RADA REDAKCYJNA REDAKCJA. Adresy redakcji

Transkrypt

1

2 RADA REDAKCYJNA JACEK BIELECKI (Uniwersytet Warszawski), MIECZYS AW K. B ASZCZYK (Uniwersytet Rzeszowski), RYSZARD CHRÓST (Uniwersytet Warszawski), JERZY D UGOÑSKI (Uniwersytet ódzki), DANUTA DZIER ANOWSKA (Centrum Zdrowia Dziecka), EUGENIA GOSPODAREK (Akademia Medyczna w Bydgoszczy), JERZY HREBENDA (Uniwersytet Warszawski), WALERIA HRYNIEWICZ (Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego), MAREK JAKÓBISIAK (Akademia Medyczna w Warszawie), MIROS AW KAÑTOCH (Pañstwowy Zak³ad Higieny), ANDRZEJ PASZEWSKI (Instytut Biochemii i Biofizyki PAN), ANDRZEJ PIEKAROWICZ (Uniwersytet Warszawski), ANTONI RÓ ALSKI (Uniwersytet ódzki), BOHDAN STAROŒCIAK (Akademia Medyczna w Warszawie), BOGUS AW SZEWCZYK (Uniwersytet Gdañski), EL BIETA TRAFNY (Wojskowy Instytut Higieny i Epidemiologii), STANIS AWA TYLEWSKA-WIERZBANOWSKA (Pañstwowy Zak³ad Higieny), GRZEGORZ WÊGRZYN (Uniwersytet Gdañski), PIOTR ZIELENKIEWICZ (Uniwersytet Warszawski) REDAKCJA JERZY HREBENDA (redaktor naczelny), JACEK BIELECKI (zastêpca), BOHDAN STAROŒCIAK (sekretarz) Adresy redakcji Redaktorzy: Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, Warszawa, tel. (0 22) /304, fax (0 22) j.hrebenda@biol.uw.edu.pl; jbielecki@biol.uw.edu.pl Sekretarz Zak³ad Mikrobiologii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna ul. Oczki 3 (parter), Warszawa, tel. (0 22) , (0 22) CZASOPISMO WYDAWANE Z FINANSOW POMOC KOMITETU BADAÑ NAUKOWYCH Index Copernicus 4,88 (2003); KBN PO5 4,0 (2004) Pismo indeksowane w EMBASE/Excepta Medica Na ok³adce: Komórki Listeria monocytogenes wewn¹trz mysiej komórki makrofagopodobnej linii I774 (Olympus IX70, wzbudzenie FITC, 1500x), fot. Jaros³aw Wiœniewski Projekt ok³adki: Jerzy Grzegorkiewicz POLSKIE TOWARZYSTWO MIKROBIOLOGÓW Nak³ad egz., Objêtoœæ 7,5 arkusza wyd., Papier offser 80 g Sk³ad i druk: Zak³ad Wydawniczy Letter Quality, Warszawa, Brylowska 35/38,

3 POST. MIKROBIOL., 2005, 44, 4, GLIKOZYLACJA BIA EK MIKROORGANIZMÓW RODZAJU CAMPYLOBACTER El bieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka *, Joanna ycka Karolina Tomczyk, Agnieszka Wyszyñska Zak³ad Genetyki Bakterii, Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, Warszawa, tel , Wp³ynê³o w w maju Wstêp. 2. Ogólna charakterystyka procesów glikozylacji bia³ek Prokaryota. 3. Glikozylacja bia³ek u Campylobacter O-glikozylacja bia³ek u Campylobacter N-glikozylacja bia³ek u Campylobacter. 4. Podsumowanie Protein glycosylation in Campylobacter Abstract: Glycosylation is considered to be the most frequent system of protein modification in eukaryotic cells. It has been recently established that also many bacterial proteins are modified by glycosylation and now it is widely accepted that prokaryotes (Archaea and Bacteria) express glycoproteins. In Gram-negative bacteria O-linked as well as N-linked glycosylation has been reported. The first one was identified in many bacterial species whereas the N-linked system seems to be rather restricted to g-proteobacteria (Campylobacter and Wolinella). In this review we provide a description of a mechanism of Campylobacter protein glycosylation and a role of this process in bacterial pathogenesis. Sequencing of the Campylobacter genomes evidently facilitates the analysis of posttranslational protein modification however many aspects of the process still remain to be determined. 1. Introduction. 2. General characterization of protein glycosylation in Prokaryota. 3. Protein glycosylation in Campylobacter O-glycosylation in Campylobacter N-glycosylation in Campylobacter. 4. Summary S³owa kluczowe: Campylobacter, glikozylacja Key words: Campylobacter, glycosylation 1. Wstêp Glikozylacja jest jedn¹ z najbardziej rozpowszechnionych posttranslacyjnych modyfikacji bia³ek maj¹cych wp³yw na ich strukturê, co tym samym warunkuje udzia³ tych protein w wielu procesach. Do niedawna uznawano, e glikozylacja wystêpuje wy³¹cznie w komórkach eukaryotycznych. Ostatnio udokumentowano, e glikoproteiny obecne s¹ tak e w proteomach organizmów prokaryotycznych [4, 48]. Prezentowana praca omawia najnowsze wyniki badañ dotycz¹ce identyfikacji i charakterystyki procesów glikozylacji bia³ek ró nych gatunków bakterii, ze szczególnym uwzglêdnieniem mikroorganizmów rodzaju Campylobacter. Campylobacter jest jedynym przedstawicielem Bacteria, którego system N-glikozylacji zosta³ szczegó³owo przeanalizowany eksperymentalnie. Poza Campylobacter obecnoœæ genów warunkuj¹cych proces glikozylacji stwierdzono, metodami in silico, w genomie pokrewnego gatunku Wolinella succinogenes [14]. W komórkach eukaryotycznych glikozylacja zachodzi w obrêbie retikulum endoplazmatycznego (RE). Reszta cukrowa mo e ³¹czyæ siê z ³añcuchem peptydowym poprzez wi¹zanie N- lub O-glikozydowe. W przypadku N-glikozylacji oligomery cukrowe wi¹ ¹ siê z reszt¹ amidow¹ asparaginy œciœle konserwowanego motywu Asn-Xaa-Ser/Thr, gdzie Xaa mo e byæ dowolnym aminokwasem z wyj¹tkiem proliny. Oligosacharydy przy³¹czane wi¹zaniem N-glikozydowym powstaj¹ na lipidowym noœniku (fosforan dolicholu) osadzonym w b³onie retikulum endoplazmatycznego. Do noœnika, od cytozolowej strony b³ony RE, przy- ³¹czany jest heptasacharyd z³o ony z piêciu mannoz i dwóch reszt GlcNAc (N-acetyloglukozoamina). Po odwróceniu orientacji fosforanu dolicholu nastêpne reszty cukrowe dobudowywane s¹ od strony œwiat³a RE [24]. W kolejnym etapie wytworzona jednostka cukrowa (Glc 3 Man 9 GlcNAc 2 ), przy udziale transferazy oligosacharydowej (OST), przenoszona jest na asparaginê syntetyzowanego ³añcucha polipeptydowego. OST to z³o ony kompleks bia³ek transmembranowych, z których najlepiej poznanym jest STT3 proteina o silnie konserwowanej sekwencji aminokwasowej odpowiedzialna prawdopodobnie za enzymatyczn¹ aktywnoœæ kompleksu bia³kowego [29, 30, 63]. W przypadku glikozylacji typu O modyfikacji podlegaj¹ reszty serynowa i treoninowa. Jednostka cukrowa wi¹ e siê do atomu tlenu grupy hydroksylowej w bocznym ³añcuchu tych aminokwasów. Synteza oligosacharydów po³¹czonych wi¹zaniem O-glikozydowym zachodzi przez do³¹czanie kolejnych monocukrów

4 300 EL BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, JOANNA YCKA, KAROLINA TOMCZYK, AGNIESZKA WYSZYÑSKA do nowo powstaj¹cego bia³ka. Proces ten zaczyna siê od przy³¹czenia N-acetylogalaktozoaminy (GalNAc) do reszt Ser/Thr. Do niej dobudowywane s¹ kolejne monosacharydy. 2. Ogólna charakterystyka procesów glikozylacji bia³ek Prokaryota Przez d³ugi czas uwa ano, e glikozylacja jest procesem typowym wy³¹cznie dla komórek organizmów eukaryotycznych. Badania ostatnich lat udokumentowa³y jednak, e proces ten jest równie wa nym mechanizmem posttranslacyjnej modyfikacji bia³ek Prokaryota. Jak siê okaza³o, glikoproteiny, traktowane pocz¹tkowo jako specyficzne dla niewielu gatunków mikroorganizmów, s¹ szeroko rozpowszechnione zarówno wœród Archaea jak i Bacteria [50]. Po raz pierwszy glikozylowane bia³ko u prokariontów zidentyfikowano w komórkach halofilnego gatunku Halobacterium halobium nale ¹cego do Archaea. Glikoproteina opisana przez M e s chera i wsp. w 1974 roku [40] okaza³a siê bia³kiem powierzchniowej warstwy S [50]. Glikoproteiny warstwy S Archaea mog¹ tworzyæ dwuwymiarowe sieci, a zwi¹zane z nimi ³añcuchy glikanowe wystaj¹ ponad powierzchniê komórki buduj¹c hydrofilny p³aszcz polisacharydowy podobny do lipopolisacharydowych antygenów O bakterii gramujemnych. Ich obecnoœæ zwiêksza ró norodnoœæ powierzchniow¹ komórek i odgrywa wa n¹ rolê w interakcji z otaczaj¹cym œrodowiskiem. Wœród Bacteria pierwsz¹ glikoproteinê odkryto w roku 1976 u bakterii termofilnych rodzajów Thermoanaerobacter i Thermoanaerobacterium [53]. Ta posttranslacyjna modyfikacja, jak wykaza³y póÿniejsze badania, wystêpuje równie w komórkach wielu rodzajów bakterii patogennych (np.: Neisseria, Borrelia, Mycobacterium, Pseudomonas, Streptococcus, Campylobacter i in.) [5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 39, 54, 60]. Podlegaj¹ jej g³ównie bia³ka powierzchniowe bêd¹ce jednoczeœnie istotnymi czynnikami wirulencji (piliny, flagelliny, adhezyny). Bia³ka bakteryjne modyfikowane s¹ przez przy³¹czanie krótkich ³añcuchów wêglowodanowych zawieraj¹cych przewa nie od jednego do szeœciu monocukrów. U Bacteria, wœród monosacharydów buduj¹cych modyfikuj¹ce bia³ka glikany najczêœciej spotyka siê heksozy, pentozy i aminocukry, choæ w ich sk³ad wchodz¹ tak e niespotykane u Eukarya wêglowodany takie jak PseAm (kwas pseudoaminowy) i jego pochodne oraz DATDH (2,4-diacetamido-2,4,6-trideoksyheksoza). Obecnoœæ tych nietypowych cukrów stwierdzono w glikoproteinach ró nych rodzajów bakterii, takich jak: Campylobacter, Legionella, Neisseria i Pseudomonas. Glikany Archaea s¹ zazwyczaj krótsze i nie posiadaj¹ powtarzaj¹cych siê sekwencji [50]. Dominuj¹cym typem glikozylacji w œwiecie organizmów prokaryotycznych jest glikozylacja typu O. Glikozylacja u Archaea i Bacteria jest mniej specyficzna co do miejsca ni u Eukarya, co warunkuje wiêksz¹ heterogennoœæ modyfikowanych bia³ek bakteryjnych [50]. Badania prowadzone metodami biochemicznymi oraz genetycznymi udokumentowa³y du ¹ ró norodnoœæ jednostek wêglowodanowych po³¹czonych z bia³kami konkretnego mikroorganizmu. Za zjawisko to odpowiedzialne jest wiele czynników. Po pierwsze polimorfizm genetycznych loci glikozylacji. Po drugie wiele genów koduj¹cych enzymy systemu glikozylacji podlega zjawisku zmiennoœci fazowej, czego konsekwencj¹ jest obecnoœæ w populacji komórek o ró nym wzorze glikozylacji bia³ek. Dodatkowo geny odpowiedzialne za produkcjê protein ulegaj¹cych glikozylacji s¹ u niektórych bakterii patogennych obiektem zmiennoœci antygenowej a aminokwasy modyfikowane przez jednostki wêglowodanowe s¹ zlokalizowane w ich wysoce zmiennych regionach. Przedzia³ komórkowy, w którym ma miejsce proces glikozylacji bia³ek prokaryotycznych nie zosta³ dok³adnie okreœlony. Wiele przes³anek wskazuje na przestrzeñ peryplazmatyczn¹. Bia³ka bêd¹ce celem glikozylacji zaopatrzone s¹ w sekwencje sygna³owe warunkuj¹ce ich transport przez b³onê cytoplazmatyczn¹ [42, 64]. Zaproponowany model sugeruje, e ³añcuch wêglowodanowy syntetyzowany na terenie cytoplazmy, po po³¹czeniu z lipidowym noœnikiem, transportowany jest do przestrzeni peryplazmatycznej, gdzie ma miejsce do³¹czenie oligosacharydu do docelowego bia³ka. Hipotezê zak³adaj¹c¹ syntetyzowanie ³añcucha wêglowodanowego na terenie cytoplazmy potwierdza fakt, e wiele enzymów bior¹cych udzia³ w tym procesie to bia³ka cytoplazmatyczne [57]. Jest te prawdopodobne, e nie istnieje jeden wspólny schemat objaœniaj¹cy proces glikozylacji u wszystkich rodzajów bakterii Gram-ujemnych. Biosynteza bakteryjnych glikoprotein mo e przebiegaæ z wykorzystaniem enzymów szlaku syntezy LPS/LOS, jak to ma miejsce np. w procesie glikozylacji piliny Pseudomonas [6, 7, 23]. Podobne mechanizmy syntezy zaobserwowano w przypadku bia³ek TibA (ang. enterotoxigenic invasion locus B) i AIDA-I (ang. adhesin invovlved in diffuse adherence) enterotoksycznych (ETEC)/enteropatogennych (EPEC) szczepów E. coli. Bia³ka te s¹ zlokalizowanymi na powierzchni komórki autotransporterami, które bior¹ udzia³ w interakcjach z komórkami eukaryotycznymi (adhezja/inwazja). Produkty genów odpowiedzialne za ich glikozylacjê, odpowiednio TibC i Aah, jako substrat wykorzystuj¹ ADP-glicero-mannozo-heptopiranozê zwi¹zek powstaj¹cy przy udziale enzymów syntezy LPS [3, 33, 41]. W genomach innych gatunków bakterii zlokalizowano genetyczne loci, zwane wyspami glikozylacji,

5 GLIKOZYLACJA BIA EK MIKROORGANIZMÓW RODZAJU CAMPYLOBACTER 301 zaanga owane wy³¹cznie w ten rodzaj modyfikacji bia- ³ek. Unieczynnienie genów takiego regionu nie wp³ywa na strukturê LPS-u, a jedynie na profil glikozylowanych protein. Tego typu organizacja genetyczna jest charakterystyczna dla szlaków zarówno N-glikozylacji w komórkach Campylobacter [43] jak i procesu O-glikozylacji flagelliny Pseudomonas [55]. Genetyczne loci, zwi¹zane z procesami glikozylacji, odnajdowane s¹ w genomach bakteryjnych czêsto w bezpoœrednim s¹siedztwie genów koduj¹cych cel ich dzia³ania. Geny tiba i aida-1 E. coli ulokowane s¹ poni ej genów tibc i aah koduj¹cych odpowiednie glikozylotransferazy [3, 33, 41]. Równie geny warunkuj¹ce glikozylacjê flagelliny w genomach Campylobacter wchodz¹ w sk³ad jednostek genetycznych zawieraj¹cych geny strukturalne bia³ek buduj¹cych aparat wici. Odmiennie przedstawia siê organizacja genetyczna systemu N-glikozylacji Campylobacter (rozdz. 3.2). Rola procesu glikozylacji w komórkach mikroorganizmów nie by³a, jak dot¹d, szczegó³owo badana. Podobnie jak w przypadku organizmów eukaryotycznych, oligosacharydowe grupy mog¹ wywieraæ istotny wp³yw na strukturê i funkcjê bia³ka modyfikowanego przez ich do³¹czenie. Wiêkszoœæ zidentyfikowanych dotychczas bakteryjnych glikoprotein to bia³ka powierzchniowe, czêsto wchodz¹ce w sk³ad organelli takich jak pili lub wici, lub wydzielane do œrodowiska. Unieczynnienie procesu glikozylacji prowadzi do zaburzeñ w procesie budowy tych organelli. W niektórych przypadkach konsekwencj¹ mutacji w genach wysp glikozylacji jest obni enie poziomu adhezji patogenu do komórek eukaryotycznych (Campylobacter, Escherichia) i zdolnoœci do kolonizacji odpowiedniej niszy ekologicznej, aczkolwiek nie zawsze zaburzenia procesu glikozylacji maj¹ odzwierciedlenie w przebiegu procesu patogenezy. Analogicznie do glikoprotein komórek ssaczych, rozpoznawanych przez odpowiednie selektyny, przypuszcza siê, e i glikoproteiny bakterii chorobotwórczych mog¹ wchodziæ w interakcje z receptorami komórek uk³adu immunologicznego gospodarza, moduluj¹c ich odpowiedÿ na infekcje bakteryjne. Dodatkowo wykazano, e glikozylowany region flagelliny Campylobacter jest jej immunodominujacym epitopem. Glikany o odpowiednich jednostkach wêglowodanowych chroni¹ równie komórki bakteryjne przed litycznym dzia³aniem sk³adników komplementu. Inna hipoteza zak³ada, e glikany do³¹czone do bia³ek, moduluj¹c proces ich degradacji przez APC (ang. antigen presenting cells), modyfikuj¹ prezentacjê fragmentów antygenów z cz¹steczkami MHC klasy II. Tego typu oddzia³ywanie mo e mieæ odzwierciedlenie w poziomie i typie stymulowanej odpowiedzi obronnej [49]. Dalszy fragment pracy omawia szczegó³y procesów glikozylacji bia³ek Campylobacter. Czytelnikom zainteresowanym przebiegiem tych procesów w komórkach innych gatunków mikroorganizmów polecamy wnikliwe prace przegl¹dowe [4, 48, 50, 52]. 3. Glikozylacja bia³ek Campylobacter Bakterie z rodzaju Campylobacter przeprowadzaj¹ zarówno O- jak i N-glikozylacjê bia³ek, wykorzystuj¹c w tym celu dodatkowe zespo³y genów, które nie bior¹ udzia³u w procesach syntezy LPS/LOS. Bia³kiem O-glikozylowanym jest flagellina, podczas gdy na drodze N-glikozylacji modyfikowanych jest ponad trzydzieœci protein. Szczegó³y tych procesów poznano stosunkowo niedawno. Pierwsz¹ pracê dokumentuj¹c¹, e za post-translacyjn¹ modyfikacjê flagelliny trzech gatunków rodzaju Campylobacter (C. jejuni, C. coli i C. fetus) odpowiedzialne s¹ procesy glikozylacji opublikowano w roku 1996 [11] O-glikozylacja bia³ek u Campylobacter Bakterie rodzaju Campylobacter s¹ ruchliwymi pa- ³eczkami opatrzonymi wici¹ zlokalizowan¹ na biegunie komórki, umo liwiaj¹c¹ tym mikroorganizmom poruszanie siê w gêstym œrodowisku œluzu jelitowego i docieranie do komórek docelowych komórek nab³onkowych jelit. Ze wzglêdu na potencjalny udzia³ wici w procesie kolonizacji jelit jak i mo liwoœæ zastosowania flagelliny, bêd¹cej immunodominuj¹cym bia³kiem Campylobacter, do konstrukcji szczepionek, bia³ko to od kilku lat jest obiektem intensywnych badañ, zarówno genetycznych jak i biochemicznych [21]. Flagella u C. jejuni jest organellum sk³adaj¹cym siê g³ównie z dwóch spokrewnionych podjednostek: FlaA i FlaB. G³ówny sk³adnik filamentu flagellinowego stanowi bia³ko FlaA. Mutacja w genie flaa w szczepie C. coli VC167 powoduje syntezê skróconego filamentu flagelliny, co objawia siê znaczn¹ redukcj¹ ruchliwoœci bakterii w porównaniu z form¹ dzik¹. Obydwie flagelliny kodowane przez geny s¹siaduj¹ce na chromosomie, ale stanowi¹ce odrêbne jednostki transkrypcyjne, wykazuj¹ ponad 93% podobieñstwo sekwencji aminokwasowej [21]. Gen flaa jest regulowany przez klasyczny dla genu flagelliny promotor odczytywany przez polimerazê RNA zale n¹ od F 28, podczas gdy ekspresja flab jest zale na od polimerazy RNA zwi¹zanej z F 54. Aktywnoœæ obu genów jest niezbêdna do maksymalnej ruchliwoœci komórek. Aktywatorem transkrypcji genów zale nych od F 54 jest fosforylowane przez FlgS bia³ko FlgR. Procesy regulacji budowy flagelli nadal nie s¹ w pe³ni poznane i ich wyjaœnienie wymaga dalszych badañ [20, 21, 25]. Spoœród zidentyfikowanych dotychczas bia³ek prokaryotycznych jednym z najintensywniej modyfikowanych jest flagellina Campylobacter. We flagellinie

6 302 EL BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, JOANNA YCKA, KAROLINA TOMCZYK, AGNIESZKA WYSZYÑSKA szczepu C. jejuni ze 107 obecnych w cz¹steczce bia³ka reszt aminokwasowych (serynowych lub treoninowych) 19 podlega glikozylacji. Do³¹czenie grup cukrowych powoduje zwiêkszenie masy cz¹steczkowej bia³ka o ok. 6 kda, co stanowi ok. 10% jej ca³kowitej masy. Ich lokalizacja nie jest przypadkowa, wszystkie z wyj¹tkiem jednej znajduj¹ siê w centralnym fragmencie bia³ka eksponowanym na powierzchni komórki. Posttranslacyjna modyfikacja ma znaczenie dla struktury flagelliny i jej w³aœciwoœci immunogennych [1, 47, 59]. W badaniach D o i g a i wsp. zaobserwowano, e flagellina C. coli VC167 wi¹ e siê z lektynami rozpoznaj¹cymi kwas sjalowy [11]. T h i bault i wsp., przy u yciu metod masowej spektrometrii i spektroskopii magnetycznego rezonansu j¹drowego, okreœlili strukturê dominuj¹cego wêglowodanu przy- ³¹czanego do flagelliny C. jejuni Nie jest to kwas N-acetyloneuraminowy, co sugerowa³y wczeœniejsze analizy, lecz kwas pseudoaminowy Pse5Ac7Ac (kwas 5,7-diacetamido-3,5,7,9-tetradeoksy-L-glicero- L-manno-nonulosonowy), dziewiêciowêglowy cukier przypominaj¹cy kwas sjalowy [Neu5Ac], oraz jego pochodna zawieraj¹ca grupê acetamidow¹ PseAm. Zidentyfikowano tak e niedu e iloœci innych analogów kwasu pseudoaminowego Pse5Pr7Pr (forma dihydroksypropionylowa) oraz Pse5Ac7Ac8OAc (forma O-acetylowana) [59]. Flagellina C. coli VC167 jest równie modyfikowana przez Pse5Ac7Ac oraz PseAm, przy czym forma kwasu pseudoaminowego zawieraj¹ca grupê acetamidow¹ jest u tego gatunku odmienna pod wzglêdem strukturalnym i immunologicznym (inne miejsce przy³¹czenia grupy acetamidowej). Do flagelliny C. coli przy³¹czane s¹ tak e, nie wystêpuj¹ce u C. jejuni, pochodne Pse5Ac7Ac oraz PseAm zawieraj¹ce deoksypentozê [37]. Jak dotychczas nie poznano dok³adnie mechanizmu/ów O-glikozylacji w komórkach Campylobacter. Od po³owy lat 90-tych XX wieku opisano kilka genów bior¹cych udzia³ w procesach glikozylacji flagelliny Campylobacter. Pierwsze z nich dok³adnie scharakteryzowane to ptma i ptmb (ang. post-translational modification). Analiza mutantów w genach koduj¹cych te bia³ka pozwoli³a okreœliæ ich funkcjê: gen ptma jest homologiem 3-oksoacylo-reduktazy (bia³kowy noœnik grup acylowych), a gen ptmb (neua3) jest domniemanym homologiem syntetazy CMP-Neu5Ac (syntetaza CMP-N-acetyloneuraminowego kwasu) [22]. Dane doœwiadczalne wskazuj¹ równie na istotn¹ rolê genu cj1293 (pseb ang. pseudaminic acid) w glikozylacji flagelliny. Gen ten koduje C 6 - dehydratazê/c 4 -reduktazê specyficzn¹ dla UDP-GlcNAc, której aktywnoœæ jest niezbêdna do syntezy pochodnej kwasu pseudoaminowego syntetyzowanego z prekursora UDP-Glc- NAc [20]. Funkcjonalny homolog genu cj HP0840 odnaleziono w genomie Helicobacter pylori, a jego aktywnoœæ potwierdzono drog¹ komplementacji mutacji w genie pseb Campylobacter [9, 20]. Ostatnie badania wykaza³y, e flagellina Helicobacter jest równie modyfikowana przez przy³¹czenie kwasu pseudoaminowego [51]. Mutant C. jejuni pseb nie ma zdolnoœci do ruchu i gromadzi wewn¹trz komórki nieglikozylowan¹ flagellinê, podczas gdy inaktywacja tego genu w szczepie C. coli VC167 nie powoduje utraty ruchliwoœci i braku glikozylacji flagelliny. Mutant C. coli VC176 pseb produkuje flagellinê modyfikowan¹ przez PseAm, a nie przez Pse5Ac7Ac. Otrzymane wyniki potwierdzi³y obserwowane wczeœniej ró nice w szlakach syntezy i do³¹czania reszt cukrowych do flagellin w dwu przebadanych szczepach [20, 37]. Dodatkowo, T h i bault i wsp. zidentyfikowali i scharakteryzowali jeszcze jeden gen C. jejuni gen psea (cj1316c) bior¹cy udzia³ w modyfikacji flagelliny. Zmutowane szczepy, nieprodukuj¹ce tego bia³ka, by³y co prawda ruchliwe, lecz ich flagellina wykazywa³a zmienione w³aœciwoœci fizykochemiczne, co zwi¹zane by³o z zamian¹ rodzaju przy³¹czonych reszt cukrowych (Pse5Am7Ac na Pse5Ac7Ac) [59]. Mutacja w s¹siaduj¹cym genie cj1317 (neub3) koduj¹cym syntetazê kwasu sjalowego skutkuje brakiem flagelli w licznych szczepach Campylobacter [36]. Zsekwencjonowanie genomu C. jejuni NCTC11168 wykaza³o istnienie regionu zwi¹zanego z procesem syntezy i glikozylacji flagelliny obejmuj¹cego oko³o 50 ORF [43]. Jak dot¹d, okreœlono funkcjê nielicznych bia³ek kodowanych w obrêbie tego regionu (produkty genów neu, pse, ptm), pozosta³e s¹ obiektem trwaj¹cych badañ. Wiele z nich posiada homologi w genomach innych rodzajów mikroorganizmów np. Neisseria czy Helicobacter, te prawdopodobnie uwik³ane w proces glikozylacji bia³ek buduj¹cych zewn¹trzkomórkowe organelle, takich jak flagellina czy pilina [48]. Geny koduj¹ce hipotetyczne bia³ka stanowi¹ 50% locus O-glikozylacji i czêœæ z nich nale y do dwóch rodzin. Pierwsza z nich rodzina genów maf (motilityassociated factors) obejmuje 7 genów (cj1318, cj1333, cj1334, cj1335/1336, cj1337, cj1340, cj1341), których produkty zlokalizowane najprawdopodobniej w cytozolu lub b³onie wewnêtrznej komórki odpowiadaj¹ za funkcjê motoryczn¹ flagelliny i maj¹ swoje homologi w genomach H. pylori i Clostridium spp. Inaktywacja genu maf5 prowadzi do zaburzeñ w budowie wici [28]. Drug¹ rodzinê, okreœlan¹ jako rodzina 617, tworzy piêæ genów: cj617/618, cj1305c, cj1306c, cj1310c, cj1342c. Dok³adna analiza regionu Cj1314- Cj1338 materia³u genetycznego ró nych szczepów Campylobacter, okreœlanego mianem ptm locus, wskazuje na wysoki poziom polimorfizmu badanego odcinka DNA. Przyk³adowo: C. jejuni nie posiada genów cj , cj1335 i cj1336. W genomie

7 GLIKOZYLACJA BIA EK MIKROORGANIZMÓW RODZAJU CAMPYLOBACTER 303 Rys. 1. Porównanie loci O-glikozylacji u ró nych szczepów Campylobacter (zmodyfikowane za [57]) Na rysunku zaznaczono geny potencjalnie podlegaj¹ce zjawisku zmiennoœci fazowej. Reprinted from Trends in Microbiology, vol. 11, Szymanski C.M., Logan S.M., Linton D., Wren B.W.: Campylobacter a tale of two protein glycosylation systems, p.p (2003), copyright. With permission from Elsevier. C. coli VC167 znaleziono natomiast kilka genów nieobecnych u C. jejuni , a wystêpuj¹cych w szczepie C. jejuni NCTC11168 [57]. Dodatkowo wiele genów koduj¹cych enzymy glikozylacji posiada d³ugie odcinki sk³adaj¹ce siê z jednego rodzaju nukleotydu. Tego typu struktura warunkuje zjawisko zmiennoœci fazowej, co ma odbicie we wzorze glikozylacji flagelliny. Organizacjê genów zwi¹zanych z procesami glikozylacji w ró nych szczepach Campylobacter przedstawia rys. 1. Fragment zawieraj¹cy geny odpowiedzialne za proces glikozylacji, zwany wysp¹ O-glikozylacji, zlokalizowany zosta³ nie tylko w genomie C. jejuni NCTC11168, ale i u innych szczepów Campylobacter, w s¹siedztwie genów bior¹cych udzia³ w syntezie LOS i prawdopodobnie powsta³ na drodze duplikacji tego regionu. Tak¹ hipotezê uwiarygodnia fakt istnienia w genomie C. jejuni NCTC11168 a trzech genów neub (ang. neuraminic acid), których produkty odpowiedzialne s¹ za syntezê kwasu N-acetyloneuraminowego (NANA). Wszystkie trzy komplementuj¹ mutacjê neub w komórkach E. coli, natomiast w komórkach C. jejuni jedynie mutacja w genie neub1 (cj1141), zlokalizowanym w locus biosyntezy LOS, ma wp³yw na strukturê os³on komórkowych. Mutacja w genie neub2 (cj1327) powoduje nieznaczn¹ zmianê masy cz¹steczkowej flagelliny, a mutacja w genie neub3 (cj1317) znosi zdolnoœæ do wytwarzania wici [36]. Podobnie inny gen (neua), bior¹cy udzia³ w biosyntezie NANA, obecny jest w dwóch kopiach: neua2 (cj1311) i neua3 (cj1331, ptmb) [43]. Wzajemne powi¹zania oraz czynniki reguluj¹ce specyficznoœæ produktów kilku paralogów genów bior¹cych udzia³ w syntezie NANA nie zosta³y jak dot¹d wyjaœnione. Wykazuj¹ one podobieñstwo nie tylko z genami C. coli, ale tak e E. coli i Legionella pneumophila [38, 65]. Glikozylacja flagelliny C. jejuni jest niezbêdna do prawid³owej funkcji tego bia³ka. Mutanty, u których proces glikozylacji nie przebiega prawid³owo wykazuj¹ mniejsz¹ ruchliwoœæ, co wp³ywa na przebieg przedinwazyjnych etapów infekcji. Zmiennoœæ genów koduj¹cych bia³ka aktywne w procesie glikozylacji warunkuje tak e ró norodn¹ zdolnoœæ poszczególnych szczepów do wywo³ywania zaka eñ N-glikozylacja bia³ek Campylobacter W komórkach Campylobacter flagellina nie jest jedynym bia³kiem posiadaj¹cym do³¹czon¹ cz¹steczkê glikanu. Young i wsp., analizuj¹c proteom Campylobacter

8 304 EL BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, JOANNA YCKA, KAROLINA TOMCZYK, AGNIESZKA WYSZYÑSKA z wykorzystaniem elektroforezy dwukierunkowej, zidentyfikowali ponad 30 innych bia³ek podlegaj¹cych glikozylacji i tym samym potwierdzili wczeœniejsze obserwacje œwiadcz¹ce o stosunkowo wysokiej liczbie bia³ek Campylobacter bêd¹cych akceptorami zwi¹zków cukrowych [34, 58, 64]. W odró nieniu od O-glikozylowanej flagelliny, oligomery cukrowe wi¹ ¹ siê z reszt¹ amidow¹ asparaginy motywu Asn-Xaa-Ser/Thr tych bia³ek (N-glikozylacja). Oznaczony symbolem wla zespó³ genów odpowiedzialnych za przeprowadzanie tej posttranslacyjnej modyfikacji zosta³ oryginalnie sklonowany z genomu szczepu C. jejuni [17]. Pocz¹tkowo uznano je za geny bior¹ce udzia³ w procesie syntezy LPS i warunkuj¹ce tym samym serotyp szczepów Campylobacter. Wskazywa³o na to znacz¹ce podobieñstwo sekwencji aminokwasowych kodowanych przez nie produktów do sekwencji aminokwasowych bia³ek szlaku syntezy LPS innych gramujemnych bakterii oraz zdolnoœæ wprowadzania modyfikacji w strukturze rdzenia LPS po ich przeniesieniu do komórek E. coli. Sklonowanie homologów genów wla ze szczepu C. jejuni i przeprowadzona nastêpnie szczegó³owa funkcjonalna charakterystyka ich produktów obali³a tê hipotezê. Nie odnotowano wp³ywu mutacji w analizowanych genach na strukturê LPS komórek Campylobacter. Zaobserwowano natomiast, e ich unieczynnienie wp³ywa na reaktywnoœæ wielu bia³ek C. jejuni z ludzk¹ lub królicz¹ surowic¹. Utrata immunoreaktywnoœci protein korelowa³a ze zmianami w profilu bia³ek szczepu dzikiego poddanego chemicznej deglikozylacji za pomoc¹ TFMS (kwas trifluorometanosulfonowy). Wynik ten sugerowa³, e badane geny mog¹ byæ czêœci¹ ogólnego systemu odpowiadaj¹cego za posttranslacyjn¹ glikozylacjê bia³ek [34, 58]. Geny ze szczepu C. jejuni zaanga owane w proces glikozylacji bia³ek nazwano pgl (ang. protein glycosylation). Procent identycznoœci sekwencji aminokwasowych produktów poszczególnych genów wla i pgl waha siê pomiêdzy 92 a 100% [58]. Analiza in silico potwierdzi³a ich obecnoœæ w zsekwencjonowanym genomie szczepu C. jejuni NCTC11168 [43] oraz w genomach czterech innych przedstawicieli tego rodzaju (C. jejuni RM1221, C. coli RM2228, C. lari RM2100 i C. upsaliensis RM3195) [15]. Zespó³ 15 genów o prawdopodobnie identycznej funkcji i podobnej organizacji odnaleziono metodami bioinformatycznymi w genomie Wolinella succinogenes, bakterii nale ¹cej jak Campylobacter do g-proteobacteria. Brak ich w zsekwencjonowanych genomach trzech przedstawicieli rodzaju Helicobacter (H. pylori J99, H. pylori oraz H. hepaticus) [14]. W obrêbie 17 kpz fragmentu genomu C. jejuni geny ogólnego systemu glikozylacji s¹ zorganizowane, co wykazano metod¹ RT-PCR, w dwie jednostki transkrypcyjne [58]. Region ten jest silnie konserwowany wœród szczepów czterech gatunków rodzaju Campylobacter, a jego geny, w przeciwieñstwie do genów warunkuj¹cych O-glikozylacjê, nie podlegaj¹ zjawisku zmiennoœci fazowej [12, 58]. Kluczowym w procesie N-glikozylacji okaza³ siê produkt genu pglb. Bia³ko to wykazuje znacz¹ce podobieñstwo do sekwencji aminokwasowej bia³ka STT3 (temperature-sensitive yeast protein 3) Saccharomyces cerevisiae [58, 64]. Jak wczeœniej wspomniano, STT3, bêd¹ce sk³adnikiem kompleksu transferazy oligosacharydu, odgrywa istotn¹ rolê w jego aktywnoœci katalitycznej [29, 63]. Homologi bia³ka STT3 odnajdywane u Eukarya i Archaea to zazwyczaj du e bia³ka ( aminokwasów) zawieraj¹ce, podobnie do bia³ka PglB, C-koñcow¹ domenê katalityczn¹ WWDYG [61, 63]. Fakt, e w komórkach mutanta pglb nie zachodzi glikozylacja bia³ek potwierdza, e enzym kodowany przez ten gen odpowiada za przeniesienie oligosacharydu na resztê Asn bia³ka docelowego, a wiêc formowanie wi¹zania N-glikozydowego [35, 61]. Proteina PglB jest pierwsz¹ opisan¹ bakteryjn¹ transferaz¹ jednostki oligosacharydowej, choæ w genomie Desulfovibrio desulfuricans odnaleziono bia³ko o motywach podobnych do PglB [57]. Podobieñstwo PglB do STT3 pozwoli³o stworzyæ prawdopodobny model biosyntezy glikoprotein z udzia- ³em bia³ek kodowanych przez geny pgl na wzór analogicznego modelu opracowanego dla organizmów wy- szych (rys. 2). Jego prawid³owoœæ potwierdzi³y badania przeprowadzone ostatnio przez L i n t o n a i wsp. [35]. Do komórek E. coli eksprymuj¹cych glikoproteinê PEB3 Campylobacter wprowadzono zespó³ genów pgl Cj sklonowanych na plazmidzie. Wykorzystuj¹c masow¹ spektrometriê analizowano wp³yw unieczynnienia genów systemu N-glikozylacji na strukturê grupy cukrowej do³¹czonej do bia³ka PEB3. Badania te wykaza³y, e w pierwszym etapie syntezy reszty glikanowej aktywne s¹ bia³ka PglF (dehydrataza), PglE (aminotransferaza) i PglD (acetylotransferaza). Modyfikuj¹ one UDP-HexNAc (UDP-N-acetyloheksozoamina) do postaci bacillozoaminy, która jest nastêpnie przy udziale bia³ka PglC przy³¹czana do lipidowego noœnika. Wczeœniejsze obserwacje wskazuj¹ce, e PglC katalizuje przy³¹czanie N-acetyloheksozoaminy (HexNAc), by³y wynikiem czêœciowej komplementacji przez transferazê WecA E. coli bia³ko aktywne w procesie biosyntezy LPS. Do bacillozoaminy poprzez wi¹zanie "-1,3-glikozydowe przy³¹czana jest cz¹steczka GalNAc a etap ten katalizowany jest przez produkt genu pgla. Bia³ko PglA jest homologiem kilku glikozylotransferaz aktywnych w biosyntezie LPS oraz produktu genu pgla N. meningitidis odgrywaj¹cego rolê w syntezie piliny [26]. PglH i PglJ odpowiadaj¹ za przy³¹czenie kolejnych dwóch reszt GalNAc [13, 35]. Za przy³¹czenie glukozy, bêd¹cej jedynym rozga³êzieniem omawia-

9 GLIKOZYLACJA BIA EK MIKROORGANIZMÓW RODZAJU CAMPYLOBACTER 305 Rys. 2. Model biosyntezy N-glikoprotein w komórkach Campylobacter (zmodyfikowane za [57]) Reprinted from Trends in Microbiology, vol. 11, Szymanski C.M., Logan S.M., Linton D., Wren B.W.: Campylobacter a tale of two protein glycosylation systems, p.p (2003), copyright. With permission from Elsevier. nego oligosacharydu, odpowiedzialna jest proteina PglI [35]. Nie wyjaœniono jak dot¹d, która transferaza odpowiada za do³¹czenie do reszty cukrowej dwóch terminalnych reszt GalNAc. Nieznana jest równie rola bia³ka PglG. Heptasacharyd ulega translokacji przez wewnêtrzn¹ b³onê do peryplazmy przy udziale ABC transportera WlaB (Cj1130c). Ostatnim etapem biosyntezy glikoproteiny jest przeniesienie oligosacharydu na bia³ko i utworzenie wi¹zania pomiêdzy bacillozoamin¹ a asparagin¹. Odpowiada za to wspomniane wczeœniej bia³ko PglB [34, 35, 57, 64]. Powy ej genu wlab po³o ony jest gale, który koduje UDP-galaktozo/glukozo-epimerazê. Udokumentowano jego rolê w biosyntezie LOS [16]. Poniewa w chromosomie C. jejuni NCTC jest tylko jedna kopia genu gale [43] a glikoproteiny zawieraj¹ GalNAc [34], istnia³o przypuszczenie, e produkt genu gale jest równie zaanga owany w glikozylacjê bia- ³ek. Jak wykaza³y badania L i n t o n a i wsp. efektem inaktywacji gale jest brak oligomeru cukrowego [35]. Ponad trzydzieœci bia³ek w komórkach C. jejuni ulega glikozylacji przy udziale produktów genów pgl. Kilka z nich zosta³o dok³adnie scharakteryzowanych. U ywaj¹c metod biochemicznych i immmunologicznych L i n t o n i wsp. zidentyfikowali dwa takie bia³ka: PEB3 (Cj0289c), opisane wczeœniej jako immunopozytywne bia³ko powierzchniowe [46], oraz CgpA (ang. Campylobacter glycoprotein Cj1670c). Wykazano zdolnoœæ wi¹zania bia³ek PEB3 oraz CgpA z lektyn¹ specyficzn¹ dla N-acetylogalaktozaminy SBA (ang. soybean agglutinin) [34]. Struktura N-glikanu zosta³a okreœlona w badaniach masowej spektrometrii i spektroskopii j¹drowego rezonansu magnetycznego (NMR) przez Young i wsp. Jest nim heptasacharyd GalNAc-"1,4-GalNAc-"1,4-[Glc$1,3-]GalNAc-"1,4- GalNAc-"1,4-GalNAc-"1,3-Bac-$1,N-Asn-Xaa (gdzie Bac to bacillozoamina 2,4-diacetoamido- 2,4,6-trideoksyheksoza) [64]. Wyniki tych eksperymentów zosta³y potwierdzone przez W ackera i wsp., którzy dodatkowo udokumentowali aktywnoœæ zespo³u genów pgl Campylobacter w komórkach E. coli [61]. Inne bia³ka Campylobacter przebadane pod tym k¹tem to: AcrA (Cj0367c permeaza typu RND ang. resistance-nodulation-cell division), CjaC/HisJ (bia³ko wi¹ ¹ce histydynê), CjaA/Cj0982c (bia³ko wi¹ ¹ce glutaminê) oraz Cjp3 (bia³ko kodowane przez gen plazmidu pvir, homolog VirB10 Agrobacterium tumefaciens sk³adnika systemu transportu typu IV) [2, 31, 44, 45, 61, 62]. Wystêpowanie motywu Asn-Xaa-Ser/Thr jest warunkiem koniecznym, ale niewystarczaj¹cym do zajœcia procesu N-glikozylacji, co wykazano na drodze specyficznej co do miejsca mutagenezy, zamieniaj¹c asparaginê motywu Asn-Xaa-Ser/Thr na inny aminokwas. I tak w przypadku bia³ek AcrA i VirB10, spoœród piêciu miejsc zawieraj¹cych kanoniczn¹ sekwencjê Asn-Xaa-Ser/Thr, tylko dwa s¹ akceptorami glikanu [31, 42]. Podobnie z dwu motywów glikozylacji obecnych w bia³ku HisJ C. jejuni tylko jeden jest modyfikowany przez przy³¹czenie oligosacharydu [42, A. W yszyñska niepublikowane dane]. Czasami podlegaj¹ce glikozylacji bia³ka Campylobacter posiadaj¹ ró n¹ w zale noœci od gatunku liczbê potencjalnych miejsc przy³¹czania oligasacharydu (Wyszyñska niepublikowane dane). Dodatkowo,

10 306 EL BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, JOANNA YCKA, KAROLINA TOMCZYK, AGNIESZKA WYSZYÑSKA identycznie jak w komórkach Eukarya obecnoœæ proliny w miejscu seryny/treoniny sekwencji aminokwasowej Asn-Xaa-Ser/Thr uniemo liwia do³¹czenie oligosacharydu [42]. Wiêkszoœæ glikoprotein Campylobacter to bia³ka zawieraj¹ce w sekwencji sygna³owej motyw charakterystyczny dla prekursorów lipoprotein. Niektóre, jak wykazano metod¹ frakcjonowania komórek, s¹ zakotwiczone w b³onie wewnêtrznej komórki [42, 62]. Proces N-glikozylacji w komórkach Campylobacter najprawdopodobniej zachodzi w przestrzeni peryplazmatycznej. W wypadku bia³ka AcrA zamiana sekwencji sygna³owej charakterystycznej dla prekursorów lipoprotein na sekwencjê sygna³ow¹ bia³ek peryplazmatycznych nie mia³a wp³ywu na jego glikozylacjê. Odwrotnie, usuniêcie sekwencji sygna³owej, skutkuj¹ce cytoplazmatyczn¹ lokalizacj¹ AcrA ca³kowicie znosi³o przy³¹czanie oligosacharydu [42]. Konsekwencje modyfikacji bia³ek, wynikaj¹ce z aktywnoœci genów pgl, dla procesu patogenezy s¹ ró norodne. Badania z surowicami ludzkimi dowodz¹, e reszty cukrowe bia³ek odgrywaj¹ prawdopodobnie kluczow¹ rolê w odpowiedzi immunologicznej gospodarza, byæ mo e istotniejsz¹ ni rdzeñ bia³kowy. Zaobserwowano, e surowica pobrana od ludzi zainfekowanych zmutowanym C. jejuni niezdolnym do glikozylacji bia³ek reaguje z mniejsz¹ liczb¹ bia³ek patogenu, ni ta pobrana od pacjentów zaka onych szczepem dzikim [58]. Glikozylacyjna modyfikacja bia³ek mo e równie stanowiæ czynnik ochronny szczepów Campylobacter przed specyficznymi mechanizmami obronnymi ustroju, w którym te patogeny bytuj¹. Inaktywacja genu pglb skutkuje znacz¹cym obni eniem poziomu adhezji i inwazji do komórek eukaryotycznych w eksperymentach in vitro a tak e zredukowaniem zdolnoœci patogenu do kolonizacji jelit myszy i, bêd¹cych g³ównym rezerwuarem mikroorganizmu jelit kurcz¹t [27, 56]. Dodatkowo, brak glikozylacji bia³ka Cjp3, sk³adnika systemu transportu typu IV, w znacz¹cy sposób redukuje zdolnoœæ komórek do pobierania obcego DNA w procesie transformacji, co obni a ró norodnoœæ populacji bakteryjnej [31]. 4. Podsumowanie Choæ procesy posttranslacyjnej modyfikacji bia³ek Campylobacter zidentyfikowano stosunkowo niedawno iloœæ informacji opisuj¹cych warunkuj¹ce genetyczne mechanizmy tego zjawiska wzrasta stosunkowo szybko. Wiele aspektów tych zagadnieñ nadal jednak pozostaje niezrozumia³ych. Dalszych badañ wymaga charakterystyka systemu O-glikozylacji, a w szczególnoœci wyjaœnienie roli wysokiego polimorfizmu genetycznego regionu chromosomu zawieraj¹cego geny uwik³ane w tym procesie. Zsekwencjonowanie genomów czterech nastêpnych przedstawicieli rodzaju Campylobacter niew¹tpliwie dostarczy interesuj¹cych danych i umo liwi przeprowadzenie porównawczych analiz. Zespó³ genów pgl Campylobacter obecny jest w genomie bakterii rodzaju Wolinella, ale brak go w genomach zsekwencjonowanych przedstawicieli rodzaju Helicobacter. Fakt ten sugeruje istotn¹ rolê procesu glikozylacji w adaptacji mikroorganizmów do ró nych œrodowisk. Z trzech rodzajów nale ¹cych do g-proteobacteria tylko Helicobacter kolonizuje œciœle okreœlon¹ niszê ekologiczn¹. Jak dot¹d znana jest rola zaledwie kilku bia³ek podlegaj¹cych N-glikozylacji, choæ wiadomo, e unieczynnienie tego procesu ma znacz¹cy wp³yw na ró norodne aspekty patogenezy i w znacz¹cy sposób obni a wirulencjê patogenu. Ca³kowicie niewyjaœnione pozostaj¹ tak e mechanizmy reguluj¹ce modyfikacjê bia³ek Campylobacter. Piœmiennictwo 1. Alm R.A., Guerry P., Power M.E., Trust T.J.: Variation in antigenicity and molecular weight of Campylobacter coli VC167 flagellin in different genetic backgrounds. J. Bacteriol. 174, (1992) 2. Bacon D.J., Alm R.A., Hu L., Hickey T.E., Ewing C.P., Batchelor R.A., Trust T.J., Guerry P.: DNA sequence and mutational analyses of the pvir plasmid of Campylobacter jejuni Infect. Immun. 70, (2002) 3. Benz I., Schmidt M.A.: Glycosylation with heptose residues mediated by the aah gene product is essential for adherence of the AIDA-I adhesin. Mol. Microbiol. 40, (2001) 4. Benz I., Schmidt M.A.: Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Mol. Microbiol. 45, (2002) 5. Brimer C.D., Montie T.C.: Cloning and comparison of flic genes and identification of glycosylation in the flagellin of Pseudomonas aeruginosa a-type strains. J. Bacteriol. 180, (1998) 6. Castric P.: pilo, a gene required for glycosylation of Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin. Microbiology, 141, (1995) 7. Castric P., Cassels F.J., Carlson R.W.: Structural characterization of the Pseudomonas aeruginosa 1244 pilin glycan. J. Biol. Chem. 276, (2001) 8. Chia J.S., Chang L.Y., Shun C.T., Chang Y.Y., Tsay Y.G., Chen J.Y.: A 60-kilodalton immunodominant glycoprotein is essential for cell wall integrity and the maintenance of cell shape in Streptococcus mutans. Infect. Immun. 69, (2001) 9. Creuzenet C., Schur M.J., Li J., Wakarchuk W.W., Lam J.S.: FlaA1, a new bifunctional UDP-GlcNAc C6 dehydratase/c4 reductase from Helicobacter pylori. J. Biol. Chem. 275, (2000) 10. Dobos K.M., Khoo K.H., Swiderek K.M., Brennan P.J., Belisle J.T.: Definition of the full extent of glycosylation of the 45-kilodalton glycoprotein of Mycobacterium tuberculosis. J. Bacteriol. 178, (1996) 11. Doig P., Kinsella N., Guerry P., Trust T.J.: Characterization of a post-translational modification of Campylobacter flagel-

11 GLIKOZYLACJA BIA EK MIKROORGANIZMÓW RODZAJU CAMPYLOBACTER 307 lin: identification of a sero-specific glycosyl moiety. Mol. Microbiol. 19, (1996) 12. Dorrell N., Wren B.W. i wsp.: Whole genome comparison of Campylobacter jejuni human isolates using a low-cost microarray reveals extensive genetic diversity. Genome Res. 11, (2001) 13. Endo T. i wsp.: Alpha-1,4-N-acetylgalactosamine transferase gene and process for producing this enzyme and N-acetylgalactosamine-containing complex carbohydrate. Patent: WO A (2002) 14. Eppinger M., Baar C., Raddatz G., Huson D.H., Schuster S.C.: Comparative analysis of four Campylobacterales. Nat. Rev. Microbiol. 2, (2004) 15. Fouts D.E., Nelson K.E. i wsp.: Major structural differences and novel potential virulence mechanisms from the genomes of multiple Campylobacter species. PLoS Biol. (2005) in process 16. Fry B.N., Feng S., Chen Y.Y., Newell D.G., Coloe P.J., Korolik V.: The gale gene of Campylobacter jejuni is involved in lipopolysaccharide synthesis and virulence. Infect. Immun. 68, (2000) 17. Fry B.N., Korolik V., ten Brinke J.A., Pennings M.T., Zalm R., Teunis B.J., Coloe P.J., van der Zeijst B.A.: The lipopolysaccharide biosynthesis locus of Campylobacter jejuni Microbiology, 144, (1998) 18. Garbe T., Harris D., Vordermeier M., Lathigra R., Ivanyi J., Young D.: Expression of the Mycobacterium tuberculosis 19-kilodalton antigen in Mycobacterium smegmatis: immunological analysis and evidence of glycosylation. Infect. Immun. 61, (1993) 19. Ge Y., Li C., Corum L., Slaughter C.A., Charon N.W.: Structure and expression of the FlaA periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi. J. Bacteriol. 180, (1998) 20. Goon S., Kelly J.F., Logan S.M., Ewing C.P., Guerry P.: Pseudaminic acid, the major modification on Campylobacter flagellin, is synthesized via the cj1293 gene. Mol. Microbiol. 50, (2003) 21. Guerry P., Alm R.A., Szymanski C., Trust T.J.: Structure, function, and antigenicity of Campylobacter flagella. (w) Campylobacter, 2nd edition, red. I. Nachamkin, M.J. Blaser, ASM Press, Washington DC, 2000, s Guerry P., Doig P., Alm R.A., Burr D.H., Kinsella N., Trust T.J.: Identification and characterization of genes required for post-translational modification of Campylobacter coli VC167 flagellin. Mol. Microbiol. 19, (1996) 23. Hahn H.P.: The type-4 pilus is the major virulence-associated adhesin of Pseudomonas aeruginosa a review. Gene, 192, (1997) 24. Helenius A., Aebi M.: Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73, (2004) 25. Hendrixson D.R., DiRita V.J.: Transcription of F 54 -dependent but not F 28 -dependent flagellar genes in Campylobacter jejuni is associated with formation of the flagellar secretory apparatus. Mol. Microbiol. 50, (2003) 26. Jennings M.P., Virji M., Evans D., Foster V., Srikhanta Y.N., Steeghs L., van der Ley P., Moxon E.R.: Identification of a novel gene involved in pilin glycosylation in Neisseria meningitidis. Mol. Microbiol. 29, (1998) 27. Karlyshev A.V., Everest P., Linton D., Cawthraw S., Newell D.G., Wren B.W.: The Campylobacter jejuni general glycosylation system is important for attachment to human epithelial cells and in the colonization of chicks. Microbiology, 150, (2004) 28. Karlyshev A.V., Linton D., Gregson N.A., Wren B.W.: A novel paralogous gene family involved in phase-variable flagella-mediated motility in Campylobacter jejuni. Microbiology, 148, (2002) 29. Kelleher D.J., Karaoglu D., Mandon E.C., Gilmore R.: Oligosaccharyltransferase isoforms that contain different catalytic STT3 subunits have distinct enzymatic properties. Mol. Cell, 12, (2003) 30. Knauer R., Lehle L.: The oligosaccharyltransferase complex from yeast. Biochim. Biophys. Acta, 1426, (1999) 31. Larsen J.C., Szymanski C., Guerry P.: N-linked protein glycosylation is required for full competence in Campylobacter jejuni J. Bacteriol. 186, (2004) 32. Leclerc G., Wang S.P., Ely B.: A new class of Caulobacter crescentus flagellar genes. J. Bacteriol. 180, (1998) 33. Lindenthal C., Elsinghorst E.A.: Enterotoxigenic Escherichia coli TibA glycoprotein adheres to human intestine epithelial cells. Infect. Immun. 69, (2001) 34. Linton D., Allan E., Karlyshev A.V., Cronshaw A.D., Wren B.W.: Identification of N-acetylgalactosamine-containing glycoproteins PEB3 and CgpA in Campylobacter jejuni. Mol. Microbiol. 43, (2002) 35. Linton D., Dorrell N., Hitchen G., Amber S., Karlyshev A.V., Morris H.R., Dell A., Valvano M. A., Aebi M., Wren B.W.: Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Mol. Microbiol. 55, (2005) 36. Linton D., Karlyshev A.V., Hitchen P.G., Morris H.R., Dell A., Gregson N.A., Wren B.W.: Multiple N-acetyl neuraminic acid synthetase (neub) genes in Campylobacter jejuni: identification and characterization of the gene involved in sialylation of lipo-oligosaccharide. Mol. Microbiol. 35, (2000) 37. Logan S.M., Kelly J.F., Thibault P., Ewing C.P., Guerry P.: Structural heterogeneity of carbohydrate modifications affects serospecificity of Campylobacter flagellins. Mol. Microbiol. 46, (2002) 38. Luneberg E., Zetzmann N., Alber D., Knirel Y.A., Kooistra O., Zahringer U., Frosch M.: Cloning and functional characterization of a 30 kb gene locus required for lipopolysaccharide biosynthesis in Legionella pneumophila. Int. J. Med. Microbiol. 290, (2000) 39. Marceau M., Forest K., Beretti J.L., Tainer J., Nassif X.: Consequences of the loss of O-linked glycosylation of meningococcal type IV pilin on piliation and pilus-mediated adhesion. Mol. Microbiol. 27, (1998) 40. Mescher M.F., Strominger J.L., Watson S.W.: Protein and carbohydrate composition of the cell envelope of Halobacterium salinarium. J. Bacteriol. 120, (1974) 41. Moormann C., Benz I., Schmidt M.A.: Functional substitution of the TibC protein of enterotoxigenic Escherichia coli strains for the autotransporter adhesin heptosyltransferase of the AIDA system. Infect. Immun. 70, (2002) 42. Nita-Lazar M., Wacker M., Schegg B., Amber S., Aebi M.: The N-X-S/T consensus sequence is required but not sufficient for bacterial N-linked protein glycosylation. Glycobiology, 15, (2005) 43. Parkhill J. Barrell B.G. i wsp.: The genome sequence of the food-borne pathogen Campylobacter jejuni reveals hypervariable sequences. Nature, 403, (2000) 44. Pawelec D., Jakubowska-Mroz J., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Campylobacter jejuni 72Dz/92 cjac gene coding 28 kda

12 308 EL BIETA KATARZYNA JAGUSZTYN-KRYNICKA, JOANNA YCKA, KAROLINA TOMCZYK, AGNIESZKA WYSZYÑSKA immunopositive protein, a homologue of the solute-binding components of the ABC transport system. Lett. Appl. Microbiol. 26, (1998) 45. Pawelec D., Rozynek E., Popowski J., Jagusztyn-Krynicka E.K.: Cloning and characterization of a Campylobacter jejuni 72Dz/92 gene encoding a 30 kda immunopositive protein, component of the ABC transport system; expression of the gene in avirulent Salmonella typhimurium. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 19, (1997) 46. Pei Z.H., Ellison R.T. 3rd, Blaser M.J.: Identification, purification, and characterization of major antigenic proteins of Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 266, (1991) 47. Power M.E., Guerry P., McCubbin W.D., Kay C.M., Trust T.J.: Structural and antigenic characteristics of Campylobacter coli FlaA flagellin. J. Bacteriol. 176, (1994) 48. Power P.M., Jennings M.P.: The genetics of glycosylation in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 218, (2003) 49. Rudd P.M., Elliott T., Cresswell P., Wilson I.A., Dwek R.A.: Glycosylation and the immune system. Science, 291, (2001) 50. Schaffer C., Messner P.: Glycobiology of surface layer proteins. Biochimie, 83, (2001) 51. Schirm M., Soo E.C., Aubry A.J., Austin J., Thibault P., Logan S.M.: Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Mol. Microbiol. 48, (2003) 52. Schmidt M.A., Riley L.W., Benz I.: Sweet new world: glycoproteins in bacterial pathogens. Trends Microbiol. 11, (2003) 53. Sleytr U.B., Thorne K.J.: Chemical characterization of the regularly arranged surface layers of Clostridium thermosaccharolyticum and Clostridium thermohydrosulfuricum. J. Bacteriol. 126, (1976) 54. Stephenson A.E., Wu H., Novak J., Tomana M., Mintz K., Fives-Taylor P.: The Fap1 fimbrial adhesin is a glycoprotein: antibodies specific for the glycan moiety block the adhesion of Streptococcus parasanguis in an in vitro tooth model. Mol. Microbiol. 43, (2002) 55. Stover C.K., Olson M.V. i wsp.: Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PA01, an opportunistic pathogen. Nature, 406, (2000) 56. Szymanski C.M., Burr D.H., Guerry P.: Campylobacter protein glycosylation affects host cell interactions. Infect. Immun. 70, (2002) 57. Szymanski C.M., Logan S.M., Linton D., Wren B.W.: Campylobacter a tale of two protein glycosylation systems. Trends Microbiol. 11, (2003) 58. Szymanski C.M., Yao R., Ewing C.P., Trust T.J., Guerry P.: Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Mol. Microbiol. 32, (1999) 59. Thibault P., Logan S.M., Kelly J.F., Brisson J.R., Ewing C.P., Trust T.J., Guerry P.: Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. J. Biol. Chem. 276, (2001) 60. Virji M.: Post-translational modifications of meningococcal pili. Identification of common substituents: glycans and alphaglycerophosphate a review. Gene, 192, (1997) 61. Wacker M., Aebi M. i wsp.: N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science, 298, (2002) 62. Wyszyñska A.: Rekombinowana Salmonella jako szczepionka anty-salmonella/campylobacter funkcjonalna charakterystyka genu cjaa (cj0982c) Campylobacter. Praca doktorska, Uniwersytet Warszawski (2004) 63. Yan Q., Lennarz W.J.: Studies on the function of oligosaccharyl transferase subunits. Stt3p is directly involved in the glycosylation process. J. Biol. Chem. 277, (2002) 64. Young N.M., Szymanski C.M. i wsp.: Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gramnegative bacterium, Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 277, (2002) 65. Zapata G., Vann W.F., Aaronson W., Lewis M.S., Moos M.: Sequence of the cloned Escherichia coli K1 CMP-N-acetylneuraminic acid synthetase gene. J. Biol. Chem. 264, (1989) Wk³ad pracy w przygotowaniu publikacji obu autorek J. yckiej i K. Tomczyk jest identyczny.

13 POST. MIKROBIOL., 2005, 44, 4, STRATEGIE IDENTYFIKACJI BAKTERYJNYCH CZYNNIKÓW WIRULENCJI Adrianna Raczkowska*, Mariusz ak, Katarzyna Brzostek Zak³ad Mikrobiologii Stosowanej, Instytut Mikrobiologii, Wydzia³ Biologii, Uniwersytet Warszawski ul. Miecznikowa 1, Warszawa, tel. (022) , * araczko@biol.uw.edu.pl Wp³ynê³o w czerwcu 2005 r. 1. Wstêp. 2. Metody biochemiczne w poszukiwaniu i charakterystyce bakteryjnych czynników wirulencji Metoda chemicznej modyfikacji Metoda zymografii Metoda tworzenia kompleksu receptor/ligand Metoda immunologiczna Metoda hybrydyzacji odejmowanej Metoda prezentacji zró nicowañ. 3. Genetyczne innowacje uzupe³niaj¹ce klasyczne, biochemiczne metody Prezentacja na fagu System dwuhybrydowy. 4. Metody identyfikacji genów wirulencji aktywnych in vivo Technologia ekspresji genów in vivo Metoda fluorescencyjna indukcji zró nicowañ Metoda mutagenizacji z zastosowaniem tzw. etykietki Metoda analizy i mapowania genomu in vivo. 5. Podsumowanie Strategies of identification of bacterial virulence factors Abstract: Strategies to identify bacterial virulence factors are important tools in discovering the mechanisms of bacterial pathogenesis. Classical methods focus on the biochemical properties of the virulence proteins. However, modern identification strategies are more and more often a combination of biochemical, genetic and genomic techniques. The sequencing of next genomes of bacterial pathogens and biotechnological progress enable the development of new methods, such as DNA chip and microarray technologies, IVET, STM or GAMBIT strategy, which will facilitate the identification of virulence factors. It is likely that many of the genes that are involved in pathogenicity will soon be discovered, thus elucidating the actual functions of bacterial virulence factors during infection of the human host. 1. Introduction. 2. Biochemical methods in searching and characterizing of bacterial virulence factors Chemical modification screens Zymography Receptor/ligand affinity screens Immunological methods Subtractive hybridization Differential display. 3. Classical, biochemical methods combined with genetic screens Phage display Two-hybrid system. 4. Methods for identification of virulence genes activated in vivo In vivo expression technology Differential fluorescence induction Signature-tagged mutagenesis Genomic analysis and mapping by in vitro transposition. 5. Summary S³owa kluczowe: czynniki wirulencji, GAMBIT, IVET, metoda ReTagging, SSH Key words: virulence factors, GAMBIT, IVET, ReTagging method, SSH 1. Wstêp W zwi¹zku z narastaniem opornoœci bakterii na antybiotyki oraz z powodu nawrotu starych chorób zakaÿnych, jak np. gruÿlica, wiele oœrodków badawczych intensywnie bada procesy patogenezy drobnoustrojów. Szczegó³owe poznanie wszystkich etapów infekcji mo e doprowadziæ do opracowania nowych, alternatywnych sposobów leczenia i walki z chorobotwórczymi mikroorganizmami. Badania te nabra³y szczególnego tempa po wprowadzeniu nowych technik pozwalaj¹cych na charakterystykê cech patogennoœci bakterii w warunkach in vivo, takich jak IVET, STM czy GAMBIT. Intensywny rozwój biologii molekularnej umo liwi³ narodziny nowej dziedziny nauki tj. genomiki. Opracowanie szybkich i wydajnych metod sekwencjonowania umo liwi³o dostêp do pe³nej informacji genetycznej mikroorganizmów. Rosn¹ca liczba znanych sekwencji genomowych pozwoli³a na badanie ewolucji bakterii, rozwój biotechnologii oraz na poznanie mechanizmów patogenezy. Dysponowanie tak¹ wiedz¹ daje mo liwoœæ syntezy nowych leków lub sk³adników skuteczniejszych i bezpieczniejszych szczepionek [18]. Pierwsz¹ poznan¹, pe³n¹ sekwencj¹ genomu by³a sekwencja Haemophilus influenzae, któr¹ opublikowano w roku 1995 [31]. Od tego czasu liczba poznanych, kolejnych sekwencji znacznie wzros³a i obecnie wynosi 164, z czego wiêkszoœæ to genomy bakterii patogennych. Rozwój bioinformatyki pozwala na trafniejsze przewidywanie funkcji wielu genów i racjonalniejsze projektowanie programów badawczych. Pojawienie siê nowych technologii tj. wykorzystanie mikropaneli pozwoli³o w jednym eksperymencie zidentyfikowaæ wszystkie geny organizmu ulegaj¹ce ekspresji w danych warunkach. Osi¹gniêcia kilku ostatnich lat umo - liwi³y dokonanie znacznego postêpu w zg³êbianiu procesów patogenezy jak równie daj¹ ogromne nadzieje na poznanie kolejnych, nowych czynników wirulencji, a co za tym idzie opracowanie nowych strategii w walce z chorobotwórczymi mikroorganizmami. Badanie mechanizmów bakteryjnej patogenezy i udzia³ czynników wirulencji w tym procesie znajduje

14 310 ADRIANNA RACZKOWSKA, MARIUSZ AK, KATARZYNA BRZOSTEK siê w centrum zainteresowañ wielu mikrobiologów i fizjologów, a tak e biologów molekularnych. Wykorzystywane klasyczne metody badañ opiera³y siê na tradycyjnej biochemii. Nowe osi¹gniêcia biologii molekularnej umo liwi³y monitorowanie ekspresji genów wirulencji w warunkach in vivo, co w wielu przypadkach zaowocowa³o identyfikacj¹ nowych genów zjadliwoœci. Przygotowana praca ma na celu przedstawienie starych klasycznych ju metod oraz tych zupe³nie nowych, opracowanych dziêki osi¹gniêciom in ynierii genetycznej. 2. Metody biochemiczne w poszukiwaniu i charakterystyce bakteryjnych czynników wirulencji Biochemiczne metody umo liwiaj¹ce identyfikacjê bakteryjnych czynników wirulencji wykorzystuj¹ w³aœciwoœci enzymatyczne bia³ek lub mechanizm oddzia- ³ywañ pomiêdzy bia³kami wirulencji patogena a bia³kami gospodarza. Metody te uzupe³niono technikami badaj¹cymi interakcjê innych makromoleku³ tj. DNA w hybrydyzacji nici komplementarnych. Podstawowym warunkiem do zastosowania najprostszych metod biochemicznych w identyfikacji czynników zjadliwoœci jest wykazanie aktywnoœci enzymatycznej lub toksycznej badanego bia³ka wirulencji, któr¹ to aktywnoœæ mo na odpowiednio oznaczyæ w warunkach in vivo lub in vitro. Przyk³adem tego typu bia³ka jest pneumolizyna Streptococcus pneumoniae. W wyniku dzia³ania pneumolizyny dochodzi do lizy czerwonych komórek krwi ssaków (RBCs), co mo na zaobserwowaæ w postaci stref przejaœnienia dooko³a kolonii S. pneumoniae rosn¹cych na pod³o u zawieraj¹cym RBCs. Wykrycie tej aktywnoœci umo liwi³o oczyszczenie, a nastêpnie scharakteryzowanie pneumolizyny [35]. Poznanie aktywnoœci enzymatycznych bia³ek mo e równie pos³u yæ jako narzêdzie w poszukiwaniach ich roli w procesie patogenezy. Jednym z g³ównych czynników wirulencji rodzaju Yersinia jest bia³ko YopH bêd¹ce fosfataz¹ tyrozynow¹ [7]. Poznanie aktywnoœci enzymatycznej bia³ka YopH pozwoli³o na wysuniêcie hipotezy wskazuj¹cej na istnienie interakcji pomiêdzy patogenem a gospodarzem, polegaj¹cej na modyfikowaniu szlaków fosforylacji bior¹cych udzia³ w przekazywaniu sygna³u w komórkach organizmu gospodarza. Czysto biochemiczne metody poszukiwania nowych czynników wirulencji bakterii maj¹ swoje zalety, poniewa niektóre mikroorganizmy trudno poddaæ wszelkiego rodzaju manipulacjom genetycznym. Ponadto niektóre czynniki wirulencji s¹ bakteriom niezbêdne do ycia zarówno w warunkach in vivo jak i in vitro, w zwi¹zku z tym nie zosta³yby wykryte przy zastosowaniu wy³¹cznie metod mutagenizacji. Istniej¹ równie powa ne ograniczenia w stosowaniu metod biochemicznych. W przypadku czynników wirulencji o nieznanej funkcji enzymatycznej pojawia siê problem doboru metody oznaczenia tej aktywnoœci Metoda chemicznej modyfikacji Jednym ze sposobów poszukiwania czynników odpowiedzialnych za proces patogenezy jest przeprowadzenie chemicznej modyfikacji struktur powierzchniowych komórki bakteryjnej za pomoc¹ reagentów nie przenikaj¹cych do wnêtrza komórki. Metoda ta pozwala nie tylko wyznakowaæ dany czynnik zlokalizowany na powierzchni, ale równie pomaga w jego póÿniejszym oczyszczeniu. Polega ona na dzia³aniu na komórki bakteryjne biotyn¹ lub radioaktywnym reagentem, a nastêpnie rozdziale elektroforetycznym wyizolowanych bia³ek powierzchniowych. Bia³ka po³¹czone z radioaktywn¹ cz¹steczk¹ mog¹ byæ uwidaczniane poprzez wykonanie autoradiogramu, natomiast te po- ³¹czone z biotyn¹ s¹ oczyszczane za pomoc¹ streptoawidyny. Metoda ta zosta³a zastosowana w badaniach bia³ek powierzchniowych Bartonella henselae [8]. Podstawow¹ zalet¹ tej procedury jest fakt, e nie trzeba nic wiedzieæ na temat danego czynnika z wyj¹tkiem tego, e faktycznie tam siê znajduje. G³ówne ograniczenie wynika natomiast z faktu, i nie wszystkie czynniki wirulencji s¹ zlokalizowane na powierzchni komórki bakteryjnej, w zwi¹zku z tym wielu z nich t¹ metod¹ nie mo na wykryæ Metoda zymografii Zymografia jest kolejn¹ technik¹ identyfikacji bakteryjnych czynników wirulencji, które wykazuj¹ aktywnoœæ enzymatyczn¹. Wiele proteaz pochodzenia bakteryjnego zaanga owana jest w proces degradacji bia³ek b³onowych komórek gospodarza. Taka dzia³alnoœæ enzymatyczna czêsto towarzyszy patogenowi podczas infekcji i pozwala w wielu przypadkach na unikniêcie odpowiedzi immunologicznej ze strony organizmu gospodarza. Zymografia polega na elektroforetycznym rozdziale interesuj¹cej nas grupy bakteryjnych bia³ek, a nastêpnie wizualnej identyfikacji ich enzymatycznej aktywnoœci. W celu wykonania oznaczenia t¹ metod¹ przygotowuje siê denaturuj¹cy el poliakrylamidowy zawieraj¹cy równomiernie rozmieszczony substrat dla enzymu, w przypadku wykrywania dzia³alnoœci proteolitycznej mo e nim byæ kazeina. Nastêpnie w tak przygotowanym elu rozdziela siê badan¹ grupê bia³ek. Kolejnym krokiem jest zrenaturowanie rozdzielonych polipeptydów poprzez usuniêcie czynnika denaturuj¹cego, a nastêpnie inkubacja elu w odpowiednich warunkach w celu wznowienia aktywnoœci enzymatycznej. Ostatnim etapem jest bar-

15 STRATEGIE IDENTYFIKACJI BAKTERYJNYCH CZYNNIKÓW WIRULENCJI 311 wienie elu np. b³êkitem Coomasie, który barwi bia³ko substratowe w elu na niebiesko. Obecnoœæ przejaœnieñ bêdzie wskazywa³a na brak substratu w danym miejscu elu, co mo e byæ jedynie skutkiem obecnoœci aktywnych enzymów proteolitycznych, które usunê³y substrat z tego fragmentu elu. Oznaczone w ten sposób proteazy mog¹ byæ w kolejnym etapie wyizolowane z elu i poddane dalszym badaniom. Ró ne odmiany i modyfikacje tej metody pozwalaj¹ na oznaczanie nie tylko aktywnoœci proteolitycznej. Praktyczne zastosowanie zymografii zaowocowa³o identyfikacj¹ hemolizyny produkowanej przez Prevotella melaninogenica [3], hydrolazy mureiny Staphylococcus aureus [19] oraz inhibitora dekstranazy S. sobrinus [37]. Modyfikacje opisanej metody pozwalaj¹ wprawdzie na wykrywanie ró nego rodzaju aktywnoœci enzymatycznej czynników wirulencji, jednak e istniej¹ pewne ograniczenia i bariery, których jak dot¹d nie pokonano. Otó niektóre enzymy bior¹ce udzia³ w procesie patogenezy nie s¹ produkowane w warunkach in vitro b¹dÿ wystêpuj¹ w formie nieaktywnej, lub te brakuje znanych substratów dla tych czynników, co wynika z ich wysokiej specyficznoœci. Wymagana jest równie w tej metodzie w³aœciwoœæ renaturacji enzymu po usuniêciu z elu czynnika denaturuj¹cego. Problem braku takiej zdolnoœci mo na rozwi¹zaæ poprzez przeprowadzenie elektroforezy w warunkach niedenaturuj¹cych, ma to jednak negatywne skutki na dok³adnoœæ rozdzia³u. Równie problemem mo e staæ siê rachunek ekonomiczny, gdy u ycie znacznej iloœci substratu w przypadku rozdzia³u na du ym elu mo e nieœæ ze sob¹ bardzo powa ne koszty Metoda tworzenia kompleksu receptor/ligand Wiele bakterii chorobotwórczych na pierwszym etapie infekcji wi¹ e siê do komórek atakowanego organizmu, jak równie produkuje specyficzne czynniki powierzchniowe, które w aktywny sposób oddzia³uj¹ z komponentami b³ony komórki eukariotycznej. Obserwacje tych interakcji by³y podstaw¹ do opracowania metody identyfikacji tych czynników wirulencji, które bior¹ udzia³ w tworzeniu kompleksu receptor/ligand. W celu wykonania analizy t¹ metod¹ nale y wyizolowaæ wszystkie bia³ka danego mikroorganizmu, a nastêpnie rozdzieliæ w denaturuj¹cym elu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Kolejnym krokiem jest renaturacja rozdzielanych polipeptydów w celu przywrócenia ich struktury III-rzêdowej, która jest niezwykle istotna w tworzeniu siê kompleksu receptor/ligand. Bia³ka przenosi siê dalej na membranê, przemywa roztworem zawieraj¹cym wyznakowany radioaktywnie ligand gospodarza, a nastêpnie wykonuje siê autoradiogram. T¹ metod¹ zidentyfikowano m. in. adhezynê Streptococcus pyogenes [41]. Ostatni¹ innowacj¹ metody tworzenia kompleksu receptor/ligand jest metoda ReTagging, która wykorzystuje aktywowany promieniami UV czynnik sieciuj¹cy przy³¹czaj¹cy cz¹steczkê biotyny do bakteryjnego receptora, gdy ten wejdzie w kontakt z ligandem gospodarza (Rys. 1). Ligand i czynnik sieciuj¹cy s¹ kowalencyjnie zwi¹zane z pod³o em takim jak albumina. Na wolnym koñcu czynnika sieciuj¹cego znajduje siê reaguj¹ca pod wp³ywem œwiat³a grupa arylowo-azydkowa. Po powstaniu kompleksu receptor/ligand, a nastêpnie dzia³aniu promieni UV czynnik sieciuj¹cy wi¹ e siê do receptora. Kolejnym etapem jest redukcja mostka dwusiarczkowego, czego skutkiem jest od³¹czenie czynnika sieciuj¹cego od albuminy. Ostatnim etapem jest dysocjacja kompleksu receptor/ligand. Od³¹czony receptor zawiera przy³¹czon¹ cz¹steczkê biotyny. Kompleks ten jest nastêpnie oczyszczany na pod³o u ze streptoawidyn¹, która posiada zdolnoœæ wi¹zania cz¹stek zwi¹zanych z biotyn¹. Taki receptor mo e byæ dalej poddany badaniom biochemicznym jak i genetycznym [23]. Zalet¹ tej metody jest mo liwoœæ oczyszczania receptorów z du ¹ wydajnoœci¹. Jej skutecznoœæ jest jednak ograniczona w przypadku polipeptydów powierzchniowych wystêpuj¹cych w ma³ej iloœci w os³onach bakteryjnych Metoda immunologiczna Poniewa wiele bakterii patogennych podczas infekcji zaburza dzia³anie systemu odpornoœciowego organizmu gospodarza opracowano kilka metod identyfikacji czynników wirulencji wp³ywaj¹cych na odpowiedÿ immunologiczn¹ gospodarza. Strategie te wykorzystuj¹ zdolnoœæ przeciwcia³ do ochrony gospodarza przed infekcj¹. W celu zastosowania tej metody nale y stworzyæ bank monoklonalnych przeciwcia³ (MAb) skierowanych przeciwko antygenom eksponowanym na powierzchni badanej bakterii. Nastêpnie ka dy MAb jest testowany pod wzglêdem zdolnoœci do ochrony gospodarza przed infekcj¹. Zahamowanie procesu patogenezy przez przeciwcia³o jest wynikiem jego wi¹zania siê z czynnikiem wirulencji i blokowania jego funkcji. MAb bior¹ udzia³ w procesie opsonizacji, co prowadzi nastêpnie do poch³aniania przez neutrofile mikroorganizmów, do których przy³¹czone jest przeciwcia³o lub czynnik C3b dope³niacza. Aby zapobiec temu procesowi do oznaczeñ stosuje siê fragmenty przeciwcia³ (fragmenty Fab), które skutecznie blokuj¹ powierzchniowe antygeny. Posiadaj¹c konkretne przeciwcia³a mo na u yæ je do oczyszczenia czynnika, którego funkcja zostaje zablokowana. Identyfikacjê mo na wykonaæ poprzez elektroforetyczny rozdzia³ bia³ek b³onowych, a nastêpnie wykonanie analizy Western Blot. Metoda ta by³a skutecznie wykorzystana do identyfikacji

16 312 ADRIANNA RACZKOWSKA, MARIUSZ AK, KATARZYNA BRZOSTEK Legenda Ligand Powstawanie kompleksu receptor/ligand NHS Mostek dwusiarczkowy Wielofunkcyjny czynnik sieciuj¹cy Biotyna Grupa azylowo-azydkowa Receptor Przy³¹czenie czynnika sieciuj¹cego do receptora pod wp³ywem promieni UV Redukcja mostków dwusiarczkowych, dysocjacja kompleksu receptor/ligand Rys. 1. Schemat metody ReTagging wg C a m illi i wsp. [9] bia³ka zwi¹zanego z adherencj¹ Mycobacterium tuberculosis do komórek gospodarza [22]. Zalet¹ tej metody jest mo liwoœæ oznaczenia powierzchniowych czynników wirulencji bakterii, istniej¹ jednak e pewne ograniczenia. Wiele bia³ek wirulencji nie jest eksponowanych na powierzchni komórki lub s¹ one ma³o immunogenne lub te wiele silnie immunogennych antygenów powierzchniowych nie jest czynnikami wirulencji Metoda hybrydyzacji odejmowanej W obrêbie spokrewnionych ze sob¹ gatunków bakterii sekwencje DNA ich genów s¹ ró ne, jak równie ró na jest ekspresja analogicznych genów. Wiedza ta umo liwi³a opracowanie kilku metod s³u ¹cych do badania ró nic w ekspresji genów jak równie identyfikacji indywidualnych genów dla danego szczepu patogennego. Zasada dzia³ania hybrydyzacji odejmowanej opiera siê na za³o eniu, e sekwencje DNA identyczne dla dwu szczepów bêd¹ po zdenaturowaniu i zmieszaniu ³¹czyæ siê ze sob¹ na zasadzie komplementarnoœci. W efekcie powstan¹ dupleksy zawieraj¹ce jedn¹ niæ DNA pochodz¹c¹ od szczepu patogennego (tzw. Tester ssdna ) zaœ drug¹ od szczepu niepatogennego (tzw. Driver ssdna ). Sekwencje unikalne, charakterystyczne dla danego szczepu pozostan¹ w postaci oryginalnej podwójnej helisy. Driver ssdna jest dostarczany w nadmiarze w celu upewnienia siê, e hybrydyzacja pomiêdzy identycznymi sekwencjami

17 STRATEGIE IDENTYFIKACJI BAKTERYJNYCH CZYNNIKÓW WIRULENCJI 313 Tester dsdna Trawienie enzymem restrykcyjnym Ligacja Adapter/Primer 1 Ligacja Adapter/Primer 2 Dodanie w nadmiarze trawionego Driver ds DNA, denaturacja, renaturacja Dodanie dodatkowego zdenaturowanego Driver ssdna, renaturacja Wype³nienie koñców (zarówno A, B, C i D) reakcja PCR (zarówno A, B, C i D z wype³nionymi koñcami) A i D: Brak amplifikacji B: Brak amplifikacji z powodu zapêtlenia matrycy E: amplifikacja Drugi PCR z primerami dla sekwencji unikalnych C: liniowa amplifikacja Rys. 2. Schemat metody SSH wg C a m illi i wsp. [9] zajdzie ze 100%-ow¹ wydajnoœci¹. Driver ssdna jest modyfikowany poprzez jego biotynylacjê, co pozwala w dalszej kolejnoœci na usuniêcie z roztworu reakcyjnego dupleksów DNA identycznego dla dwóch szczepów oraz nadmiaru Driver ssdna. Badanie ró nic sekwencji miêdzy dwoma szczepami mo na przeprowadziæ przy u yciu DNA genomowego jak i cdna, natomiast badanie ró nic w ekspresji genów w warunkach in vitro i in vivo tylko przy u yciu cdna [33]. W celu zwiêkszenia wydajnoœci tej metody opracowano kilka jej modyfikacji przy zachowaniu g³ównego mechanizmu jej dzia³ania. Jedn¹ z nich jest metoda RDA (ang. Representational Difference Analysis) [27], któr¹ zastosowano m.in. do zbadania ró nic genetycznych miêdzy blisko spokrewnionymi patogenami takimi jak Neisseria meningitidis i N. gonorrhoeae [38]. Tester dsdna poddaje siê dzia³aniu enzymu restrykcyjnego, a nastêpnie wprowadza siê na koñcach

18 314 ADRIANNA RACZKOWSKA, MARIUSZ AK, KATARZYNA BRZOSTEK uzyskanych fragmentów DNA tzw. adapter/starter. Tak zmodyfikowana pula Tester dsdna jest amplifikowana i po denaturacji mieszana ze zdenaturowan¹ pul¹ Driver ssdna ciêt¹ równie enzymem restrykcyjnym. Mieszaninê reakcyjn¹ poddaje siê nastêpnie renaturacji. Podczas tego procesu wiêkszoœæ fragmentów Tester ssdna po³¹czy siê z fragmentami Driver ssdna. Tester ssdna unikalny dla danego szczepu bêdzie hybrydyzowa³ sam ze sob¹ tworz¹c wyjœciowy DNA, który dziêki obecnoœci sekwencji adapter/starter mo e byæ powielony w reakcji PCR. Pomimo prac nad ulepszeniem tej metody jest ona nadal pracoch³onna i ma³o czu³a. Z ostatniego powodu wiele ró nic wystêpuj¹cych na poziomie sekwencji DNA szczepu patogennego i niepatogennego tego samego gatunku nie mo e byæ zidentyfikowanych. Nowoœci¹ w tym zakresie jest metoda SSH (ang. Suppresive Subtractive Hybridization) (Rys. 2). Dziêki niej zidentyfikowano kilkanaœcie ró nic w sekwencji genomu pomiêdzy szczepami H. pylori izolowanymi od ma³p, a szczepami izolowanymi od ludzi [2]. Ró nica pomiêdzy SSH, a opisan¹ wczeœniej metod¹ RDA polega na zastosowaniu dwóch rodzajów sekwencji adapter/ starter. Trawiony Tester dsdna dzielony jest na dwie pule, a na koñcach otrzymanych fragmentów DNA w puli 1 wprowadzony jest adapter/starter 1 oraz w puli 2 adapter/starter 2. Nastêpnie do ka dej puli DNA dodawany jest w nadmiarze Driver dsdna nie poddany adnym modyfikacjom. Po przeprowadzeniu denaturacji, a w dalszej kolejnoœci renaturacji pule 1 i 2 s¹ mieszane ze sob¹ z dodaniem kolejnej, nadmiernej porcji Driver dsdna. Podczas drugiej reakcji hybrydyzacji pozosta³y niespecyficzny Tester ssdna z puli 1 i 2 bêdzie hybrydyzowa³ z drug¹ porcj¹ Driver ssdna. Unikalny Tester ssdna z puli 1 bêdzie hybrydyzowa³ z komplementarnym Tester ssdna z puli 2. Powsta³y fragment dsdna bêdzie zawiera³ adapter/starter 1 na jednym koñcu i adapter/starter 2 na drugim koñcu cz¹steczki. Pozwoli to nastêpnie na amplifikacjê odcinków DNA w reakcji PCR przy u yciu starterów komplementarnych odpowiednio do adapter/starter 1 i adapter/starter Metoda prezentacji zró nicowañ Metoda prezentacji zró nicowañ (DD ang. Differential Display) pozwala na badanie ró nic na poziomie DNA w szczepie patogennym i niepatogennym oraz na poznanie indywidualnego wzoru ekspresji genów szczepów hodowanych w warunkach in vitro oraz in vivo [43]. W metodzie tej wykorzystuje siê parê losowych starterów w celu otrzymania produktów reakcji PCR amplifikowanych na matrycy DNA izolowanym z dwóch populacji komórek. W drugim przypadku matrycê stanowi cdna przepisane z wyizolowanego bakteryjnego mrna. Rozdzielone w elu otrzymane wczeœniej produkty reakcji PCR tworz¹ charakterystyczny profil losowych fragmentów DNA. Ró nice we wzorze mog¹ wskazywaæ na istnienie indywidualnych genów w badanym szczepie lub ró nic w ich ekspresji. Zalet¹ tej metody jest mo liwoœæ jej zastosowania przy u yciu niewielkich iloœci wyizolowanego mrna, jest ona równie czu³a i pozwala na identyfikacjê genów, których ekspresja zachodzi na niskim poziomie. Metoda prezentacji zró nicowanej zosta³a zastosowana do identyfikacji kilkunastu bakteryjnych czynników wirulencji m. in. S. enterica sv. Typhimurium [43]. Opisane metody identyfikacji bakteryjnych czynników wirulencji takie jak zymografia czy metoda receptor/ligand jako ostateczny wynik poszukiwania daj¹ produkt bia³kowy. Mo e to byæ koniec pracy je eli chodzi o biochemiczn¹ charakterystykê bia³ka wirulencji. Jednak w celu poznania sekwencji DNA koduj¹cej dane bia³ko jest to dopiero pocz¹tek drogi. Odnalezienie genu odpowiedzialnego za syntezê czynnika wirulencji mo e pozwoliæ na ocenê jego faktycznej roli w procesie patogenezy poprzez wyciszenie jego ekspresji na drodze mutagenezy. Otrzymane mutanty s¹ nastêpnie charakteryzowane pod wzglêdem zdolnoœci do wywo³ywania infekcji. Poznanie sekwencji genu mo liwe jest dziêki zastosowaniu metod odwrotnej genetyki. Fragment bia³ka jest przepisywany na sekwencjê DNA, a nastêpnie s³u y jako sonda do hybrydyzacji kolonijnej biblioteki genów dzikiego szczepu. 3. Genetyczne innowacje uzupe³niaj¹ce klasyczne, biochemiczne metody Opisane wczeœniej metody wykorzystuj¹ m.in. w³aœciwoœci biochemiczne bia³ek w celu identyfikacji bakteryjnych czynników wirulencji. Nie uwzglêdniaj¹ one jednak osi¹gniêæ biologii molekularnej i mo liwoœci jakie ona daje. Rozwój tej dziedziny nauki umo liwi³ opracowanie kilku technik, wykorzystuj¹cych in ynieriê genetyczn¹, w badaniach oddzia³ywañ pomiêdzy bia³kami patogena i organizmu gospodarza Prezentacja na fagu W metodzie tej wykorzystuje siê faga 8 jako wektora do klonowania genów badanej bakterii patogennej. Fag jest tak zmodyfikowany, aby bia³kowy produkt ekspresji wprowadzonego genu pojawi³ siê na powierzchni jego kapsydu. Jest to mo liwe dziêki konstrukcji fuzji genów bia³ka p³aszcza wirusa z ró nymi fragmentami genomu patogena. W ten sposób przygotowan¹ bibliotek¹ fagow¹, infekuje siê komórki Escherichia coli rosn¹cej na pod³o u sta³ym. Powsta³e ³ysinki odpowiadaj¹ ró nym klonom fagowym, z których

19 STRATEGIE IDENTYFIKACJI BAKTERYJNYCH CZYNNIKÓW WIRULENCJI 315 ka dy na swej powierzchni prezentuje inne bia³ko bakteryjne. Nastêpnie zawartoœæ ³ysinki przenosi siê na b³onê nitrocelulozow¹, któr¹ inkubuje siê z wybran¹ pul¹ bia³ek eukariotycznych wyznakowanych fluorescencyjnie lub radioaktywnie. Oddzia³ywanie pomiêdzy bia³kami bakteryjnymi zlokalizowanymi w p³aszczu faga, a bia³kami gospodarza prowadzi do wyznakowania okreœlonej ³ysinki. W dalszej kolejnoœci umo liwi to identyfikacjê genu koduj¹cego bia³ko uczestnicz¹ce prawdopodobnie we wczesnym etapie infekcji bakteryjnej [12]. Opisana powy ej strategia identyfikacji bakteryjnych czynników wirulencji mo e mieæ kilka odmian przy zachowaniu g³ównego mechanizmu dzia- ³ania. Metoda prezentacji na fagu by³a stosowana do identyfikacji receptorów powierzchniowych u Staphylococcus aureus m. in. czterech receptorów dla fibrynogenu, dwóch dla fibronektyny, dwóch dla przeciwcia³ IgG oraz dwóch dla kolagenu [24] System dwuhybrydowy System dwuhybrydowy jest metod¹ pozwalaj¹ca na badanie interakcji pomiêdzy dwoma bia³kami w warunkach in vitro. Jedn¹ z jego odmian jest tzw. system cya w E. coli, który wykorzystuje mechanizm transdukcji sygna³u z udzia³em camp. Dwa potencjalnie oddzia³ywuj¹ce ze sob¹ bia³ka s¹ ³¹czone z dwiema rozdzielonymi domenami cyklazy adenylanowej tj. T18 i T25 pochodz¹cej z Bordetella pertusis. Roz³¹czone domeny enzymu nie mog¹ wzajemnie siê rozpoznaæ i cz¹steczki sygna³owe nie s¹ syntetyzowane. Po³¹czenie domeny T18 i T25 z potencjalnie oddzia³ywuj¹cymi ze sob¹ bia³kami prowadzi do rekonstrukcji cz¹steczki, a co za tym idzie do syntezy camp, który w postaci kompleksu camp-cap indukuje ekspresjê genu reporterowego np. genu koduj¹cego $-galaktozydazê. Jego enzymatyczna aktywnoœæ w pod³o u zawieraj¹cym X-gal i IPTG prowadzi do powstania barwnych kolonii, z których niebieskie bêd¹ celem poszukiwañ [25]. Kolejn¹ odmian¹ systemu dwuhybrydowego jest metoda wykorzystuj¹ca komórki dro d y do badania oddzia³ywañ typu bia³ko bia³ko [16]. Podobnie jak w systemie cya E. coli rozdzielone domeny w tym przypadku czynnika transkrypcyjnego, nie s¹ w stanie wzajemnie siê rozpoznaæ, nie jest wiêc mo liwa ekspresja genu reporterowego. Te dwie domeny po³¹czone z dwoma potencjalnie oddzia³ywuj¹cymi ze sob¹ bia³kami w momencie ich interakcji umo liwiaj¹ rekonstrukcjê czynnika transkrypcyjnego. Metoda prezentacji na fagu jak i system dwuhybrydowy umo liwiaj¹ badanie interakcji typu bia³ko bia³ko. Pierwsza z technik jest skuteczniejsza w badaniu oddzia³ywañ receptor/ligand, zaœ druga z powodzeniem wykrywa interakcje miêdzy bia³kami cytoplazmatycznymi. 4. Metody identyfikacji genów wirulencji aktywnych in vivo Czynniki wirulencji syntetyzowane przez patogena w warunkach in vivo czêsto nie powstaj¹ in vitro, lub te odwrotnie, produkowane in vitro nie syntetyzowane s¹ w warunkach in vivo. Ponadto rodzaj bakteryjnych czynników wirulencji syntetyzowanych w trakcie infekcji mo e siê zmieniaæ w czasie, jak równie mo e zmieniaæ siê miejsce ich powstawania i dzia³ania. Patogeneza jest procesem wieloetapowym zachodz¹cym in vivo oraz anga uj¹cym od kilku do kilkudziesiêciu bia³ek wirulencji. Œrodowisko organizmu gospodarza ró ni siê pod wieloma wzglêdami od œrodowiska panuj¹cego w hodowlach tkankowych. Przede wszystkim jest bardziej z³o one, ponadto zmienia siê w czasie wraz z postêpem infekcji. Strategia yciowa patogena zale y od dostêpnoœci substancji od ywczych, a to z kolei przek³ada siê na zmiany ekspresji genów. Warunki in vivo wp³ywaj¹ na proces patogenezy poprzez kontrolê tempa wzrostu, rozmiaru populacji oraz produkcji odpowiednich czynników wirulencji. Szybkoœæ wzrostu organizmu patogennego jest bardzo wa na i musi byæ odpowiednia na ró nych etapach postêpuj¹cej infekcji Technologia ekspresji genów in vivo Technologia ekspresji genów in vivo (IVET, ang. In Vivo Expression Technology) jest strategi¹ identyfikacji genów wirulencji bakterii patogennych bêd¹cych aktywnymi jedynie podczas infekcji. Wykrywanie tych czynników zjadliwoœci metodami prowadzonymi w warunkach in vitro by³oby nie mo liwe poniewa poza organizmem gospodarza geny te w wiêkszoœci nie ulegaj¹ ekspresji [10]. Pierwotnie metoda IVET polega³a na stworzeniu transkrypcyjnie funkcjonalnych fuzji genowych fragmentów DNA chromosomu S. enterica sv. Typhimurium z genem markerowym umo liwiaj¹cym wykrycie aktywnoœci powsta³ych fuzji w warunkach in vivo [28]. W metodzie tej zastosowano szczep auksotroficzny nieposiadaj¹cy zdolnoœci do syntezy puryny (mutant delecyjny w genie pura), a co za tym idzie niezdolny do prze ycia podczas infekcji w organizmie myszy (Rys. 3). W pierwszym etapie stworzono szczep S. enterica sv. Typhimurium z delecj¹ w genie pura, a nastêpnie skonstruowano plazmid samobójczy nios¹cy geny pura-laczy pozbawiony w³asnych promotorów, przed którymi wklonowywano ró ne fragmenty genomowego DNA. Takimi konstruktami transformowano szczep )pura S. enterica sv. Typhimurium. Obecnoœæ w plazmidzie losowych fragmentów genomu S. enterica prowadzi do w³¹czenie siê wektora do genomu bakteryjnego na drodze rekombinacji homologicznej.

20 316 ADRIANNA RACZKOWSKA, MARIUSZ AK, KATARZYNA BRZOSTEK Metoda ta okaza³a siê bardzo skutecznym narzêdziem w poszukiwaniu bakteryjnych genów wirulencji aktywnych tylko podczas infekcji. Istnieje jednak pula genów indukowanych w warunkach in vivo, ale indukcja ta nie jest ci¹g³a oraz trwa krótko. Auksotroficzna odmiana IVET nie jest w stanie wykryæ tych genów poniewa synteza puryny, która jest niezbêdna bakterii do przetrwania w organizmie myszy musi byæ ci¹g³a. Chwilowa indukcja promotora powoduje tylko czasow¹ produkcjê puryny, a wiêc bakterie nie prze yj¹ ca³ego okresu infekcji. W zwi¹zku z tym zaprojektowano metodê RIVET (ang. Recombination-based In vivo Expression Technology), która z powodzeniem pozwala na oznaczenie genów nietranskrybowanych konstytutywnie w warunkach in vivo. W pierwszej kolejnoœci w tej metodzie do DNA genomu badanej bakterii patogenbla mob orir6k gen X pura lacz X + ) pura chromosom pojedynczy crossing-over pura lacz X + ) pura Infekcja zwierzêcia Selekcja w warunkach in vivo Rys. 3. Schemat auksotroficznej odmiany metody IVET wg C a m illi i wsp. [9] Uzyskan¹ pulê transformantów z fuzj¹ chromosomaln¹ podawano myszom w celu wywo³ania infekcji. Po kilku dniach odzyskiwano bakterie, a nastêpnie wysiewano na szalki z pod³o em ró nicuj¹cym uzupe³nionym X-gal oraz IPTG. W organizmie myszy prze- ywa³y tylko te szczepy, które by³y zdolne do syntezy puryny, a wiêc te które posiada³y promotor aktywny w warunkach in vivo. Interesuj¹cymi szczepami by³y wiêc te klony, które na pod³o ach z X-gal oraz IPTG tworzy³y bia³e kolonie tj. nie nios³y aktywnie transkrybowanego genu lacz. W szczepach tych fuzja puralaczy znalaz³a siê pod kontrol¹ promotora aktywnego jedynie w warunkach in vivo, a nie in vitro. Mo na wiêc by³o przypuszczaæ, e z tych promotorów transkrybowane s¹ geny bêd¹ce czynnikami wirulencji S. enterica sv. Typhimurium [11].