Praca oryginalna Original Article

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number Praca oryginalna Original Article Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu we krwi pacjentów po przeszczepieniach narządowych Monitoring immunosuppressive drug concentrations using LC-MS/MS on a basis of whole blood everolimus determination in organ transplant patients Paweł K. Kunicki 1, Jolanta Duda 2 1 Pracownia Farmakologii Klinicznej i Terapii Zakładu Biochemii Klinicznej, Instytut Kardiologii w Warszawie, 2 Pracownia Farmakokinetyki Zakładu Analizy Chemicznej, Instytut Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie Streszczenie Przedstawiono zastosowanie metody UPLC-MS/MS i zestawu analitycznego MassTrak TM Immunosuppressants XE RUO Kit (Waters) do analizy stężenia ewerolimusu (EWE) w próbkach krwi pełnej pacjentów po przeszczepieniach narządowych. Metodyka i odczynniki poddane zostały częściowej walidacji. Granica oznaczalności (LLOQ) dla EWE wynosi 1,0 ng/ml. Potwierdzono, że metoda jest liniowa w zakresie 1,0-33,8 ng/ml, jest specyficzna i spełnia wymagania dla precyzji wewnątrzseryjnej (RSD 5,7%), precyzji międzyseryjnej (RSD 8,4%), oraz dokładności wewnątrzseryjnej (100,2 %) i międzyseryjnej (97,3 %), stabilności i efektu przeniesienia. Materiał kliniczny stanowiło 105 próbek krwi pacjentów leczonych EWE, które analizowano podwójnie w laboratorium w Warszawie, a następnie wysyłano do laboratorium referencyjnego wykorzystującego zwalidowaną metodę LC-MS/MS. Uzyskano wyniki stężeń EWE w zakresie 1,00-10,85, średnio: 4,43 ng/ml dla metody ocenianej oraz: 1,40-10,50, średnio: 4,53 ng/ml dla metody referencyjnej (NS), charakteryzujące się satysfakcjonującą korelacją (r=0,9376, p<0,0001) pomimo potencjalnego wpływu warunków i czasu transportu na wynik. Analiza Bland-Altman wykazała bias = -0,09 ng/ml (95% CI: -0,24; +0,06) wskazujący na nieznamienność różnicy pomiędzy metodami. W wymiarze procentowym średni bias wyniósł -4,9 %, przy czym dla decyzyjnych wartości stężenia EWE wynosił on odpowiednio: -9,4 % dla 3 ng/ml oraz +5,7 % dla 8 ng/ml. Analiza regresji Passing-Bablok wykazała zależność y = 1,123 x - 0,43. Zastosowana metoda pozwala na szybkie i wiarygodne oznaczanie EWE w próbkach krwi pacjentów będąc wygodnym narzędziem dla potrzeb rutynowej terapii monitorowanej i badań farmakokinetycznych. Summary The paper presents an implementation of the UPLC-MS/MS method and MassTrak TM Immunosuppressants XE RUO Kit (Waters) to measure everolimus (EWE) concentrations in whole blood samples from patients after organ transplantation. The method & reagents used were subject to partial validation. The limit of quantification (LLOQ) for EWE is 1.0 ng/ml. The method was found: linear in the range of ng/ml, specific and fulfilling criteria for intra- (RSD 5.7%) and inter-assay (RSD 8.4 %) precision, intra- (100.2 %) and inter-assay accuracy (97.3 %), stability and for carry-over test. A total number of 105 blood samples from patients treated with EWE were analyzed in duplicate at our Warsaw laboratory, and subsequently, the samples were transferred in series to a reference laboratory where a validated LC-MS/MS method was used to determine EWE. Drug concentrations measured by the implemented method ranged: , (mean: 4.43) ng/ml, whereas measured by the reference method ranged: , (mean: 4.53) ng/ml (NS). The methods correlated well (r=0.9376, p<0.0001) despite the potential effects of sample deterioration during transfer and storage. The Bland-Altman analysis revealed mean bias = ng/ml (95% CI: -0.24; +0.06) indicating an insignificant difference between the methods. The bias yielded -4.9 %, being -9.4 % at 3 ng/ml, and +5.7 % at 8 ng/ml for decisive EWE concentrations, respectively. The Passing-Bablok regression was obtained: y = x The presented method is suitable for rapid and reliable EWE determination in patients samples serving as a valuable tool for routine therapeutic drug monitoring and pharmacokinetic studies. 265

2 Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu... Słowa kluczowe: ewerolimus, takrolimus, cyklosporyna, syrolimus, LC-MS/MS, terapia monitorowana Key words: everolimus, tacrolimus, cyclosporine, sirolimus, LC-MS/MS, therapeutic drug monitoring Wstęp Ewerolimus (EWE) jest najnowszym z podstawowych leków immunosupresyjnych wprowadzonym do praktyki klinicznej w ostatnich kilku latach. Stosowanie EWE w transplantologii staje się coraz bardziej powszechne, pomimo że niezbędnym warunkiem terapii jest regularne monitorowanie jego stężenia we krwi pacjenta dla indywidualizacji dawkowania. Niska i zmienna dostępność biologiczna, polimorficzny metabolizm katalizowany przez układ CYP3A4-5 oraz liczne interakcje w fazie farmakokinetycznej są przyczyną stosowania w przypadku EWE terapii monitorowanej stężeniem leku [1, 2]. Z uwagi na terapeutyczne stężenia EWE wynoszące kilka ng na 1 ml krwi pełnej, konieczne jest stosowanie specyficznej metodyki analitycznej z odpowiednio niską granicą oznaczalności metody (LLOQ). Referencyjną techniką analityczną jest chromatografia cieczowa połączona z podwójną detekcją masową (LC-MS/MS) [3-7]. Zapewnia ona specyficzność oraz odpowiednie parametry walidacji, niestety, podstawowym ograniczeniem w dostępie do niej jest kosztowna aparatura oraz wyspecjalizowany personel analityczny. W wielu krajach europejskich, zwłaszcza w dużych ośrodkach naukowo-diagnostycznych, LC-MS/MS jest powszechnie obecna w laboratoriach realizujących terapię monitorowaną [3-7]. Alternatywą dla metod chromatograficznych są metodyki immunochemiczne, zapewniające często satysfakcjonujące parametry walidacji i dużą automatyzację analiz. Nieustannie jednak największym problemem jest niewystarczająca specyficzność metod immunochemicznych powodująca uzyskiwanie wyników zawyżonych średnio nawet o kilkadziesiąt procent, jak również relatywnie wysoka cena samych odczynników [6, 7]. W przypadku EWE jedyną praktycznie dostępną do końca 2009 r. metodyką immunochemiczną była metoda fluorescencyjno-polaryzacyjno immunochemiczna (FPIA) z wykorzystaniem analizatora TDx firmy Abbott; W czerwcu 2010 roku firma ThermoFisher zaoferowała analizator immunochemiczny CDx90 wprowadzając zestaw nowych odczynników QMS Everolimus Assay. Niestety, odczynniki te nie zapewniły wiarygodności oznaczeń uprawniającej do zastosowania w terapii monitorowanej u pacjentów po transplantacji [8]. Referencyjna metoda analityczna (LC-MS/MS) nie była dotychczas stosowana w polskich laboratoriach z uwagi na wysoki koszt aparatury. Przedstawiony problem z dostępnością do szybkiej i wiarygodnej metody oznaczania stężenia EWE u polskich pacjentów stał się inspiracją do wprowadzenia metody LC-MS/MS do rutynowego monitorowania stężenia tego leku. Celem pracy było przedstawienie wyników pomiarów stężenia EWE w próbkach krwi pobranych od grupy polskich pacjentów po przeszczepach narządowych i oznaczonych metodą LC-MS/MS przy użyciu zestawu analitycznego MassTrak TM Immunosuppressants XE RUO Kit (Waters) w porównaniu z wynikami otrzymanymi w laboratorium referencyjnym wykorzystującym zwalidowaną metodę LC-MS/ MS. Materiał i metody W badaniach zastosowano system ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) połączonej z tandemową detekcją masową (MS/MS) - Aquity Ultra PerformanceLC, Quattro Premier XE firmy Waters (Milford, MA, USA). Oznaczenia przeprowadzono przy użyciu zestawu analitycznego Mass- Trak TM Immunosuppressants XE RUO Kit (Waters) umożliwiającego jednoczesną analizę 4 podstawowych leków immunosupresyjnych: EWE, oraz cyklosporyny (CSA), takrolimusu (TAC) i syrolimusu (SYR) we krwi pełnej. Technika UPLC jest odmianą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC High Performance Liquid Chromatography). Obejmuje procesy chromatograficzne, w których fazą ruchomą jest ciecz przepływająca pod wysokim ciśnieniem przez fazę nieruchomą (nośnik; wypełnienie kolumny). Do uzyskania ciśnienia używa się pomp dostarczających fazę ruchomą, pod ciśnieniem do psi. Dzięki użyciu techniki UPLC redukuje się znacznie czas analizy i zużycie odczynników. Detektory reagujące na zmiany zachodzące w składzie fazy ruchomej, podczas wymywania z kolumny składników, umożliwiają śledzenie rozdziału mieszanin, identyfikację i oznaczenie zawartości poszczególnych składników. Tandemowa spektrometria masowa to technika analityczna pozwalająca na określanie struktury badanego związku. Strukturę identyfikuje się na podstawie jonów fragmentacyjnych, które są charakterystyczne dla danego związku lub grupy związków. W praktyce metoda MS/MS polega na tym, iż z widma masowego selekcjonuje się wybrany jon (najczęściej jon molekularny). Jon ten poddawany jest kolizjom (następuje jego zderzenie z wprowadzonym gazem obojętnym). Na skutek zderzeń jon macierzysty (parent ion) rozpada się na jony fragmentacyjne (daughter ions). Zastosowanie detekcji masowej zapewnia wysoką specyficzność metody. Połączenie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową łączy zalety obu technik. Procedura przygotowania próbki do analizy oparta jest na zjawisku precypitacji. Do 50 µl próbki krwi badanej (kalibracyjnej, kontrolnej) dodaje się 20 µl 0,1 M roztworu ZnSO 4. Wstępna hemoliza erytrocytów i strącenie białek ułatwia ekstrakcję leków immunosupresyjnych z matrycy biologicznej. Ekstrakcję ciecz-ciecz przeprowadza się poprzez dodanie do próbki 500 µl acetonitrylu zawierającego standard wewnętrzny [ 13 C 2 ]-ewerolimus (dla EWE), [D 12 ]-cyklosporynę A (dla CSA) i askomycynę (dla TAC i SYR). Otrzymany po wymieszaniu i odwirowaniu próbki supernatant jest nanoszony na kolumnę chromatograficzną w objętości 20 µl. 266

3 Rozdział chromatograficzny prowadzono na kolumnie Mass- Trak TDM C18 cartridge column 2,1 x 10 mm (Waters) w temperaturze +55 C, przy gradientowym przepływie (0,4 ml/min.) fazy ruchomej: metanol - woda zawierającej 2 mm octanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego. Po jonizacji ES+ jonami amonowymi [NH 4 ] + monitorowano jony macierzyste i jony fragmentacyjne oznaczanych leków immunosupresyjnych oraz ich standardów wewnętrznych: EWE (975,2 / 908,4), CSA (1219,8 / 1202,8), TAC (821,5 / 768,5), SYR (931,6 / 864,5), [ 13 C 2 ]-EWE (981,2 / 914,5), [D 12 ]- CSA (1231,8 / 1214,8), askomycyna (809,5 / 756,5). Przykład widma masowego przedstawia Ryc. 1, a przykładowy chromatogram przedstawiono na Ryc. 2. Użyto argonu jako gazu kolizyjnego. Czas analizy jednej próbki wynosił 2 minuty. Krzywe kalibracyjne wyznaczano przy użyciu 7 kalibratorów w zakresach: EWE 0-33,8 ng/ml (Ryc. 3), CSA ng/ml, SYR 0-31,1 ng/ml, TAC 0-33,6 ng/ml. W każdej serii oznaczeń analizowano po 3 próbki kontrolne - EWE: 2,0; 9,2; 25,7 ng/ml, CSA: 161; 429; 956 ng/ml, SYR: 2,3; 8,4; 22,9 ng/ml, TAC: 2,3; 9,1; 24,5 ng/ml. Do obliczeń zastosowano program komputerowy MassLynx 4.1 z aplikacją TargetLynx (Waters). Do kalibracji zastosowano model regresji ważonej 1/x. Zgodnie z zaleceniami nowej wytycznej EMA [9] metodyka poddana została częściowej walidacji w zakresie dostępnym dla komercyjnych zestawów odczynnikowych. Walidacja objęła: specyficzność, liniowość, zakres, precyzję, dokładność oraz efekt przeniesienia (carry-over). Oceniono stabilność roztworu standardu wewnętrznego oraz stabilność próbek badanych, kalibracyjnych i kontrolnych: długoterminową w temperaturze od +2 C do +8 C, krótkoterminową w temperaturze pokojowej, po ekstrakcji w warunkach przechowywania przed analizą oraz podczas przechowywania w autosamplerze. Wyniki oznaczeń EWE uzyskane omawianą metodą porównano z pomiarami wykonanymi w referencyjnym laboratorium (Analytical Unit, St George s University of London) wykorzystującym zwalidowaną metodę LC-MS/MS [10]. W skrócie: w laboratorium referencyjnym EWE izolowano z krwi pełnej (kalibratory / próbki kontroli jakości / próbki badane) metodą ekstrakcji ciecz-ciecz (0,1 M wodorotlenek sodu, eter metylo-tert-butylowy) po uprzedniej precypitacji 5% siarczanem cynku i acetonem. Chromatografię przeprowadzono na kolumnie Alltima C18 150mm x 2,1mm, 5µm (Alltech) w temperaturze +50ºC, przy przepływie 0,35 ml/ min fazy ruchomej o składzie metanol : woda (82:18, v/v) zawierającej 2 mm octanu amonu i 0,1% kwasu mrówkowego. W celu monitorowania jonów zastosowano spektrometr masowy z podwójnym kwadrupolem Sciex API2000 (Applied Biosystems) ze źródłem turbo-ion spray i temperaturą +450ºC. Zastosowano jonizację dodatnią i oznaczano jony macierzyste oraz jony fragmentacyjne EWE (975,6/908,5) i standardu wewnętrznego [ 13 C 2 EWE] (981,6/914,4). Gazem kolizyjnym był azot. Całkowity czas oznaczenia wynosił 5 minut. Krzywe kalibracyjne wyznaczano przy użyciu 6 kalibratorów o stężeniach 1-50 ng/ml analizowanych dwukrotnie. Zastosowano model regresji ważonej 1/x 2. Próbki kontrolne (3, 15, 30 ng/ml) analizowano w dwóch powtórzeniach pomiędzy próbkami w danej sekwencji analitycznej. Materiał kliniczny stanowiły próbki krwi pełnej pochodzące od pacjentów po przeszczepieniach narządowych (serce, nerka, wątroba) leczonych EWE w różnych schematach immunosupresji. Próbki krwi pobierane były dla określenia stężenia minimalnego w stanie stacjonarnym. Ponieważ ce- Rycina 1 Widmo masowe EWE m/z 975,37; CSA m/z 1219,59; SYR m/z 931,44; TAC m/z 821,

4 Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu... Rycina 2. Przykładowy chromatogram. Rycina 3. Przykładowa krzywa kalibracyjna dla EWE. lem badania było porównanie dwóch metod analitycznych zrezygnowano z oceny wpływu dodatkowych czynników demograficznych (wiek, płeć) i terapeutycznych (rodzaj przeszczepu, schemat immunosupresji) traktując każdą próbkę jako źródło dwóch niezależnych obserwacji. Analizie poddano 105 próbek krwi, w których oznaczano stężenie EWE: najpierw podwójnie przy użyciu zestawu analitycznego MassTrak TM Immunosuppressants XE RUO Kit (Waters) w laboratorium w Warszawie, a następnie odpowiednio zabezpieczone próbki wysyłano do laboratorium referencyjnego w Londynie. Taka sytuacja spowodowała zaistnienie dodatkowego czynnika: wpływu transportu próbek (głównie w postaci czasu i temperatury), który mógłby być odpowiedzialny za ewentualne różnice w wartościach stężeń EWE uzyskiwanych w laboratorium referencyjnym oraz mieć negatywny wpływ na korelację wyników. Do statystycznego porównania metod zastosowano analizę regresji Passing-Bablok, odpowiednią do porównania dwóch równocennych metod pomiarowych oraz analizę Bland- Altman, która umożliwia ocenę różnicy pomiędzy pomiarami (bias) [11-14]. Obydwa narzędzia dostępne są w oprogramowaniu MedCalc. Dodatkowo, wobec nieodrzucenia hipotezy o normalności rozkładu wyniki pomiarów porównano testem t dla prób powiązanych. 268

5 Wyniki W laboratorium Instytutu Biotechnologii i Antybiotyków w Warszawie wykonano częściową walidację metody LC-MS/ MS. Granica oznaczalności metody (LLOQ) EWE wynosi 1,0 ng/ml. Potwierdzono, że metoda jest liniowa w zakresie 1,0-33,8 ng/ml (y = 0, x + 0, ; R = 0,997347; R 2 = 0,994701). Na podstawie analizy 10 ślepych próbek oceniono specyficzność metody stwierdzając brak sygnałów na chromatogramach zarówno w czasie retencji odpowiadającym substancji badanej - EWE, jak i standardowi wewnętrznemu - [ 13 C 2 ]-EWE. Kryteria akceptacji dla precyzji: RSD 20,0 % dla stężenia na poziomie LLOQ i RSD 15,0 % dla wszystkich pozostałych stężeń z zakresu kalibracji zostały spełnione dla precyzji wewnątrzseryjnej (RSD 5,7%) i precyzji międzyseryjnej (RSD 8,4%). Dokładność wewnątrzseryjna (100,2 %) i międzyseryjna (97,3 %) spełnia wymagania wytycznej [9] (100,0 ± 20,0 % dla stężenia na poziomie LLOQ i 100,0 ± 15.0 % dla wszystkich pozostałych stężeń z zakresu kalibracji). W teście carry-over (efekt przeniesienia) nie stwierdzono obecności sygnału substancji oznaczanej i standardu wewnętrznego w próbkach ślepych analizowanych bezpośrednio po próbce najwyższego stężenia z zakresu kalibracji. Analizę przeprowadzono w 7 cyklach. Wykonane testy stabilności potwierdziły spełnienie wymagań stawianych metodom bioanalitycznym (dokładność oznaczeń w odniesieniu do wartości wyjściowej 100,0 ± 15,0 %). W dwóch badanych próbkach obiema metodami uzyskano wynik poniżej LLOQ (<1,0 ng/ml), stąd ocenę statystyczną wykonano dla n=103 próbek. Metodą badaną uzyskano stężenia EWE w zakresie 1,00-10,85 ng/ml, średnio 4,43 ± 2,22 ng/ml, natomiast w laboratorium referencyjnym zmierzono w tych samych próbkach stężenie EWE w zakresie 1,40-10,50 ng/ml, średnio 4,53 ± 1,99 ng/ml. Wynik uzyskany w laboratorium w Warszawie stanowi zatem średnio 96,72 ± 16,67 % wartości zmierzonej w ośrodku referencyjnym, przy czym analiza statystyczna nie potwierdziła znamienności różnic (p=0,2349). Wykazano satysfakcjonującą korelację (r=0,9376; p<0,0001; y = 1,045 x - 0,29) pomiędzy obiema metodami, pomimo potencjalnego wpływu warunków i czasu transportu na wynik oznaczeń w laboratorium referencyjnym. W związku z niewielkim zakresem pomiarów analiza Bland- Altman została oparta na ocenie różnic przedstawionych w wymiarze stężenia (Ryc. 4) [13] uzyskano wartość -0,09 ng/ml (95% CI: -0,24; +0,06) wskazującą na nieznamienność różnicy pomiędzy metodami. W wymiarze procentowym analiza Bland-Altman wykazała średni bias = -4,9 %, przy czym dla decyzyjnych wartości stężenia EWE (granice zakresu stężeń terapeutycznych) wynosił on odpowiednio: -9,4 % dla 3 ng/ml oraz +5,7 % dla 8 ng/ml. Przeprowadzona analiza regresji Passing-Bablok wykazała zależność y = 1,123 x - 0,43 i została przedstawiona graficznie na Ryc. 5. Nie stwierdzono znaczącego odchylenia od liniowości (p>0,10), jednak wyznaczone współczynniki Rycina 4. Ocena różnicy pomiędzy pomiarami wykonana za pomocą analizy Bland-Altman i przedstawiona w wymiarze stężenia. równania regresji: a = 1,12 (95% CI: 1,07; 1,19) i b = -0,43 (95% CI: -0,77; -0,17) nie potwierdziły równocenności obu metod. Jak zaznaczono wcześniej, zestaw analityczny MassTrak TM Immunosuppressants XE RUO Kit umożliwia jednoczesną analizę 4 podstawowych leków immunosupresyjnych: EWE, oraz CSA, TAC i SYR we krwi pełnej. Dla oznaczeń EWE i TAC producent uzyskał certyfikat dla analizy in vitro (IV), dla pozostałych: CSA i SYR laboratorium powinno przeprowadzić walidację metody, przed jej zastosowaniem w terapii monitorowanej stężeniem leku. Dyskusja Przedstawione w pracy wyniki oznaczeń stężenia EWE uzyskane w obu laboratoriach przy użyciu dwóch różnych metod LC-MS/MS wykazały dobrą korelację. Nie stwierdzono różnicy w pomiarach zarówno w analizie procedurą Bland- Altman, jak i w statystycznym porównaniu wartości średnich. Wyników tych nie potwierdzono wprawdzie w analizie regresji Passing-Bablok, jednak należy podkreślić, że odnotowana na reprezentatywnej liczbie pomiarów różnica pomiędzy metodami (bias) nie przekraczała wartości ± 10 % w całym zakresie stężeń terapeutycznych (3-8 ng/ml). Świadczy to o klinicznej równorzędności zastosowanych metod w terapii monitorowanej stężeniem EWE [11, 14]. Korelacja pomiędzy wynikami, aczkolwiek satysfakcjonująca, mogłaby być wyższa przy zastosowaniu podwójnych uśrednionych pomiarów (analogicznie do laboratorium w Warszawie) w ośrodku referencyjnym. Porównywalne liczbowo wyniki uzyskane w laboratorium w Londynie przemawiają za stabilnością EWE w warunkach transportu i przechowywania przed powtórną analizą. Dotychczas medyczne laboratoria diagnostyczne nie korzystały z techniki LC-MS/MS z uwagi na uwarunkowania wymienione we wstępie pracy. Dodatkowo, pokutuje przekonanie, że metodyka taka jest przeznaczona dla placówek naukowo-badawczych lub przemysłowych, a jest 269

6 Monitorowanie stężenia leków immunosupresyjnych techniką LC-MS/MS na przykładzie oznaczania ewerolimusu... Rycina 5. Porównanie oznaczeń stężenia EWE z wykorzystaniem analizy regresji Passing-Bablok. zbyt wyrafinowana do rutynowego stosowania w diagnostyce laboratoryjnej. Coraz niższa cena aparatury w połączeniu z dostępnością komercyjnych zestawów aplikacyjnych przeznaczonych do analizy kilku leków jednocześnie oraz niewielkie zużycie odczynników i krótki czas analizy sprawiają, że technika LC-MS/MS, (w tym wykorzystująca zestawy analityczne firmy Waters) jest powszechnie wykorzystywana w terapii monitorowanej w wielu krajach. Potwierdzeniem tego trendu jest pojawiająca się duża liczba nowych aplikacji [10, 15-17]. Nasze badania przedstawione na przykładzie oznaczania EWE we krwi pacjentów po przeszczepieniach narządowych dowodzą, że możliwe jest skuteczne wprowadzenie techniki LC-MS/MS także do polskiej diagnostyki laboratoryjnej. Podziękowania Firma Novartis Poland sp. z o.o. sfinansowała wykonanie oznaczeń stężenia EWE w próbkach krwi pacjentów po transplantacji leczonych preparatem Certican. Autorzy składają podziękowanie: prof. D.W. Holt i dr D.A. McKeown z Analytical Unit, St George s University of London za współpracę przy analizie próbek metodą referencyjną. Piśmiennictwo 1. Kirchner GI, Meier-Wiedenbach I, Manns MP. Clinical pharmacokinetics of everolimus. Clin Pharmacokinet 2004; 43: Dunn C, Croom KF. Everolimus. A review of its use in renal and cardiac transplantation. Drugs 2006; 66: Taylor PJ, Franklin ME, Graham KS, et al. A HPLC-mass spectrometric method suitable for the therapeutic drug monitoring of everolimus. J Chromatogr B 2007; 848: Koster RA, Dijkers ECF, Uges DRA. Robust, high-throughput LC- MS/MS method for therapeutic drug monitoring of cyclosporine, tacrolimus, everolimus, and sirolimus in whole blood. Ther Drug Monit 2009; 31: Meinitzer A, Gartner G, Pilz S, et al. ultra fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry routine method for simultaneous determination of cyclosporin A, tacrolimus, sirolimus and everolimus in whole blood using deuterated internal standards for cyclosporin A and everolimus. Ther Drug Monit 2010; 32: Moes DJAR, Press RR, de Fijter JW, et al. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry outperforms fluorescence polarization immunoassay in monitoring everolimus therapy in renal transplantation. Ther Drug Monit 2010; 32: Sallustio BC, Noll BD, Morris RG. Comparison of blood sirolimus, tacrolimus and everolimus concentrations measured by LC-MS/MS, HPLC-UV and immunoassay methods. Clin Biochem 2011; 44: Kunicki PK. Application of new QMS everolimus assay performed on CDX 90 analyzer (ThermoFisher) to therapeutic drug monitoring in transplant patients. Ther Drug Monit 2011; 33: Guideline on bioanalytical method validation, European Medicines Agency, 2011, EMEA / CHMP / EWP / / 2009 of 21 July McKeown DA, Hammond GW, Christians U, et al. Multi-centre evaluation of the Waters MassTrak XE (IUO) kit for use with LC-MS/MS for the quantification of everolimus. Ther Drug Monit 2011; 33: Bland JM, Altman DG. Statistical methods for assessing agreement between two methods of clinical measurement. Lancet 1986; i: Payne RB. Method comparison: evaluation of least squares, Deming and Passing/Bablok regression procedures using computer simulation. Ann Clin Biochem 1997; 34: Dewitte K, Fierens C, Stöckl D, et al. Application of the Bland- Altman plot for interpretation of method-comparison studies: A critical investigation of its practice. Clin Chem 2002; 48: Altman DG, Bland JM. Commentary on quantifying agreement between two methods of measurement. Clin Chem 2002; 48: Parant F, Bouche L, Rougemont B, et al. Evaluation of two tandem-ms kits for immunosuppressant analysis on a Waters Xevo TQ-S tandem mass spectrometer. Ther Drug Monit 2011; 33: Juenke JEM, Smith J, Thomas RL, et al. An everolimus method comparison between Waters MassTrak XE (IUO) Kit and an HPLC-MS/MS method, in renal transplant patients. Ther Drug Monit 2011; 33: Ji M, Kim S, Chung HJ, et al. Evaluation of the MassTrak Immunosupressant XE Kit for the determination of everolimus and cyclosporin A in human whole blood employing isotopically labeled internal standards. Clin Chem Lab Med 2011; [Epub ahead of print]. Zaakceptowano do publikacji: Adres do korespondencji: dr n. farm. Paweł K. Kunicki Pracownia Farmakologii Klinicznej i Terapii Zakładu Biochemii Klinicznej Instytut Kardiologii Warszawa, Alpejska 42 Tel.: ; fax p.kunicki@ikard.pl 270