Program Operacyjny Kapitał Ludzki

Transkrypt

1 ROZWÓJ POTENCJAŁU DYDAKTYCZNO-NAUKOWEGO MŁODEJ KADRY AKADEMICKIEJ POLITECHNIKI WROCŁAWSKIEJ Program Operacyjny Kapitał Ludzki Poddziałanie 4.1.1: Wzmocnienie i rozwój potencjału dydaktycznego uczelni ROZWÓJ POTENCJAŁU DYDAKTYCZNO-NAUKOWEGO MŁODEJ KADRY AKADEMICKIEJ POLITECHNIKI WROCŁAWSKIEJ SPRAWOZDANIE Z PRZEBIEGU STAŻU NAUKOWO-DYDAKTYCZNEGO W OKRESIE OD DO WNIOSEK Nr UMOWA STYPENDIALNA Nr.. NA STYPENDIUM WYJAZDOWE 5 MIESIĘCZNE 1. Stypendysta Projektu: Imię i nazwisko Katarzyna Wysocka-Król Stanowisko Doktorant Wydział (W-11) Wydział Podstawowych Problemów Techniki Instytut (I-21) Instytut Inżynierii Biomedycznej i Pomiarowej 2. Ośrodek akademicki odbywania stażu naukowo-dydaktycznego: Wojskowa Akademia Techniczna im. Jarosława Dąbrowskiego Instytut Optoelektroniki (IOE) ul. gen. Sylwestra Kaliskiego Warszawa 3. Opiekun naukowy stażysty ze strony jednostki przyjmującej: ppłk dr inż. Mirosław Kwaśny Biuro Projektu: Wrocław, Wybrzeże Wyspiańskiego 27, pok. 153a Tel.: ; ; mail: mlodakadra@pwr.wroc.pl Fax:

2 2 4. Temat stażu zgodnie z naukowo-dydaktycznym planem stażu: Badania in vitro fotodynamicznego oddziaływania nanomateriałów zol-żelowych domieszkowanych srebrem 4. Sprawozdanie dotyczy całości stażu naukowo-dydaktycznego odbytego w okresie 5 miesięcy. S P R A W O Z D A N I E Z P R Z E B I E G U S T A Ż U 5. Omówienie całości osiągniętych rezultatów oraz ich zgodności z naukowo-dydaktycznym planem stażu: W naszym kraju, zgodnie z trendami w światowej nauce medycznej (zwłaszcza onkologicznej) przykłada się w ostatnich latach duże znaczenie do rozwoju nowych metod diagnostyki i leczenia nowotworów, dążąc do minimalnie inwazyjnych metod diagnostycznych i zabiegowych. Jednym z głównych kierunków rozwoju jest metoda fotodynamiczna (photodynamic therapy, PDT oraz photodynamic diagnostics, PDD). W onkologii, podobnie jak w innych specjalnościach medycznych, ogromne znaczenie ma wczesna diagnostyka zmian przed- lub nowotworowych. Metoda fotodynamiczna jest relatywnie nową techniką z wyjątkowymi możliwościami diagnostyki i leczenia, czyli ma zastosowanie we wczesnym wykrywaniu i leczeniu chorób nowotworowych. Diagnostyka fotodynamiczna, podobnie, jak i inne metody wczesnego wykrywania zmian patologicznych, jest obarczona pewnym błędem, który wynika z wielu czynników. Najważniejszymi z nich są: trudności z doborem i aplikacją fotouczulacza w obrębie badanego narządu, problemy z ustaleniem czasu pomiędzy podaniem barwnika, a ekspozycją na światło lasera oraz dobranie odpowiedniej długości fali dla danego fotouczulacza. Proponowany projekt dotyczy zbadania możliwości zastosowania fotoaktywnych krzemionkowych i tytanowych materiałów zol-żelowych domieszkowanych nanocząsteczkami srebra do oddziaływania fotodynamicznego, w szczególności do zwiększenia fotodynamicznego efektu antybakteryjnego, fluorescencyjnego i terapeutycznego. W diagnostyce i terapii fotodynamicznej (PDD i PDT) ważnymi elementami stają się zagadnienia dozymetrii światła i fotouczulaczy. Prezentowany projekt dotyczy badań in vitro na komórkach modelowych HeLa, w obecności aktywnych nanocząsteczek srebra, wykorzystując metodę pomiaru intensywności fluorescencji w zależności od rodzaju fotouczulacza, stężenia oraz czasu ekspozycji, po wcześniejszym przeprowadzeniu badań właściwości fluorescencyjnych w laboratorium optycznym. Linia komórkowa HeLa jest bardzo dobrym modelem, wywodzi się z komórek raka szyjki macicy, jest praktycznie nieśmiertelna i hodowana w wielu laboratoriach świata. Główne zadania, które zaplanowano realizować w projekcie: 1. Synteza nanomateriałów krzemionkowych i tytanowych jako nośników aktywnych

3 3 nanocząsteczek. 2. Domieszkowanie nanomateriałów zol-żelowych nanocząsteczkami srebra i fotouczulaczami. 3. Badanie in situ właściwości optycznych wytwarzanych nanomateriałów, w tym możliwości wzmocnienia oddziaływania fotodynamicznego w obecności aktywnych nanocząsteczek srebra. 4. Zapoznanie się z metodą i warunkami hodowli linii komórkowych HeLa in vitro jako modelu zmian nowotworowych. 5. Pomiary in vitro natężenia sygnału fluorescencji w zależności od dawki i rodzaju fotouczulacza. Główny cel, jaki założono osiągnąć, to optymalizacja dawkowania fotodynamicznego w PDD/PDT, jak również zbadanie wpływu nanmateriałów zol-żelowych na oddziaływanie fotodynamiczne w obecności aktywnych nanocząsteczek srebra na komórki HeLa w warunkach in vitro. W pierwszym etapie stażu wytworzono nanomateriały stosując technologię zol-żel i bazując na prekursorze krzemionkowym TEOS(Si(OC 2 H 5 ) 4 ) (modyfikacja tzw. procesu Stöbera) oraz tytanowym TEOT (Ti(OC 2 H 5 ) 4 ) (zad. 1). Zsyntetyzowano nanomateriały krzemionkowe oraz nanomateriały na bazie dwutlenku tytanu w formie amorficznej i krystalicznej, które stały się bazą dla nanocząsteczek srebra. Następnie właściwości zsyntetyzowanych nanomateriałów zostały ulepszone właściwościami srebra, poprzez domieszkowanie nanomateriałów zol-żelowych krzemionkowych i tytanowych nanocząsteczkami srebra, wykorzystując tzw. procedurę Tollena, przy zastosowaniu tzw. reduktora Tollena - roztworu glukozy (zad. 2). Następnie unieruchomiono w zol-żelowych matrycach fotouczulacze stosowane w medycynie fotodynamicznej i zbadano właściwości spektroskopowe. Przeprowadzono badania właściwośći optycznych (zad. 3), przy wykorzystaniu spektrometru UV-VIS (AvaSpec-3648). Określono zakres długości fal (widma wzbudzeniowe związku) umożliwiających wzbudzenie fotouczulacza-fotolonu przy długości emisji λ em =663 nm i określono maksimum wzbudzenia na 405 nm. Natomiast dla fotouczulacza-ppix, zebrano widma wzbudzeniowe przy długości emisji λ em =618 nm i wyznaczono maksimum wzbudzenia na 396 nm. Ze względu na znacznie niższą intensywność sygnału fluorescencyjnego PPIX w stosunku do sygnału Fotolonu, zwiększono wielkości szczelin wzbudzeniowej i emisyjnej. Dodatkowo analizując widma fluorescencyjne nanomateriałów domieszkowanych fotouczulaczami o stałym stężeniu, zaobserwowano wzmocnienie fluorescencji pod wpływem aktywnych nanocząsteczek srebra, zależne od stężenia i wielkości nanocząsteczek srebra. Z uwagi na konieczność obrazowania próbek zarówno w postaci utrwalonej (1-4h inkubacji z fotouczulaczem),

4 4 jak i w trybie przeżyciowym (12-24h inkubacji), zbadano wpływ środka utrwalającego (3% paraformaldehyd) na widmo emisyjne Fotolonu i PPIX. Paraformaldehyd, w stężeniach znacznie przekraczających stężenia w próbkach obrazowanych mikroskopowo, nie powoduje zmiany intensywności fluorescencji fotofonu i PPIX, jak i nie przesuwa położenia maksimum emisji. Wybrana linia komórkowa HeLa jest bardzo dobrym modelem (zad. 4). HeLa to linia ludzkich komórek nabłonkowych pochodzących z raka szyjki macicy. Uległy one transformacji nowotworowej na skutek zakażenia wirusem brodawczaka HPV 18. Pobrane zostały od 31 letniej Murzynki Henrietty Lacks, która zmarła w 1951r. Komórki te, jako nowotworowe, nieustannie i szybko się dzielą, dzięki czemu są bardzo dobrym modelem badań biologii nowotworów (zwłaszcza raka szyjki macicy). Komórki linii HeLa hodowano w medium DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), w temperaturze 37 o C, 5% CO 2 do poziomu konfluencji >85%. Na potrzeby obrazowania mikroskopowego komórki przenoszono na szkiełka mikroskopowe metodą trypsynizacji i inkubowano do czasu pomiaru (37 o C, 5%CO 2 ). Do obrazowania mikroskopowego komórki inkubowano z zadanym czynnikiem: przez 1, 2, 4, 12 lub 24 godziny. Komórki inkubowane przez 1-4 h obrazowano w postaci utrwalonej 3% roztworem paraformaldehydu. Obrazowanie komórek inkubowanych z badanymi związkami przez 12 godzin lub dłużej prowadzono w trybie przeżyciowym, z wykorzystaniem modułu termostatującego stolik mikroskopowy (37 o C, 5%CO 2 ). W wyniku przeprowadzonych pomiarów mikroskopowych wykazano, iż spośród wszystkich analizowanych próbek, komórek HeLa zawierających określone stężenia fotouczulacza Fotolonu, niezbędny do zaobserwowania związku wewnątrz komórek, okazał się czas inkubacji min. 4 godziny oraz stężenie fotouczulacza min. 1 µg/ml (zad. 5). Ze względu na bardzo niski sygnał widoczny podczas 4 godzinnej inkubacji, przeprowadzono pomiary podczas których wydłużono czas inkubacji do 12 godzin, dzięki czemu udało się zaobserwować sygnał fluorescencyjny dla badanych próbek, o stężeniu Fotolonu mniejszym niż dla czasu inkubacji 4h (1 µg/ml). Ty samym udało się określić minimalne stężenie niezbędne dla obserwacji mikroskopowych w czasie 12 godzinnej inkubacji. W trakcie dalszych pomiarów określono także wpływ srebra koloidalnego na poziom fluorescencji komórek HeLa. Wyniki otrzymane dla komórek inkubowanych przez 12 godzin w obecności Fotofonu o stężeniu 1µg/ml, wykazano widoczną obecność srebra wewnątrz komórek oraz obecność Fotolonu w obrazie fluorescencyjnym. Ze względu na niską rozpuszczalność Protoporfiryny IX w wodzie oraz wodnych roztworach, otrzymane wyniki znacząco różnią się od tych uzyskanych dla Fotolonu (zad. 5). W przypadku buforowych roztworów wodnych PPIX o niskich stężeniach (<1µg/ml) nie zaobserwowano fluorescencji. W celu identyfikacji minimalnego stężenia pozwalającego na skuteczną obserwację

5 5 mikroskopową zaproponowano podaż PPIX z roztworu właściwego DMSO (Dimetylu sulfotlenek, POCh) do roztworu buforowego. Uzyskane wyniki w trakcie 12 godzinnej inkubacji komórek HeLa w roztworze buforowym PPIX o stężeniu 10 µg/ml jednoznacznie wykazują wtórną rekrystalizację PPIX rozcieńczanego z DMSO, co nie pozwala na stosowanie tego rozpuszczalnika w bardziej zaawansowanych aplikacjach. Szczególnie wyraźnie widać iż kryształy PPIX nie wnikają do jądra a pozostają głównie w cytoplazmie. Dodatkowo charakterystyczny jest brak dużej ilości tego związku w błonach komórkowych. Podsumowaując scharakteryzowano właściwości optyczne nanomateriałów zol-żlowych domieskzowanych srebrem, również w obecności fotouczulaczy. Ustalono optymalną linię lasera do zastosowania w obrazowaniu mikroskopowym, tj. linię 405 nm. Maksimum emisji Fotolonu w ph=7.0 ustalono na 664 nm. Natomiast dla PPIX, maksimum wzbudzenia to 396 nm przy maksimum długości fali emisji 618 nm. Pokazano, iż obecność paraformaldehydu, nie wpływa na przebieg widm emisyjnych Fotolonu, umożliwiając tym samym jego zastosowanie w roli utrwalacza komórek, przed ich obrazowaniem mikroskopowym. Określono poziom wnikania dwóch związków z grupy fotouczulaczy do komórek HeLa oraz określono minimalne stężenia fotouczulaczy, niezbędne dla celów diagnostycznych, przy okreslonych czasach inkubancji. Dodatkowo, nie wykazano wpływu koloidalnego srebra zarówno na poziom wnikania jak i na poziom fluorescencji fotolonu w komórkach. Zaobserwowano wnikanie nanocząstek srebra koloidalnego do komórek HeLa, jednak nie wykazano toksycznego efektu jego działania na te komórki. W trakcie prowadzonych pomiarów, wykazano wtórny proces krystalizacji związku PPIX, rozpuszczonego do roztworu właściwego w DMSO, a następnie rozpuszczonego w buforze. Realizacja podjętych w projekcie zadań zaowocowała poznaniem właściwości fluorescencyjnych materiałów zol-żelowych domieszkowanych fotoaktywnymi nanocząsteczkami srebra i fotouczulaczami oraz zbadaniem możliwości zwiększenia efektywności fotodynamicznej fotouczulaczy poprzez dodanie fotoaktywnych nanocząsteczek. Badania in vitro umożliwiły zbadanie wpływu nanomateriałów zol-żelowych domieszkowanych srebrem i fotouczulaczami na zmiany nowotworowe linii komórkowej HeLa. Realizacja projektu może poszerzyć współpracę naukową z partnerami krajowymi i zagranicznymi, zarówno w obszarze badań in vitro. Rozwinięcie nowych idei w ramach projektu pozwoli na uzyskanie funduszy na dalsze badania w programach krajowych i międzynarodowych, a tym samym przyczyni się do powstania nowych pomysłów na wspólne badania. Data i podpis Stypendysty

6 6 8. Opinia Opiekuna naukowego stażysty nt. osiągniętych rezultatów oraz ich zgodności z zaplanowanymi i przydatności w pracy naukowo-dydaktycznej (zatwierdzenie stażu): 1. Ocena przebiegu stażu zgodnie z naukowo-dydaktycznym planem stażu (0 5 pkt.) dołączyć w załączniku.. 2. Ocena wartości osiągniętych rezultatów stażu (0 5 pkt.) wypełnia recenzent.... Data i podpis Recenzenta