WIELOSKŁADNIKOWA ANALIZA POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W OWOCACH I WARZYWACH METODĄ LC-MS/MS

Transkrypt

1 Katolicki Uniwersytet Lubelski Jana Pawła II Wydział Biotechnologii i Nauk o Środowisku Autoreferat rozprawy doktorskiej WIELOSKŁADNIKOWA ANALIZA POZOSTAŁOŚCI PESTYCYDÓW W OWOCACH I WARZYWACH METODĄ LC-MS/MS Anna Maria Stachniuk Promotor: dr hab. Elżbieta Anna Stefaniak Promotor pomocniczy: dr hab. Emilia Fornal Lublin 24

2

3 Wstęp Jakość żywności jest istotnym czynnikiem determinującym stan zdrowia człowieka. Obecność toksycznych i szkodliwych dla zdrowia substancji w żywności jest istotnym problemem i wymaga przedsięwzięcia zarówno środków zaradczych umożliwiających zapobieganie zanieczyszczeniom, jak i kontrolnych umożliwiających ocenę stopnia skażenia produktu końcowego. Szczególną grupę zanieczyszczeń żywności stanowią pestycydy. Substancje te już w małych ilościach mogą wywoływać ostre zatrucia, przyczyniać się do powstawania chorób nowotworowych oraz wad rozwojowych, wpływać negatywnie na system hormonalny, immunologiczny i nerwowy. Znaczna część pestycydów wykazuje szkodliwe działanie już przy bardzo niskich stężeniach, w zakresie ng/g oraz poniżej, stąd też istnieje bardzo duże zapotrzebowanie ich identyfikowania oraz oznaczania w żywności przy użyciu metod o dużej selektywności i czułości. W analizie pozostałości pestycydów, podobnie jak w analizie innych substancji skażających żywność, widoczny jest wyraźny trend w kierunku opracowania szybkich metod jednoczesnego oznaczania pozostałości wielu składników. Za koniecznością opracowania metod pozwalających na jednoczesną analizę wielu związków pochodzących z różnych klas chemicznych przemawia miedzy innymi fakt stosowania różnorodnych substancji aktywnych zawartych w środkach ochrony roślin stosowanych w rolnictwie, co może prowadzić do współwystępowania szerokiej gamy pestycydów różniących się właściwościami chemicznymi w produkcie spożywczym. Coraz większe zapotrzebowanie na tego typu metody analiz jest również naturalną konsekwencją wprowadzenia niskich dopuszczalnych poziomów stężeń pozostałości pestycydów w żywności na terenie Unii Europejskiej oraz obowiązkowej ich kontroli. Nie bez znaczenia jest także wzrost świadomości konsumentów oczekujących produktów bezpiecznych i wolnych od zanieczyszczeń chemicznych. Wielu z nich jest gotowych zapłacić wyższą cenę, aby uzyskać pewność, że kupują i spożywają zdrową i bezpieczną żywność. Różnorodność zarejestrowanych substancji, które mogą być stosowane jako pestycydy, oraz obowiązujące uregulowania prawne wymuszające coraz większą częstotliwość i liczbę przeprowadzonych analiz, stawiają przed analitykiem nie lada wyzwanie obejmujące zapewnienie rzetelności i powtarzalności otrzymanych wyników. Analiza próbek żywności pod kątem obecności pestycydów stanowi wieloetapową procedurę analityczną obejmującą pobieranie i przygotowanie próbki w tym ekstrakcję analitów z matrycy, oczyszczanie ekstraktów oraz oznaczenie pestycydów. Prawidłowe pobranie próby oraz jej prawidłowe przygotowanie mają pryncypialne znaczenie, gdyż determinują jakość i wiarygodność wyniku oznaczenia. 3

4 Wstęp W ciągu ostatniego dziesięciolecia nastąpił znaczny wzrost i rozwój metod ekstrakcyjnych stosowanych do izolacji pestycydów z żywności umożliwiających równoczesną ekstrakcję pozostałości wielu substancji o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych [-2]. Szczególnym momentem tego rozwoju było wprowadzenie w 23 roku, a do celów analiz LC-MS w 25 roku techniki ekstrakcyjnej zwanej QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) - ekstrakcji rozpuszczalnikiem połączonej z oczyszczaniem ekstraktu. Od tego momentu w literaturze odnaleźć można zarówno wiele przykładów zastosowania tej techniki do oznaczeń pozostałości pestycydów w całej gamie produktów spożywczych jak i prace poświęcone porównaniu QuEChERS z innymi technikami ekstrakcyjnymi [2,22]. Obok QuEChERS, najczęściej stosowane do ekstrakcji próbek lub ich wstępnego oczyszczania są techniki SPE (Solid Phase Extraction), w tym również dspe (dispersive SPE) oraz SE (Solvent Extraction) wraz z LLE (Liquid- Liquid Extraction) z bardzo często następującym po nich etapem oczyszczenia ekstraktów za pomocą techniki SPE. Udział pozostałych technik ekstrakcyjnych jest stosunkowo niewielki (rysunek ). MSPD 5% MASE / HR-LPME 2% USE 4% PLE 4% SFE % CHEMAC % SEC % STEMIT % QuEChERS 38% SPE, dspe 8% SE, LLE 25% Rysunek. Zestawienie częstotliwości stosowania technik izolacji i oczyszczania ekstraktów stosowanych do oznaczania pozostałości pestycydów w próbkach żywności metodą LC-MS, na podstawie zestawienia publikacji za lata W analizie pestycydów jednym z głównych problemów jest optymalizacja zastosowanej techniki ekstrakcyjnej połączonej z oczyszczaniem ekstraktu. Do izolacji pestycydów z żywności najczęściej stosowanym rozpuszczlanikiem jest acetonitryl, obok metanolu i octanu etylu. Wśród sorbentów natomiast największą popularnością cieszą się kolumienki Oasis HLB oraz mieszaniny PSA (Primary-Secondary Amine) i GCB (Graphitized Carbon Black). Wielu autorów preferuje omijanie etapu oczyszczania ekstraktu 4

5 Wstęp i jego bezpośrednie dozowanie do LC-MS [23-27]. Jednak dozowanie nieoczyszczonego ekstraktu wymusza konieczność starannego zbadania efektu matrycowego powodowanego przez koeluujące z analitem składniki matrycy. Efekt ten prowadzi do tłumienia (rzadziej do wzmocnienia) jonizacji analitu, wpływając niekorzystnie na dokładność i powtarzalność oznaczenia. Chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią mas (LC-MS) stanowi obecnie jedną z najczęściej stosowanych metod wykorzystywanych do wykrywania, identyfikacji i oznaczania ilościowego pestycydów w żywności. Metoda ta dostarcza informacji o strukturze analitu, ma małe wymagania co do oczyszczania próbki, nie wymaga derywatyzacji substancji analizowanych, pozwala analizować jednocześnie substancje różniące się znacznie polarnością. Jej popularność potwierdza coraz większa liczba publikacji poświęconych roli LC-MS w oznaczaniu zanieczyszczeń żywności, w tym pestycydów [-3]. Połączenie efektywnej techniki rozdzielania chromatograficznego LC z selektywną techniką detekcji MS zrewolucjonizowało analityczne możliwości oznaczeń ilościowych, umożliwiając wykrywanie zarówno coraz większej liczby związków w pojedynczym oznaczeniu jak i coraz bardziej śladowych ilości substancji obecnych w analizowanej próbce. Współcześnie istnieje wiele odmian połączeń chromatografii cieczowej z spektrometrem masowym, z których każde posiada inne zastosowania i wymaga stosowania aparatów o innej konstrukcji. QQQ 6% Q 4% IT 5% Q-Trap 9% TOF 6% Q-TOF 5% Rysunek 2. Zestawienie częstotliwości stosowania poszczególnych analizatorów oraz układów tandemowych występujących w połączeniach z chromatografią cieczową stosowanych do analizy pozostałości pestycydów w próbkach żywności, na podstawie zestawienia publikacji za lata W analizie pozostałości pestycydów w żywności najczęściej spotykany jest układ wysokosprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemowym spektrometrem mas typu potrójny kwadrupol (QQQ), pracujący w trybie monitorowania wybranych reakcji 5

6 Wstęp fragmentacji (MRM). Zestawienie stosowanych na przestrzeni ostatnich dziesięciu lat rodzajów spektrometrów masowych w analizie pozostałości pestycydów w żywności przedstawia rysunek 2. Do najważniejszych zalet wysokosprawnej/ultrasprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrem mas należą: wysoka czułość i selektywność oraz krótki czas analizy umożliwiający w trakcie jednego cyklu analitycznego rozdzielenie i oznaczenie znacznej liczby związków. Stąd tak wysoka popularność techniki w oznaczeniach pozostałości różnych substancji, w tym pestycydów. Podstawowym ograniczeniem metody jest wrażliwość na współwystępujące składniki matrycy, szczególnie w przypadku analizy związków występujących w skomplikowanych matrycach biologicznych, takich jak żywność. Kalibracja z wykorzystaniem matrycy próbki jest najczęściej stosowaną techniką zmniejszającą wpływ matrycy na wynik oznaczenia ilościowego. Analiza pozostałości pestycydów w żywności, ze względu na złożoność matryc, niskie stężenia oznaczanych związków oraz coraz większą liczbę dopuszczonych do użycia środków ochrony roślin podlega nieustannej modyfikacji. Pomimo opracowania szeregu procedur analitycznych umożliwiających jednoczesną izolację pestycydów o zróżnicowanej budowie chemicznej z produktów spożywczych, przed analitykami nadal stoją liczne wyzwania zarówno w obszarze przygotowania prób, jak i analizy. 6

7 Cel i zakres pracy Trudności analityczne pojawiające się w trakcie oznaczeń pozostałości pestycydów metodą LC-MS wynikają przede wszystkim ze złożonego charakteru matrycy, jaką jest żywność. Aby zrekompensować skutki wpływu składników matrycy na wynik analizy, do oznaczeń ilościowych stosuje się zwykle procedurę sporządzania roztworów wzorcowych z wykorzystaniem matrycy analizowanego produktu. W badaniach obejmujących znaczną ilość produktów żywnościowych dopuszczalne jest również (i często praktykowane) stosowanie jednej matrycy reprezentatywnej dla jednorodnej grupy produktów. Jednakże wiadomo, że zarówno izolacja analitu z badanego produktu jak i efekt matrycowy (tłumienia lub wzmocnienia intensywności sygnału MS) są zależne od układu analit-matryca. Zastosowanie jednej matrycy reprezentatywnej dla licznej grupy analizowanych produktów może być znakomitym rozwiązaniem, jednakże brakuje systematycznych badań ukierunkowanych na ilościową ocenę, jak stosowanie jednej matrycy reprezentatywnej wpływa na wynik analizy. Zasadniczym celem przedstawionej pracy doktorskiej była ocena wpływu zastosowania matrycy reprezentatywnej w procesie kalibracji na wynik ilościowego oznaczenia pozostałości pestycydów metodą LC-MS/MS. Oceny tej dokonano na przykładzie oznaczania pozostałości pięćdziesięciu sześciu pestycydów w owocach miękkich. Badania nad zastosowaniem matrycy reprezentatywnej zostały poprzedzone optymalizacją i walidacją metody oznaczania pozostałości pestycydów przy zastosowaniu w kalibracji metody matrycy właściwej danemu produktowi. Cel pochodny zakładał, że zoptymalizowana i zwalidowana procedura zostanie wykorzystana do przeprowadzenia oceny stopnia skażenia pozostałościami pestycydów prób owoców miękkich. Metodę wykorzystano także do określenia częstotliwości występowania incydentów skażenia wśród wybranych warzyw. Oznaczenie stopnia skażenia owoców i warzyw jest istotne w kontekście oceny efektywności i celowości prowadzenia oznaczeń metodami umożliwiajacymi jednoczesne oznaczanie wielu związków należących do różnych klas chemicznych. Dodatkowym celem było podjęcie próby wykorzystania opracowanej metodyki do rozszerzenia gamy analizowanych związków poza grupę pestycydów i wprowadzenie jednoczesnego oznaczania związków z grupy mykotoksyn. Te niezwykle toksyczne metabolity grzybów pleśniowych rozwijających się na różnych surowcach i produktach spożywczych (w tym na owocach i warzywach) są równie szkodliwe dla zdrowia jak 7

8 Cel i zakres pracy pestycydy. Dołączenie mykotoksyn do analitycznej metody oznaczania pozostałości pestycydów stworzyłoby dodatkowe możliwości szybkiej i rzetelnej oceny jakości produktów spożywczych. Program badawczy obejmował następujące zagadnienia: optymalizację metody LC-MS/MS dla potrzeb oznaczania pozostałości pestycydów w owocach miękkich i warzywach z rodziny kapustowatych, wykazanie wiarygodności, aplikacyjności i gotowości zoptymalizowanej metody do wdrożenia oraz wykonanie kosztorysu wdrożenia metody, wyznaczenie funkcji oraz parametrów oceny przydatności matrycy reprezentatywnej, zbadanie wpływu wyboru matrycy reprezentatywnej dla grupy owoców miękkich na wynik oznaczenia ilościowego, ocenę stopnia skażenia oraz częstotliwości incydentów skażenia pestycydowego w oznaczanych owocach i warzywach w kontekście oceny celowości prowadzenia oznaczeń metodami umożliwiajacymi jednoczesne oznaczanie wielu związków należących do różnych klas chemicznych; ocenę możliwości oznaczania pozostałości aflatoksyn obok pozostałości pestycydów w próbkach czarnej porzeczki stosując pojedynczą metodę ekstrakcji i oznaczenia. 8

9 2 Wyniki i dyskusja 2. Optymalizacja metody LC-MS/MS oznaczania pozostałości pestycydów w owocach i warzywach Oznaczenia pozostałości pestycydów prowadzono metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemowym spektrometrem mas typu potrójny kwadrupol (QQQ). Identyfikację i oznaczenie ilościowe pestycydów przeprowadzano w trybie monitorowania wybranych reakcji rozpadu jonów macierzystych (MRM). Ekstrakcję pestycydów z próbek rzeczywistych prowadzono metodą QuEChERS zgodnie z obowiązującą normą PN-EN Metodą objęto 56 pestycydów i 7 matryc (malinę, jeżynę, truskawkę, porzeczkę czarną, porzeczkę czerwoną, brokuła i kalafiora). W celu zapewnienia wiarygodności wyników przeprowadzono walidację metody zgodnie z kryteriami SANCO/2495/2 w zakresie dostosowanym do celów prowadzonych badań. Zbadano: selektywność, liniowość, granicę wykrywalności i oznaczalności, powtarzalność metody, odzysk, efekt matrycowy, efektywność procesową (z ang. process efficiency) oraz stabilność roztworów wzorcowych. W opracowanej metodzie dla większości oznaczanych pestycydów we wszystkich siedmiu rozważanych matrycach odzysk na oznaczanym poziomie stężeń zgodnym z obowiązującym najwyższym dopuszczalnym poziomie pozostałości (NDP) był w zalecanym zakresie (8 2%). Najniższą wartość odzysku przy powtarzalności na poziomie wartości względnego odchylenia standardowego RSD (Relative Standard Deviation) poniżej % uzyskano w matrycach wzbogaconych metosulamem oraz tiabendazolem, natomiast najwyższą wartość odzysku również przy powtarzalności RSD<% w matrycach wzbogaconych linuronem. W celu oszacowania precyzji metody obliczono względne odchylenia standardowe stosunku powierzchni piku pestycydu do powierzchni piku wzorca wewnętrznego zarówno dla wyników badań prowadzonych w ciągu jednego dnia pomiarowego, jak i dla wyników uzyskanych z różnych dni pomiarowych. Względne odchylenie standardowe (RSD) wyznaczone na podstawie wyników jednego dnia pomiarowego dla 56 pestycydów we wszystkich siedmiu objętych badaniem matrycach mieściło się w zakresie,6,99% z medianą,85% Wartości RSD międzydniowe były nieco wyższe i mieściły się w zakresie,65 2,8% z medianą 3,7%. Liniowość metody zbadano za pomocą pomiaru sygnału wzorców pestycydów na pięciu poziomach stężeń. Wyznaczone dla 56 pestycydów wartości współczynników determinacji R 2 mieściły się w 9

10 Wyniki i dyskusja zakresie,99-,9999 dla wszystkich siedmiu objętych badaniem matryc, co świadczy o zachowaniu liniowości kalibracji i wskazań detektora w badanym zakresie stężeń. Wysoką czułość metody potwierdziły uzyskane wyniki wartości granic wykrywalności LOD (Limit of Detection). Dla wszystkich 56 pestycydów w 7 objętych badaniem matrycach mieściły się w zakresie od,3 µg/kg do 22,7 µg/kg. Granice oznaczalności LOQ (Limit of Quantification) w zdecydowanej większości były wielokrotnie niższe od NDP i zawierały się przedziale od, µg/kg do 75,7 µg/kg. Uzyskanie satysfakcjonujących parametrów walidacyjnych metody umożliwiło zastosowanie jej do oznaczeń pozostałości pestycydów w próbkach rzeczywistych. 2.2 Wpływ zastosowania matrycy reprezentatywnej w procesie kalibracji na wynik oznaczenia ilościowego pestycydów Aby zbadać wpływ matrycy reprezentatywnej na wynik oznaczenia przeprowadzono badania obejmujące analizę pozostałości pestycydów w jednorodnej grupie produktów spożywczych stanowiących zbiór pięciu owoców miękkich: truskawek, malin, jeżyn, porzeczek czarnych i czerwonych. Dla każdej z wymienionych matryc przygotowano krzywe kalibracyjne. Badaniami objęto 56 pestycydów. Matrycę reprezentatywną wybrano w sposób losowy. Badania przeprowadzono z zastosowaniem reprezentatywnej krzywej kalibracyjnej przygotowanej dla maliny. Zaproponowano zastosowanie następujących parametrów: funkcji względnej różnicy oznaczenia, stężeń granicznych oraz efektywności procesowej Funkcja względnej różnicy oznaczenia Różnica oznaczenia ilościowego jest wielkością pomiarową wynikającą z zastosowania reprezentatywnej krzywej kalibracyjnej do oznaczenia pozostałości pestycydu w próbce rzeczywistej innej niż matryca reprezentatywna. Aby wyjaśnić istotę jej zagadnienia, na rysunku nr 3 przedstawiono dwie krzywe kalibracyjne o różnych współczynnikach kierunkowych. Kolorem czerwonym zaznaczono krzywą kalibracyjną wykonaną z wykorzystaniem analizowanej próbki (matryca właściwa), kolorem niebieskim zaznaczono krzywą kalibracyjną wykonaną z wykorzystaniem próbki reprezentatywnej (matryca reprezentatywna). Dokonując analizy próbki rzeczywistej (zaznaczonej na wykresie czarną linią ciągłą) uzyskujemy wynik, na którego wpływ mają dwa czynniki: błąd wynikający z pomiaru oraz błąd krzywej kalibracyjnej (zaznaczone na rysunku czarną linią

11 Wyniki i dyskusja przerywaną). Wpływ tych czynników umiejscawia nam wynik oznaczenia w określonym przedziale stężeń. Porównując wynik analizy ilościowej próbki rzeczywistej wykonanej za pomocą dwóch różnych krzywych kalibracyjnych (właściwej i reprezentatywnej) jesteśmy w stanie zaobserwować dwa niepokrywające się ze sobą zakresy stężeń oraz określić różnicę w ich oznaczeniu (zaznaczoną na rysunku jako Q diff (z ang. quantification difference)). W zależności od analizowanego pestycydu oraz rodzaju analizowanej matrycy zakresy te będą mniej lub bardziej rozbieżne. Możliwa jest również sytuacja, w której oba zakresy stężeń będą się pokrywały, a wartość Q diff będzie równa zero. Matryca właściwa Matryca reprezentatywna Rysunek 3. Schemat obrazujący względną różnicę oznaczenia ilościowego Qdiff powstałą w wyniku prowadzenia oznaczenia ilościowego danego analitu przy zastosowaniu matrycy właściwej oraz matrycy reprezentatywnej Do wyliczenia wartości względnej różnicy oznaczenia (Q diff ) zastosowano następującą zależność: Q diff = (C (w) C (r) ) / C (r) () W przypadku liniowych krzywych kalibracyjnych zależność () można wyrazić jako funkcję: Q diff = f(c (r) ) = (b (r) b (w) ) / (a (w) C (r) ) + a (r) / a (w) (2) gdzie: Q diff funkcja względnej różnicy oznaczenia, C (w) stężenie uzyskane z kalibracji wykorzystującej właściwą matrycę próbki,

12 Wyniki i dyskusja a (w) b (w) parametry kierunkowe krzywej kalibracyjnej wykonanej z wykorzystaniem właściwej próbki (matryca właściwa), C (r) stężenie uzyskane z kalibracji wykorzystującej matrycę reprezentatywną, a (r) b (r) parametry kierunkowe krzywej kalibracyjnej wykonanej z wykorzystaniem próbki reprezentatywnej (matryca reprezentatywna). Wyznaczone wartości względnej różnicy oznaczenia w funkcji stężenia obliczonego w oparciu o reprezentatywną krzywą kalibracyjną na przykładzie sześciu wybranych pestycydów przedstawiono na rysunku 4. Na zaprezentowanych wykresach widoczne są zarówno dodatnie jak i ujemne wartości funkcji, co oznacza, że zastosowanie kalibracji wykorzystującej matrycę reprezentatywną prowadzi zarówno do uzyskania zawyżonych jak i zaniżonych wartości stężenia pestycydu. Dokonując interpretacji uzyskanych wyników względnej różnicy oznaczenia arbitralnie przyjęto 25% poziom akceptowalnego limitu różnicy oznaczenia dopuszczającego stosowanie matrycy reprezentatywnej w przypadku oznaczania ilościowego pestycydu w matrycy innej niż reprezentatywna. Poziom ten na zaprezentowanych wykresach zaznaczono w postaci dwóch poziomych linii przerywanych (rysunek 4). Dla przedstawionych 6 pestycydów w większości objętych badaniem matryc w szerokim zakresie stężeń wartość względnej różnicy oznaczenia nie przekroczyła dopuszczalnego 25% limitu. Wyjątek stanowił metamidofos oznaczany w jeżynie, w przypadku którego limit ten został przekroczony. Najbardziej znaczącymi wartościami względnej różnicy oznaczenia, z praktycznego punktu widzenia podejmowania decyzji o przekroczeniu w produkcie wartości NDP pestycydu będą wartości oscylujące w granicy oraz powyżej NDP pestycydów. Jako wartość graniczną przyjęto C r = NDP, co zaznaczono za pomocą pionowej linii ciągłej na zaprezentowanych rysunkach. W przypadku kwinalfosu, pomimo iż rozpiętość zakresu wartości względnej różnicy oznaczenia w niskim zakresie stężeń będzie się wahać w przedziale od około do,5, to już w granicy i powyżej NDP pozostanie relatywnie stała w przedziale od,5 do dla wszystkich czterech objętych badaniem matryc (rysunek 4). 2

13 Wyniki i dyskusja,5 ALACHLOR,5 BENDIOKARB -,5 -,5 - -,5,,5,2,5,,5,2,5 FENPROPIDYNA,5 KWINALFOS -,5 -,5 - -,5,,5,2,5,,5,2,5 METAMIDOFOS,5 TERBUTRYN -,5 -,5 - -,5,,5,2,5,,5,2 truskawka porzeczka czerwona porzeczka czarna jeżyna Rysunek 4. Funkcja względnej różnicy oznaczenia (Qdiff) wyznaczona dla alachloru, bendiokarbu, fenpropidyny, kwinalfosu, metamidofosu oraz terbutynu w truskawce, jeżynie, porzeczce czarnej i czerwonej przy zastosowaniu maliny jako matrycy reprezentatywnej, Ciągła linią pionową zaznaczono stężenie C r równe NDP, poziomą linią przerywaną akceptowalny +/- 25% poziom różnicy oznaczenia 3

14 Wyniki i dyskusja Aby umożliwić łatwe i szybkie porównanie wpływu matrycy reprezentatywnej (malina) na wynik oznaczenia ilościowego wszystkich 56 pestycydów objętych badaniem w owocach miękkich: jeżynie, truskawce, porzeczce czarnej i czerwonej, względne różnice oznaczenia ilościowego zostały wyliczone dla pojedynczej wartości stężenia równej C r =,5 mg/kg i przedstawiono w postaci rozkładu procentowego na histogramach przedstawionych na rysunku 5. 4 TRUSKAWKA 4 PORZECZKA CZERWONA częstotliwość występowania [%] 3 2 częstotliwość występowania [%] 3 2 częstotliwość występowania [%] Qdiff(C w-c r)/c r[%] Qdiff(C w-c r)/c r[%] 25 PORZECZKA CZARNA JEŻYNA częstotliwość występowania [%] Qdiff(C w-c r)/c r[%] Qdiff(C w-c r)/c r[%] Rysunek 5. Histogramy względnej różnicy oznaczenia (Q diff ) pozostałości 56 pestycydów w czterech owocach miękkich: truskawce, jeżynie, porzeczce czarnej i czerwonej wyliczonej przy wartości stężenia Cr =,5 mg/kg, jako matrycę reprezentatywną zastosowano malinę Ponad 9% objętych badaniem pestycydów, na poziomie stężenia C r =,5 mg/kg, wykazało wartość względnej różnicy oznaczenia w zakresie poniżej 2% w przypadku porzeczki czarnej oraz czerwonej, poniżej 3% w przypadku truskawek oraz poniżej 35% w przypadku jeżyn. 25% akceptowalny poziom różnicy oznaczenia nie został przekroczony 4

15 Wyniki i dyskusja dla 5 pestycydów w czarnej i czerwonej porzeczce, 46 pestycydów w jeżynie oraz 4 pestycydów w truskawce Stężenia graniczne Zastosowanie 25% dopuszczalnego poziomu względnej różnicy oznaczenia ilościowego jako maksymalnego akceptowalnego kryterium stosowania w procesie kalibracji matrycy reprezentatywnej w miejsce matrycy właściwej wpłynęło na potrzebę zastosowania jako parametru granicznego stężeń ograniczających nazwanych stężeniami granicznymi C (r)lim (rysunek 6). a) b) KARBENDAZYM,5,5 KARBENDAZYM Cr (lim) =,9 Cr (lim) =, Cr (lim) =,4 -,5 - -,5 - Cr (lim) =,2 Cr (lim) =,5,5,,5,2,4,8,2 truskawka porzeczka czerwona porzeczka czarna jeżyna Rysunek 6. Funkcja względnej różnicy oznaczenia (Qdiff) na przykładzie karbendazymu (a) z zaznaczonymi stężeniami granicznymi C (r)lim (b) Można wyróżnić trzy przypadki: (I) (II) (III) 25% kryterium Q diff jest spełnione dla wszystkich stężeń powyżej wyznaczonego stężenia granicznego C (r)lim, przykład diuronu na rysunku 7, 25% kryterium Q diff jest spełnione w określonym zakresie wyznaczonych stężeń granicznych, przykład aminokarbu na rysunku 7, 25% kryterium Q diff nigdy nie zostaje osiągnięte, względna różnica oznaczenia w całym zakresie stężeń przekracza 25%, przykład tiabendazolu na rysunku 7. 5

16 Wyniki i dyskusja,5 (a) DIURON,5 (b) DIURON -,5 -,5 - -,5,,5,2,2,4,5 (c) AMINOKARB,5 (d) AMINOKARB -,5 -,5 - -,5,,5,2,4,8,2,5 (e) TIABENDAZOL,5 (f) TIABENDAZOL -,5 -,5 - -,5,,5,2,,2,3,4 truskawka porzeczka czerwona porzeczka czarna jeżyna Rysunek 7. Funkcja względnej różnicy oznaczenia (Q diff ) wyznaczona dla diuronu, aminokarbu oraz tiabendazolu w truskawce, jeżynie, porzeczce czarnej i czerwonej przy zastosowaniu maliny jako matrycy reprezentatywnej. Wykresy (a),(c),(e) przedstawiają przebieg funkcji w szerokim zakresie stężeń, podczas gdy wykresy (b),(d),(f) przedstawiają wycinek przebiegu funkcji ograniczony do wąskiego zakresu stężeń 6

17 Wyniki i dyskusja Względna efektywność procesowa W celu ułatwienia procesu podejmowania decyzji o zastosowaniu matrycy reprezentatywnej do oznaczeń ilościowych, zaproponowano wprowadzenie względnej efektywności procesowej jako parametru ułatwiającego wybór pestycydów, które mogą być oznaczane za pomocą kalibracji wykorzystującej matrycę reprezentatywną przy zachowaniu akceptowalnego kryterium względnej różnicy oznaczenia na poziomie 25%. Różnice między wynikami oznaczenia uzyskanymi z wykorzystaniem w procesie kalibracji matrycy reprezentatywnej i matrycy właściwej są następstwem różnic w odzyskach poszczególnych analitów wynikające z obecności w analizowanych próbkach składników matrycy właściwej innych niż składniki matrycy reprezentatywnej zastosowanej w procesie kalibracji, jak i różnic związanych ze zmianą jonizacji analitu wskutek obecności w matrycy właściwej składników innych niż w matrycy reprezentatywnej. Efektywność procesowa jest jednym z tych parametrów walidacyjnych, która łączy w sobie stratę analitu z odzysku z wzmocnieniem lub osłabieniem sygnału MS w wyniku efektu matrycowego. Wartości względnej efektywności procesowej pestycydów wyznaczono przy ich stężeniach odpowiadających NDP. Dla każdego pestycydu wyliczono następnie względne odchylenie standardowe (RSD) względnych efektywności procesowych, gdyż stwierdzono, że parametr ten może być przydatny do oceny selekcji pestycydów, które mogą być oznaczane z zastosowaniem kalibracji wykorzystującej matrycę reprezentatywną, przy zachowaniu kryterium akceptowalności: względnej różnicy oznaczenia nie przekraczającej 25%. Zauważono, że wyznaczone wartości RSD względnych efektywności procesowych dla pestycydów spełniających 25% kryterium Q diff we wszystkich 4 objętych badaniem matrycach nie przekroczyły %, mediana RSD 4%. Wartości RSD względnych efektywności procesowych pozostałych pestycydów mieściły się w przedziale 22%, mediana 3,7%. Im wyższe RSD względnej efektywności procesowej, tym wyższa będzie różnica w oznaczeniu ilościowym pestycydu w co najmniej jednym z badanych owoców, przy zastosowaniu kalibracji wykorzystującej matrycę reprezentatywną. 2.3 Ocena efektywności stosowania metod umożliwiających jednoczesne oznaczanie wielu związków chemicznych do oznaczania pozostałości pestycydów w owocach i warzywach Zoptymalizowaną i zwalidowaną metodę LC-MS/MS zastosowano do wykrywania i oznaczania pozostałości pestycydów w próbkach 7 rodzajów owoców i warzyw (malin, 7

18 Wyniki i dyskusja truskawek, jeżyn, porzeczek czarnych i czerwonych, kalafiora i brokuła) pochodzących z lokalnego przedsiębiorstwa produkującego mrożonki. Szczegółową specyfikację zbadanych próbek przedstawiono w tabeli. Tabela. Liczba analizowanych próbek owoców i warzyw, liczba próbek bez pozostałości pestycydów oraz liczba próbek z wykrytymi pozostałościami pestycydów porzeczka czarna porzeczka czerwona malina truskawka jeżyna kalafior brokuł RAZEM liczba próbek bez pozostałości NDP > NDP Na 38 przebadanych próbek owoców i warzyw, w 44 próbkach wykryto obecność pozostałości pestycydów w zakresie od, mg/kg do,64 mg/kg, wśród których aż w 2 próbkach, stanowiących 5% ogółu analizowanych, odnotowano przekroczenia najwyższych dopuszczalnych poziomów (NDP). Spośród 56 oznaczanych związków wykryto pozostałości 3 (rysunek 8). Do najczęściej wykrywanych pozostałości pestycydów w przypadku malin należały pyrimetanil i acetamipryd, w przypadku porzeczek: czarnej i czerwonej karbendazym i propargit oraz w przypadku brokuła i kalafiora metamitron i ometoat. Nie stwierdzono obecności pozostałości pestycydów w przypadku próbek jeżyny i truskawki. Karbendazym (F) Acetamipryd (I) Metamitron (H) Propargit (A) Fenazachina (I) Pyrimetanil (F) Pyraklostrobina (F) Tiachlopryd (I) Dimetoat (I) Fenheksamid (F) Flusilazol (F) Ometoat (I) Cyprodynil (F) Rysunek Liczba próbek Częstotliwość występowania pozostałości pestycydów (w nawiasie podano rodzaj oznaczonego pestycydu: (F)fungicyd, (I)insektycyd, (H)herbicyd, (A)akaracyd) W przebadanych owocach i warzywach wykazano najczęstszą obecność fungicydów (6 oznaczonych związków) stanowiących 46,2% ogółu wykrytych substancji, insektycydów 8

19 Wyniki i dyskusja 38,6% (5 oznaczonych związków) oraz znacznie rzadszą obecność herbicydów 7,7% ( oznaczony związek) i akarycydów 7,7% ( oznaczony związek). Najczęściej wykrywaną pozostałością pestycydu w grupie fungicydów był karbendazym. Związek ten oznaczono w % próbek, w tym najczęściej w porzeczce czarnej (6,5%), porzeczce czerwonej (3,6%) oraz brokule (,9%). Spośród 38 próbek poddanych analizie, owoce stanowiły największy odsetek próbek z pozostałościami przekraczającymi najwyższe dopuszczalne poziomy pozostałości (NDP) (rysunek 9). Najwyższe skażenie wśród objętych analizą próbek odnotowano w przypadku czarnej porzeczki. Spośród 36 podanych analizie próbek prawie połowa (7 próbek) zawierała pozostałości pestycydów, z czego aż 3 próbek zawierało pozostałości przekraczające najwyższe dopuszczalne poziomy (NDP). owoce i warzywa łącznie owoce warzywa 7% 5% 24 % 5% 6% 69% % 66 % 68% Rysunek 9. próbki bez pozostałości próbki z pozostałościami > NDP próbki z pozostałościami NDP Częstotliwość skażenia prób owoców i warzyw pozostałościami pestycydów Obecność kilku pestycydów w jednej próbce stwierdzono w przypadku 2 próbek spośród 38 analizowanych (rysunek ). W 8 z 2 przypadków stwierdzono obecność pozostałości 2 pestycydów, w 3 z 2 obecność pozostałości 3 pestycydów oraz w przypadku obecność pozostałości 4 pestycydów. Najwyższą liczbę pozostałości pestycydów odnotowano w próbce brokuła, w której dwie spośród czterech wykrytych pozostałości przekraczały najwyższy dopuszczlny poziom (NDP). owoce warzywa owoce i warzywa łącznie 25% 7% 23% 6% 69% 7% 66 % 9% 68% próbki bez pozostałości próbki z kilkoma pozostałościami próbki z jedną pozostałością Rysunek. Profil częstotliwości skażenia prób owoców i warzyw w funkcji liczby wykrywanych pestycydów 9

20 Wyniki i dyskusja Ocenę efektywności metod umożliwiajacych jednoczesne oznaczanie wielu związków należących do różnych klas chemicznych (proporcji pestycydów wykrywanych do całkowitej liczby pestycydów oznaczanych) przeprowadzono na podstawie wyników badań własnych oraz przeglądu literaturowego z ostatnich lat. Wyznaczono stosunek procentowy liczby pestycydów wykrytych do całkowitej liczby pestycydów analizowanych, uzyskane wartości przedstawiono na rysunku. Wartości median wyznaczonego stosunku procentowego wynosiły odpowiednio: 3% dla grupy do 3 oznacznych pestycydów, 25% dla grupy od 3 do oznaczanych pestycydów oraz 2% dla grupy powyżej oznaczanych pestycydów. W badaniach własnych wartość wyznaczonego stosunku liczby pestycydów wykrytych do całkowitej liczby pestycydów analizowanych wyniosła 23,2%. 8 6 stosunek procentowy [%] 4 2 < > liczba analizowanych pestycydów [n] Rysunek. Stosunek procentowy liczby pestycydów wykrytych do całkowitej liczby pestycydów analizowanych metodami umożliwiającymi jednoczesne oznaczanie wielu związków należących do różnych klas chemicznych wyznaczony na podstawie przeglądu literatury Niska wartość uzyskanego stosunku procentowego, widoczna zwłaszcza w grupie metod obejmujących powyżej analizowanych związków, jednoznacznie wskazuje, że pomimo dużego nakładu pracy, kosztów i wysiłku, znaczna część pestycydów jest wykrywana rzadko lub nigdy nie jest wykrywana. 2