Marta Hajdziona, Andrzej Molski

Wielkość: px
Rozpocząć pokaz od strony:

Download "Marta Hajdziona, Andrzej Molski"

Transkrypt

1

2 2010, 64, 3-4 PL ISSN ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA: WYKORZYSTANIE TECHNIKI FRET W BADANIACH ZWIJANIA SIÊ I DYNAMIKI KONFORMACYJNEJ RYBOZYMÓW SINGLE-MOLECULE RNA ENZYMOLOGY: USING FRET TO EXPLORE FOLDING AND CONFORMATIONAL DYNAMICS OF RIBOZYMES Marta Hajdziona, Andrzej Molski Pracownia Dynamiki Procesów Fizykochemicznych, Wydzia³ Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza ul. Grunwaldzka 6, Poznañ Abstract Wstêp 1. Budowa, wystêpowanie i rola rybozymów 2. FRET pojedynczych par cz¹steczek (spfret) 3. Fa³dowanie rybozymów 3.1. Rybozym Tetrahymena thermophila 3.2. Rybozym typu hairpin 3.3. Inne uk³ady 4. Aktywnoœæ katalityczna rybozymów i jej sprzê enie z dynamik¹ konformacyjn¹ 4.1. Rybozym Tetrahymena thermophila 4.2. Rybozym typu hairpin 4.3. Inne uk³ady 5. Analiza danych w badaniach pojedynczych cz¹steczek RNA 5.1. Rozk³ady czasów on i off 5.2. Modelowanie i symulacje eksperymentów spfret Podsumowanie i perspektywy Piœmiennictwo cytowane

3 174 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Mgr Marta Hajdziona ukoñczy³a studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Od 2006 roku jest doktorantk¹ w Pracowni Dynamiki Procesów Fizykochemicznych. Prowadzi miêdzy innymi badania dotycz¹ce wyznaczania parametrów kinetycznych z pomiarów FRET pojedynczych cz¹steczek. Celem jej pracy jest znalezienie optymalnych metod analizy danych w pomiarach FRET pojedynczych cz¹steczek. Prof. dr hab. Andrzej Molski jest absolwentem Wydzia³u Matematyki, Fizyki i Chemii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Od roku 2002 kieruje Pracowni¹ Dynamiki Procesów Fizykochemicznych. Obecnie prowadzi badania dotycz¹ce teorii spektroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cz¹steczek. Jest cz³onkiem Polskiego Towarzystwa Chemicznego.

4 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 175 ABSTRACT Ribozymes are biologically important macromolecules that play a crucial role in cell metabolism and functions. Knowledge of folding and catalytic properties of ribozymes can be useful in biotechnology and medicine. In this work, we present a review of single-molecule RNA enzymology with particular emphasis on folding and catalysis observed with single-molecule FRET. Single-molecule spectroscopy provides insight into behaviors of individual molecules without averaging inherent in bulk measurements. In the first section we introduce ribozymes as RNA enzymes [1, 2]. In the second section, we present the structure of RNA molecules and examples of reaction mechanisms (Fig. 1) and function of different types of ribozymes (Fig. 2 5). Next, we review single-molecule FRET spectroscopy (Fig. 6, 7, Eqs. 1, 2). In the fourth section, we present examples of folding dynamics of ribozymes. In the fifth part, we focus on ribozyme catalysis (Fig. 8, 9). We discuss the coupling of conformational dynamics with catalytic reactions. In the last part we present methods of data analysis that can be used to obtain the kinetic rates from single molecule FRET experiments (Fig. 10). Keywords: ribozymes, single-molecule fluorescence spectroscopy, FRET S³owa kluczowe: rybozymy, spektroskopia fluorescencyjna pojedynczych cz¹steczek, FRET

5 176 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI WSTÊP Cz¹steczki RNA maj¹ce w³aœciwoœci katalityczne nazywane s¹ rybozymami. Do lat 80. ubieg³ego wieku uwa ano, e jedynymi substancjami katalizuj¹cymi reakcje w ywych organizmach s¹ bia³ka (enzymy). Prze³om nast¹pi³, gdy Thomas Cech, prowadz¹c badania splicingu RNA maj¹ce na celu znalezienie enzymu katalizuj¹cego wycinanie intronów RNA u Tetrahymena thermophila, stwierdzi³, e w badanych cz¹steczkach splicing zachodzi nawet w nieobecnoœci bia³ek, co oznacza, e sama cz¹steczka RNA ma w³aœciwoœci katalityczne [1]. Równolegle Sidney Altman doszed³ do podobnego wniosku badaj¹c dojrzewanie trna (ang. transfer RNA) w rybosomach [2]. W 1989 r. Cech i Altman otrzymali Nagrodê Nobla z chemii za odkrycie w³aœciwoœci katalitycznych RNA. Istnieje szereg powodów, dla których podejmowane s¹ badania aktywnoœci enzymatycznej rybozymów. Po pierwsze, rybozymy uczestnicz¹ w wa nych reakcjach, których poznanie jest niezbêdne do zrozumienia metabolizmu komórkowego. Po drugie, rybozymy maj¹ zazwyczaj prostsz¹ budowê od enzymów bia³kowych, poniewa sk³adaj¹ siê jedynie z czterech rodzajów monomerów, a tak e ze wzglêdu na komplementarnoœæ miêdzy adenin¹ i uracylem oraz guanin¹ i cytozyn¹. Poniewa rybozymy s¹ mniej z³o one ni enzymy bia³kowe, mechanizm ich dzia³ania powinien byæ prostszy do rozwik³ania. Po trzecie, selektywnoœæ dzia³ania rybozymów mo e byæ wykorzystana w terapii celowanej w RNA, choæ wymaga to jeszcze pokonania wielu problemów zwi¹zanych m.in. ze stabilnoœci¹ chemiczn¹ oligonukleotydów w œrodowisku komórkowym, transportem do odpowiedniego miejsca w komórce, fa³dowaniem do aktywnej konformacji. Po czwarte, najnowsze osi¹gniêcia spektroskopii pojedynczych cz¹steczek pozwalaj¹ na obserwowanie fa³dowania i aktywnoœci pojedynczych cz¹steczek rybozymów, co dostarcza informacji, które s¹ niedostêpne z powodu uœredniania towarzysz¹cego badaniom zespo³ów cz¹steczek w roztworze. Ukaza³ siê szereg prac przegl¹dowych dotycz¹cych rybozymów [3 8]. Niniejsza praca poœwiêcona jest enzymologii pojedynczych cz¹steczek RNA, a w szczególnoœci badaniom ich fa³dowania i sprzê eniu dynamiki konformacyjnej z aktywnoœci¹ katalityczn¹ rybozymów. Jedn¹ z technik s³u ¹cych do badania dynamiki pojedynczych cz¹steczek rybozymów jest rezonansowe przeniesienie energii FRET (ang. Förster Resonance Energy Transfer) pomiêdzy par¹ fluoroforów donorem i akceptorem do³¹czonych do biopolimeru. Fluorescencja pary donor akceptor zale y od odleg³oœci pomiêdzy nimi. Obserwuj¹c zmiany intensywnoœci fluorescencji donora i akceptora mo na uzyskaæ informacje o zmianach konformacyjnych w cz¹steczce. W przypadku rybozymów aktywnoœæ katalityczna jest œciœle zwi¹zana ze zmianami konformacyjnymi w ich strukturze trzeciorzêdowej.

6 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA BUDOWA, WYSTÊPOWANIE I ROLA RYBOZYMÓW Cz¹steczki RNA maj¹ strukturê pierwszorzêdow¹ jednoniciowych ³añcuchów. Cztery zasady nukleinowe mog¹ wytwarzaæ miêdzy sob¹ wi¹zania wodorowe (adenina z uracylem i cytozyna z guanin¹). Powstaj¹ w ten sposób motywy strukturalne (pêtle, wybrzuszenia, spinki), bêd¹ce elementami struktury drugorzêdowej cz¹steczki RNA. Elementy te mog¹ oddzia³ywaæ ze sob¹, tworz¹c przestrzennie sfa³dowan¹ strukturê trzeciorzêdow¹. Ze wzglêdu na fakt, e ka dy rybonukleotyd niesie ze sob¹ jeden ³adunek ujemny, fa³dowaniu RNA, tj. procesowi tworzenia siê struktury trzeciorzêdowej, przeszkadza elektrostatyczne odpychanie miêdzy elementami sk³adowymi ³añcucha. Z tego powodu do wytworzenia siê prawid³owej (natywnej) struktury RNA konieczna jest obecnoœæ jonów dodatnich. W komórce mog¹ to byæ m.in. kationy magnezowe lub sodowe. Po opublikowaniu odkryæ Cecha i Altmana pojawi³o siê wiele doniesieñ o aktywnoœci katalitycznej RNA, a tak e o samo-tn¹cych i samo-sk³adaj¹cych siê cz¹steczkach [9, 10]. Ze wzglêdu na budowê i rodzaj przeprowadzanej reakcji wœród rybozymów wyró nia siê introny grupy I, introny grupy II, RNA RNazy P, rybozymy typu hammerhead, hairpin, HDV (ang. Hepatitis Delta Virus), VS (ang. Varkud Satellite), oraz makrokompleksy rybonukleoproteinowe, i spliceosomy [3]. Choæ zdarza siê, e w ywych organizmach dzia³anie rybozymów wspomagane jest przez bia³ka, sam¹ aktywnoœæ katalityczn¹ wykazuje cz¹steczka RNA. Rybozymy przeprowadzaæ mog¹ reakcje transestryfikacji (miêdzy innymi rybozym typu hairpin), transferu nukleotydu (introny grupy I i II), hydrolizy (RNA RNazy P), a tak e syntezy wi¹zania peptydowego (rybosom). Inny podzia³ rybozymów opiera siê na wielkoœci cz¹steczek. Wyró nia siê rybozymy ma³e, o niezbyt skomplikowanej budowie oraz du e, z³o one z licznych czêœci helikalnych i pêtli. Z³o ona struktura trójwymiarowa rybozymów pozwala im na przeprowadzenie reakcji katalitycznej w œciœle okreœlonym miejscu. Rybozymy potrafi¹ nie tylko przeorganizowaæ swoje miejsce aktywne, ale tak e katalizowaæ reakcje poprzez zbli enie do siebie dwóch substratów [11]. Wiêkszoœæ znanych obecnie rybozymów katalizuje reakcje, w wyniku których nastêpuje nieodwracalna zmiana rybozymu, a w konsekwencji utrata w³aœciwoœci katalitycznych. O takich rybozymach bêdziemy mówili, e katalizuj¹ tylko jeden obrót reakcji. Istniej¹ jednak rybozymy, które, podobnie jak enzymy bia³kowe, pozostaj¹ niezmienione w wyniku reakcji. Jest to rybozym wystêpuj¹cy w rybosomie [12], a tak e RNA RNazy P [13]. Rybozymy te mog¹ przeprowadzaæ wiele obrotów reakcji i s¹ katalizatorami w klasycznym rozumieniu tego terminu. W badaniach in vitro wykorzystuje siê czêsto modyfikacje rybozymów zdolnych do katalizowania tylko jednego obrotu reakcji do form mog¹cych katalizowaæ wiele obrotów reakcji.

7 178 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 1. Figure 1. Dwa przyk³ady mechanizmów aktywnoœci katalitycznej rybozymów. A) Intron grupy I: nukleofilowy atak tlenu 3 guanozyny, która nie nale y do rozcinanego ³añcucha RNA. B) Intron grupy II: nukleofilowy atak tlenu 2 nukleotydu, bêd¹cego czêœci¹ intronu wycinanego ³añcucha. W obu przypadkach produktem jest egzon z grup¹ hydroksylow¹ na koñcu 3. Dwa oddzielone wczeœniej intronem egzony ³¹cz¹ siê, a dodatkowym produktem jest intron, na którego koñcu 5 znajduje siê reszta guanozyny Two examples of catalytic activity of ribozymes. A) Group I intron: nucleophilic attack of a 3 oxygen from guanosine that is not part of the cleaved RNA chain. B) Group II intron: nucleophilic attack of a 2 oxygen from nucleotide that belongs to the intron part of the cleaved RNA chain. In both cases the reaction product is an exon with a hydroxyl group at the 3 end. Two exons, separated by an intron, combine, and an additional product is an intron with a guanozine at the 5 end W niniejszej pracy skupiono siê na najlepiej dot¹d zbadanych rybozymach: rybozymie Tetrahymena thermophila (intron grupy I) oraz rybozymie typu hairpin przeprowadzaj¹cym reakcjê transestryfikacji 2'O, zaliczanych odpowiednio do grupy du ych i ma³ych rybozymów. W obu przypadkach s¹ to cz¹steczki, które in vivo katalizuj¹ tylko jeden obrót reakcji. Dla porównania omówiono tak e inne uk³ady, m.in. RNA RNazy P, który katalizuje reakcjê hydrolizy oraz Diels-Alderazê (DAzê), katalizuj¹c¹ reakcjê cykloaddycji substratów nie bêd¹cych nukleotydami [11, 14 15]. Rybozym Tetrahymena thermophila katalizuje wycinanie intronów (niekoduj¹cych fragmentów) w³asnego ³añcucha RNA. Rybozym Tetrahymena thermophila nale y do grupy du ych rybozymów, sk³ada siê z wielu czêœci helikalnych oraz licznych pêtli wewnêtrznych (Rys. 2). Rybozymy typu hairpin bior¹ udzia³ miêdzy innymi w replikacji wirusa mozaiki tytoniowej [16]. W trakcie namna ania tworzy siê ³añcuch komplementarny do satelitarnego RNA, rybozym typu hairpin rozcina komplementarny ³añcuch a nastêpnie liguje go i w ten sposób powstaje matryca, na podstawie której syntetyzowane s¹ potomne cz¹steczki RNA.

8 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 179 Rysunek 2. Figure 2. Budowa rybozymu Tetrahymena thermophila Structure of Tetrahymena thermophila ribozyme Rybozymy typu hairpin mog¹ znacznie ró niæ siê miêdzy sob¹ budow¹. Na Rysunku 3 przedstawiono ogólny schemat budowy dla tej grupy cz¹steczek RNA. Czêœæ aktywna katalitycznie pozostaje niezmienna i sk³ada siê z dwóch helikalnych ramion, na których znajduj¹ siê pêtle wewnêtrzne, z³o one zawsze z takich samych nukleozydów. W sk³ad pozosta³ej, niekatalitycznej czêœci mog¹ wchodziæ ró ne struktury drugorzêdowe. Na przyk³ad naturalna forma rybozymu typu hairpin wirusa mozaiki tytoniowej sk³ada siê z czterech helikalnych ramion: dwóch aktywnych katalitycznie, z pêtlami wewnêtrznymi i dwóch dodatkowych, dziêki którym dzia³anie rybozymu jest szybsze. Zagadnienie to zostanie dok³adniej omówione w rozdzia- ³ach 3.2 i 4.2.

9 180 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 3. Figure 3. Budowa rybozymów typu hairpin. Lini¹ kropkowan¹ oznaczono czêœci budowy cz¹steczki, ró - ni¹ce siê znacznie dla ró nych rybozymów i mog¹ce tworzyæ ró norodne struktury drugorzêdowe. Lini¹ ci¹g³¹ oznaczono g³ówn¹ czêœæ aktywn¹ katalitycznie, sk³adaj¹c¹ siê z dwóch helikalnych ramion, których sk³ad nukleotydowy mo e byæ ró ny. Na tych ramionach znajduj¹ siê pêtle wewnêtrzne, które zbudowane s¹ zawsze z takiej samej sekwencji nukleotydowej i to w ich obrêbie przeprowadzana jest w³aœciwa reakcja katalityczna. Obszar, który jest niezmienny dla ró nych rybozymów nale ¹cych do tej samej grupy nazywa siê regionem konserwatywnym Structure of the hairpin ribozyme. Dotted line: parts of the molecule which can have different secondary structure for different ribozymes. Solid line the main catalytic part containing two helical arms which can be constructed from different nucleotide pairs. The helical arms contain internal loops, always built from the same nucleoside sequence, regardless of the kind of ribozyme. The actual catalytic act takes place at the internal loops. A region that is invariant for different ribozymes is called a conservative region W eksperymentach in vitro badano zarówno naturaln¹ formê rybozymu (Rys. 4A), jak i jego ró ne modyfikacje. W formie naturalnej, po zajœciu reakcji katalitycznej jedna z czêœci substratu pozostaje przy³¹czona do rybozymu [16 18]. Uniemo liwia to przy³¹czenie kolejnego substratu. Podobnie zachowuje siê uproszczona forma rybozymu, pozbawiona dwóch ramion nie zawieraj¹cych pêtli wewnêtrznych (Rys. 4B) [19, 20]. Dalsza modyfikacja, dziêki której obie czêœci rozciêtego substratu od³¹czaj¹ siê, pozwala na odtworzenie rybozymu po reakcji rozcinania i umo liwia przy³¹czanie kolejnego substratu [21 24]. Tak¹ formê nazywaæ bêdziemy form¹ minimaln¹ (Rys. 4C).

10 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 181 Rysunek 4. Figure 4. Modyfikacje rybozymu hairpin wykorzystywane w badaniach pojedynczych cz¹steczek. Lini¹ ci¹g³¹ zaznaczono regiony aktywnie katalitycznie, lini¹ kropkowan¹ oznaczono obszary, które maj¹ wp³yw na szybkoœæ reakcji. Strza³kami oznaczono miejsce unieruchamiania (MU) cz¹steczki oraz miejsce ciêcia (MC) ³añcucha. A) Forma naturalna, B) forma uproszczona pozbawiona ramion nie zawieraj¹cych pêtli wewnêtrznych, C) forma minimalna, która mo e katalizowaæ wielu obrotów reakcji Modifications of the hairpin ribozyme. Solid line: catalytically active regions, dotted line: noncatalytic regions that determine the reaction rate. Arrows: immobilization place (MU) and cleavage place (MC). A) Natural form of the ribozyme, B) Simplified form without the helical arms which do not contain internal lops, C) Minimal form that can catalyze multicyclic reactions RNaza P odgrywa kluczow¹ rolê w dojrzewaniu koñca 5' trna zarówno u bakterii [2], archeowców jak i u organizmów eukariotycznych [25]. RNaza P in vivo wystêpuje w postaci holoenzymu (w akcie katalitycznym wspó³uczestniczy bia³kowy kofaktor). U bakterii kofaktor sk³ada siê z jednej cz¹steczki bia³ka, u archeowców z czterech i u organizmów eukariotycznych z dziewiêciu lub dziesiêciu cz¹steczek bia³ka [13]. In vitro RNaza P wykazuje, w odpowiednich warunkach ph i stê- enia jonów dodatnich, w³aœciwoœci katalityczne nawet w nieobecnoœci czêœci bia³kowych. Rybozymy pochodz¹ce z organizmów eukariotycznych dzia³aj¹ nawet do kilku rzêdów wielkoœci wolniej od bakteryjnych [25]. Mo e byæ to spowodowane faktem wystêpowania ró nic w budowie miejsca przy³¹czania substratu. Innym ciekawym przyk³adem rybozymu jest rybozym katalizuj¹cy cykloaddycjê Dielsa-Aldera [11]. Rybozym ten katalizuje reakcjê miêdzycz¹steczkow¹ miêdzy substratami nie bêd¹cymi cz¹steczkami RNA. Kataliza przeprowadzana jest poprzez zbli anie do siebie substratów. Dzia³anie tego ma³ego rybozymu jest inhibitowane przez powstaj¹cy produkt [15]. DAza (ang. Diels-Alder reaction) katalizuje stereospecyficzne formowanie siê wi¹zania wêgiel wêgiel miêdzy antracenem (dien) i imidem kwasu maleinowego (dienofil).

11 182 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 5. Figure 5. Struktura formy sfa³dowanej Diels-Alderazy. Zaznaczono miejsce unieruchomienia (MU), które stosuje siê w badaniach na poziomie pojedynczych cz¹steczek Folded Diels-Alderase structure. MU immobilization place used in single-molecule measurements 2. FRET POJEDYNCZYCH PAR CZ STECZEK (spfret) Zjawisko FRET polega na bezpromienistym przeniesieniu energii pomiêdzy dwoma fluoroforami, ze wzbudzonego donora na akceptor. Wydajnoœæ przeniesienia energii zale y od stopnia nak³adania siê widm emisji donora i absorpcji akceptora i zmniejsza siê gwa³townie ze wzrostem odleg³oœci miêdzy fluoroforami. Wydajnoœæ przeniesienia energii mo na zapisaæ wzorem [26]: (1) gdzie E wydajnoœæ FRET, R odleg³oœæ miêdzy donorem i akceptorem, a R 0 odleg³oœæ, dla której wydajnoœæ FRET wynosi 0,5. Zasiêg przeniesienia energii FRET to ok. 100 Å. Ze wzglêdu na wysok¹ czu³oœæ na zmianê po³o enia miêdzy fluoroforami zjawisko FRET mo e byæ wykorzystywane do mierzenia zmian odleg³oœci wewn¹trz makrocz¹steczek biologicznych [27, 28]. Wraz z postêpem technicznym sta³o siê mo liwe obserwowanie zjawiska FRET dla pojedynczych par cz¹steczek (ang. single-pair FRET, spfret). Do wykonywania pomiarów wykorzystuje siê miêdzy innymi mikroskop konfokalny. Inn¹ technik¹ jest TIR (ang. Total Internal Reflection), gdzie wykorzystywany jest fakt, e œwiat³o przy przejœciu z oœrodka o wy szym do oœrodka o ni szym wspó³czynniku za³amania pod k¹tem wiêkszym od k¹ta granicznego ulega ca³kowitemu odbiciu wewnêtrznemu. Przystêpny opis technik pomiaru FRET dla pojedynczych par cz¹steczek mo na znaleÿæ w pracy [29].

12 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 183 W idealnych warunkach œwiat³o laserowe wzbudza jedynie cz¹steczkê donora, a fluorescencja akceptora pochodzi jedynie od bezpromienistego przeniesienia energii z donora na akceptor. Wydajnoœæ przeniesienia energii definiuje siê wtedy jako: (2) gdzie: E wydajnoœæ przeniesienia energii, I A intensywnoœæ fluorescencji akceptora, I D intensywnoœæ fluorescencji donora. Zasadê dzia³ania techniki spfret przedstawiono na Rysunku 6. Rysunek 6. Figure 6. Zasada techniki spfret. Po lewej: cz¹steczka donora (szara) i akceptora (czarna) przy³¹czone do biopolimeru. Na œrodku: trajektorie fluorescencji donora (linia szara) i akceptora (linia czarna). Po prawej: trajektorie FRET. A) Du a odleg³oœæ miêdzy fluoroforami powoduje nisk¹ wydajnoœæ przeniesienia energii i obserwuje siê tylko fluorescencjê donora. B) Odleg³oœæ miêdzy fluoroforami jest porównywalna z R 0 (wzór 1), tak e oba barwniki (donor i akceptor) emituj¹ fotony fluorescencji. C) Ma³a odleg³oœæ miêdzy fluoroforami powoduje wysok¹ wydajnoœæ przeniesienia energii i obserwuje siê g³ównie fluorescencjê akceptora Principle of the spfret technique. Left: biopolymer with a donor (gray) and acceptor (black), middle: donor (gray line) and acceptor (black line) fluorescence trajectories. Right: FRET trajectories. A) The distance between the dyes is large, energy transfer is low so only the donor fluorescence is observed. B) The distance between dyes is equal to R 0 (eqn 1), donor and acceptor emit photons of fluorescence. C) Short inter-dye distance and high FRET: the acceptor fluorescence is observed Jeœli donor i akceptor przy³¹czone s¹ do odpowiednio dobranych miejsc rybozymu, zaobserwowaæ mo na charakterystyczn¹ trajektoriê wydajnoœci spfret, która zmienia siê skokowo miêdzy wartoœci¹ wysok¹ (np. E on = 0,8) i nisk¹ (np. E off = 0,2), (Rys. 7).

13 184 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 7. Figure 7. A) Przyk³adowe trajektorie fluorescencji pojedynczej cz¹steczki donora (I D linia szara) i akceptora (I A linia czarna) oraz B) obliczona na ich podstawie trajektoria spfret (E = I A /( I A + I D )) A) Example of single-molecule fluorescence trajectories of donor (I D gray line) and acceptor (I A black line). B) the calculated spfret trajectory (E = I A /( I A + I D )) Ze wzglêdu na istnienie ruchów Browna, cz¹steczki zawieszone w roztworze mog¹ opuœciæ objêtoœæ wzbudzania. Aby tego unikn¹æ, cz¹steczki unieruchamia siê na powierzchni szk³a [29]. Jeden ze sposobów polega na pokryciu powierzchni kwarcowej glikolem polietylenowym (ang. PEG), a nastêpnie na³o eniu bia³ka bêd¹cego pochodn¹ awidyny, np. neutrawidynê lub streprawidynê. Bia³ka te wykazuj¹ du e powinowactwo do biotyny, do której przy³¹cza siê z kolei badan¹ cz¹steczkê kwasu nukleinowego (DNA, lub RNA) [29]. Na przyk³ad, bardzo silne oddzia³ywania niekowalencyjne prowadz¹ do sta³ej dysocjacji M dla kompleksu biotyna i streptawidyna. Unieruchomienie mo e wp³ywaæ na w³aœciwoœci cz¹steczek. Istnieje niebezpieczeñstwo, e pozbawiona pewnej liczby stopni swobody cz¹steczka zachowuje siê inaczej ni w warunkach naturalnych. Mo na to (do pewnego stopnia) zweryfikowaæ porównuj¹c wyniki otrzymane dla pojedynczych, unieruchomionych cz¹steczek z wynikami otrzymanymi dla zespo³u cz¹steczek w roztworze. Innym problemem jest fotowybielanie. Jeœli cz¹steczka jest unieruchomiona, fluorofory znajduj¹ siê pod ci¹g³ym dzia³aniem promieniowania wzbudzaj¹cego, co mo e znacznie przyœpieszyæ ich fotowybielanie. Konieczne jest zatem zoptymalizowanie intensywnoœci wzbudzenia, wybór odpowiednich barwników, a tak e zastosowanie efektywnych metod analizy danych. 3. FA DOWANIE RYBOZYMÓW Cz¹steczki RNA wykazuj¹ w³aœciwoœci katalityczne jedynie po uzyskaniu odpowiedniej struktury trzeciorzêdowej. Zrozumienie zale noœci drogi fa³dowania od czynników zewnêtrznych, takich jak stê enie jonów i temperatura, jest niezbêdne dla mo liwoœci kontrolowania procesu uzyskiwania zdolnoœci katalitycznych przez cz¹steczkê biopolimeru. Dotyczy to zarówno enzymów bia³kowych jak i enzymów RNA. Warunkiem poprawnego sfa³dowania RNA jest obecnoœæ dodatnich jonów

14 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 185 metali (np. sodowych, magnezowych). Od ich stê enia zale y po³o enie punktu pocz¹tkowego fa³dowania na powierzchni energii swobodnej, co z kolei determinuje drogê jak¹ musi przebyæ cz¹steczka aby uzyskaæ formê natywn¹. Sfa³dowane cz¹steczki rybozymów wykazuj¹ lokaln¹ dynamikê konformacyjn¹. Na przyk³ad w cz¹steczce rybozymu typu hairpin po³o enie helikalnych ramion fluktuuje pomiêdzy dwoma konformacjami. Konformacjê, w której ramiona zawieraj¹ce pêtle wewnêtrzne znajduj¹ siê blisko siebie nazywaæ bêdziemy form¹ zwiniêt¹ (ang. docked), zaœ konformacjê, w której ramiona zawieraj¹ce pêtle wewnêtrzne oddalone s¹ od siebie na pewn¹ odleg³oœæ nazywaæ bêdziemy form¹ rozwiniêt¹ (ang. undocked) RYBOZYM TETRAHYMENA THERMOPHILA Fa³dowanie rybozymu Tetrahymena thermophila by³o badane zarówno w eksperymentach dla zespo³ów cz¹steczek [30, 31] jak i dla pojedynczych cz¹steczek [32 34]. Stwierdzono, e mo e siê on znajdowaæ w 3 stanach: rozfa³dowanym, niepoprawnie sfa³dowanym i poprawnie sfa³dowanym (natywnym). Forma rozfa³dowana wykazuje wydajnoœæ przeniesienia na poziomie E = 0,1, sfa³dowana niepoprawnie E = 0,3, a poprawnie sfa³dowana E = 0,9. W procesie fa³dowania niezbêdna jest obecnoœæ jonów magnezowych, natomiast wybór drogi fa³dowania zale y od stê- enia jonów sodowych. Dla wysokiego stê enia (> 250 mmol/dm 3 ) fa³dowanie przebiega bardzo szybko do stanu natywnego, przy œrednim stê eniu ( mmol/dm 3 ) obserwuje siê stan przejœciowy, z którego cz¹steczka mo e przejœæ do stanu natywnego, lub niepoprawnie sfa³dowanego. Natomiast dla ma³ego stê enia jonów sodowych (< 150 mmol/dm 3 ) obserwuje siê na drodze fa³dowania, oprócz stanu przejœciowego, pu³apkê energetyczn¹. Stwierdzono tak e, e wczeœniejsze wytworzenie struktury drugorzêdowej nie jest konieczne do poprawnego sfa³dowania. Rybozym Tetrahymena thermophila wykazuje lokalne fluktuacje struktury. W badaniach na zespole cz¹steczek wyznaczono sta³¹ równowagow¹ zwijania (K dock = 7 ± 3), stwierdzono, e tworzenie struktury trzeciorzêdowej przebiegaæ mo e ró nymi drogami a tak e zaobserwowano d³ugo yj¹ce stany rozfa³dowane. Badania pojedynczych cz¹steczek pozwoli³y na wyznaczenie sta³ych szybkoœci zwijania i rozwijania [33] oraz kszta³tu powierzchni energii swobodnej fa³dowania [32]. Na poziomie pojedynczych cz¹steczek wyznaczono sta³¹ rozwijania (k undock = 1,62 ± 0,08 s 1 ) i zwijania (k dock = 0,224 ± 0,015 s 1 ), a tak e obliczono sta³¹ równowagow¹ zwijania (K dock = k dock /k undock = 7,2 ± 0,8) [33].

15 186 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI 3.2. RYBOZYM TYPU HAIRPIN W naturalnych warunkach rybozym ten wystêpuje w postaci struktury Holliday a, w której na dwóch s¹siaduj¹cych ze sob¹ ramionach znajduj¹ siê pêtle wewnêtrzne. Wykazano jednak e, e aktywnoœæ katalityczn¹ mog¹ mieæ formy zmodyfikowane pozbawione ramion nie zawieraj¹cych pêtli (Rys. 4). Rybozymy znakowano fluorescencyjnie na dwóch ramionach zawieraj¹cych pêtle wewnêtrzne. W eksperymencie obserwowano trzy ró ne wydajnoœci FRET. Wartoœci wysoka (E = 0,81) i niska (E = 0,15) odpowiada³y rybozymowi odpowiednio w formie zwiniêtej i rozwiniêtej z przy³¹czonym substratem, natomiast poœrednia (E = 0,38) odnosi³a siê do wolnego rybozymu. Stwierdzono, e rybozym, do którego przy³¹czony jest nie rozciêty substrat wykazuje inn¹ dynamikê konformacyjn¹, ni rybozym z przy³¹czonym, rozciêtym substratem. Badaj¹c formê minimaln¹ (Rys. 4C), wyznaczono sta³¹ zwijania rybozymu z nierozciêtym substratem, której wartoœæ by³a taka sama jak dla zespo³u cz¹steczek (0,008 s 1 ). Stwierdzono, e ró ne cz¹steczki wykazuj¹ ró ne sta³e rozwijania. Najwolniejsza sta³a rozwijania (0,005 s 1 ) zgadza³a siê z wynikami otrzymanymi dla zespo³u cz¹steczek. Zaobserwowano tak e efekt pamiêci pomimo, e ró ne cz¹steczki rybozymu wykazuj¹ ró ne sta³e szybkoœci rozwijania, to jedna, konkretna cz¹steczka charakteryzuje siê tym, e jej sta³a szybkoœci rozwijania nie zmienia siê w trakcie eksperymentu. Dla porównania, rybozym z rozciêtym substratem wykazuje sta³¹ szybkoœci zwijania równ¹ 0,02 s 1, zaobserwowano ró norodnoœæ kinetyczn¹ sta³ej rozwijania. Tak wiêc sta³a zwijania rybozymu z przy³¹czonym, rozciêtym substratem jest 2,5 razy wiêksza ni sta³a zwijania rybozymu, do którego przy³¹czony jest nie rozciêty substrat. Porównuj¹c wyniki eksperymentalne otrzymane dla formy minimalnej i naturalnej rybozymu stwierdzono, e forma minimalna wymaga dwa do trzy razy wiêkszego stê enia jonów magnezowych, a jej sta³a zwijania jest o trzy rzêdy wielkoœci mniejsza ni sta³a zwijania dla formy naturalnej INNE UK ADY Domena katalityczna RNazy P RNA z Bacillus Subtilis jest dobrym modelem do badañ kinetyki fa³dowania, poniewa obszar energii swobodnej nie zawiera pu³apek energetycznych [35, 36]. Dodatkowo jest to rybozym na tyle du y, by stosowaæ dla niego zasady fa³dowania du ych cz¹steczek RNA. Badania na poziomie pojedynczych cz¹steczek potwierdzi³y wczeœniejsze spostrze enia o fa³dowaniu z udzia- ³em stanów przejœciowych. Pozwoli³y tak e stwierdziæ, e nie jest to jeden, a trzy stany przejœciowe. Warunki pocz¹tkowe (stê enie jonów dodatnich, ph roztworu) determinuj¹ punkt startowy fa³dowania na powierzchni energii swobodnej, a co za

16 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 187 tym idzie maj¹ bezpoœredni wp³yw na drogê fa³dowania (czy przebiega ona z udzia- ³em pu³apek energetycznych, czy te bez nich). Wykorzystuj¹c technikê FRET pojedynczych cz¹steczek stwierdzono, e fa³dowanie DAzy do formy aktywnej przebiega poprzez stan przejœciowy. Cz¹steczki DAzy znakowano fluoresencyjnie, wykorzystuj¹c Cy3 jako donor i Cy5 jako akceptor. Stan rozfa³dowany stanowi k³êbek statystyczny, w którym nie wytworzy³y siê jeszcze wi¹zania wodorowe miêdzy komplementarnymi parami zasad. Po dodaniu jonów jednododatnich (Na + ) wytwarza siê struktura drugorzêdowa, na któr¹ sk³adaj¹ siê czêœci helikalne i pêtle wewnêtrzne. W ten sposób cz¹steczka przechodzi do stanu poœredniego. Wytworzenie struktury trzeciorzêdowej (a wiêc przejœcie do stanu sfa³dowaniego) nastêpuje po dodaniu do uk³adu jonów dwudodatnich. Wtedy to czêœci struktury drugorzêdowej zaczynaj¹ oddzia³ywaæ ze sob¹. 4. AKTYWNOŒÆ KATALITYCZNA RYBOZYMÓW I JEJ SPRZÊ ENIE Z DYNAMIK KONFORMACYJN Badania pojedynczych cz¹steczek pokazuj¹, e ró ne cz¹steczki rybozymów wykazuj¹ ró n¹ aktywnoœæ katalityczn¹. Rozk³ady aktywnoœci katalitycznej rybozymów s¹ zgodne z wartoœciami œrednimi uzyskanymi w badaniach zespo³ów cz¹steczek [21, 33]. Jak wszystkie makrocz¹steczki biologiczne, rybozymy wykazuj¹ dynamikê konformacyjn¹. W przypadku rybozymów stwierdzono sprzê enie aktywnoœci katalitycznej z dynamik¹ konformacyjn¹. Na przyk³ad dla rybozymu typu hairpin polega to na zmianie czêstoœci przejœæ pomiêdzy stanem zwiniêtym i rozwiniêtym rybozymu, gdy przy³¹czony substrat ulega rozciêciu RYBOZYM TETRAHYMENA THERMOPHILA Aktywnoœæ katalityczn¹ Tetrahymena thermophila badano dla pojedynczych, unieruchomionych cz¹steczek [33]. Schemat reakcji przedstawiono na Rysunku 8. Poniewa po rozciêciu produkt oznakowany barwnikiem fluorescencyjnym oddziela siê od rybozymu, mo liwe by³o okreœlenie momentu rozciêcia jako nag³ego zmniejszenia fluorescencji pojedynczej cz¹steczki. Rysunek 8. Figure 8. Mechanizm katalizy enzymu Tetrahymena thermophila dla oligonukleotydowego substratu (S-A = CCCUCUA), do którego do³¹czony jest barwnik fluorescencyjny Cy3. Guanozyna (G) przy³¹cza siê do rybozymu E, który katalizuje rozciêcie substratu, a produkt (GACy3) oddziela siê od rybozymu Enzymatic catalysis mechanism of Tetrahymena thermophila ribozyme for oligonucleotide substrate (S-A = CCCUCUA) with a fluorescent dye (Cy3) attached. Guanosine (G) attaches to ribozyme E and catalyzes substrate cleavage, product (GACy3) dissociates from the ribozyme

17 188 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Etapem limituj¹cym szybkoœæ jest etap rozciêcia. Zale noœæ szybkoœci rozciêcia v od stê enia guanozyny [G] by³a zgodna z równaniem Michaelisa-Menten [37], v = k [G]/ (K 1/2 + [G]), ze sta³¹ szybkoœci rozciêcia k = 0,21 ± 0,01 s 1 i sta³¹ Michaelisa-Menten K 1/2 = 0,26 ± 0,04 mmol/dm 3. Wyniki te zgadza³y siê z tymi otrzymanymi dla zespo³u cz¹steczek i wynosz¹cymi k max = 0,21 ± 0,01 s 1, a K 1/2 = 0,30 ± 0,05 mmol/dm 3. Reakcja rozcinania zachodzi³a tylko wtedy, gdy rybozym znajdowa³ siê w konformacji poprawnie zwiniêtej, której wydajnoœæ spfret wynosi³a E = 0, RYBOZYM TYPU HAIRPIN Mechanizm aktywnoœci katalitycznej formy minimalnej rybozymu typu hairpin przedstawiono na Rysunku 9. Poniewa poszczególne etapy reakcji maj¹ porównywalne szybkoœci, zale noœci kinetyczne s¹ z³o one i wymagaj¹ analizy numerycznej [21]. Rysunek 9. Figure 9. Mechanizm katalizy formy minimalnej rybozymu hairpin. Do cz¹steczki przy³¹czono dwa barwniki fluorescencyjne: Cy3 jako donor (szary) i Cy5 jako akceptor (czarny). (A) wolny rybozym i przy³¹czaj¹cy siê do niego substrat, (B) rozwiniêty rybozym z przy³¹czonym substratem, (C) zwiniêty rybozym z przy³¹czonym substratem, (D) rybozym z rozciêtym substratem, (E) rozwiniêty rybozy z rozciêtym substratem, (F) wolny rybozym i uwolnione produkty Mechanism of catalysis for the minimal form of the hairpin ribozyme. Two fluorescent dyes are attached to the ribozyme: Cy3 as a donor (gray) and Cy5 as an acceptor (black). (A) free ribozyme and the substrate, (B) undocked ribozyme-substrate complex, (C) docked ribozyme-substrate complex, (D) docked ribozyme with cleaved substrate, (E) undocked ribozyme with cleaved substrate, (F) free ribozyme and products Wydajnoœæ FRET w stanie zwiniêtym wynosi ok. 0,8, natomiast dla formy rozwiniêtej ok. 0,15. Rybozym (zarówno w formie minimalnej jak i naturalnej), do którego przy³¹czony jest rozciêty substrat wykazuje szybkie przejœcia miêdzy stanami zwiniêtym i rozwiniêtym. Dziêki temu mo na na podstawnie trajektorii FRET okreœliæ moment rozciêcia. Widoczne jest to jako przejœcie z d³ugotrwaj¹cego stanu wysokiego FRET (E = 0,8) do szybkich fluktuacji miêdzy wartoœciami E = 0,2 i 0,8. Akt katalityczny obserwuje siê poœrednio, znaj¹c dynamikê konformacyjn¹ form rybozymu z przy³¹czonym rozciêtym i nierozciêtym substratem. Dla formy minimalnej (Rys. 4C) wyznaczono sta³¹ równowagi rozcinania K 0,5, oraz przedzia³, 0,1 do 0,4 s 1, w którym mieœci siê sta³a rozcinania, a tak e odpowiedni przedzia³, 0,2 do 0,8 s 1, dla sta³ej ligacji [21]. Dla formy naturalnej

18 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 189 sta³e rozcinania i ligacji wahaj¹ siê wed³ug ró nych autorów [16, 18] miêdzy 0,6 a 1 min 1 dla sta³ej rozcinania i min 1 dla sta³ej ligacji INNE UK ADY Porównywano kinetykê dzia³ania RNA RNazy P dla organizmów prokariotycznych (bakterie, archeowce), jak i eukariotycznych [25, 38], w warunkach kiedy mo - liwy jest jeden obrót reakcji. Stwierdzono, e bez udzia³u bia³ek, sta³e rozcinania przeprowadzanego przez rybozymy eukariotyczne (ludzki i G. lamblia) wynosz¹ odpowiednio 2, i 3, min 1, przy czym prokariotyczny RNA RNazy P przeprowadza proces rozcinania ze sta³¹ szybkoœci 8,4 min 1. Powodem tak du ych rozbie noœci mo e byæ fakt nieobecnoœci w rybozymach eukariotycznych fragmentów odpowiedzialnych za przy³¹czanie substratu w organizmach prokariotycznych. Zmodyfikowano wiêc rybozym bakteryjny, usuwaj¹c te fragmenty i stwierdzono, e sta³a rozcinania zmniejszy³a siê do wartoœci 2, min 1. Pozostaje wiêc nadal ró nica dwóch rzêdów wielkoœci. Stwierdzono, e najprawdopodobniej w wyniku ewolucji RNA RNazy P coraz bardziej uzale nia³ siê od pomocy kofaktorów bia³kowych, niemniej jednak nie utraci³ w³aœciwoœci katalitycznych. 5. ANALIZA DANYCH W BADANIACH POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA Przegl¹d metod statystycznej analizy danych w zastosowaniu do badañ nad pojedynczymi cz¹steczkami znaleÿæ mo na w pracach [39, 40]. Analiza danych w enzymologii pojedynczych cz¹steczek RNA polega czêsto na analizie trajektorii spfret wykazuj¹cych skoki pomiêdzy stanami o ró nej wydajnoœci przeniesienia energii fluorescencji E. Jeœli poziom szumu jest niski, liczbê stanów FRET mo na okreœliæ wizualnie z wykresu trajektorii. Podobnie mo na ustaliæ progi pozwalaj¹ce przypisaæ zmierzone wartoœci E do poszczególnych stanów, a nastêpnie wyznaczyæ d³ugoœci interwa³ów czasu przebywania w tych stanach. Analiza histogramów czasów przebywania w poszczególnych stanach FRET pozwala wyznaczyæ sta³e szybkoœci przejœæ pomiêdzy stanami. Wyznaczenie liczby stanów i rozk³ad trajektorii na odcinki odpowiadaj¹ce poszczególnym stanom s¹ trudne jeœli szum eksperymentalny jest du y, jak to ma czêsto miejsce w badaniach spfret. Dlatego poszukuje siê nowych metod statystycznej analizy danych. Interesuj¹ce mo liwoœci daje modelowanie trajektorii spfret jako ukrytego procesu Markowa [41], lub modelowanie zliczeñ w kana³ach donora jako modulowanych procesów Poissona [42].

19 190 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI 5.1. ROZK ADY CZASÓW ON I OFF W spektroskopii spfret rejestruje siê trajektorie fluorescencji donora i akceptora. W badaniach rybozymów trajektorie te wykazuj¹ czêsto dwa lub wiêcej dyskretnych wartoœci wydajnoœci przeniesienia energii E, a przejœcia miêdzy stanami zachodz¹ w sposób skokowy. W najprostszym przypadku obserwuje siê dwie wartoœci E odpowiadaj¹ce wysokiej (E on ) i niskiej (E off ) wydajnoœci przeniesienia energii. Na podstawie trajektorii E dobierana jest wartoœæ progowa, np. E p = (E on + E off )/2, rozdzielaj¹ca trajektoriê na okresy o wysokiej (on) wydajnoœci (E > E p ) i okresy o niskiej (off) wydajnoœci przeniesienia energii (E < E p ). Kolejne czasy przebywania w stanach on i off, s¹ zmiennymi losowymi o rozk³adach zale nych od mechanizmu zmian konformacyjnych. W celu wyznaczenia sta³ych szybkoœci przejœæ, do histogramu czasów on i off dopasowuje siê krzywe wynikaj¹ce z modelu zmian konformacyjnych (Rys. 10). Otrzymuje siê w ten sposób sta³e kinetyczne ucieczki ze stanów on i off (k on i k off ), bêd¹ce odwrotnoœciami œrednich czasów przebywania w ka dym ze stanów (τ on i τ off ). Wariantem tej metody jest dopasowywanie modelu do kumulatywnych histogramów czasów on i off [19]. Rysunek 10. Przyk³ad analizy on-off: histogramy czasów przebywania w stanie on (A) i off (B) wraz z dopasowanymi krzywymi wyk³adniczymi (linie ci¹g³e) i wartoœciami sta³ych kinetycznych ucieczki (k on, k off ) u ytymi do symulacji (indeks teor) i odzyskanymi (indeks dop) w wyniku dopasowañ Figure 10. Example of an on-off analysis: on- (A) and off- (B) time histograms with fitted exponential curves (solid lines) and the kinetic rates (k on, k off ) used in simulations ( teor ) and those obtained from fitting ( dop ) Jeœli szum eksperymentalny jest du y mo na zastosowaæ wyg³adzanie trajektorii spfret [43] MODELOWANIE I SYMULACJE EKSPERYMENTÓW spfret W pracy [39] zaproponowano model trajektorii wydajnoœci jako realizacji ukrytego modelu Markowa. Ukryte modele Markowa zosta³y pocz¹tkowo zastosowane w automatycznym rozpoznawaniu mowy, a póÿniej znalaz³y zastosowanie w innych dziedzinach [44].

20 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 191 Model Markowa sk³ada siê z dyskretnych stanów, pomiêdzy którymi nastêpuj¹ przeskoki. Szybkoœæ przejœæ miêdzy stanami opisana jest równaniami kinetycznymi. Przyk³adem modelu Markowa jest model zmian konformacyjnych cz¹steczki RNA przedstawiony na Rysunku 9. Proces zmian konformacyjnych jest ukryty poniewa obserwujemy go jedynie poœrednio, w postaci trajektorii wydajnoœci FRET. Wartoœæ wydajnoœci E informuj¹ca o konformacji cz¹steczki jest zmienna losow¹ o rozk³adzie, który z dobrym przybli eniem jest rozk³adem Gaussa. Trajektoria FRET jest traktowana jako generowana przez ukryty model Markowa, a celem analizy danych jest okreœlenie liczby stanów i sta³ych szybkoœci przejœæ tego modelu. Przyk³ad zastosowania w eksperymencie z rybozymami znajduje siê w pracy [19]. W pracy [45] zastosowano symulacje do okreœlenia mo liwoœci wyznaczania liczby stanów i wyznaczania parametrów kinetycznych dla krótkich trajektorii spfret. Eksperymentalna trajektoria wydajnoœci spfret jest szeregiem czasowym obliczanym jako E i = n Ai / (n Ai + n Di ), gdzie n Ai i n Di s¹ liczbami zliczeñ fotonów odpowiednio w kanale akceptora i donora, w przedziale czasowym (ih, (i + 1)h) o szerokoœci h. Liczby zliczeñ n Ai i n Di s¹ zmiennymi losowymi, których wartoœci œrednie s¹ równe I Ai h i I Di h, gdzie I Ai i I Di s¹ œrednimi intensywnoœciami fluorescencji akceptora i donora w interwale (ih, (i + 1)h). E i jest oszacowaniem œredniej wydajnoœci FRET w i-tym interwale (ih, (i + 1)h). Oznacza to uœrednienie informacji po szerokoœci interwa³u h. Metod¹ analizy spfret, która unika tego ograniczenia jest metoda najwiêkszej wiarygodnoœci zastosowana bezpoœrednio do trajektorii czasów detekcji fotonów w kana³ach donora i akceptora. Gopich i Szabo [42] opracowali podstawy teoretyczne tego podejœcia i zademonstrowali, e mo e byæ ono stosowane do estymacji parametrów w spfret. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY Rybozymy s¹ wa nymi biologicznie cz¹steczkami RNA wystêpuj¹cymi we wszystkich ywych organizmach. Dziêki badaniom na zespole cz¹steczek mo liwe by³o okreœlenie mechanizmów dzia³ania rybozymów i wyznaczenie niektórych sta- ³ych kinetycznych. Zastosowanie spektroskopii pojedynczych cz¹steczek pozwoli³o na pe³niejszy opis aktywnoœci rybozymów. Wyznaczono sta³e kinetyczne, których okreœlenie w badaniach na zespole cz¹steczek by³o niemo liwe. Zaobserwowano tak e zjawiska, uœredniaj¹ce siê w pomiarach na zespole cz¹steczek. Na przyk³ad, stwierdzono istnienie heterogenicznoœci polegaj¹cej na tym, e ró ne cz¹steczki, pomimo takiej samej budowy chemicznej i identycznych warunków eksperymentalnych katalizuj¹ reakcje z ró nymi sta³ymi szybkoœci. Nale y przypuszczaæ, e kolejne lata przynios¹ dalsze zastosowania metod pojedynczych cz¹steczek do badania zarówno enzymów RNA jak i enzymów bia³kowych.

PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc

PRAWA ZACHOWANIA. Podstawowe terminy. Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc PRAWA ZACHOWANIA Podstawowe terminy Cia a tworz ce uk ad mechaniczny oddzia ywuj mi dzy sob i z cia ami nie nale cymi do uk adu za pomoc a) si wewn trznych - si dzia aj cych na dane cia o ze strony innych

Bardziej szczegółowo

40. Międzynarodowa Olimpiada Fizyczna Meksyk, 12-19 lipca 2009 r. ZADANIE TEORETYCZNE 2 CHŁODZENIE LASEROWE I MELASA OPTYCZNA

40. Międzynarodowa Olimpiada Fizyczna Meksyk, 12-19 lipca 2009 r. ZADANIE TEORETYCZNE 2 CHŁODZENIE LASEROWE I MELASA OPTYCZNA ZADANIE TEORETYCZNE 2 CHŁODZENIE LASEROWE I MELASA OPTYCZNA Celem tego zadania jest podanie prostej teorii, która tłumaczy tak zwane chłodzenie laserowe i zjawisko melasy optycznej. Chodzi tu o chłodzenia

Bardziej szczegółowo

1 FILTR. Jak usun¹æ 5 zanieczyszczeñ za pomoc¹ jednego z³o a? PROBLEMÓW Z WOD ROZWI ZUJE. NOWATORSKIE uzdatnianie wody 5 w 1

1 FILTR. Jak usun¹æ 5 zanieczyszczeñ za pomoc¹ jednego z³o a? PROBLEMÓW Z WOD ROZWI ZUJE. NOWATORSKIE uzdatnianie wody 5 w 1 Jak usun¹æ 5 zanieczyszczeñ za pomoc¹ jednego z³o a? 1 FILTR ROZWI ZUJE PROBLEMÓW Z WOD 1 TWARDOŒÆ 2 ELAZO 3 MANGAN 4 AMONIAK 5 ORGANIKA Zanieczyszczenia takie jak: twardoœæ, mangan, elazo, naturalne substancje

Bardziej szczegółowo

Lp. Tematyka Liczba godzin I. Wymagania edukacyjne

Lp. Tematyka Liczba godzin I. Wymagania edukacyjne Anna Ulrych Plan wynikowy Przedmiot: Materiały fryzjerskie Kierunek : Technikum Usług Fryzjerskich- rok szkolny 05/ 06 Liczba godzin: 76 Liczba godzin w roku szkolnym: KL.II Lp. Tematyka Liczba godzin

Bardziej szczegółowo

BEZPIECZE STWO PRACY Z LASERAMI

BEZPIECZE STWO PRACY Z LASERAMI BEZPIECZE STWO PRACY Z LASERAMI Szkodliwe dzia anie promieniowania laserowego dotyczy oczu oraz skóry cz owieka, przy czym najbardziej zagro one s oczy. Ze wzgl du na kierunkowo wi zki zagro enie promieniowaniem

Bardziej szczegółowo

Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko

Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Imię i nazwisko Temat: Czy świetlówki energooszczędne są oszczędne i sprzyjają ochronie środowiska? Karta pracy III.. Imię i nazwisko klasa Celem nauki jest stawianie hipotez, a następnie ich weryfikacja, która w efekcie

Bardziej szczegółowo

Od redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2.

Od redakcji. Symbolem oznaczono zadania wykraczające poza zakres materiału omówionego w podręczniku Fizyka z plusem cz. 2. Od redakcji Niniejszy zbiór zadań powstał z myślą o tych wszystkich, dla których rozwiązanie zadania z fizyki nie polega wyłącznie na mechanicznym przekształceniu wzorów i podstawieniu do nich danych.

Bardziej szczegółowo

Laboratorium z Konwersji Energii. Ogniwo fotowoltaiczne

Laboratorium z Konwersji Energii. Ogniwo fotowoltaiczne Laboratorium z Konwersji Energii Ogniwo fotowoltaiczne 1.0 WSTĘP Energia słoneczna jest energią reakcji termojądrowych zachodzących w olbrzymiej odległości od Ziemi. Zachodzące na Słońcu przemiany helu

Bardziej szczegółowo

Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami

Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami Steelmate - System wspomagaj¹cy parkowanie z oœmioma czujnikami Cechy: Kolorowy i intuicyjny wyœwietlacz LCD Czujnik wysokiej jakoœci Inteligentne rozpoznawanie przeszkód Przedni i tylni system wykrywania

Bardziej szczegółowo

DWP. NOWOή: Dysza wentylacji po arowej

DWP. NOWOŒÆ: Dysza wentylacji po arowej NOWOŒÆ: Dysza wentylacji po arowej DWP Aprobata Techniczna AT-15-550/2007 SMAY Sp. z o.o. / ul. Ciep³ownicza 29 / 1-587 Kraków tel. +48 12 78 18 80 / fax. +48 12 78 18 88 / e-mail: info@smay.eu Przeznaczenie

Bardziej szczegółowo

2.Prawo zachowania masy

2.Prawo zachowania masy 2.Prawo zachowania masy Zdefiniujmy najpierw pewne podstawowe pojęcia: Układ - obszar przestrzeni o określonych granicach Ośrodek ciągły - obszar przestrzeni którego rozmiary charakterystyczne są wystarczająco

Bardziej szczegółowo

Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem

Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem Harmonogramowanie projektów Zarządzanie czasem Zarządzanie czasem TOMASZ ŁUKASZEWSKI INSTYTUT INFORMATYKI W ZARZĄDZANIU Zarządzanie czasem w projekcie /49 Czas w zarządzaniu projektami 1. Pojęcie zarządzania

Bardziej szczegółowo

Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego

Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Promocja i identyfikacja wizualna projektów współfinansowanych ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego Białystok, 19 grudzień 2012 r. Seminarium współfinansowane ze środków Unii Europejskiej w ramach

Bardziej szczegółowo

Klasyfikacja i oznakowanie substancji chemicznych i ich mieszanin. Dominika Sowa

Klasyfikacja i oznakowanie substancji chemicznych i ich mieszanin. Dominika Sowa Klasyfikacja i oznakowanie substancji chemicznych i ich mieszanin Dominika Sowa Szczecin, 8 maj 2014 Program prezentacji: 1. Definicja substancji i mieszanin chemicznych wg Ustawy o substancjach chemicznych

Bardziej szczegółowo

Marek Kudła. Rybozymy. RNA nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej

Marek Kudła. Rybozymy. RNA nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej Marek Kudła Rybozymy RNA nośnik informacji i narzędzie katalizy enzymatycznej Właściwości RNA umożliwiają ce kataliz ę enzymatyczną Możliwo ść tworzenia skomplikowanej struktury II i III rzędowej przez

Bardziej szczegółowo

CZUJNIKI TEMPERATURY Dane techniczne

CZUJNIKI TEMPERATURY Dane techniczne CZUJNIKI TEMPERATURY Dane techniczne Str. 1 typ T1001 2000mm 45mm 6mm Czujnik ogólnego przeznaczenia wykonany z giêtkiego przewodu igielitowego. Os³ona elementu pomiarowego zosta³a wykonana ze stali nierdzewnej.

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA

SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA SCENARIUSZ ZAJĘĆ SZKOLNEGO KOŁA NAUKOWEGO Z PRZEDMIOTU CHEMIA PROWADZONEGO W RAMACH PROJEKTU AKADEMIA UCZNIOWSKA Temat lekcji Jak dowieść, że woda ma wzór H 2 O? Na podstawie pracy uczniów pod opieką Tomasza

Bardziej szczegółowo

Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas

Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas Slajd 1 Spektrometria mas i sektroskopia w podczerwieni Slajd 2 Informacje uzyskiwane dzięki spektrometrii mas Masa cząsteczkowa Wzór związku Niektóre informacje dotyczące wzoru strukturalnego związku

Bardziej szczegółowo

Chemia i technologia materiałów barwnych BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ZWIĄZKÓW BARWNYCH WYKORZYSTANIEM SPEKTROFOTOMETRII UV-VIS.

Chemia i technologia materiałów barwnych BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ZWIĄZKÓW BARWNYCH WYKORZYSTANIEM SPEKTROFOTOMETRII UV-VIS. Chemia i technologia materiałów barwnych Ćwiczenia laboratoryjne BADANIE WŁAŚCIWOŚCI ZWIĄZKÓW BARWNYCH WYKORZYSTANIEM SPEKTROFOTOMETRII UV-VIS. Z Opracowanie: dr inŝ. Ewa Wagner-Wysiecka Politechnika Gdańska

Bardziej szczegółowo

TEORIE KWASÓW I ZASAD.

TEORIE KWASÓW I ZASAD. TERIE KWASÓW I ZASAD. Teoria Arrheniusa (nagroda Nobla 1903 r). Kwas kaŝda substancja, która dostarcza jony + do roztworu. A + + A Zasada kaŝda substancja, która dostarcza jony do roztworu. M M + + Reakcja

Bardziej szczegółowo

Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska

Zarządzanie projektami. wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska Zarządzanie projektami wykład 1 dr inż. Agata Klaus-Rosińska 1 DEFINICJA PROJEKTU Zbiór działań podejmowanych dla zrealizowania określonego celu i uzyskania konkretnego, wymiernego rezultatu produkt projektu

Bardziej szczegółowo

SPEKTROSKOPIA LASEROWA

SPEKTROSKOPIA LASEROWA SPEKTROSKOPIA LASEROWA Spektroskopia laserowa dostarcza wiedzy o naturze zjawisk zachodz cych na poziomie atomów i cz steczek oraz oddzia ywaniu promieniowania z materi i nale y do jednej z najwa niejszych

Bardziej szczegółowo

4. OCENA JAKOŒCI POWIETRZA W AGLOMERACJI GDAÑSKIEJ

4. OCENA JAKOŒCI POWIETRZA W AGLOMERACJI GDAÑSKIEJ 4. OCENA JAKOŒCI POWIETRZA 4.1. Ocena jakoœci powietrza w odniesieniu do norm dyspozycyjnych O jakoœci powietrza na danym obszarze decyduje œredni poziom stê eñ zanieczyszczeñ w okresie doby, sezonu, roku.

Bardziej szczegółowo

Stechiometria równań reakcji chemicznych, objętość gazów w warunkach odmiennych od warunków normalnych (0 o C 273K, 273hPa)

Stechiometria równań reakcji chemicznych, objętość gazów w warunkach odmiennych od warunków normalnych (0 o C 273K, 273hPa) Karta pracy I/2a Stechiometria równań reakcji chemicznych, objętość gazów w warunkach odmiennych od warunków normalnych (0 o C 273K, 273hPa) I. Stechiometria równań reakcji chemicznych interpretacja równań

Bardziej szczegółowo

Ćwiczenie: "Ruch harmoniczny i fale"

Ćwiczenie: Ruch harmoniczny i fale Ćwiczenie: "Ruch harmoniczny i fale" Opracowane w ramach projektu: "Wirtualne Laboratoria Fizyczne nowoczesną metodą nauczania realizowanego przez Warszawską Wyższą Szkołę Informatyki. Zakres ćwiczenia:

Bardziej szczegółowo

spektroskopia UV Vis (cz. 2)

spektroskopia UV Vis (cz. 2) spektroskopia UV Vis (cz. 2) spektroskopia UV-Vis dlaczego? wiele związków organicznych posiada chromofory, które absorbują w zakresie UV duża czułość: zastosowanie w badaniach kinetyki reakcji spektroskop

Bardziej szczegółowo

Kuratorium Oświaty w Lublinie

Kuratorium Oświaty w Lublinie Kuratorium Oświaty w Lublinie ZESTAW ZADAŃ KONKURSOWYCH Z CHEMII DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW ROK SZKOLNY 2014/2015 KOD UCZNIA ETAP OKRĘGOWY Instrukcja dla ucznia 1. Zestaw konkursowy zawiera 12 zadań. 2. Przed

Bardziej szczegółowo

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp

TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp TEST dla stanowisk robotniczych sprawdzający wiedzę z zakresu bhp 1. Informacja o pracownikach wyznaczonych do udzielania pierwszej pomocy oraz o pracownikach wyznaczonych do wykonywania działań w zakresie

Bardziej szczegółowo

PREZENTACJA INFORMACJI FINANSOWEJ w analizach i modelowaniu finansowym. - dane z rynków finansowych DANE RÓD OWE

PREZENTACJA INFORMACJI FINANSOWEJ w analizach i modelowaniu finansowym. - dane z rynków finansowych DANE RÓD OWE DANE RÓD OWE PREZENTACJA INFORMACJI FINANSOWEJ - dane z rynków finansowych - w formie baz danych - w formie tabel na stronach internetowych - w formie plików tekstowych o uk³adzie kolumnowym - w formie

Bardziej szczegółowo

Projekt Studenckiego Koła Naukowego CREO BUDOWA GENERATORA WODORU

Projekt Studenckiego Koła Naukowego CREO BUDOWA GENERATORA WODORU Projekt Studenckiego Koła Naukowego CREO BUDOWA GENERATORA WODORU Stanowisko testowe Opracował Tomasz Piaścik Wprowadzenie Malejące zasoby naturalne, wpływ na środowisko naturalne i ciągle rosnące potrzeby

Bardziej szczegółowo

Automatyzacja pakowania

Automatyzacja pakowania Automatyzacja pakowania Maszyny pakuj¹ce do worków otwartych Pe³na oferta naszej firmy dostêpna jest na stronie internetowej www.wikpol.com.pl Maszyny pakuj¹ce do worków otwartych: EWN-SO do pakowania

Bardziej szczegółowo

HiTiN Sp. z o. o. Przekaźnik kontroli temperatury RTT 4/2 DTR. 40 432 Katowice, ul. Szopienicka 62 C tel/fax.: + 48 (32) 353 41 31. www.hitin.

HiTiN Sp. z o. o. Przekaźnik kontroli temperatury RTT 4/2 DTR. 40 432 Katowice, ul. Szopienicka 62 C tel/fax.: + 48 (32) 353 41 31. www.hitin. HiTiN Sp. z o. o. 40 432 Katowice, ul. Szopienicka 62 C tel/fax.: + 48 (32) 353 41 31 www.hitin.pl Przekaźnik kontroli temperatury RTT 4/2 DTR Katowice, 1999 r. 1 1. Wstęp. Przekaźnik elektroniczny RTT-4/2

Bardziej szczegółowo

OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU

OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU OZNACZANIE WAPNIA I MAGNEZU W PRÓBCE WINA METODĄ ATOMOWEJ SPEKTROMETRII ABSORPCYJNEJ Z ATOMIZACJA W PŁOMIENIU Celem ćwiczenia jest zapoznanie z techniką atomowej spektrometrii absorpcyjnej z atomizacją

Bardziej szczegółowo

KONKURS CHEMICZNY DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW

KONKURS CHEMICZNY DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW KONKURS CHEMICZNY DLA UCZNIÓW GIMNAZJÓW WOJEWÓDZTWO WIELKOPOLSKIE Etap wojewódzki rok szkolny 2009/2010 Dane dotyczące ucznia (wypełnia Komisja Konkursowa po rozkodowaniu prac) wylosowany numer uczestnika

Bardziej szczegółowo

7. REZONANS W OBWODACH ELEKTRYCZNYCH

7. REZONANS W OBWODACH ELEKTRYCZNYCH OBWODY SYGNAŁY 7. EZONANS W OBWODAH EEKTYZNYH 7.. ZJAWSKO EZONANS Obwody elektryczne, w których występuje zjawisko rezonansu nazywane są obwodami rezonansowymi lub drgającymi. ozpatrując bezźródłowy obwód

Bardziej szczegółowo

NAJWAŻNIEJSZE ZALETY LAMP DIODOWYCH

NAJWAŻNIEJSZE ZALETY LAMP DIODOWYCH NAJWAŻNIEJSZE ZALETY LAMP DIODOWYCH Pozwalają zaoszczędzić do 80% energii elektrycznej i więcej! Strumień światła zachowuje 100% jakości w okresie eksploatacji nawet do 50.000 do 70.000 h tj. w okresie

Bardziej szczegółowo

Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r.

Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r. Nagroda Nobla z fizjologii i medycyny w 2004 r. Receptory zapachu i organizacja systemu węchowego Takao Ishikawa, M.Sc. Zakład Biologii Molekularnej Instytut Biochemii Uniwersytetu Warszawskiego 10 mln

Bardziej szczegółowo

Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu

Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Techniki korekcyjne wykorzystywane w metodzie kinesiotapingu Jak ju wspomniano, kinesiotaping mo e byç stosowany jako osobna metoda terapeutyczna, jak równie mo e stanowiç uzupe nienie innych metod fizjoterapeutycznych.

Bardziej szczegółowo

Lekcja 173, 174. Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe.

Lekcja 173, 174. Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe. Lekcja 173, 174 Temat: Silniki indukcyjne i pierścieniowe. Silnik elektryczny asynchroniczny jest maszyną elektryczną zmieniającą energię elektryczną w energię mechaniczną, w której wirnik obraca się z

Bardziej szczegółowo

INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201

INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: 0101872HC8201 INSTRUKCJA OBSŁUGI URZĄDZENIA: PZ-41SLB-E PL 0101872HC8201 2 Dziękujemy za zakup urządzeń Lossnay. Aby uŝytkowanie systemu Lossnay było prawidłowe i bezpieczne, przed pierwszym uŝyciem przeczytaj niniejszą

Bardziej szczegółowo

I B. EFEKT FOTOWOLTAICZNY. BATERIA SŁONECZNA

I B. EFEKT FOTOWOLTAICZNY. BATERIA SŁONECZNA 1 OPTOELEKTRONKA B. EFEKT FOTOWOLTACZNY. BATERA SŁONECZNA Cel ćwiczenia: 1.Zbadanie zależności otoprądu zwarcia i otonapięcia zwarcia od natężenia oświetlenia. 2. Wyznaczenie sprawności energetycznej baterii

Bardziej szczegółowo

PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP

PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP Warszawa, dnia 04 września 2015 r. RZECZPOSPOLITA POLSKA MINISTER FINANSÓW PL-LS.054.24.2015 Pani Małgorzata Kidawa Błońska Marszałek Sejmu RP W związku z interpelacją nr 34158 posła Jana Warzechy i posła

Bardziej szczegółowo

LASERY I ICH ZASTOSOWANIE

LASERY I ICH ZASTOSOWANIE LASERY CH ZASTOSOWANE Laboratorium nstrukcja do ćwiczenia nr Temat: Pomiar mocy wiązki laserowej 3. POMAR MOCY WĄZK LASEROWEJ LASERA He - Ne 3.1. Cel ćwiczenia. Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z metodą

Bardziej szczegółowo

WYZNACZANIE PRZYSPIESZENIA ZIEMSKIEGO ZA POMOCĄ WAHADŁA REWERSYJNEGO I MATEMATYCZNEGO

WYZNACZANIE PRZYSPIESZENIA ZIEMSKIEGO ZA POMOCĄ WAHADŁA REWERSYJNEGO I MATEMATYCZNEGO Nr ćwiczenia: 101 Prowadzący: Data 21.10.2009 Sprawozdanie z laboratorium Imię i nazwisko: Wydział: Joanna Skotarczyk Informatyki i Zarządzania Semestr: III Grupa: I5.1 Nr lab.: 1 Przygotowanie: Wykonanie:

Bardziej szczegółowo

Wyznaczanie współczynnika sprężystości sprężyn i ich układów

Wyznaczanie współczynnika sprężystości sprężyn i ich układów Ćwiczenie 63 Wyznaczanie współczynnika sprężystości sprężyn i ich układów 63.1. Zasada ćwiczenia W ćwiczeniu określa się współczynnik sprężystości pojedynczych sprężyn i ich układów, mierząc wydłużenie

Bardziej szczegółowo

Jerzy Stopa*, Stanis³aw Rychlicki*, Pawe³ Wojnarowski* ZASTOSOWANIE ODWIERTÓW MULTILATERALNYCH NA Z O ACH ROPY NAFTOWEJ W PÓ NEJ FAZIE EKSPLOATACJI

Jerzy Stopa*, Stanis³aw Rychlicki*, Pawe³ Wojnarowski* ZASTOSOWANIE ODWIERTÓW MULTILATERALNYCH NA Z O ACH ROPY NAFTOWEJ W PÓ NEJ FAZIE EKSPLOATACJI WIERTNICTWO NAFTA GAZ TOM 24 ZESZYT 1 2007 Jerzy Stopa*, Stanis³aw Rychlicki*, Pawe³ Wojnarowski* ZASTOSOWANIE ODWIERTÓW MULTILATERALNYCH NA Z O ACH ROPY NAFTOWEJ W PÓ NEJ FAZIE EKSPLOATACJI 1. WPROWADZENIE

Bardziej szczegółowo

Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe

Projekt MES. Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe Projekt MES Wykonali: Lidia Orkowska Mateusz Wróbel Adam Wysocki WBMIZ, MIBM, IMe 1. Ugięcie wieszaka pod wpływem przyłożonego obciążenia 1.1. Wstęp Analizie poddane zostało ugięcie wieszaka na ubrania

Bardziej szczegółowo

Olej rzepakowy, jako paliwo do silników z zapłonem samoczynnym

Olej rzepakowy, jako paliwo do silników z zapłonem samoczynnym Coraz częściej jako paliwo stosuje się biokomponenty powstałe z roślin oleistych. Nie mniej jednak właściwości fizykochemiczne oleju napędowego i oleju powstałego z roślin znacząco różnią się miedzy sobą.

Bardziej szczegółowo

ZA CZNIK C: FUNKCJE KLAWISZY I SPOSOBY WPROWADZANIA PARAMETRÓW

ZA CZNIK C: FUNKCJE KLAWISZY I SPOSOBY WPROWADZANIA PARAMETRÓW ZA CZNIKI ZA CZNIK C: FUNKCJE KLAWISZY I SPOSOBY WPROWADZANIA PARAMETRÓW Pola, do których wprowadzamy dane, mog¹ byæ: znakowe, numeryczne, typu daty oraz typu memo (pola tekstowe). Istniej¹ ró nice w wykorzystaniu

Bardziej szczegółowo

Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI

Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI Techniczne nauki М.М.Zheplinska, A.S.Bessarab Narodowy uniwersytet spożywczych technologii, Кijow STOSOWANIE PARY WODNEJ SKRAPLANIA KAWITACJI SKLAROWANEGO SOKU JABŁKOWEGO Skutecznym sposobem leczenia soku

Bardziej szczegółowo

PL 215455 B1. PRZEMYSŁOWY INSTYTUT MOTORYZACJI, Warszawa, PL 25.05.2009 BUP 11/09

PL 215455 B1. PRZEMYSŁOWY INSTYTUT MOTORYZACJI, Warszawa, PL 25.05.2009 BUP 11/09 PL 215455 B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 215455 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 383749 (51) Int.Cl. B62M 23/02 (2006.01) B62M 6/60 (2010.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Bardziej szczegółowo

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH. Wniosek DECYZJA RADY

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH. Wniosek DECYZJA RADY KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH Bruksela, dnia 13.12.2006 KOM(2006) 796 wersja ostateczna Wniosek DECYZJA RADY w sprawie przedłużenia okresu stosowania decyzji 2000/91/WE upoważniającej Królestwo Danii i

Bardziej szczegółowo

Temat: Funkcje. Własności ogólne. A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1

Temat: Funkcje. Własności ogólne. A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1 Temat: Funkcje. Własności ogólne A n n a R a j f u r a, M a t e m a t y k a s e m e s t r 1, W S Z i M w S o c h a c z e w i e 1 Kody kolorów: pojęcie zwraca uwagę * materiał nieobowiązkowy A n n a R a

Bardziej szczegółowo

PODSTAWY OBLICZEŃ CHEMICZNYCH DLA MECHANIKÓW

PODSTAWY OBLICZEŃ CHEMICZNYCH DLA MECHANIKÓW PODSTAWY OBLICZEŃ CHEMICZNYCH DLA MECHANIKÓW Opracowanie: dr inż. Krystyna Moskwa, dr Wojciech Solarski 1. Termochemia. Każda reakcja chemiczna związana jest z wydzieleniem lub pochłonięciem energii, najczęściej

Bardziej szczegółowo

Elementy cyfrowe i układy logiczne

Elementy cyfrowe i układy logiczne Elementy cyfrowe i układy logiczne Wykład Legenda Zezwolenie Dekoder, koder Demultiplekser, multiplekser 2 Operacja zezwolenia Przykład: zamodelować podsystem elektroniczny samochodu do sterowania urządzeniami:

Bardziej szczegółowo

Podstawowe pojęcia: Populacja. Populacja skończona zawiera skończoną liczbę jednostek statystycznych

Podstawowe pojęcia: Populacja. Populacja skończona zawiera skończoną liczbę jednostek statystycznych Podstawowe pojęcia: Badanie statystyczne - zespół czynności zmierzających do uzyskania za pomocą metod statystycznych informacji charakteryzujących interesującą nas zbiorowość (populację generalną) Populacja

Bardziej szczegółowo

UKŁAD ROZRUCHU SILNIKÓW SPALINOWYCH

UKŁAD ROZRUCHU SILNIKÓW SPALINOWYCH UKŁAD ROZRUCHU SILNIKÓW SPALINOWYCH We współczesnych samochodach osobowych są stosowane wyłącznie rozruszniki elektryczne składające się z trzech zasadniczych podzespołów: silnika elektrycznego; mechanizmu

Bardziej szczegółowo

Innowacyjna gospodarka elektroenergetyczna gminy Gierałtowice

Innowacyjna gospodarka elektroenergetyczna gminy Gierałtowice J. Bargiel, H. Grzywok, M. Pyzik, A. Nowak, D. Góralski Innowacyjna gospodarka elektroenergetyczna gminy Gierałtowice Streszczenie W artykule przedstawiono główne elektroenergetyczne innowacyjne realizacje

Bardziej szczegółowo

Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence.

Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence. Informacje dla kadry zarządzającej Zobacz to na własne oczy. Przyszłość już tu jest dzięki rozwiązaniu Cisco TelePresence. 2010 Cisco i/lub firmy powiązane. Wszelkie prawa zastrzeżone. Ten dokument zawiera

Bardziej szczegółowo

HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.

HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs. HAŚKO I SOLIŃSKA SPÓŁKA PARTNERSKA ADWOKATÓW ul. Nowa 2a lok. 15, 50-082 Wrocław tel. (71) 330 55 55 fax (71) 345 51 11 e-mail: kancelaria@mhbs.pl Wrocław, dnia 22.06.2015 r. OPINIA przedmiot data Praktyczne

Bardziej szczegółowo

Metrologia cieplna i przepływowa

Metrologia cieplna i przepływowa Metrologia cieplna i przepływowa Systemy, Maszyny i Urządzenia Energetyczne, I rok mgr Pomiar małych ciśnień Instrukcja do ćwiczenia Katedra Systemów Energetycznych i Urządzeń Ochrony Środowiska AGH Kraków

Bardziej szczegółowo

Krótka informacja o instytucjonalnej obs³udze rynku pracy

Krótka informacja o instytucjonalnej obs³udze rynku pracy Agnieszka Miler Departament Rynku Pracy Ministerstwo Gospodarki, Pracy i Polityki Spo³ecznej Krótka informacja o instytucjonalnej obs³udze rynku pracy W 2000 roku, zosta³o wprowadzone rozporz¹dzeniem Prezesa

Bardziej szczegółowo

1. Rozwiązać układ równań { x 2 = 2y 1

1. Rozwiązać układ równań { x 2 = 2y 1 Dzień Dziecka z Matematyką Tomasz Szymczyk Piotrków Trybunalski, 4 czerwca 013 r. Układy równań szkice rozwiązań 1. Rozwiązać układ równań { x = y 1 y = x 1. Wyznaczając z pierwszego równania zmienną y,

Bardziej szczegółowo

W tym elemencie większość zdających nie zapisywała za pomocą równania reakcji procesu zobojętniania tlenku sodu mianowanym roztworem kwasu solnego.

W tym elemencie większość zdających nie zapisywała za pomocą równania reakcji procesu zobojętniania tlenku sodu mianowanym roztworem kwasu solnego. W tym elemencie większość zdających nie zapisywała za pomocą równania reakcji procesu zobojętniania tlenku sodu mianowanym roztworem kwasu solnego. Ad. IV. Wykaz prac według kolejności ich wykonania. Ten

Bardziej szczegółowo

Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT. Departament Ceł, Ministerstwo Finansów

Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT. Departament Ceł, Ministerstwo Finansów Stan prac w zakresie wdrożenia systemów operacyjnych: NCTS2, AIS/INTRASTAT, AES, AIS/ICS i AIS/IMPORT Departament Ceł, Ministerstwo Finansów Usługa e-tranzyt System NCTS 2 Aktualny stan wdrożenia Ogólnopolskie

Bardziej szczegółowo

OŚWIETLENIE PRZESZKLONEJ KLATKI SCHODOWEJ

OŚWIETLENIE PRZESZKLONEJ KLATKI SCHODOWEJ OŚWIETLENIE PRZESZKLONEJ KLATKI SCHODOWEJ Przykład aplikacji: rys. 1 rys. 2 rys. 3 rys. 4 W tym przypadku do sterowania oświetleniem wykorzystano przekaźniki fi rmy Finder: wyłącznik zmierzchowy 11.01.8.230.0000

Bardziej szczegółowo

INSTRUKCJA OBSŁUGI WD2250A. WATOMIERZ 0.3W-2250W firmy MCP

INSTRUKCJA OBSŁUGI WD2250A. WATOMIERZ 0.3W-2250W firmy MCP INSTRUKCJA OBSŁUGI WD2250A WATOMIERZ 0.3W-2250W firmy MCP 1. CHARAKTERYSTYKA TECHNICZNA Zakresy prądowe: 0,1A, 0,5A, 1A, 5A. Zakresy napięciowe: 3V, 15V, 30V, 240V, 450V. Pomiar mocy: nominalnie od 0.3

Bardziej szczegółowo

Kto poniesie koszty redukcji emisji CO2?

Kto poniesie koszty redukcji emisji CO2? Kto poniesie koszty redukcji emisji CO2? Autor: prof. dr hab. inŝ. Władysław Mielczarski, W zasadzie kaŝdy dziennikarz powtarza znaną formułę, Ŝe nie ma darmowych obiadów 1. Co oznacza, Ŝe kaŝde podejmowane

Bardziej szczegółowo

Agrofi k zy a Wyk Wy ł k ad V Marek Kasprowicz

Agrofi k zy a Wyk Wy ł k ad V Marek Kasprowicz Agrofizyka Wykład V Marek Kasprowicz Spektroskopia p nauka o powstawaniu i interpretacji widm powstających w wyniku oddziaływań wszelkich rodzajów promieniowania na materię ę rozumianą jako zbiorowisko

Bardziej szczegółowo

GEO-SYSTEM Sp. z o.o. GEO-RCiWN Rejestr Cen i Wartości Nieruchomości Podręcznik dla uŝytkowników modułu wyszukiwania danych Warszawa 2007

GEO-SYSTEM Sp. z o.o. GEO-RCiWN Rejestr Cen i Wartości Nieruchomości Podręcznik dla uŝytkowników modułu wyszukiwania danych Warszawa 2007 GEO-SYSTEM Sp. z o.o. 02-732 Warszawa, ul. Podbipięty 34 m. 7, tel./fax 847-35-80, 853-31-15 http:\\www.geo-system.com.pl e-mail:geo-system@geo-system.com.pl GEO-RCiWN Rejestr Cen i Wartości Nieruchomości

Bardziej szczegółowo

Spektroskopia UV-VIS zagadnienia

Spektroskopia UV-VIS zagadnienia Spektroskopia absorbcyjna to dziedzina, która obejmuje metody badania materii przy użyciu promieniowania elektromagnetycznego, które może z tą materią oddziaływać. Spektroskopia UV-VS zagadnienia promieniowanie

Bardziej szczegółowo

DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15

DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15 DE-WZP.261.11.2015.JJ.3 Warszawa, 2015-06-15 Wykonawcy ubiegający się o udzielenie zamówienia Dotyczy: postępowania prowadzonego w trybie przetargu nieograniczonego na Usługę druku książek, nr postępowania

Bardziej szczegółowo

Egzamin gimnazjalny. Biologia. Także w wersji online TRENING PRZED EGZAMINEM. Sprawdź, czy zdasz!

Egzamin gimnazjalny. Biologia. Także w wersji online TRENING PRZED EGZAMINEM. Sprawdź, czy zdasz! Egzamin gimnazjalny 3 Biologia TRENING PRZED EGZAMINEM Także w wersji online Sprawdź, czy zdasz! Spis treści Zestaw 1: Związki chemiczne budujące organizmy oraz pozyskiwanie i wykorzystywanie energii 5

Bardziej szczegółowo

Dobór nastaw PID regulatorów LB-760A i LB-762

Dobór nastaw PID regulatorów LB-760A i LB-762 1 z 5 Dobór nastaw PID regulatorów LB-760A i LB-762 Strojenie regulatorów LB-760A i LB-762 Nastawy regulatora PID Regulatory PID (rolnicze np.: LB-760A - poczynając od wersji 7.1 programu ładowalnego,

Bardziej szczegółowo

Dr inż. Andrzej Tatarek. Siłownie cieplne

Dr inż. Andrzej Tatarek. Siłownie cieplne Dr inż. Andrzej Tatarek Siłownie cieplne 1 Wykład 3 Sposoby podwyższania sprawności elektrowni 2 Zwiększenie sprawności Metody zwiększenia sprawności elektrowni: 1. podnoszenie temperatury i ciśnienia

Bardziej szczegółowo

PRZEWODNIK PO PRZEDMIOCIE

PRZEWODNIK PO PRZEDMIOCIE Nazwa przedmiotu: Kierunek: Inżynieria Biomedyczna Rodzaj przedmiotu: obowiązkowy moduł kierunkowy ogólny Rodzaj zajęć: wykład, ćwiczenia, laboratorium CHEMIA Chemistry Forma studiów: studia stacjonarne

Bardziej szczegółowo

REGULAMIN TURNIEJU SPORTOWEJ GRY KARCIANEJ KANASTA W RAMACH I OGÓLNOPOLSKIEGO FESTIWALU GIER UMYSŁOWYCH 55+ GORZÓW WLKP. 2013 R.

REGULAMIN TURNIEJU SPORTOWEJ GRY KARCIANEJ KANASTA W RAMACH I OGÓLNOPOLSKIEGO FESTIWALU GIER UMYSŁOWYCH 55+ GORZÓW WLKP. 2013 R. REGULAMIN TURNIEJU SPORTOWEJ GRY KARCIANEJ KANASTA W RAMACH I OGÓLNOPOLSKIEGO FESTIWALU GIER UMYSŁOWYCH 55+ GORZÓW WLKP. 2013 R. Termin: 13 kwietnia 2013 r. godz. 10:45 15:45 Miejsce: WiMBP im. Zbigniewa

Bardziej szczegółowo

Współczesne nowoczesne budownictwo pozwala na wyrażenie indywidualnego stylu domu..

Współczesne nowoczesne budownictwo pozwala na wyrażenie indywidualnego stylu domu.. Współczesne nowoczesne budownictwo pozwala na wyrażenie indywidualnego stylu domu.. w którym będziemy mieszkać. Coraz więcej osób, korzystających ze standardowych projektów, decyduje się nadać swojemu

Bardziej szczegółowo

Ogólne Warunki Ubezpieczenia PTU ASSISTANCE I.

Ogólne Warunki Ubezpieczenia PTU ASSISTANCE I. Ogólne Warunki Ubezpieczenia PTU ASSISTANCE I 1. 2. 3. 1. 1 Niniejsze Ogólne Warunki Ubezpieczenia PTU ASSISTANCE I, zwane dalej OWU, stosuje siê w umowach ubezpieczenia PTU ASSISTANCE I zawieranych przez

Bardziej szczegółowo

Cel modelowania neuronów realistycznych biologicznie:

Cel modelowania neuronów realistycznych biologicznie: Sieci neuropodobne XI, modelowanie neuronów biologicznie realistycznych 1 Cel modelowania neuronów realistycznych biologicznie: testowanie hipotez biologicznych i fizjologicznych eksperymenty na modelach

Bardziej szczegółowo

Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach?

Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach? Czy przedsiêbiorstwo, którym zarz¹dzasz, intensywnie siê rozwija, ma wiele oddzia³ów lub kolejne lokalizacje w planach? Czy masz niedosyt informacji niezbêdnych do tego, by mieæ pe³en komfort w podejmowaniu

Bardziej szczegółowo

Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą

Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą Warunki Oferty PrOmOcyjnej usługi z ulgą 1. 1. Opis Oferty 1.1. Oferta Usługi z ulgą (dalej Oferta ), dostępna będzie w okresie od 16.12.2015 r. do odwołania, jednak nie dłużej niż do dnia 31.03.2016 r.

Bardziej szczegółowo

Licencję Lekarską PZPN mogą uzyskać osoby spełniające następujące wymagania:

Licencję Lekarską PZPN mogą uzyskać osoby spełniające następujące wymagania: Uchwała nr III/46 z dnia 19 marca 2014 roku Zarządu Polskiego Związku Piłki Nożnej w sprawie zasad przyznawania licencji dla lekarzy pracujących w klubach Ekstraklasy, I i II ligi oraz reprezentacjach

Bardziej szczegółowo

INSTRUKCJA SERWISOWA. Wprowadzenie nowego filtra paliwa PN 874060 w silnikach ROTAX typ 912 is oraz 912 is Sport OPCJONALNY

INSTRUKCJA SERWISOWA. Wprowadzenie nowego filtra paliwa PN 874060 w silnikach ROTAX typ 912 is oraz 912 is Sport OPCJONALNY Wprowadzenie nowego filtra paliwa PN 874060 w silnikach ROTAX typ 912 is oraz 912 is Sport ATA System: Układ paliwowy OPCJONALNY 1) Zastosowanie Aby osiągnąć zadowalające efekty, procedury zawarte w niniejszym

Bardziej szczegółowo

WZORU UŻYTKOWEGO EGZEMPLARZ ARCHIWALNY. d2)opis OCHRONNY. (19) PL (n)62894. Centralny Instytut Ochrony Pracy, Warszawa, PL

WZORU UŻYTKOWEGO EGZEMPLARZ ARCHIWALNY. d2)opis OCHRONNY. (19) PL (n)62894. Centralny Instytut Ochrony Pracy, Warszawa, PL RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej d2)opis OCHRONNY WZORU UŻYTKOWEGO (21) Numer zgłoszenia: 112772 (22) Data zgłoszenia: 29.11.2001 EGZEMPLARZ ARCHIWALNY (19) PL (n)62894 (13)

Bardziej szczegółowo

TABELA ZGODNOŚCI. W aktualnym stanie prawnym pracodawca, który przez okres 36 miesięcy zatrudni osoby. l. Pornoc na rekompensatę dodatkowych

TABELA ZGODNOŚCI. W aktualnym stanie prawnym pracodawca, który przez okres 36 miesięcy zatrudni osoby. l. Pornoc na rekompensatę dodatkowych -...~.. TABELA ZGODNOŚCI Rozporządzenie Komisji (UE) nr 651/2014 z dnia 17 czerwca 2014 r. uznające niektóre rodzaje pomocy za zgodne z rynkiem wewnętrznym w zastosowaniu art. 107 i 108 Traktatu (Dz. Urz.

Bardziej szczegółowo

Wst p do obs ugi bazy danych Reaxys

Wst p do obs ugi bazy danych Reaxys Wst p do obs ugi bazy danych Reaxys Baza danych Reaxys pozwala na przeszukiwanie literatury z zakresu chemii, biologii i nauk pokrewnych. Przeszukiwanie literatury odbywa si mo e na ró nych drogach: -

Bardziej szczegółowo

ROZPORZ DZENIE MINISTRA GOSPODARKI z dnia 11 sierpnia 2000 r. w sprawie przeprowadzania kontroli przez przedsiêbiorstwa energetyczne.

ROZPORZ DZENIE MINISTRA GOSPODARKI z dnia 11 sierpnia 2000 r. w sprawie przeprowadzania kontroli przez przedsiêbiorstwa energetyczne. ROZPORZ DZENIE MINISTRA GOSPODARKI z dnia 11 sierpnia 2000 r. w sprawie przeprowadzania kontroli przez przedsiêbiorstwa energetyczne. (Dz. U. Nr 75, poz. 866, z dnia 15 wrzeœnia 2000 r.) Na podstawie art.

Bardziej szczegółowo

KONKURS PRZEDMIOTOWY Z FIZYKI dla uczniów gimnazjów województwa lubuskiego 23 marca 2012 r. zawody III stopnia (finałowe)

KONKURS PRZEDMIOTOWY Z FIZYKI dla uczniów gimnazjów województwa lubuskiego 23 marca 2012 r. zawody III stopnia (finałowe) Pieczęć KONKURS PRZEDMIOTOWY Z FIZYKI dla uczniów gimnazjów województwa lubuskiego 23 marca 2012 r. zawody III stopnia (finałowe) Witamy Cię na trzecim etapie Konkursu Przedmiotowego z Fizyki i życzymy

Bardziej szczegółowo

8. Zginanie ukośne. 8.1 Podstawowe wiadomości

8. Zginanie ukośne. 8.1 Podstawowe wiadomości 8. 1 8. ginanie ukośne 8.1 Podstawowe wiadomości ginanie ukośne zachodzi w przypadku, gdy płaszczyzna działania obciążenia przechodzi przez środek ciężkości przekroju pręta jednak nie pokrywa się z żadną

Bardziej szczegółowo

SCENARIUSZ LEKCJI WYCHOWAWCZEJ: AGRESJA I STRES. JAK SOBIE RADZIĆ ZE STRESEM?

SCENARIUSZ LEKCJI WYCHOWAWCZEJ: AGRESJA I STRES. JAK SOBIE RADZIĆ ZE STRESEM? SCENARIUSZ LEKCJI WYCHOWAWCZEJ: AGRESJA I STRES. JAK SOBIE RADZIĆ ZE STRESEM? Cele: - rozpoznawanie oznak stresu, - rozwijanie umiejętności radzenia sobie ze stresem, - dostarczenie wiedzy na temat sposobów

Bardziej szczegółowo

wêgiel 19 28 38 48 59 70 79 88 drewno 15 21 28 36 44 52 60 68

wêgiel 19 28 38 48 59 70 79 88 drewno 15 21 28 36 44 52 60 68 wêgiel drewno 19 28 38 48 59 70 79 88 15 21 28 36 44 52 60 68 Kocio³ SOLID EKO jest eliwnym, automatycznym kot³em na paliwa sta³e wyposa onym w dodatkowe rusztowe palenisko sta³e do spalania drewna kawa³kowego,

Bardziej szczegółowo

Edycja geometrii w Solid Edge ST

Edycja geometrii w Solid Edge ST Edycja geometrii w Solid Edge ST Artykuł pt.: " Czym jest Technologia Synchroniczna a czym nie jest?" zwracał kilkukrotnie uwagę na fakt, że nie należy mylić pojęć modelowania bezpośredniego i edycji bezpośredniej.

Bardziej szczegółowo

Badanie silnika asynchronicznego jednofazowego

Badanie silnika asynchronicznego jednofazowego Badanie silnika asynchronicznego jednofazowego Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest poznanie budowy i zasady funkcjonowania silnika jednofazowego. W ramach ćwiczenia badane są zmiany wartości prądu rozruchowego

Bardziej szczegółowo

Metoda LBL (ang. Layer by Layer, pol. Warstwa Po Warstwie). Jest ona metodą najprostszą.

Metoda LBL (ang. Layer by Layer, pol. Warstwa Po Warstwie). Jest ona metodą najprostszą. Metoda LBL (ang. Layer by Layer, pol. Warstwa Po Warstwie). Jest ona metodą najprostszą. Po pierwsze - notacja - trzymasz swoją kostkę w rękach? Widzisz ścianki, którymi można ruszać? Notacja to oznaczenie

Bardziej szczegółowo

Procedura ewakuacji szkoły Cel procedury

Procedura ewakuacji szkoły Cel procedury Procedura ewakuacji szkoły Cel procedury Zapewnienie sprawnego przygotowania i przeprowadzenia bezpiecznej ewakuacji uczniów i pracowników Szkoły w sytuacji wystąpienia zagrożenia. I. Przedmiot i zakres

Bardziej szczegółowo

Akademickie Centrum Czystej Energii. Fotoogniwo

Akademickie Centrum Czystej Energii. Fotoogniwo Fotoogniwo 1. Zagadnienia półprzewodniki, pasma energetyczne, energie Fermiego, potencjał dyfuzji, wydajność, akceptor, donor, pasmo walencyjne, pasmo przewodzenia, efekt fotoelektryczny wewnętrzny, pirometr

Bardziej szczegółowo

Zagospodarowanie magazynu

Zagospodarowanie magazynu Zagospodarowanie magazynu Wymagania wobec projektu magazynu - 1 jak najlepsze wykorzystanie pojemności związane z szybkością rotacji i konieczną szybkością dostępu do towaru; im większa wymagana szybkość

Bardziej szczegółowo

ANALOGOWE UKŁADY SCALONE

ANALOGOWE UKŁADY SCALONE ANALOGOWE UKŁADY SCALONE Ćwiczenie to ma na celu zapoznanie z przedstawicielami najważniejszych typów analogowych układów scalonych. Będą to: wzmacniacz operacyjny µa 741, obecnie chyba najbardziej rozpowszechniony

Bardziej szczegółowo