Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechniki Gdańskiej, "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

Transkrypt

1 WYKORZYSTANIE TECHNIKI LC-MS W BADANIACH ŚRODOWISKOWYCH Agata KOT-WASIK, Jacek NAMIEŚNIK Katedra Chemii Analitycznej, Wydział Chemiczny, Politechniki Gdańskiej, Gdańsk "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

2 ANALITYKA CHEMICZNA BADANIA PODSTAWOWE BADANIA STOSOWANE Edukacja Badania naukowe i prace rozwojowe Dostępne techniki i metodyki analityczne "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

3 WIEDZA O ŚRODOWISKU ANA ALITYKA KONTROLA I ZAPEWNIENIE JAKOŚCI WYNIKÓW POMIARÓW ANALITYCZNYCH MONI ITORING "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

4 CELE I ZADANIA ANALITYKI I MONITORINGU ŚRODOWISKA Identyfikacja źródeł i oszacowanie wielkości i zasięgu oddziaływania emisji Oszacowanie poziomu imisji Badania szlaków przemian zanieczyszczeń w środowisku Badania losu środowiskowego ksenobiotyków Ocena skuteczności zabiegów sozotechnicznych Ocena toksyczności i ekotoksycznosci zanieczyszczeń Badania procesów bioakumulacji zanieczyszczeń przez organizmy żywe "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

5 ANALITYKA I MONITORING ŚRODOWISKA PROBLEMY I WYZWANIA Niskie i bardzo niskie poziomy stężeń analitów w próbkach charakteryzujących się złożonym składem matrycy Możliwość fluktuacji czasowych ch i przestrzennych stężeń ż ń ksenobiotyków Niebezpieczeństwo interferencji związanych z występowaniem składników o zbliżonych właściwościach fizykochemicznych Nieznajomość j szlaków przemian poszczególnych ksenobiotyków Konieczność oznaczania nie tylko zanieczyszczeń pierwotnych ale także i produktów przemian i metabolizmu Brak odpowiednich wzorców i materiałów odniesienia "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

6 Związki podlegające uregulowaniom prawnym Zanieczyszczenia środowiska Związki nie podlegające uregulowaniom prawnym (nowopojawiające się zanieczyszczenia) srodowiska KLASYFIKACJA ZANIECZYSZCZEŃ ŚRODOWISKA Dioksyny (PCDD+PCDF) Kompleksy metali Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne Polichlorowane bifenyle Pestycydy chloroorganiczne Estrogeny Fitoestrogeny Bisfenol A Bromowane opóźniacze zapłonu Surfuktanty niejonowe i produkty ich rozkładu i metabolizmu Alkilofenole Związki wywołujące zakłócenia równowagi hormonalnej w organizmach żywych (związki endokrynne) Pozostałości farmaceutyków Pochodne ftalanów Syntetyczne związki zapachowe Środki higieny osobistej "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

7 OCENA STOPNIA ZANIECZYSZCZENIA ŚRODOWISKA ANALIZA CHEMICZNA WSKAŹNIKI SUMARYCZNE BIOWSKAŹNIKI / BIOMONITORY Uzyskana informacja jest bardzo szczegółowa, ale jest niewystarczająca do pełnej oceny stopnia zanieczyszczenia badanego elementu środowiska Dają informacje bardzo ogólne, które nie są prostą zależnością powiązane z toksycznością badanego elementu środowiska Uzyskana informacja jest bardzo ogólna, ale daje kompleksową odpowiedź czy środowisko wpływa toksycznie na żywe organizmy "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

8 OCENA STOPNIA ZANIECZYSZCZENIA ŚRODOWISKA Monitoring Monitoring Monitoring diagnostyczny operacyjny badawczy Monitoring parametrów fizykochemicznych Prace badawcze (np. identyfikacja zanieczyszczeń) Monitoring i chemiczny Monitoring biologiczny Stan jakości wód Bardzo dobry lub dobry stan wód Ryzyko niespełnienia celów środowiskowych Dodatkowe informacje Prace badawcze (np. ustalenie źródła emisji zanieczyszczeń) Ponowna ocena Wyjaśnienie sytuacji Wybór strategii remediacji i jej wdrożenie konieczność uzupełnienia klasycznych metodyk analitycznych nowymi narzędziami "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

9 ZALEŻNOŚCI WYSTĘPUJĄCE W SRODOWISKU Zależność Wzajemne zależności pomiędzy indywiduami chemicznymi Mutagenność Interpretacja środowiskowad i k Specjacja (indywidua chemiczne) Fizjologia Skład pierwiastkowy Sumaryczne parametry stopnia zanieczyszczenia środowiska Toksykologia Szlaki przemian Analogie biochemiczne % ppm ppb ppt ppq Rozcieńczenie (stężenie zanieczyszczeń) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

10 ODDZIAŁYWANIE ZANIECZYSZCZEŃ NA CZĘŚĆ NIEOŻYWIONĄ IOŻYWIONA ŚRODOWISKA Podstawowe właściwości ksenobiotyku Zanieczyszczenia (ksenobiotyki) Środowisko nieożywione Biota rozmieszczenia powietrze Właściwości układu (zmienność, złożoność) emisja Woda powierzchniowa gleba przemiany woda gruntowa Osady denne pobieranie metabolizm rozmieszczenie wydalanie Los chemiczny Los środowiskowy Biodostępność Toksykokinetyka i dynamika Ekspozycja Ekspozycja wewnętrzna R. P. Schwarzenbach, B. I. Escher, K. Fenner, T. B. Hofstetter, C. A. Johnson, U. von Gunten, B. Wehrli, Science, 313, (2006) Skutki "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

11 TECHNIKA METODA METODYKA (procedura analityczna, sposób postępowania analitycznego) PROCEDURA ANALITYCZNA (METODYKA ANALITYCZNA) METODA ANALITYCZNA TECHNIKA ANALITYCZNA ANALIT MATRYCA DOKŁADNIE OPISANY SPOSÓB POSTĘPOWANIA "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

12 TECHNIKI ANALITYCZNE WYKORZYSTYWANE W BADANIACH ŚRODOWISKOWYCH ANALIT(Y) Techniki instrumentalne Testy Czujniki Elektrochemiczne Chemiczne Immunochemiczne Spektroskopowe Sondy Bioczujniki Termiczne Chromatograficzne "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

13 ELEMENTY SKŁADOWE POSTĘPU W ZAKRESIE INSTRUMENTACJI DZIAŁANIA ZE STRONY WYTWÓRCY SPRZĘTU KONTROLNO-POMIAROWE Nowe osiągnięcia w zakresie badań naukowych Przykład: opracowanie nowej zasady pomiaru Prace badawczo-rozwojowe Projektowanie Inżynieria procesów wytwarzania Produkcja poszczególnych elementów i podzespołów Montaż Testowanie kontrola jakości wyrobów Zapewnienie i jakości ś Marketing Serwis Sprzedaż Postęp w zakresie technologii wytwarzania Przykład: nowy przyrząd analityczny do precyzyjnego oznaczania poziomu zawartości składnika X w określonym produkcie Zwiększone wymagania ze strony użytkowników Przykład: zapotrzebowanie na nową precyzyjną metodę pomiaru analitu X w badanym materiale Y "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

14 ELEMENTY STRATEGII POBIERANIA PRÓBEK DO ANALIZY Cel pobierania próbek Miejsce pobierania próbek Rodzaj analitów lub oznaczanego parametru Odczynniki i materiały STRATEGIA POBIERANI A PRÓBEK Częstotliwość pobierania próbek Typ próbnika Wielkość próbki G. Capadoglio, Sampling techniques for sea water and sediments. W: Marine Chemistry (ed. A. Gianguzza et al), Academic Kluwer Publ., 1997, "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

15 PODSTAWOWE SKŁADOWE DOKUMENTACJI POBIERANIA PRÓBEK ŚRODOWISKOWYCH Charakterystyka etapu pobierania próbek Matryca próbki Techniki pobierania i próbek Sekwencja pobierania próbek Rodzaj używanych próbników Numery identyfikacyjne Rodzaj stosowanego konserwanta Parametry oznaczane w trakcie analizy Parametry próbki określone w trakcie pobierania próbki (temperatura, ph, przewodnictwo elektryczne itp.) Dane o sposobie kalibracji przyrządów używanych w terenie Przewoźnik i sposób dostarczenia próbki do laboratorium Wewnętrzna temperatura chłodzonych pojemników (na etapie pobierania i transportu) Etykieki próbek Nazwa próbnika Data pobierania i próbki Czas pobierania próbki Numer próbki Umiejscowienie punktu pobierania próbki Typ próbki Anality Sposób konserwacji Opis losu próbki (ang. chain of- custody) Numer próbki Data pobrania próbki Czas pobierania próbki Typ próbki Sposób identyfikacji próbki Numer pojemnika na próbnik (próbkę) Anality Podpis próbobiorcy S. S. Prasad, TrAC, 13, 157 (1994) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

16 KONTROLA JAKOŚCI (QUALITY CONTROL QC) W chemii analitycznej polega na wykorzystaniu specyficznych sposobów postępowania celem zapewnienia PRECYZJI i DOKŁADNOŚCI na każdym etapie dla otrzymania Procedury analitycznej wysokiej jakości. Wyników analitycznych ZAPEWNIENIE JAKOSCI (QUALITY ASSURANCE QA) Stanowi szczegółowy opis postępowania od momentu pobrania próbki aż do obróbki wyników- w zakresie kontroli działań zapewniających wysoką jakość wyników analitycznych. Program ten musi być przedstawiony w formie pisemnej. "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

17 LABORATORIUM ANALITYCZNE ŚWIADCZY USŁUGI I MOŻE WPŁYWAĆ NA POPRAWĘ ZARÓWNO PRODUKTÓW, SYSTEMÓW PRODUKCYJNYCH (I NIE TYLKO) ALE RÓWNIEŻ I INNYCH TYPÓW USŁUG JAKOŚĆ OGÓLNA 21 JAKOŚĆ PRODUKTÓW OGÓLNA JAKOŚĆ ANALITYCZNA 2 JAKOŚĆ SYSTEMÓW PRODUKCYJNYCH JAKOŚĆ USŁUG 3 M. Varcalcel, A. Rios, TrAC, 13, 17 (1994) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

18 SYSTEM ZAPEWNIENIA JAKOŚCI WYNIKÓW ANALITYCZNYCH WYNIKI ANALITYCZNE LABORATORIUM ANALITYCZNE KONTROLA JAKOŚCI OSZACOWANIE JAKOŚCI WPROWADZENIE ZMIAN, POPRAWEK I ULEPSZEŃ "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

19 SKŁADNIKI SYSTEMU kontroli i zapewnienia jakości wyników analitycznych (QC / QA) Monitorowanie i ocena precyzji wyników analitycznych poprzez p okresowe badania próbek kontrolnych Ocena dokładności wyników analitycznych poprzez: Analizę ę próbek certyfikowanych y materiałów odniesienia, Porównanie wyników z wynikami uzyskanymi w rezultacie zastosowania metody odniesienia, Analiza próbek z dodatkiem wzorca, Karty kontrolne, Audyty. d t "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

20 Elementy składowe etapu pobierania próbek w terenie SKŁADNIKI SYSTEMU KONTROLI I ZAPEWNIENIA JAKOSCI (QA/ QC) Elementy składowe prac laboratoryjnych Pobieranie Planowanie Przyjęcie próbek Pobieranie próbek Konserwacja Zbieranie próbek Wysyłka i transport Standardowe procedury operacyjne Audyty Działania naprawcze Dokumentacja Opis losu próbki (ang. chain-ofcustody) Przygotowanie póbk próbek Analiza Kontrola jakości sprawdzenia tła Generacja danych analitycznych Walidacja danych Przygotowanie sprawozdania S. S. Prasad, TrAC, 13, 157 (1994) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

21 SPÓJNOŚĆ POMIAROWA ( traceability ) ) Wtrosceowłaściwą o jakość wyników analitycznych coraz większą uwagę zwraca się na tzw. spójność pomiarową (ang. traceability). Po terminem spójność pomiarowa, zgodnie z przyjętą definicją rozumie się ę cechę ę wyniku pomiarowego lub wartości standardowej, polegającą na możliwości odniesienia tej wartości do narodowych lub międzynarodowych standardów przez nieprzerwany łańcuch porównań, przy założeniu, że znane są wartości atoś iniepewności noś i wyniku związane z wszystkim stkim znanymi źródłami błędów. Zakłada się przy tym, że: Podjęto wszystkie niezbędne przedsięwzięcia by zmniejszyć liczbę źródeł błędów oraz wielkość błędów pomiarowych Tam gdzie to było możliwe wprowadzono poprawki przy obliczaniu wyniku końcowego analizy. Definicja ta odnosi się do wszystkich typów pomiarów, włącznie z pomiarami analitycznymi. "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

22 SPOSOBY UZYSKIWANIA SPÓJNOŚCI POMIAROWEJ Kalibrację podstawowych przyrządów pomiarowych przez specjalistów z odpowiedniego centrum metrologicznego Wykonanie wzorców i materiałów odniesienia do sprawdzenia stosowanych metod i technik analitycznych. "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

23 HIERARCHICZNE ZESTAWIENIE RÓŻNEGO TYPU METRIAŁÓW ODNIESIENIA Podstawowe jednostki miar układu SI (kg, metr, mol, etc.) Wzorce pierwszorzędowe Certyfikowane materiały odniesienia Materiały odniesienia Póbki Próbki wzorcowe (testowe) t "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

24 Pożądana charakterystyka substancji traktowanych jako wzorce pierwszorzędowe Dostępność w handlu Wysoka czystość chemiczna (100± 0.02% Wysoka stabilność Homogeniczność Niehigroskopijność i odporność na wietrzenie Rozpuszczalność Wysoka masa cząsteczkowa lub niska wartość mnożnika analitycznego (w celu minimalizacji błędów ę ważenia) Ilościowy i stechiometryczny przebieg reakcji zachodzącej w trakcie miareczkowania "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

25 Hierarchia niektórych elementów odniesienia w analityce Metody pierwotne chemicznej Certyfikowane materiały odniesienia Metody odniesienia Badania międzylaboratoryjneę yj Robocze materiały odniesienia Laboratoria odniesienia Jednostki układu SI Metody pierwotne Pierwotne chemiczne Materiały odniesienia Metody wtórne Pierwotne chemiczne Materiały odniesienia Jednostki układu SI Metrologiczne laboratoria chemiczne Laboratoria odniesienia Producenci materiałów odniesienia Przyrządy pomiarowe odniesienia Robocze chemiczne materiały odniesienia Laboratoria analityczne Mieszaniny i Próbki z dodatkiem wzorca A. Marato, J. Riu, R. Boque, F.X. Rius, Estimating uncertainties of analytical results using information from the validation process, Anal. Chim. Acta, 391, (1999) Techniki alternatywne "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

26 SPÓJNOŚĆ POMIAROWA WYNIKÓW ANALITYCZNYCH wzorzec pierwszorzędowy SI wzorzec drugorzędowy wzorzec handlowy RM (bez certyfikatu) Laboratoryjny materiał odniesienia (LRM 1) Laboratoryjny materiał odniesienia (LRM 2) Wynik pomiaru analitu w badanej próbce (laboratorium nr 1) Wynik pomiaru analitu w badanej próbce (laboratorium nr 2) D. B. Hibbert, Accred. Qual. Assur., 11, (2006) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

27 WŁAŚCIWE ZASTOSOWANIE CERTYFIKOWANYCH MATERIAŁÓW ODNIESIENIA (CRM) I MATERIAŁÓW DO KONTROLI JAKOŚCI Ś (QCM) Certyfikowane materiały odniesienia (CRM) Wewnętrzna kontrola jakości -Walidacja metodyk analitycznych -Oszacowanie Kontrola niepewności i zapewnienie -Kalibracja jakości wyników przyrządów pomiarowych Materiały do kontroli jakości (QCM) Zewnętrzna kontrola jakości Testy biegłości ł ś i T. Venelinov, A. Sahuquillo, Trends Anal. Chem., 25, (2006) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

28 Wyniki pomiarów Metoda pomiarowa Materiał odniesienia (do kalibracji). Inne metody analityczne Materiał odniesienia (do walidacji metody) Pierwotna, bezpośrednia ś metoda analityczna Układ SI Metoda stosunków Pierwotny Niezależny, ale materiał podobny łańcuch odniesienia spójności pomiarowej. -nośniki cechy charakterystycznej względem której musi być spełniony wymóg spójności pomiarowej H. Felber, Chimia, 53, (1999) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

29 ANALIZA DWUWYMIAROWA sygnału Intens sywność t ri t r t ri+1 i+1 t ri+2 i+2 W typowym przypadku analiza chromatograficzna dostarcza nam informacji dwuwymiarowej. Najczęściej jest to zależność między wielkością sygnału z detektora (1 wymiar) od czasu retencji (2 wymiar). Czas Identyfikacja odbywa się na podstawie czasu retencji. Problem 1 W przypadku analizy skomplikowanych mieszanin nie mamy pewności, że dany pik odpowiada pojedynczej substancji. Problem 2 Niemożliwa jest identyfikacja nieznanych substancji. "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

30 ANALIZA DWUWYMIAROWA Problem 1 - nakładanie się pików Rozwiązanie Powtórzyć analizę ę przy użyciu kolumny z innym typem wypełnienia. Charakter oddziaływań pomiędzy analitem a fazą stacjonarną musi być inny niż za pierwszym razem. Zalety: - łatwość wykonania - niski koszt Wady: -czasochłonność!! "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

31 ANALIZA DWUWYMIAROWA Problem 2 - identyfikacja nieznanych substancji Rozwiązanie Zastosować detektor umożliwiający uzyskanie informacji o strukturze analitu. Innymi słowy zastosować techniki łączone. Zalety: -możliwość identyfikacji nieznanych związków - informacja o ich masie cząsteczkowej i/lub strukturze - szybsze uzyskanie wyniku końcowego - łatwe wykrywanie faktu nakładania się pików Wady: - wysokie koszty inwestycyjne -wysokie wymagania co do kwalifikacji personelu "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

32 intensywność sygnału TECHNIKI ŁĄCZONE Dzięki wykorzystaniu technik łączonych informacja 8000 analityczna zyskuje dodatkowy d wymiar (struktura) m/z czas "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

33 TECHNIKI ŁĄCZONE NOWE MOŻLIWOŚCI Ż Ś Techniki łączone są coraz powszechniej wykorzystywane y y w praktyce laboratoryjnej j (również w zakresie analityki środowiskowej). TECHNIKA LC-MS NARZĘDZIE DO UZYSKIWANIA INFORMACJI O STANIE ŚRODOWISKA "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

34 SŁOWNICTWO Interface łącznik (interfejs) Negative ionisation ujemna jonizacja (a nie negatywna jonizacja) Positive ionisation dodatnia jonizacja (a nie pozytywna jonizacja) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

35 ZAKRES ZASTOSOWAŃ RÓŻNYCH TYPÓW POŁĄCZEŃ STOSOWANYCH W TECHNICE HPLC-MS Masa czą ąsteczko owa anal litu APCI GC/MS ESI TERMOROZPYLA NIE PBI FA B niepolarne bardzo polarne Polarność analitu "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

36 PRZYKŁADY WYKORZYSTANIA TECHNIKI LC-MS W BADANIACH ŚRODOWISKOWYCH UZYSKANE (EFEKTY BADAŃ PROWADZONYCH W KATEDRZE CHMII ANALITYCZNEJ WYDZIAŁU CHMICZNEGO POLITECHNIKI GDAŃSKIEJ) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

37 ZASTOSOWANIA TECHNIKI HPLC-MS Oznaczanie pozostałości niesteroidowych środków przeciwzapalnych i przeciwbólowych (NSLPZ) w próbkach środowiskowych Związki biologicznie aktywne z grupy NSPLZ (ang. NSAID) są już w niektórych krajach obecne w wodzie pitnej na poziomie ppt, powodując efekt lekoodporności. Związki te spotyka się również w wodach powierzchniowych. i h Celem badań ń było ł opracowanie metodyki oznaczania NSPLZ w próbach wody pitnej i powierzchniowej oraz przeprowadzenie monitoringu stanu środowiska wodnego. "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

38 POZOSTAŁOŚCI FARMACEUTYKÓW W ŚRODOWISKU - KAMIENIE MILOWE 1981 Stwierdzenie obecności ś oraz ilościowe ś oznaczenie kwasu klofibrowego w próbkach środowiskowych (USA) 1997 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w ściekach szpitalnych (Niemcy) 1997 Badania dotyczące toksyczności antybiotyków w środowisku wodnym (Dania) 1998 Monitorowanie wód rzecznych i ścieków w Niemczech na obecność pozostałości farmaceutyków (Niemcy) 1998 Oznaczanie związków z grupy antybiotyków w różnych próbkach wody (Niemcy) 1999 Opracowanie metodyki analitycznej umożliwiającej j stwierdzenie obecności estrogenów w wodach powierzchniowych (USA) 2002 Pierwsza metodyka jednoczesnego oznaczania pozostałości wielu farmaceutyków w próbkach środowiskowych (Dania) Oznaczanie pozostałości farmaceutyków w wodach pitnych (Niemcy) 2003 Opracowanie odpowiednich modeli matematycznych do przewidywania stężenia i losu poszczególnych farmaceutyków w środowisku (Belgia) 2005 Oznaczanie pozostałości farmaceutyków próbkach stałych (Hiszpania) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

39 GŁÓWNE PRZYCZYNY POJAWIANIA SIĘ W ŚRODOWISKU RÓŻNORODNYCH ZWIĄZKÓW Ą LECZNICZYCH: produkcję odpowiednich preparatów i oddziaływaniem na środowisko zakładów przemysłu ł farmaceutycznego i weterynaryjnego; zrzucanie do środowiska dużych ilości przeterminowanych środków (bez ich utylizacji) zarówno z gospodarstw domowych (na małą skalę), jak i z ściekami i opadami szpitalnymi (na znacznie większą skalę); wydalanie pozostałości leków i ich metabolitów przez ludzi i zwierzęta. "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

40 Antybiotyki Erytromicyn Ofloxacin Chlortetracycline Oxytetracycline Streptomycin Flumequine Ciprofloxacin Trimetoprim Sulfamethoxazole Lincomycin Penicillin Lincomycin Amoxicillin Spiramycin Sterydy i hormony pokrewne 17-β-estradiol β Estrone 17 α-ethinyl estradiol Dietylstilbestrol Dietylstilbestrol aceton Leki przeciwzapalne Kwas acetylosalicylowy (Aspiryna) Diklofenak Ibuprofen Acetaminofen Metamizol Codeina Indometacina Naproxen Fenazon Najpopularniejsze farmaceutyki występujące w środowisku Leki przeciwrakowe Cyclofosfamid Ifosfamid Środki moczopędne Furosemid Leki przeciwpadaczkowe Carbamazepin Leki antydepresyjne Mianserin Leki uspakajające Diazepam Leki hipolipemizujące Bezafibrat Gemfibrozil Kwas klofibrowy Fenofibrat Beta-blokery Metoprolol Propranolol Nadolol Atenolol Sotalol Betaxolol A. Nikolaou, S. Meric, D. Fatta, Anal. Bioanal. Chem., 387, 1225 (2007) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

41 Wybrane grupy farmaceutyków i ich wskaźniki ryzyka środowiskowego Leki przeciwbólowe Lek Przykłady Wskaźnik ryzyka Niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSLPZ np.. Ibuprofen): inne leki przeciwbólowe (np.. Acetaminofen) Bardzo często stosowane : wykrywane w środowisku Antybiotyki Penicylina, sulfametoksazol Duże ilości Wykrywane w środowisku Dotyczy toksyczności i oporu antybakteryjnego Beta blokery i leki przeciwpadaczkowe Propanolol, metoprolol Karbamazepina, fenobarbital Duże ilości: wykrywane w środowisku Duże ilości Długoterminowe stosowanie Trwałe Leki hipolipemizujące Statyny (np.. Atorvastin, Klofibrat) Długoterminowe stosowanie Często wykrywane Leki przeciwdepresyjne Fluoksetyna, Risperidon Przedmiot testów toksyczności Tabletki antykoncepcyjne Zakrojone na szeroką skalę badania Hormony 17 -etinyloestradiol Właściwości toksyczne Często wykrywane Leki przeciwhistaminowe Loratadyna, Cymetydyna Często stosowany lek bez recepty S. K. Kethan, T. J. Collins, Chem. Rev., 107, (2007) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

42 Produkty farmaceutyczne (PP s) w środowisku (podejście zintegrowane) Cykl życia y produktów farmaceutycznych Wytwórcy Dystrybutorzy Konsumenci Wody odpływowe z oczyszczalni ścieków (WWTP) Receptory środowiskowe Narażenie organizmów Typ dostępnych danych Farmakologiczne Fizyko-chemiczne Konsumpcja Odpowiednie PPs i ich metabolity Skuteczność terapii Emisja stężeń PPs i produktów ich przemian MECs (naturalna i pitna woda, osady i gleba) Los środowiskowy (biodostępność, trwałość) Toksyczność Bioakumulacja Inne efekty Podejście zintegrowane Działania W celu zmniejszenia występowania i wpływu PPs (zapobieganie, nowe C. Coetsier, L. Lin, E. Touraud, sposoby oczyszczania scieków ) Anal. Bioanal. Chem., 387, (2007) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

43 WYBRANE ZWIĄZKI WŁĄCZONE DO LISTY SUBSTANCJI PRIORYTETOWYCH (Holandia) Związki 17 α-ethinyl estradiol Obecność w wodach odpływowych z oczyszczalni ścieków (WWTP) Min [µg l-1 ] Stężenie Max [µg l-1 ] Związki 17 α ethinyl estradiol + n.d < Bisfenol A endokrynnie Estron czynne Substancje medyczne Ibuprofen Anhydroerytromecyna Sulfometoksazol Karbamazepina Sotalol Kwas??? n.d nie wykryto + wykryto w ilości od 5% do 50% w badanych próbkach z oczyszczalni ścieków ++ wykryto w ilości od 50% do 95% w badanych próbkach z oczyszczalni ścieków +++ wykryto w ilości większej niż 95% badanych próbkach z oczyszczalni ścieków P. De Jong, J. F. Kramer, W. F. Slotema, K. A. Third, STOWA REPORT , ISBN "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

44 NIESTEROIDOWE LEKI PRZECIWZAPALNE (NSLPZ) HOOC H N Cl F F COOH OH Cl Diklofenak O H 3 C CH 3 COOH Diflunisal NSLPZ Naproxen O CH 3 COOH HO CH 3 N O Fenoprofen CH 3 H C O 3 CH COOH 3 H 3 C Tolmetin Ibuprofen "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

45 SPE w układzie off-line H O H 2 O MeOH 2 Próbka MeOH naniesienie próbki (sorpcja) przemycie złoża sorbentu odparowanie rozpuszczalnika do sucha w strumieniu azotu elucja analitów (desorpcja) rozpuszczenie suchej pozostałości w fazie ruchomej oznaczenie końcowe za pomocą techniki HPLC/DAD/MS "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

46 SPE w układzie on-line Kolumna analityczna Detektory Kolumna SPE Pompa 2 DAD MS PRÓBKA Ściek ETAP 1- izolacja i wzbogacanie analitów z próbek wody "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

47 Porównanie etapu ekstrakcji (SPE) w układzie off-line i on-line Objętość próbki 1000 ml Objętość próbki 100 ml SPE (w układzie off-line) Wstępne przygotowanie próbki t= 2 min Przygotowanie kolumienek t= 18 min Wstępne przygotowanie próbki t= 2 min Przygotowanie kolumienek t= 8 min SPE (w układzie online) EKSTRAKCJA SPE t= 70 min EKSTRAKCJA SPE t= 35 min Suszenie złoża kolumienki SPE t= 5 min Przełączenie zaworu Elucja analitów t= 20 min Odparowanie rozpuszczalnika t= 200 min ANALIZA HPLC-DAD-MS t= 25 min Czas całkowity 70 minut Rozpuszczenie pozostałości t= 30 min Czas całkowity 370 minut ANALIZA HPLC-DAD-MS t= 25 min "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

48 5 O Signal inte ensity (DAD) F O CH 3 F COOH OH CH 3 COOH OH 2 HO H N Cl Cl C H 3 MeO O N CH 2 COOH H 3 C 3 H 3 C CH 3 O OH CH Time min Signal intens sity (ESI-MS) = tolmetin 2 = naproksen 3 = fenoprofen 4 = diflunisal 5 = diklofenak 6 = ibuprofen min Time "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

49 próbka wody powierzchniowej z dodatkiem wzorców Signal intensity Signal intensity Time próbka wody powierzchniowej Time Sign nal intensity próbka wody rzecznej Time min "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

50 PORÓWNANIE TECHNIKI SPE- HPLC-DAD-MS W UKŁADZIE ON-LINE WZGLĘDEM UKŁADU OFF-LINE: Bardzo dobra odtwarzalność wyników Mała objętość próbek do analizy Krótszy czas analizy Możliwość automatyzacji procesu Wysoki koszt wyposażenia PORÓWNANIE TECHNIKI SPE- HPLC-DAD-MS W UKŁADZIE OFF-LINE WZGLĘDEM UKŁADU ON-LINE : efekty pamięci złoża, brak możliwości powtórzenia danej analizy, brak możliwości wzbogacania analitów z kilku próbek równocześnie ( w przypadku układu of-line jest możliwe prowadzenie kilku operacji ekstrakcji kt kji równocześnie) ś "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

51 TECHNIKA SPE-HPLC-DAD-MS UMOŻLIWIA WYKRYWANIE ŚLADOWYCH ILOŚCI (NA POZIOMIE ppt) RÓŻNYCH FARMACEUTYKÓW W PRÓBKACH WODNYCH Off- line On-line RSD % <11 <7 Odtwarzalność % Granica wykrywalności ng/l ,7-50 "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

52 NAJCZĘŚCIEJ Ę STOSOWANE KOKCYDIOSTATYKI Antybiotyki z grupy jonoforów (salinomycyna, y narazyna, manenzyna, lazalocyd) Substancje działające antagonistycznie w stosunku do witamin (amprolium, trimetroprim, t i diawerdyna, d pirymethamina) i Sulfonamidy (sulfadimetoksyna, sulfametazyna, sulfanitron) Nitrozwiązki (nitrofural, nicarbazin,dimetridazol) Pozostałe kokcydiostatyki (ROBENIDYNA, clopidol) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

53 TECHNIKI EKSTRAKCJI ROBENIDYNY Z PRÓBEK PASZY WYTRZĄSANIE UAE SOXHLET SOXTEC MAE ASE 8 g paszy z dodatkiem wzorca + 8 g piasku* 5 g paszy z dodatkiem wzorca + 5 g piasku* 4 g paszy z dodatkiem wzorca 2.5 g paszy z dodatkiem wzorca 0.5 g paszy z dodatkiem wzorca 8 g paszy z dodatkiem wzorca + 5 g piasku* Przygotowanie próbki przed ekstrakcją 60 ml MeOH +CH 3 COOH (1%V/V) 25 ml MeOH +CH 3 COOH (1%V/V) 45 ml MeOH +CH 3 COOH (1%V/V) 25 ml MeOH +CH 3 COOH (1%V/V) 9 ml MeOH +CH 3 COOH (1%V/V) 25 ml MeOH +CH 3 COOH (1%V/V) Rodzaj i objętość rozpuszczalnika użytego do ekstrakcji ekstrakcja w temperaturze otoczenia ekstrakcja w temepraturze otoczenia ekstrakcja w podwyższonej temperaturze ekstrakcja w temperatur ze wrzenia ekstrakcja w temp. 60, 80, 100, 120, 140 o C ekstrakcja w temp. 60, 80, 100, 120, 140 o C Temperatura ekstrakcji czas ekstrakcji czas ekstrakcji czas ekstrakcji czas ekstrakcji czas ekstrakcji czas ekstrakcji, ciśnienie, objętość zużytego ż rozpuszcz., ilość cykli Inne parametry wpływające na efektywność ekstrakcji ekstrakt + sito molekularne 5Ǻ, energiczne wytrząsanie 5 min Osuszanie ekstraktu 2 ml ekstraktu oczyszczanie przy użyciu kolumienki Pasteura wypełnionej 1 g Al 2 O 3 elucja 10 ml metanolu, odparowanie do Vk = 10 ml w strumieniu azotu Oczyszczanie ekstraktu Oznaczenie końcowe z użyciem HPLC DAD MS Objęść nastrzyku 20 μl Oznaczenie chromtograficzne "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

54 WARUNKI ROZDZIELANIA ROBENIDYNY Z WYKORZYSTANIEM Y HPLC DAD D -MS Kolumna chromatograficzna: 125 x 4.0, 5 µm LiChrosphere ODS (Merck) Natężenie przepływu fazy ruchomej: 1 ml/min Temperatura pracy kolumny: 30 o C Faza ruchoma: warunki izokratyczne (70% metanol, 30% woda z dodatkiem 0.1% TFAA v/v) "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

55 WARUNKI DETEKCJI Detektor DAD Monitorowana długość fali: 317 nm Sygnał detek ktora MS widmo SCAN m/z min Spektrometr mas Typ jonizacji: elektrorozpylanie (ESI), tryb jonów dodatnich Natężenie przepływu strumienia gazu suszącego: 12 l/min Ciśnienie: 45psi Temperatura gazu suszącego: 350 o C Napiecie i kapilary: 5000 V Tryb monitorowania jonów: SIM, jony monitorowane 334 oraz 336 m/z Napięcie kapilary: 95 ev "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,

56 Porównanie odzysków robenidyny z próbek rzeczywistych i próbek z dodatkiem wzorca uzyskanych w wyniku zastosowania różnych technik ekstrakcji 120 Odzysk [%] próbki skażone próbki rzeczyw iste 20 0 ASE MAE Soxtec Soxhlet UAE "Analityczne zastosowania chromatografii cieczowej" Warszawa,