Streszczenie. Fot. 1. Pędraki chrabąszczy w trzech stadiach rozwojowych (fot. L. Sukovata)

Transkrypt

1 Streszczenie Bezpieczne dla środowiska metody ochrony ekosystemów leśnych zagrożonych przez chrabąszcze Melolontha spp. Instytut Badawczy Leśnictwa (zleceniodawca NCBiR, nr umowy NR /2010) Lata realizacji: Chrabąszcz majowy Melolontha melolontha L. i pokrewny mu chrabąszcz kasztanowiec M. hippocastani (F.) (Coleoptera, Scarabaeidae) występują w Polsce dość powszechnie. Fot. 1. Pędraki chrabąszczy w trzech stadiach rozwojowych (fot. L. Sukovata) Postacie dorosłe (imagines) odżywiają się głównie liśćmi drzew liściastych, ale to larwy (pędraki, fot. 1) żerujące na korzeniach roślin często wyrządzają znaczące szkody w rolnictwie, ogrodnictwie i sadownictwie nie tylko w Polsce, ale także i w innych krajach Europy. Pędraki chrabąszczy są groźnymi i uporczywymi szkodnikami również w leśnictwie, niszcząc hodowany materiał sadzeniowy w szkółkach oraz sadzonki w uprawach zakładanych na zrębach i terenach porolnych. Poza tym, nie mogąc skutecznie wykonywać odnowień i zalesień, leśnicy zmuszeni są do wstrzymywania planowanych cięć, co zakłóca cykl produkcyjny i grozi zachwianiem zrównoważonej gospodarki leśnej. Znaczne ograniczenia w stosowaniu insektycydów (ze względu na regulacje prawne wprowadzone przez Unię Europejską w celu ochrony środowiska), dotychczas powszechnie i z dobrym skutkiem wykorzystywanych w walce z tymi szkodnikami, wymusiły podjęcie kompleksowych badań mających na celu poszerzenie wiedzy o biologii, ekologii i morfologii chrabąszczy oraz interakcji tych owadów z innymi komponentami ekosystemów leśnych. Głównym celem projektu było opracowanie strategii postępowania hodowlano-ochronnego w ekosystemach leśnych zagrożonych przez chrabąszcze, opartej na działaniach proekologicznych. W ramach projektu szczególną uwagę zwrócono na: znalezienie cech morfologicznych, które umożliwią rozróżnienie pędraków chrabąszcza kasztanowca i chrabąszcza majowego w poszczególnych stadiach rozwoju, wpływ głównych gatunków drzew leśnych stanowiących pokarm chrabąszczy na rozwój i śmiertelność ich pędraków oraz długość życia imagines i płodność samic, preferencje środowiskowe chrabąszczy oraz wpływ dotychczasowych sposobów zagospodarowania lasu na ich występowanie, 1

2 występowanie patogenów i parazytoidów jako wrogów naturalnych w populacjach chrabąszczy w różnych warunkach środowiskowych, wpływ wybranych czynników abiotycznych i biotycznych na porażanie pędraków chrabąszczy przez entomopatogeniczny grzyb Beauveria brongniartii, oddziaływanie świeżych trocin sosnowych na zbiorowiska mikroorganizmów glebowych i pędraki chrabąszczy, wpływ roślin o potencjalnych właściwościach trujących lub odstraszających na pędraki i imagines chrabąszczy, wpływ związków pochodzenia roślinnego o potencjalnych właściwościach odstraszających lub antyfidantnych na rozwój i intensywność żerowania pędraków oraz imagines chrabąszczy. Do określenia cech różnicujących pędraki dwóch gatunków chrabąszczy wykorzystano badania morfologiczne oraz genetyczne. Materiał do badań uzyskano poprzez a b Fot. 2. Głowa pędraka chrabąszcza widok od strony grzbietowej (strzałkami oznaczono miejsce pomiaru szerokości: puszki głowowej (a) oraz nadustka (b)) (fot. T. Jaworski) zliczono szczecinki w obrębie rastra. hodowlę larw z jaj złożonych przez samice. Część osobników zebrano także w terenie. Analizy morfologiczne przeprowadzono na 20 pędrakach każdego gatunku w stadium L2 i na 45 pędrakach każdego gatunku w stadium L1. Pomierzono szerokość puszki głowowej i nadustka (fot. 2), określono stosunek długości przedostatniego i ostatniego członu głaszczka szczękowego oraz stosunek długości przedostatniego i ostatniego członu czułka. Dodatkowo u badanych okazów Do badań genetycznych wykorzystano po 10 pędraków obu gatunków w stadium L1. Wydzielono fragment sekwencji DNA kodującej gen podjednostki I oksydazy cytochromowej (COI). Na podstawie analizy polimorfizmu sekwencji regionu COI wyodrębniono sekwencje zmienne, do których zaprojektowano startery i sondy typu TaqMan. Do regionu COI, w regionach wspólnych dla obu gatunków, zaprojektowano startery do reakcji HRM PCR. Badania wykazały, że szerokość puszki głowowej oraz nadustka u pędraków chrabąszcza majowego była większa niż u chrabąszcza kasztanowca, przy czym prawidłowość ta dotyczyła obu analizowanych stadiów (ryc. 1 dla stadium L2). 2

3 Szerokość puszki głowowej [mm] 4,65 4,60 4,55 4,50 4,45 4,40 4,35 4,30 4,25 Mediana 25%-75% U=57,5 P=0,0001 A Szerokość nadustka [mm] 2,38 2,36 2,34 2,32 2,30 2,28 2,26 2,24 2,22 Mediana 25%-75% U=89,5 P=0,0028 B 4,20 2,20 4,15 Ryc. 1. Szerokość puszki głowowej (A) i nadustka (B) u pędraków L2 M. hippocastani i M. melolontha Stosunek długości członów głaszczka szczękowego przyjmował większe wartości u pędraków chrabąszcza kasztanowca w stadium L2, jednak zależności tej nie potwierdzono u pędraków w stadium L1. Liczba szczecinek w obrębie rastra była większa u chrabąszcza majowego i zależność ta dotyczyła obu stadiów. Cecha ta u obu gatunków była wartością stałą dla obu stadiów rozwojowych. Stosunek długości dwóch ostatnich członów czułka u pędraków chrabąszczy w stadium L1 przyjmował większe wartości dla M. hippocastani, niż dla M. melolontha. W wyniku przeprowadzonej analizy dyskryminacyjnej opracowano modele klasyfikacyjne do oznaczania pojedynczych pędraków do gatunku z dokładnością ok. 80 i 90%, odpowiednio dla pędraków L1 i L2. Wspólnymi cechami uwzględnionymi w modelach dla obydwu stadiów były: szerokość puszki głowowej i liczba szczecinek w obrębie rastra. W przypadku modelu dla pędraków L1 istotny był także stosunek długości dwóch ostatnich członów czułka, a dla pędraków L2 stosunek długości członów głaszczka szczękowego. Porównanie sekwencji nukleotydowych regionu COI pomiędzy gatunkami chrabąszczy pozwoliło na oszacowanie podobieństwa obu gatunków na poziomie 87,8%. Różnice w sekwencji regionu COI pomiędzy badanymi gatunkami pozwoliły na zaprojektowanie starterów oraz sond TaqMan specyficznie rozpoznających poszczególne gatunki. M. hippocastani M. melolontha M. hippocastani M. melolontha Wpływ różnych gatunków drzew i krzewów, stanowiących bazę pokarmową dla imagines chrabąszczy, na długość życia imagines oraz płodność samic badano w latach 2011 i Przeprowadzono ocenę takich gatunków drzew i krzewów, jak: dąb szypułkowy, dąb bezszypułkowy, buk zwyczajny, brzoza brodawkowata, modrzew europejski, olsza czarna, grab zwyczajny, robinia akacjowa, czeremcha amerykańska, jarząb pospolity i bez czarny. Imagines hodowano na ulistnionych pędach wymienionych roślin umieszczonych w 2,18 3

4 szklanych kloszach w szklarni. Dwa razy w tygodniu wymieniano pędy na świeże oraz określano śmiertelność i ważono poszczególne osobniki chrabąszczy. Do badania płodności samic chrabąszczy majowego i kasztanowca w 2011 r. i 2013 r. użyto po 216 owadów (po 108 sztuk dla samców i samic). Podobnie jak w poprzednim doświadczeniu samice zostały umieszczone wraz z samcami w kloszach na liściach odpowiednich gatunków roślin. Po ok. 10 dniach wybrano po 10 samic z każdego gatunku rośliny i pojedynczo umieszczono w kloszach z ziemią i odpowiednią rośliną. Po ok. 3 tygodniach policzono złożone jaja. Wpływ wybranych roślin na pędraki w stadiach: L1, L2 i L3 badano w latach 2011 i Do badań wybrano następujące gatunki: dąb szypułkowy, dąb bezszypułkowy, buk zwyczajny, brzoza brodawkowata, olsza czarna, modrzew europejski oraz sosna zwyczajna. Do doniczek z glebą, w których posadzono sadzonki poszczególnych gatunków drzew, wkładano po 2 pędraki w stadium L1 i po 1 pędraku w stadium L2 lub L3. Przed włożeniem do ziemi pędraki ważono z dokładnością do 0,001 g. Ocenę śmiertelności i ponowne ważenie pędraków przeprowadzano co 2-3 tygodnie. Podczas każdej kontroli rośliny wymieniano na nowe. Do oceny rozwoju imagines i pędraków chrabąszczy wykorzystano współczynnik względnego przyrostu masy ciała (RGR), który obliczano wg wzoru (Lazarevic et al. 2002): ( ) ( ), gdzie M o i M t początkowa i końcowa masa ciała owada (g), T t-o liczba dni między początkowym i końcowym ważeniem. Liście dębu szypułkowego i bezszypułkowego były dla obu gatunków chrabąszczy pokarmem najbardziej korzystnym dla ich przeżywalności, przyrostu masy ciała (ryc. 2) oraz płodności. Również liście grabu zwyczajnego i igły modrzewia europejskiego stanowiły wartościowy pokarm dla rozwoju chrabąszcza majowego, natomiast parametry życiowe chrabąszcza kasztanowca były na tych gatunkach nieco gorsze. Odwrotną zależność wykazano w przypadku liści buka zwyczajnego i jarzębu pospolitego. Brzozę brodawkowatą można zaliczyć do grupy gatunków zapewniających umiarkowany rozwój dla imagines chrabąszcza kasztanowca, a jednocześnie niekorzystnie oddziaływających na chrabąszcza majowego. Samice obydwu gatunków chrabąszczy hodowane na liściach brzozy nie składały jaj. 4

5 RGR 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 A a a ab F=7,80 df=5,12 P=0,0018 ab Średnia +Błąd std. b RGR 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 B cd d bc F=18,31 df=5,12 P<0,0001 ab Średnia +Błąd std. abc -0,02 b -0,02 a -0,04-0,04-0,06-0,06-0,08 Q.robur Ryc. 2. Względny przyrost masy ciała samic chrabąszcza majowego (A) i chrabąszcza kasztanowca (B) żerujących na liściach różnych gatunków drzew w warunkach laboratoryjnych w okresie 5-11 maja 2011 r. Negatywny wpływ na przeżywalność i rozwój imagines oraz płodność samic miały takie gatunki, jak czeremcha amerykańska i robinia akacjowa, a szczególnie olsza czarna i bez czarny. Na liściach tych gatunków imagines żerowały słabo lub nie odbywały żeru w ogóle. Przeprowadzone badania wykazały, że pędraki chrabąszczy są owadami polifagicznymi, tolerującymi szeroki zakres roślin żywicielskich. Korzenie wszystkich wybranych do badań roślin były w pełni wystarczające do zaspokojenia potrzeb żywieniowych, umożliwiając pędrakom zakończenie rozwoju, jednak największy przyrost masy ciała oraz największą przeżywalność stwierdzono u pędraków żerujących na korzeniach brzozy brodawkowatej i sosny zwyczajnej. F.sylvatica L.decidua Q.petraea A.glutinosa B.pendula Gatunek drzewa W celu określenia preferencji środowiskowych chrabąszczy i wpływu dotychczasowych sposobów zagospodarowania lasu na ich występowanie przeprowadzono kontrolę zagęszczenia pędraków w glebie wewnątrz różnych drzewostanów gospodarczych. Kryterium wyboru drzewostanów była faza rozwojowa (uprawa, młodnik, tyczkowina, drągowina, drzewostan dojrzewający itd.). W każdym z wybranych drzewostanów wykonano ocenę zapędraczenia poprzez przeszukanie gleby w 25 dołach kontrolnych rozmieszczonych w siatce 30x50 m, ponadto opisano ogólne pokrycie powierzchni i skład gatunkowy, a także wykonano zdjęcia ażurowości okapu drzewostanu. W trzech drzewostanach, w których stwierdzono duże zagęszczenie pędraków, oraz w trzech odpowiadających im drzewostanach (ten sam typ siedliskowy lasu, podobny wiek itp.), w których pędraki nie występowały, zainstalowano doglebowe rejestratory mikroklimatyczne, które rejestrowały temperaturę i wilgotność gleby w sezonie wegetacyjnym 2012 r. -0,08 Q.robur F.sylvatica L.decidua Q.petraea A.glutinosa B.pendula Gatunek drzewa 5

6 Do oceny zależności nasilenia występowania chrabąszczy od różnych typów siedliskowych lasu i różnych kategorii gruntów wykorzystane zostały materiały z nadleśnictw: Narol i Ostrowiec Św. Kontrolę występowania szkodników korzeni wykonano (zgodnie z Instrukcją ochrony lasu) dla następujących kategorii gruntów: przeznaczonych pod zalesienia gruntów porolnych lub nieleśnych w roku poprzedzającym zalesienie, na zrębach bieżących, haliznach i płazowinach na rok przed ich odnowieniem, w istniejących uprawach i plantacjach nasiennych oraz w drzewostanach rębnych przewidzianych do wyrębu. Baza danych objęła okres 5 jesiennych kontroli zapędraczenia gleb leśnych w latach Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że zróżnicowana atrakcyjność drzewostanu dla chrabąszczy wynika z odrębnych warunków panujących wewnątrz ekosystemu leśnego. Na pierwszy plan wysuwają się właściwości siedliska, które odzwierciedlają różnice w pokrywie roślinnej, składzie i strukturze drzewostanu. Najchętniej zasiedlane przez chrabąszcze były siedliska lasowe, których żyzność pozwala gatunkom liściastym osiągnąć optimum warunków życiowych. Stwierdzono, że pędraki chrabąszczy (L2) częściej występowały w otoczeniu drzew takich gatunków, jak: buk zwyczajny, dąb szypułkowy i brzoza brodawkowata. Występowanie pędraków, mających ograniczone możliwości przemieszczania się na duże odległości, jest determinowane miejscem żeru uzupełniającego imagines prowadzonego na w/w drzewach liściastych i miejscem złożenia jaj przez samice, często w sąsiedztwie drzew żywicielskich. Wśród faz rozwojowych drzewostanu tylko w drzewostanach w fazie młodnika zagęszczenie pędraków było względnie niskie. W fazie tej panują specyficzne warunki mikroklimatyczne, które wydatnie zmniejszają ryzyko występowania pędraków chrabąszczy. Ryc. 3. Ryzyko wystąpienia pędraków chrabąszczy w zależności od pokrycia roślinnego powierzchni gleby Duże zagęszczenie drzew uniemożliwia rozwój pokrywy roślinnej, której korzenie stanowią pożywienie dla najmłodszego stadium larwalnego chrabąszczy. Zasiedlanie przez chrabąszcze upraw, a także drzewostanów starszych faz rozwojowych można wiązać z bardziej ażurowym okapem koron drzew i obecnością pokrywy roślinnej (ryc. 3), która tworzy się pod wpływem dostępu 6

7 do światła, przy jednoczesnej osłonie drzewostanu, który łagodzi skutki niekorzystnych czynników meteorologicznych i zmniejsza wartości amplitud temperatury gleby i powietrza. Niezależnie od pozostałych czynników środowiskowych granica między ekosystemem powierzchni otwartej a ekosystemem leśnym w sposób istotny kształtuje wysoki stan zapędraczenia w drzewostanach ekotonowych. W ramach badań analizowano warunki środowiskowe nie tylko w aspekcie ich wpływu na preferencje imagines chrabąszczy, ale także na występowanie wrogów naturalnych, z uwzględnieniem stadiów rozwojowych chrabąszczy. Badania przeprowadzono głównie w nadleśnictwach: Brzeziny, Opoczno, Kozienice i Lubartów. W każdym z nich, oprócz Nadl. Brzeziny, założono 4 powierzchnie doświadczalne w gradiencie mikroklimatycznym: I drzewostan o dużym zwarciu; II drzewostan o zwarciu rozluźnionym; III drzewostan zagospodarowany rębnią gniazdową (gniazda o powierzchni ok. 0,15 ha), IV zrąb zupełny o powierzchni do 4 ha (duża powierzchnia otwarta). W Nadl. Brzeziny założono dwie powierzchnie typu I i III. Na każdej powierzchni wiosną i jesienią przeprowadzono ocenę liczebności pędraków i imagines chrabąszczy w glebie. Na powierzchniach typu I, II i IV polegała ona na przeszukaniu gleby z 12 dołów próbnych o wymiarach 1,0 x 0,5 x 0,7 m ułożonych na planie prostokąta i oddalonych od siebie o 20 metrów. Na powierzchniach typu III (gniazda) analizy wykonano na czterech gniazdach, po 3 doły próbne/ gniazdo. Znajdowane osobniki chrabąszczy umieszczano pojedynczo w ponumerowanych pojemnikach z glebą, którą w laboratorium wymieniano na sterylizowany piasek. Hodowlę zebranych osobników prowadzono przez 2 (imagines) lub 6 tygodni (pędraki). Co kilka dni sprawdzano stan zdrowotny owadów, a znalezione osobniki martwe poddawano analizie patologicznej. Dodatkowo, na terenie nadleśnictw: Kozienice i Opoczno, na każdej z czterech typów powierzchni dokonano pomiarów temperatury powietrza i gleby oraz natężenia światła. Zgodnie z oczekiwaniami wykazano, że temperatura powietrza i gleby oraz natężenie światła były generalnie największe na zrębach zupełnych, stopniowo malały na gniazdach i w drzewostanach rozluźnionych, a najmniejsze wartości osiągały w drzewostanie zwartym. Wskazuje to na istotny wpływ sposobu zagospodarowania lasu (wykonywanie rębni zupełnych i gniazdowych, przerzedzanie drzewostanów poprzez wykonywanie zabiegów pielęgnacyjnych) na kształtowanie się warunków mikroklimatycznych, które z kolei znacząco oddziaływały zarówno na zagęszczenie populacji chrabąszczy w glebie, jak i na występowanie ich wrogów naturalnych. Na żyźniejszych siedliskach (LMśw) wykazano wyraźny trend zmniejszania się liczebności populacji wraz ze zwiększaniem się otwartości 7

8 terenu (od drzewostanów zwartych, poprzez drzewostan rozluźniony i gniazda, po zrąb zupełny). Na siedliskach słabszych (Bśw) wpływ ten był nieznaczny, pod warunkiem braku w podszycie gatunków liściastych jako atrakcyjnej bazy pokarmowej, zwłaszcza dla samic. Ogólna śmiertelność chrabąszczy była generalnie większa w drzewostanach, niż na powierzchniach innych typów, i zależność ta była najbardziej wyraźna przy dużym zagęszczeniu populacji. Poziom spasożytowania był ogólnie niski i nie różnił się na powierzchniach poszczególnych typów. Ryzyko występowania bakterii i porażenia przez entomopatogeniczne grzyby było zdecydowanie większe w drzewostanie zwartym, niż na gniazdach czy zrębach zupełnych, ale głównie przy wysokiej liczebności populacji, jak miało to miejsce np. w Nadl. Kozienice (ryc. 4). Występowanie nicieni charakteryzowało się odwrotną tendencją. Typy powierzchni Gniazda vs Zrąb zupełny Drzewostan zwarty vs Zrąb zupełny Drzewostan zwarty vs Gniazda Drzewostan rozluźniony vs Zrąb zupełny Drzewostan rozluźniony vs Gniazda Drzewostan rozluźniony vs Drzewostan zwarty Typy powierzchni 0,2 A Drzewostan rozluźniony vs Drzewostan zwarty 0,5 Drzewostan rozluźniony vs Zrąb zupełny 0,8 Drzewostan zwarty vs Zrąb zupełny Drzewostan rozluźniony vs Gniazda 2,0 Gniazda vs Zrąb zupełny Drzewostan zwarty vs Gniazda Ryc. 4. Ocena ryzyka ( PU) porażenia chrabąszczy przez bakterie (A) i entomopatogeniczne grzyby (B) na powierzchniach różnych typów w Nadleśnictwie Kozienice Badania wykazały, że różne czynniki oporu środowiska wpływają na poszczególne stadia rozwojowe z niejednakowym nasileniem. Imagines charakteryzowały się największą zdrowotnością, a zamieranie powodowały wyłącznie entomopatogeniczne grzyby. Wraz z rozwojem pędraków nieznacznie wzrasta ich ogólna śmiertelność. Na powierzchniach doświadczalnych stwierdzono dwa spośród znanych, typowych organizmów, które mogą przyczyniać się do ograniczenia liczebności populacji chrabąszczy: grzyby z rodzaju Beauveria sp. i pasożytniczą muchówkę Dexia rustica. Porażenie kolejnych stadiów rozwojowych chrabąszczy przez grzyby z rodzaju Beauveria sp. nie różniło się. Natomiast D. rustica wyhodowano wyłącznie z młodszych stadiów rozwojowych pędraków L1 i L2, przy czym największą frekwencję porażenia żywiciela zaobserwowano u pędraków L1. 5,0 8,0 20,0 Ryzyko względne 50,0 80,0 B 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 3,0 5,0 7,0 9,0 Ryzyko względne 20,0 8

9 W ciałach martwych chrabąszczy nie stwierdzono obecności typowych owadobójczych gatunków nicieni, np. z rodzajów Heterorhabditis i Steinernema, czy z rodziny Mermithidae. Odnotowano natomiast, że wiele martwych osobników było zasiedlonych przez nicienie z rodzaju Koerneria i z gatunku Diplogasteroides magnus, których rolą jest prawdopodobnie głównie przetwarzanie martwej materii organicznej pojawiającej się w środowisku, np. z chwilą śmierci pędraka. Szczególną uwagę w trakcie realizacji tematu poświęcono zależności porażania pędraków chrabąszczy przez entomopatogeniczny grzyb Beauveria brongniartii od wybranych czynników abiotycznych i biotycznych. Testowano czy: odczyn podłoża ma wpływ na kiełkowanie i sporulację wybranych szczepów B. brongniartii; odczyn gleby ma wpływ na efektywność porażania pędraków chrabąszczy przez B. brongniartii; kiełkujące konidia wybranych szczepów B. brongniartii i kultury grzybów mykoryzowych Thelephora terrestris i Hebeloma crustuliniforme oddziałują na siebie wzajemnie w hodowlach dwuorganizmowych; kultury wybranych szczepów B. brongniartii i kultury grzybów mykoryzowych (j.w.) w hodowlach dwuorganizmowych wzajemnie na siebie oddziałują; kultury wybranych szczepów B. brongniartii i kultury Trichoderma harzianum w hodowlach dwuorganizmowych wzajemnie na siebie oddziałują; aplikacja B. brongniartii na uprawie leśnej zagrożonej przez pędraki chrabąszczy Melolontha spp. powoduje zmiany w strukturze mykoryz sadzonek sosny Pinus sylvestris L. Jak wykazały przeprowadzone doświadczenia laboratoryjne i terenowe, odczyn gleby w różny sposób wpływa na kiełkowanie konidiów B. brongniartii w zależności od szczepu: dla niektórych szczepów nie ma różnicy między zdolnością kiełkowania w środowisku kwaśnym (ph 4) i obojętnym (ph 7), dla innych zdolność kiełkowania w środowisku kwaśnym jest dwukrotnie słabsza. W środowisku kwaśnym (ph 4) szczepy B. brongniartii także mniej wydajnie wytwarzały konidia następnej generacji, mykoza testowanych pędraków rozwijała się wolniej i śmiertelność po 60 dniach była dwukrotnie niższa (43%), niż w glebie o odczynie obojętnym (83%) (ryc. 5). Badane szczepy B. brongniartii w hodowlach na podłożu kwaśnym oosporeiny. nie produkują 9

10 Ryc. 5. Śmiertelność skumulowana z uwzględnieniem śmiertelności naturalnej pędraków L3 chrabąszczy hodowanych w glebie o różnym odczynie (gleba z Nadl. Chełm odczyn obojętny, gleba z Nadl. Opoczno odczyn kwaśny) zakażonej konidiami B. brongniartii (szczep BP) w koncentracji 1,47 x 10 4 /g s.m. gleby Grzyby ektomykoryzowe w różny sposób reagowały na kiełkujące konidia B. brongniartii: T. terrestris wytwarzała niewielką strefę inhibicji, nie dopuszczając do kiełkowania w swoim najbliższym sąsiedztwie, a H. crustuliniforme nie wytwarzała jej w ogóle. H. crustuliniforme i B. brongniartii w hodowlach dwuorganizmowych zapoczątkowanych od strzępek nie wykazywały wzajemnego antagonizmu. Brak antagonizmu między H. crustuliniforme i B. brongniartii może świadczyć o potencjalnej możliwości wspólnego wzrostu np. w ryzosferze tej samej sadzonki. Być może jest realne wyhodowanie mykoryzowanych sadzonek zaszczepionych B. brongniartii tak, by poprawić udatność zalesień/ odnowień na zapędraczonych terenach. T. harzianum silnie ogranicza wzrost strzępek B. brongniartii, ale nie zarasta miejsc pokrytych konidiami (fot. 3). Wskazuje to, że na siedliskach sprzyjających rozwojowi grzybów z rodzaju Trichoderma środki z B. brongniartii, w których formulacja zawierałaby strzępki, a nie konidia, mogą wykazywać słabą skuteczność wobec pędraków. 10

11 A B C Fot. 3. Przykład wzrostu T. harzianum (kolor zielony) i B. brongniartii (kolor biały, szczepy: BIPESCO 2 A, BP B i OŚ - C) na płytkach z podłożami: S (A), SNA (B) i SNP (C) (fot. A. Sierpińska) Jednorazowa aplikacja wysokiej dawki B. brongniartii (szczep BIPESCO 2) przeciwko pędrakom chrabąszczy Melolontha sp. w uprawie P. sylvestris nie powodowała trwałych zmian w strukturze zbiorowisk grzybów mykoryzowych sadzonek sosny. Bezpieczniej jest jednak stosować B. brongniartii między rosnącymi sadzonkami, gdzie może ona oddziaływać tylko na grzybnię ekstramatrykalną, nie powodując zakłóceń w zbiorowiskach grzybów mykoryzowych. Z drugiej strony należy doświadczalnie stwierdzić, czy taki sposób aplikacji skutecznie chroni rośliny przed pędrakami. Wyniki badań wskazują, że środek ochrony roślin zawierający B. brongniartii do stosowania przeciwko pędrakom chrabąszczy w glebach leśnych powinien: zawierać jako substancję aktywną szczep dobrze kiełkujący w środowisku o kwaśnym odczynie (ph gleb leśnych jest często < 4); wydajnie wytwarzać konidia następnej generacji w środowisku o kwaśnym odczynie; mieć sprawdzoną, wysoką aktywność owadobójczą wobec pędraków chrabąszczy (wszystkich stadiów, a przede wszystkim L3) w środowisku o kwaśnym odczynie; być formulacją zawierającą konidia, a nie strzępki grzyba. W ramach tematu podjęto próbę zmiany zbiorowisk mikroorganizmów glebowych (grzybów, bakterii, nicieni) niesprzyjających dla pędraków chrabąszczy poprzez wprowadzenie świeżych trocin sosnowych w oparciu o założenie, że będą one stymulatorem zmian mikrobiologicznych negatywnie wpływających na zdrowotność pędraków. Zakres badań obejmował analizy cech chemicznych gleby, zbiorowisk grzybów mykoryzowych, grzybów i bakterii glebowych oraz nicieni i grzybów entomopatogenicznych, a także ocenę liczebności pędraków w glebie i śmiertelności sadzonek z tytułu żerowania pędraków. 11

12 Założono 3 obiekty doświadczalne na terenach o silnym zapędraczeniu dwie w Nadl. Lubartów (grunt leśny) oraz jedną w Nadl. Świerczyna (grunt porolny). W każdym obiekcie wytyczono 9 rzędów, a następnie w 3 rzędach, na całej ich długości, przemieszano z glebą trociny świerkowe, w 3 innych rzędach trociny podsypywano bezpośrednio pod korzeń sadzonki, a 3 pozostałe rzędy stanowiły wariant kontrolny z sadzonką, bez trocin. Doświadczenie założono jesienią 2011 r. (wariant jesienny) i wiosną 2012 r. (wariant wiosenny). W wariancie jesiennym posadzono sadzonki drzew gatunków liściastych: dąb szypułkowy (obiekt Lubartów A), dąb bezszypułkowy (obiekt Lubartów B), olsza czarna (obiekt Świerczyna). W wariancie wiosennym we wszystkich obiektach posadzono 1-roczne sadzonki sosny zwyczajnej. Analizy chemiczne i mikrobiologiczne gleby, ocenę zdrowotności sadzonek, stanu umykoryzowania ich korzeni oraz liczebności pędraków przeprowadzano dwukrotnie w dwóch terminach (jesiennym i wiosennym), rejestrując stan wyjściowy oraz po upływie roku. Dodanie trocin iglastych do gleby, zarówno leśnej, jak i porolnej, wyraziło się wieloma zmianami w jej aktywności mikrobiologicznej. Izolowano z niej zarówno grzyby uczestniczące w procesach tworzenia humusu, jak i grzyby entomopatogeniczne, wykorzystywane do produkcji biopreparatów, np. z rodzaju Metarhizium, a także bakterie, które bytują w przewodach pokarmowych pędraków i mogą wpływać na prawidłowy przebieg ich procesów życiowych. Aplikacja trocin do gleby leśnej (obiekt Lubartów) powodowała niejednokrotnie efekt zwiększenia liczby pędraków, co może być potwierdzeniem zjawiska stymulowania wędrówki pędraków w kierunku większej koncentracji dwutlenku węgla, uwalniającego się w trakcie mikrobiologicznego rozkładu martwego drewna w glebie. W przypadku wprowadzenia trocin do gleby porolnej (obiekt Świerczyna), przeznaczonej pod zalesienie olszą, nie stwierdzono wzrostu liczby pędraków, co może oznaczać pewne działanie ochronne trocin, w przypadku ich podania pod korzeń sadzonki w momencie sadzenia. Aplikacja trocin do gleby nie przyniosła jednoznacznych i przekonujących rezultatów w zakresie zakładanego repelentnego oddziaływania trocin na pędraki chrabąszczy i wymaga kontynuacji badań w celu jednoznacznej interpretacji oddziaływania trocin na pędraki chrabąszczy i na otaczające je glebowe środowisko mikrobiologiczne. W ramach badań mających na celu ocenę wpływu roślin i produktów roślinnych o potencjalnych właściwościach trujących lub odstraszających na pędraki i imagines chrabąszczy testowano: 12

13 rośliny z rodziny bobowatych Fabaceae (łubin trwały Lupinus polyphyllus L., lucernę siewną Medicago sativa L. i koniczynę białą Trifolium repens L.), astrowatych Asteraceae (wrotycz pospolity Tanacetum vulgare L.) i kapustowatych (gorczycę sarepską Brassica juncea (L.) Czern.), produkty pochodzące z gorczycy sarepskiej, tzn. mączkę i granulat z odolejonych nasion. Doświadczenia w warunkach laboratoryjnych, pół-naturalnych i terenowych polegały na sprawdzeniu czy: 1) wybrane rośliny mają negatywny wpływ na rozwój pędraków wyrażony zwiększoną śmiertelnością i zmniejszeniem przyrostu masy ciała w porównaniu z wariantem kontrolnym; 2) wybrane rośliny są w stanie ochronić sadzonki drzew leśnych przed uszkodzeniem przez pędraki (ryc. 6); 3) wybrane rośliny mają wpływ na wybór miejsca składania jaj przez samice chrabąszczy; 4) produkty z nasion gorczycy sarepskiej mają wpływ na przeżywalność pędraków. W wyniku badań nad potencjalnym wpływem łubinu trwałego, koniczyny białej, lucerny siewnej i wrotyczu pospolitego na pędraki chrabąszczy stwierdzono, że rośliny te nie tylko nie maja jakiegokolwiek niekorzystnego wpływu, ale też powodują lepszy rozwój pędraków w porównaniu z pędrakami żerującymi na korzeniach sadzonek sosny zwyczajnej. Nie stwierdzono również repelentnego oddziaływania łubinu i wrotyczu na samice chrabąszczy podczas wyboru miejsca składania jaj. Oprócz tego, testowane rośliny charakteryzowały się bardzo słabą udatnością kiełkowania i zdolnością do konkurencji z innymi roślinami na glebach leśnych. I II III sosna pędrak testowana roślina Ryc. 6. Schemat doświadczenia mającego na celu ocenę repelentnych właściwości łubinu trwałego i wrotyczu pospolitego w stosunku do pędraków chrabąszczy (sadzonki sosny zwyczajnej posłużyły jako roślina atrakcyjna dla pędraków) w donicach balkonowych o wymiarach 80 x 18 x 14 cm W badaniach terenowych mączki i granulatu z nasion gorczycy sarepskiej nie udało się uzyskać spodziewanego znacznego efektu zmniejszenia liczebności pędraków w glebie, chociaż w doświadczeniach laboratoryjnych trujący efekt tych produktów został wcześniej 13

14 udowodniony w stosunku do pędraków wszystkich stadiów rozwojowych. Oznacza to, że kierunek ten wymaga dalszych badań. N pędraków / m efekt czasu: F=7,49 df=1,16 P=0,0146 efekt interakcji wariant x czas: F=5,83 df=3,16 P=0, Rok Ryc. 7. Zmiany liczebności (średnia błąd std.) zdrowych pędraków chrabąszczy w czasie w Nadl. Świerczyna w różnych wariantach doświadczenia: gorczyca-1 i gorczyca-2 gorczyca sarepska wysiana wiosną i przyorana odpowiednio po zakończeniu kwitnienia lub w trakcie kwitnienia, ugór czarny gleba utrzymywana w czarnym ugorze, zadarniona gleba nieuprawiana (wariant kontrolny) Analiza wyników doświadczenia z gorczycą sarepską wysianą na powierzchni w Nadl. Świerczyna wykazała istotny wpływ zarówno czasu, jak i interakcji wariantu doświadczenia i czasu na liczebność pędraków (ryc. 7). Spadek liczebności był istotny w wariancie z gorczycą przyoraną po zakończeniu kwitnienia (gorczyca-1: F=11,84 df=1,16 P=0,0034) i z ugorem czarnym (ugór czarny: F=9,87 df=1,16 P=0,0063), podczas gdy na powierzchni stwierdzono wzrost liczebności pędraków, chociaż był on nieistotny. zadarnionej W ramach badań dotyczących możliwości wykorzystania antyfidantów botanicznych do ograniczania szkód powodowanych w lasach przez pędraki oraz imagines chrabąszczy Melolontha spp. wykonano doświadczenia laboratoryjne i pół-polowe określające antyfidantną aktywność rutyny i kwercetyny flawonoidów wyizolowanych z gryki Fagopyrum esculentum oraz wyciągu z olszy czarnej Alnus glutinosa wobec chrabąszcza majowego M. melolontha. gorczyca-1 gorczyca-2 ugór czarny zadarniona W warunkach laboratoryjnych hodowano chrząszcze chrabąszcza majowego na gałązkach dębu szypułkowego Quercus robur opryskanych wodnymi roztworami rutyny, kwercetyny i wyciągu z olszy oraz wodą destylowaną (wariant kontrolny doświadczenia). Przez 2 tygodnie oceniano śmiertelność chrząszczy oraz intensywność ich żerowania na podstawie suchej masy ekskrementów, a po tym czasie określono płodność samic. W warunkach pół-polowych (w okrytych siatką pawilonach umieszczonych na terenie otwartym) wykonano testy wyboru w celu porównania atrakcyjności pokarmowej liści Q. robur nieopryskanych i opryskanych ww. antyfidantami dla chrząszczy M. melolontha. W tych samych warunkach hodowano również pędraki umieszczone pojedynczo w donicach z 14

15 glebą, w których posadzono 2-letnie drzewka sosny zwyczajnej Pinus sylvestris. Następnie glebę polewano roztworami rutyny, kwercetyny oraz wyciągu z olszy czarnej. Wariant kontrolny stanowiła hodowla pędraków w donicach z glebą polewaną wodą. Po 4 miesiącach porównano masę i śmiertelność pędraków, a także masę korzeni sadzonek znajdujących się w donicach. Ryc. 8. Intensywność żerowania chrząszczy M. melolontha na pokarmie traktowanym antyfidantami, określona na podstawie masy ekskrementów wydalanych w ciągu doby przez 1 osobnika W trakcie doświadczeń stwierdzono zwiększoną śmiertelność oraz obniżoną intensywność żerowania chrząszczy i płodność samic chrabąszcza majowego hodowanego na liściach dębu szypułkowego opryskanych roztworem rutyny (ryc. 8). Roztwory kwercetyny i wyciągu z olszy czarnej nie miały wpływu na rozwój i płodność badanych owadów. W testach wyboru wykazano, że chrząszcze unikały żerowania na liściach dębu opryskanych roztworem rutyny (tabela). Natomiast w równym stopniu żerowały na liściach traktowanych roztworem kwercetyny i wyciągu z olszy czarnej oraz na liściach kontrolnych. Tabela. Liczba wizyt chrząszczy M. melolontha na liściach oraz liczby uszkodzonych liści Q. robur w testach wyboru Średnia liczba ± odch. stand. Wariant wizyt chrząszczy na liściach uszkodzonych liści doświadczenia opryskanych opryskanych nieopryskanych antyfidantem antyfidantem nieopryskanych rutyna 2,0 ± 1,0a* 4,7 ± 0,6b 2,7 ± 1,5a 22,3 ± 7,5b wyciąg z olszy 5,0 ± 1,0b 7,0 ± 3,0bc 14,7 ± 1,0b 51,0 ± 9,5c kwercetyna 6,3 ± 0,6bc 8,0 ± 1,0c 6,6 ± 1,5a 33,3 ± 11,3bc *różne litery oznaczają statystycznie istotne różnice przy α=0,05 Nie stwierdzono wpływu rutyny, kwercetyny i wyciągu z olszy czarnej na rozwój pędraków oraz rozmiar powodowanych przez nie szkód. Uzyskane wyniki wskazują na potencjalną możliwość wykorzystania roztworu rutyny w ochronie drzewostanów przed chrabąszczem majowym. 15

16 Wyniki uzyskane w trakcie trzyletniego okresu realizacji tematu posłużyły do opracowania podstaw strategii postępowania hodowlano-ochronnego w ekosystemach leśnych zagrożonych przez chrabąszcze. Mogą one znaleźć zastosowanie także w rolnictwie, ogrodnictwie i sadownictwie. Należy jednak zaznaczyć, iż z uwagi na krótki okres trwania badań, krótszy nawet niż cykl rozwoju jednej generacji chrabąszczy, podjęte w ramach projektu badania powinny być kontynuowane. Wynika to przede wszystkim z uzyskania w niektórych przypadkach wyników odmiennych niż zakładano na podstawie opublikowanych danych literaturowych. Z drugiej natomiast strony wykryto nowe czynniki, mechanizmy i zależności, które powinny zostać lepiej poznane, aby w przyszłości móc je potencjalnie wykorzystać w integrowanej metodzie ochrony roślin przed chrabąszczami. Kierownik projektu Dr hab. Lidia Sukovata, prof. nadzw. 16