WĘGIEL 14 C W DIAGNOZOWANIU ZAKAŻENIA PRZEWODU POKARMOWEGO - HELICOBACTER PYLORI

Transkrypt

1 PL WĘGIEL 14 C W DIAGNOZOWANIU ZAKAŻENIA PRZEWODU POKARMOWEGO - HELICOBACTER PYLORI Marta Wasilewska -Radwańska, Aleksandra Jung, Tadeusz Kuc, Wydział Fizyki i Techniki Jądrowej AGH, Al.Mickiewicza 30, Kraków Zbigniew Kopański, Antoni Cienciała, Bożena Witkowska Szpital Wojskowy, ul. Wrocławska 1-3, Kraków Abstract Investigations aiming to develop diagnostication of'helicobacterpylori by use non-invasive methods have been concentrated on 14 C labelled urea, however 13 C stable isotope was also successfully applied in this purpose. In the described breath test each one of a group of patients subjected to diagnostication was administered 92.5 kbq as the 14 CO(NH 2 ) 2 in form of the water solution. Specific 14 CO 2 activity in breath out air reached its maximum (ca. 50 Bq/mmol) after 10 minutes for Hp(+) patients. Direct sorption of CO 2 in Hydroxide of Hyamine (1-mol solution in methanol) with phenoloftaleine as ph indicator, and following measurement in LS spectrometer TRI- CARB 2550-TR/AB, Canberra-Packard with admixed 10 ml liquid scintillator (Perma- Fluor or Insta-Fluor) enabled diagnostication of Hp with sensitivity: 100%, and specificity: 92.6%. Application of 13 C labelled urea is less complicated with respect to sample preparation, and can be entirely automated, but requires expensive mass-spectrometer and highly enriched in 13 C urea (at least 99.0 %) for results comparable to the 14 C. Od momentu odkrycia bakterii Helicobacter pylori [H. pylori), jednego z ważniejszych patogennych czynników choroby wrzodowej żołądka i dwunastnicy, nastąpił dynamiczny rozwój metod wykrywających obecność tej bakterii w przewodzie pokarmowym [1,2]. Poprawna diagnoza jest niezbędna w celu zaplanowania odpowiedniej terapii. Metody wykrywające obecność H. pylori dzielimy na inwazyjne (badanie bakteriologiczne, histologiczne, szybkie testy ureazowe np.clo-test) oraz nieinwazyjne (badanie serologiczne, testy oddechowe z użyciem węgla 13 C lub!4 C). Testy oddechowe odgrywają coraz większą rolą ze względu na dużą skuteczność (98,1%), czułość (100%), swoistość (92,6%) uzyskaną bez konieczności pobierania wycinków błony śluzowej [3]. Ponadto mogą podawać informację o masywności zakażenia i nadają się do monitorowania leczenia w przeciwieństwie do badań serologicznych, konkurencyjnej metody nieinwazyjnej. Celem pracy jest przedstawienie wyników uzyskanych dla testu oddechowego 190

2 z użyciem mocznika znakowanego 14 C oraz porównanie tej metody z testem oddechowym z użyciem mocznika znakowanego 13 C, zaproponowanej przez D.Grahama i P.Kleina [4,5], a przeprowadzonej w standardowych warunkach laboratoryjnych. Test oddechowy z użyciem mocznika znakowanego 14 C. Zasada testów oddechowych opiera się na wykorzystaniu zdolności enzymuureazy, produkowanego przez H. pylori, do rozkładu mocznika wprowadzanego do organizmu [1,2]. Testem oddechowym przebadano łącznie grupę 108 pacjentów, w tym 45 kobiet i 63 mężczyzn, w wieku lat, średnia wieku 41,2 lat. Badania wykonano w 5 WSK w Krakowie. Test rozpoczynał się od pobrania próby tłowej wydychanego powietrza do polietylenowego balonu od pacjentów, którzy byli na czczo. Następnie pacjentom podawano mocznik znakowany 14 C o aktywności 92,5 kbq (2,5 (j.ci) w postaci roztworu wodnego. Wydychane powietrze było zbierane do polietylenowych balonów po czasie 2, 5, 10, 15, 20, 30 i 50 minut od momentu podania radiofarmaceutyku i przepuszczane przez lml 1-molo-wego roztworu hiaminy w metanolu (Hyamine hydroxide, f.packard), który miał tę własność, że wyłapywał dokładnie 1 mmol CO2. Indykatorem tej reakcji była fenoloftaleina, w ilości 20 ul, która powodowała zmianę barwy z różowej na białą. Następnie dodawano 10 ml scyntylatora (Insta-Fluor, f.packard). Pomiary dokonywano w spektrometrze ciekloscyntylacyjnym 2550 TR/AB Canberra-Packard [6]. Zoptymalizowana szerokość okna pomiarowego wynosiła 3-60 kev. Czas pomiaru był ograniczony przez limit liczby zliczeń (10 4 zliczeń ) lub przez limit czasu pomiaru (25 minut). W celu przedstawienia uzyskanych wyników w jako Bg/mmol wydychanego powietrza został wykonany wzorzec aktywności, dzięki któremu możliwe było określenie wydajności spektrometru ciekłoscyntylacyjnego 2550 TR/AB Canberra- Packard jako [7], : Ec-u = (0,02±0,002) Bq/cpm. Granica wykrywalności, czyli najmniejsza aktywność jaką można wyznaczyć tą metodą, została zdefiniowana jako 3-krotny błąd poziomu tła podzielony przez czułość metody. Wynosi ona dla opisanego zestawu pomiarowego 0,23 Bq. Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że wśród populacji 108 pacjentów 83 stanowią osoby zakażone Helicobacterpylori (Hp+), a 25 to osoby zdrowe (Hp-). Dane te w postaci uśrednionych wyników dla Hp+ i Hp- są przedstawione na rys. 1. Dla optymalizacji czasu trwania badania został określony przedział czasu pobrania próby wydychanego powietrza, tak aby granica pomiędzy pacjentem Hp+ i Hp- była maksymalna (rys. 1). Tym optymalnym czasem jest przedział kilku minut począwszy od 10-tej minuty od podania radioizotopu, różnica między pacjentem dodatnim a ujemnym jest wtedy maksymalna, na poziomie ufności 95% (hipoteza testowana testem t- Studenta). Uzyskane wyniki potwierdzają wartość diagnostyczną testu (czułość-100%, swoistość-92,6%, skuteczność-98%), jak również jego dużą precyzję (99%) i czułość metody (50cpm/Bq) [3]. Określona granica wykrywalności, jak i powyższe parametry wskazują, że moglibyśmy podawać aktywność conajmniej o połowę mniejszą dalej mając dużą wiarygodność testu. 191

3 O u O" O o er ca o czas od podania izotopu [min] średni pacjent negatywny (Hp-) wynik min. (Hp-) wynik max. (Hp-) średni pacjent pozytywny (Hp+) wynik min. (Hp+) wynik max. (Hp+) średni (Hp+) - średni (Hp-) Rys. 1. Uśrednione wyniki pomiarów uzyskane dla testu oddechowego z użyciem mocznika znakowanego 14 C (pacjenci pozytywni - Hp+, pacjenci negatywni Hp-). Test oddechowy z użyciem mocznika znakowanego 13 C Podobnie jak dla radioizotopu 14 C izotop węgla I3 C może być użyty dla znakowania mocznika, który w wyniku działania H.pylori rozkładany jest do znakowanego CO 2. Średnia abundancja 13 C w węglu występującym na Ziemi wynosi ok. 1.1% przy czym zmiania się nieco w zależności od typu związku chemicznego i jego pochodzenia. Stężenie izotopu I3 C dla łatwego określenia nawet niewielkich zmian podaje się według powszechnie przyjętej notacji jako 5 13 CPDB [8] wyrażającej względne odchylenie w stosunku do standardu PDB (węglan z formacji Pee Dee), w którym 13 C/ 12 C = x 10" 6 [9]. 192

4 Technika diagnostyczna z zastosowaniem 13 C opisana przez Grahama et al. [4] podobnie jak w przypadku 14 C polegała na podaniu mocznika silnie wzbogaconego ale w izotop 13 C (99%) w ilości 5 mg/kg ciała (średnio mg) i następnie pobieraniu wydychanego powietrza do worków polietylenowych, z których odzyskany CO 2 był mierzony w spektrometrze masowym. Mocznik znakowany 13 C może być podawany w formie roztworu lub kapsułki [10]. Próbki powietrza pobierane są co 10 minut i analizowane przy użyciu gazowego spektrometru masowego jako stosunek 13 CO 2 / 12 CO 2 [4,5,10] e-8 4e-8 6e-8 8e-8 1e-7 Udział CO 2 z produkcji Hp Rys. 2. Wielkość sygnału izotopowego w zależności od udziału CO 2 wytworzonego 13, przez H.pylori z mocznika znakowanego C o różnym wzbogaceniu (opis przy wykresach). Próg detekcji spektrometru: 0.1 %o, próg diagnostyczny: 0.5 %o. Możliwość detekcji 13 C w niewielkiej ilości CO 2 (poniżej 5 cm 3 ) w spektrometrach o standardowej precyzji ok. 0.1 %o dla 5 ll5 C oraz prosta technika preparacyjna z możliwością automatyzacji całości procedury sprawia, że zastosowanie tego izotopu może stać się konkurencyjne w stosunku do 14 C. Wzbogacenie mocznika w lj C przy użyciu standardowych technik musi być stosunkowo wysokie ok. 99% (rys. 2), co potwierdzają wcześniejsze publikacje [4]. 193

5 Wnioski Test oddechowy z użyciem mocznika znakowanego 14 C ma dużą wartość diagnostyczną, a jego zastosowanie w wykrywaniu zakażenia Helicobacter pylori staje się rutynową metodą, tym bardziej, że jest to metoda nieinwazyjna [6]. Istotnym usprawnieniem przeprowadzanych badań było wykonanie wzorca aktywności [8], dzięki któremu wynik może być porównywany z analogicznym wynikiem, ale pochodzącym z innego laboratorium, dużo prostsza jest wtedy analiza narażenia radiologicznego, czy inne kalkulacje. Zaletą testów z użyciem mocznika znakowanego 13 C jest mała ilość wydychanego powietrza (około 1 ml) [4], próbki można więc przesyłać do innego ośrodka wyposażonego w spektrometr masowy, co jest korzystne ponieważ eksploatacja spektrometru przez jeden ośrodek diagnostyczny jest nieopłacalna, wynik uzyskiwany jest jednak dopiero po kilku dniach. Test ten nie może być wykonywany bez wcześniejszego pomiaru próbki tłowej, gdyż mogą wystąpić duże różnice dla tej wartości ze względu na strefę geograficzną, nawet o kilka /oo wartości 5 C. W porównaniu do testu z użyciem 13 C, test z użyciem mocznika znakowanego 14 C jest stosunkowo prostym, szybkim i kilka razy tańszym testem wykrywającym zakażenie H. pylori, o wysokiej precyzji i pomijalnym narażeniu radiologicznym. Nie jest jednak zalecany w przypadku diagnozy dzieci i kobiet w ciąży. Piśmiennictwo [1] Marshall B.J.,Plankey H.W., Hoffman S.R.: Am.J.Gastroenterol., 86, 6, ,(1991). [2] Bielański W., Konturek S.J.: Nukleomka, 41, 2, 57-64, (1996). [3] Wasilewska-Radwańska M., Jung A., Kuc T., Kopański Z., Cienciała A., WitkowskaB.: Diagnostyka zakażenia Helicobacter pylori metodą testu oddechowego z użyciem mocznika znakowanego 14 C. X Krajowa Konferencja Naukowa Biocybernetyka i Inżynieria Biomedyczna", Warszawa, XII. 1997, Materiały Konferencyjne, Warszawa, 1997, [4] Graham D.Y., Klein P.D., Evans D.J., Evans D.G., Alpert L.C., Opekun A.R., Boutton T.W.: Lancet, 5, , (1987). [5] Graham D.Y., Klein P.D..Am.J.Gastroenterol.,88, 11, , (1993). [6] Kopański Z., Nizioł J., Micherdzmski J.,Wasilewska-Radwańska M., Łasa J., Cienciała A., Witkowska B., Czajecki K.: Gastroenterol.Pol., 12, , (1995). [7]Wasilewska-Radwańska M., Pysklak S., Gilewicz-Wolter 1, Kuc T., Jung A., Nizioł J., Kopański Z., Micherdziński J., Cienciała A.: Polish J. Med. Phys. & Eng., 5, 2, ,(1996). [8]Craig H.: Geochim. Cosmochim. Acta, 3, 53-92, (1953). [9]Craig H.: Geochim. Cosmochim. Acta, 12, , (1957). [10] Bielański W.: J.Physiol.&Pharm., 16, (1995). 194