ DO OZNACZANIA BENZOESANU SODU W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH ZASTOSOWANIE WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ DO OZNACZANIA BENZOESANU SODU W PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wstęp

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY)

OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Ćwiczenie 8 OZNACZANIE AKTYWNOŚCI ALKALICZNEJ DIFOSFATAZY (PIROFOSFATAZY) Część doświadczalna obejmuje: - sączenie Ŝelowe ekstraktu uzyskanego z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy - oznaczanie aktywności

Bardziej szczegółowo

6. Wykorzystanie tyrozynazy otrzymywanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus Bisporus) do produkcji L-DOPA

6. Wykorzystanie tyrozynazy otrzymywanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus Bisporus) do produkcji L-DOPA 6. Wykorzystanie tyrozynazy otrzymywanej z pieczarki dwuzarodnikowej (Agaricus Bisporus) do produkcji L-DOPA L-DOPA (L-3,4-dihydroksyfenyloalanina) jest naturalnym prekursorem dopaminy, jednego z najważniejszych

Bardziej szczegółowo

Biznes Mixer w ramach Forum Inicjowania Rozwoju 2014

Biznes Mixer w ramach Forum Inicjowania Rozwoju 2014 Biznes Mixer w ramach Forum Inicjowania Rozwoju 2014 Oferta rozwiązań naukowych dla biznesu i innych partnerów InnoDoktorant, VI edycja Magdalena Śliwińska prof. dr hab. inż. Waldemar Wardencki dr. inż.

Bardziej szczegółowo

PL 198188 B1. Instytut Chemii Przemysłowej im.prof.ignacego Mościckiego,Warszawa,PL 03.04.2006 BUP 07/06

PL 198188 B1. Instytut Chemii Przemysłowej im.prof.ignacego Mościckiego,Warszawa,PL 03.04.2006 BUP 07/06 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 198188 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 370289 (51) Int.Cl. C01B 33/00 (2006.01) C01B 33/18 (2006.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22)

Bardziej szczegółowo

NH 2 CH 3. Numer CAS: 106-49-0

NH 2 CH 3. Numer CAS: 106-49-0 Podstawy i Metody Oceny Środowiska Pracy 2011, nr 1(67), s. 155 160 dr SŁAWOMIR BRZEŹNICKI mgr MARZENA BONCZAROWSKA dr JAN GROMIEC Instytut Medycyny Pracy im. prof. dr med. Jerzego Nofera 91-348 Łódź ul.

Bardziej szczegółowo

Jakościowe i ilościowe oznaczanie alkoholi techniką chromatografii gazowej

Jakościowe i ilościowe oznaczanie alkoholi techniką chromatografii gazowej Jakościowe i ilościowe oznaczanie alkoholi techniką chromatografii gazowej Instrukcja do ćwiczeń opracowana w Katedrze Chemii Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego. 1. Wstęp teoretyczny Zagadnienie rozdzielania

Bardziej szczegółowo

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych UNIWERSYTET GDAŃSKI WYDZIAŁ CHEMII Pracownia studencka Katedry Analizy Środowiska Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych Ćwiczenie nr 3 Oznaczanie chlorków metodą spektrofotometryczną z tiocyjanianem rtęci(ii)

Bardziej szczegółowo

Jeśli wyniki tego samego badania przeprowadzone dwoma różnymi metodami nie różnią się od siebie

Jeśli wyniki tego samego badania przeprowadzone dwoma różnymi metodami nie różnią się od siebie lek.wet. Agnieszka Dereczeniuk Badania laboratoryjne w hodowli Łódź 24.03.2012 Po co badać? Badania przesiewowe Badania profilaktyczne Badania obowiązkowe dla danej rasy Badania okresowe Badania diagnostyczne

Bardziej szczegółowo

ĆWICZENIE 3. I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów

ĆWICZENIE 3. I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów ĆWICZENIE 3 I. Analiza miareczkowa mocnych i słabych elektrolitów Alkacymetria jest metodą opartą na reakcji zobojętniania jonów hydroniowych jonami wodorotlenowymi lub odwrotnie. H 3 O+ _ + OH 2 O Metody

Bardziej szczegółowo

Biologiczna ocena wyrobów medycznych Testy in vitro

Biologiczna ocena wyrobów medycznych Testy in vitro Specjalistyczne metody badań materiałów, 2014 Biologiczna ocena wyrobów medycznych Testy in vitro Bogdan Walkowiak Zakład Biofizyki IIM PŁ in vitro vs in vivo i ex vivo http://sexymammy.fotolog.pl/in-vitro-wedlug-disy,1370470

Bardziej szczegółowo

Chromatograf gazowy z detektorem uniwersalnym i podajnikiem próbek ciekłych oraz zaworem do dozowania gazów

Chromatograf gazowy z detektorem uniwersalnym i podajnikiem próbek ciekłych oraz zaworem do dozowania gazów Strona1 Sprawa Nr RP.272.79.2014 załącznik nr 6 do SWZ (pieczęć Wykonawcy) PRMTRY TNZN PRZMOTU ZMÓWN Nazwa i adres Wykonawcy:... Nazwa i typ (producent) oferowanego urządzenia:... zęść 1 hromatograf gazowy

Bardziej szczegółowo

Długotrwały niedobór witaminy C (hipoascorbemia) powoduje miażdżycę oraz osadzanie się lipoproteiny(a) w naczyniach krwionośnych transgenicznych myszy

Długotrwały niedobór witaminy C (hipoascorbemia) powoduje miażdżycę oraz osadzanie się lipoproteiny(a) w naczyniach krwionośnych transgenicznych myszy Długotrwały niedobór witaminy C (hipoascorbemia) powoduje miażdżycę oraz osadzanie się lipoproteiny(a) w naczyniach krwionośnych transgenicznych myszy Nowa publikacja Instytutu Medycyny Komórkowej dr Ratha

Bardziej szczegółowo

Odpowiedź:. Oblicz stężenie procentowe tlenu w wodzie deszczowej, wiedząc, że 1 dm 3 tej wody zawiera 0,055g tlenu. (d wody = 1 g/cm 3 )

Odpowiedź:. Oblicz stężenie procentowe tlenu w wodzie deszczowej, wiedząc, że 1 dm 3 tej wody zawiera 0,055g tlenu. (d wody = 1 g/cm 3 ) PRZYKŁADOWE ZADANIA Z DZIAŁÓW 9 14 (stężenia molowe, procentowe, przeliczanie stężeń, rozcieńczanie i zatężanie roztworów, zastosowanie stężeń do obliczeń w oparciu o reakcje chemiczne, rozpuszczalność)

Bardziej szczegółowo

Zapytanie ofertowe nr 1/2014 ( dotyczy zamówienia badań )

Zapytanie ofertowe nr 1/2014 ( dotyczy zamówienia badań ) Zdrochem Sp. z o.o. Warszawa, 27 stycznia 2014 r. tel. +48 223900990, 609 019 283 fax. +48 223507490 info@zdrochem.pl www.zdrochem.pl I. ZAMAWIAJĄCY Zdrochem Sp. z o.o. NIP: 7010333468 REGON: 145983792

Bardziej szczegółowo

Sterowanie jakości. cią w laboratorium problem widziany okiem audytora technicznego

Sterowanie jakości. cią w laboratorium problem widziany okiem audytora technicznego Sterowanie jakości cią w laboratorium problem widziany okiem audytora technicznego Ewa Bulska Piotr Pasławski W treści normy PN-EN ISO/IEC 17025:2005 zawarto następujące zalecenia dotyczące sterowania

Bardziej szczegółowo

Wartość dodana dla Twojego procesu produkcji. BD s NEW Rapid Microbiology BD FACSMicroCount

Wartość dodana dla Twojego procesu produkcji. BD s NEW Rapid Microbiology BD FACSMicroCount Wartość dodana dla Twojego procesu produkcji BD s NEW Rapid Microbiology BD FACSMicroCount Wyzwania W procesie produkcji. Wykrycie zanieczyszczenia Możliwość modelowania operacji Redukcja strat w surowcach

Bardziej szczegółowo

Grzegorz Satała, Tomasz Lenda, Beata Duszyńska, Andrzej J. Bojarski. Instytut Farmakologii Polskiej Akademii Nauk, ul.

Grzegorz Satała, Tomasz Lenda, Beata Duszyńska, Andrzej J. Bojarski. Instytut Farmakologii Polskiej Akademii Nauk, ul. Grzegorz Satała, Tomasz Lenda, Beata Duszyńska, Andrzej J. Bojarski Instytut Farmakologii Polskiej Akademii Nauk, ul. Smętna 12, Kraków Plan prezentacji: Cel naukowy Podstawy teoretyczne Przyjęta metodyka

Bardziej szczegółowo

AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ

AUTOREFERAT ROZPRAWY DOKTORSKIEJ POLITECHNIKA ŚLĄSKA Wydział Chemiczny Katedra Chemii Nieorganicznej, Analitycznej i Elektrochemii Iwona Wojciechowska-Witkowska Opracowanie metod rozdzielczych do oznaczania wybranych związków o właściwościach

Bardziej szczegółowo

1.Wstęp. Ćwiczenie nr 9 Zatężanie z wody związków organicznych techniką SPE (solid phase extraction)

1.Wstęp. Ćwiczenie nr 9 Zatężanie z wody związków organicznych techniką SPE (solid phase extraction) 1.Wstęp Ćwiczenie nr 9 Zatężanie z wody związków organicznych techniką SPE (solid phase extraction) W analizie mikrośladowych ilości związków organicznych w wodzie bardzo ważny jest etap wstępny, tj. etap

Bardziej szczegółowo

WYCIECZKA DO LABORATORIUM

WYCIECZKA DO LABORATORIUM WYCIECZKA DO LABORATORIUM W ramach projektu e-szkoła udaliśmy się do laboratorium w Krotoszynie na ul. Bolewskiego Mieliśmy okazję przeprowadzić wywiad z kierowniczką laboratorium Panią Hanną Czubak Oprowadzała

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI CHLORAMFENIKOLU W MOCZU BYDŁA Z ZASTOSOWANIEM POLIMERÓW Z ODWZOROWANIEM CZĄSTECZKOWYM METODĄ LC-MS/MS

OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI CHLORAMFENIKOLU W MOCZU BYDŁA Z ZASTOSOWANIEM POLIMERÓW Z ODWZOROWANIEM CZĄSTECZKOWYM METODĄ LC-MS/MS BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XLIII, 2010, 2, str. 222 227 Lech Rodziewicz OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI CHLORAMFENIKOLU W MOCZU BYDŁA Z ZASTOSOWANIEM POLIMERÓW Z ODWZOROWANIEM CZĄSTECZKOWYM METODĄ LC-MS/MS Pracownia

Bardziej szczegółowo

W analizie oznaczania tetracyklin w paszach leczniczych zastosowano micelarną fazę ruchomą składająca się z 7% butanolu, 0,02 M kwasu szczawiowego i

W analizie oznaczania tetracyklin w paszach leczniczych zastosowano micelarną fazę ruchomą składająca się z 7% butanolu, 0,02 M kwasu szczawiowego i STRESZCZENIE W części wstępnej pracy przedstawiono charakterystykę pasz oraz omówiono właściwości fizykochemiczne, zakres i mechanizm działania tetracyklin. Przedyskutowano występowanie pozostałości tych

Bardziej szczegółowo

Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej

Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie alkacymetrycznej metody oznaczania aktywności lipazy trzustkowej z użyciem

Bardziej szczegółowo

Techniki immunochemiczne. opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami

Techniki immunochemiczne. opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami Techniki immunochemiczne opierają się na specyficznych oddziaływaniach między antygenami a przeciwciałami Oznaczanie immunochemiczne RIA - ( ang. Radio Immuno Assay) techniki radioimmunologiczne EIA -

Bardziej szczegółowo

Źródła błędów i ich eliminacja w technice ICP.

Źródła błędów i ich eliminacja w technice ICP. Źródła błędów i ich eliminacja w technice ICP. Irena Jaroń Centralne Laboratorium Chemiczne Państwowy Instytut Geologiczny, Rakowiecka 4, 05-975 Warszawa Atomowa spektrometria emisyjna ze wzbudzeniem w

Bardziej szczegółowo

Zagadnienia z chemii na egzamin wstępny kierunek Technik Farmaceutyczny Szkoła Policealna im. J. Romanowskiej

Zagadnienia z chemii na egzamin wstępny kierunek Technik Farmaceutyczny Szkoła Policealna im. J. Romanowskiej Zagadnienia z chemii na egzamin wstępny kierunek Technik Farmaceutyczny Szkoła Policealna im. J. Romanowskiej 1) Podstawowe prawa i pojęcia chemiczne 2) Roztwory (zadania rachunkowe zbiór zadań Pazdro

Bardziej szczegółowo

Główne zagadnienia: - mol, stechiometria reakcji, pisanie równań reakcji w sposób jonowy - stężenia, przygotowywanie roztworów - ph - reakcje redoks

Główne zagadnienia: - mol, stechiometria reakcji, pisanie równań reakcji w sposób jonowy - stężenia, przygotowywanie roztworów - ph - reakcje redoks Główne zagadnienia: - mol, stechiometria reakcji, pisanie równań reakcji w sposób jonowy - stężenia, przygotowywanie roztworów - ph - reakcje redoks 1. Która z próbek o takich samych masach zawiera najwięcej

Bardziej szczegółowo

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab

SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab SZCZEGÓŁOWE KRYTERIA OCENIANIA Z CHEMII DLA KLASY II GIMNAZJUM Nauczyciel Katarzyna Kurczab CZĄSTECZKA I RÓWNANIE REKCJI CHEMICZNEJ potrafi powiedzieć co to jest: wiązanie chemiczne, wiązanie jonowe, wiązanie

Bardziej szczegółowo

J.T.Baker HYDRA-POINT TM PRODUKTY DO ANALIZY METODĄ KARLA FISCHERA. Europa Środkowy Wschód Afryka

J.T.Baker HYDRA-POINT TM PRODUKTY DO ANALIZY METODĄ KARLA FISCHERA. Europa Środkowy Wschód Afryka J.T.Baker HYDRA-POINT TM PRODUKTY DO ANALIZY METODĄ KARLA FISCHERA Europa Środkowy Wschód Afryka Optymalna jakość dla laboratorium: Funkcjonalne produkty do analizy metodą Karla Fischera pod marką gwarantującą

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO

Ćwiczenie numer 6. Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO Ćwiczenie numer 6 Analiza próbek spożywczych na obecność markerów GMO 1. Informacje wstępne -screening GMO -metoda CTAB -qpcr 2. Izolacja DNA z soi metodą CTAB 3. Oznaczenie ilościowe i jakościowe DNA

Bardziej szczegółowo

METODY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO POMIARU STOSUNKÓW IZOTOPOWYCH PIERWIASTKÓW LEKKICH. Spektrometry IRMS akceptują tylko próbki w postaci gazowej!

METODY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO POMIARU STOSUNKÓW IZOTOPOWYCH PIERWIASTKÓW LEKKICH. Spektrometry IRMS akceptują tylko próbki w postaci gazowej! METODY PRZYGOTOWANIA PRÓBEK DO POMIARU STOSUNKÓW IZOTOPOWYCH PIERWIASTKÓW LEKKICH Spektrometry IRMS akceptują tylko próbki w postaci gazowej! Stąd konieczność opracowania metod przeprowadzania próbek innych

Bardziej szczegółowo

Materiał i metody. Wyniki

Materiał i metody. Wyniki Abstract in Polish Wprowadzenie Selen jest pierwiastkiem śladowym niezbędnym do prawidłowego funkcjonowania organizmu. Selen jest wbudowywany do białek w postaci selenocysteiny tworząc selenobiałka (selenoproteiny).

Bardziej szczegółowo

1.3. Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach

1.3. Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach 1. Lipidy 36 Odparować z nich rozpuszczalnik i zanalizować je w argentacyjnej chromatografii cienkowarstwowej (zob. s. 33). Uzyskane frakcje nasyconych, jedno- i dwunienasyconych lipidów rezorcynolowych

Bardziej szczegółowo

Szanowne koleżanki i koledzy nauczyciele chemii!

Szanowne koleżanki i koledzy nauczyciele chemii! Szanowne koleżanki i koledzy nauczyciele chemii! Chciałabym podzielić się z Wami moimi spostrzeżeniami dotyczącymi poziomu wiedzy z chemii uczniów rozpoczynających naukę w Liceum Ogólnokształcącym. Co

Bardziej szczegółowo

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl

Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl Strona 1 z 7 Adres strony internetowej, na której Zamawiający udostępnia Specyfikację Istotnych Warunków Zamówienia: www.imp.sosnowiec.pl Sosnowiec: Sukcesywna dostawa odczynników dla Instytutu Medycyny

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenia nr 2: Stężenia

Ćwiczenia nr 2: Stężenia Ćwiczenia nr 2: Stężenia wersja z 5 listopada 2007 1. Ile gramów fosforanu(v) sodu należy zużyć w celu otrzymania 2,6kg 6,5% roztworu tego związku? 2. Ile należy odważyć KOH i ile zużyć wody do sporządzenia

Bardziej szczegółowo

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7

PROJEKT WSPÓŁFINANSOWANY PRZEZ UNIĘ EUROPEJSKĄ Z EUROPEJSKIEGO FUNDUSZU ROZWOJU REGIONALNEGO 1 z 7 Poznań, dnia 28.04.2014 r. BioVentures Institute Spółka z ograniczoną odpowiedzialnością ul. Promienista 83 60 141 Poznań Zapytanie ofertowe nr 01/2014 Projekt Nowa technologia wytwarzania szczepionek

Bardziej szczegółowo

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.05.2006 06742337.

(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.05.2006 06742337. PL/EP 1889070 T3 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1889070 (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 13.0.06 06742337.6 (1) Int. Cl. G01N33/68

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI AZAPERONU I KARAZOLOLU W NERKACH ZWIERZĄT METODĄ LC-MS/MS

OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI AZAPERONU I KARAZOLOLU W NERKACH ZWIERZĄT METODĄ LC-MS/MS ROCZN. PZH 2009, 60, Nr 1, 19-23 OZNACZANIE POZOSTAŁOŚCI AZAPERONU I KARAZOLOLU W NERKACH ZWIERZĄT METODĄ LC-MS/MS DETERMINATION OF AZAPERONE AND CARAZOLOL RESIDUES IN ANIMALS KIDNEY USING LC-MS/MS METHOD

Bardziej szczegółowo

KARTA KURSU. Kod Punktacja ECTS* 2

KARTA KURSU. Kod Punktacja ECTS* 2 KARTA KURSU Nazwa Nazwa w j. ang. BIOCHEMIA BIOCHEMISTRY Kod Punktacja ECTS* 2 Koordynator Prof. dr hab. Maria Filek Zespół dydaktyczny dr Anna Barbasz dr Elżbieta Rudolphi-Skórska dr Apolonia Sieprawska

Bardziej szczegółowo

OBLICZENIA BIOCHEMICZNE

OBLICZENIA BIOCHEMICZNE OBLICZENIA BIOCHEMICZNE Praca w laboratorium biochemicznym wymaga umiejętności obliczania stężeń i rozcieńczeń odczynników stosowanych do doświadczeń. W podstawowym kursie biochemii nie ma czasu na przygotowywanie

Bardziej szczegółowo