Marta Hajdziona, Andrzej Molski

Transkrypt

1

2 2010, 64, 3-4 PL ISSN ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA: WYKORZYSTANIE TECHNIKI FRET W BADANIACH ZWIJANIA SIÊ I DYNAMIKI KONFORMACYJNEJ RYBOZYMÓW SINGLE-MOLECULE RNA ENZYMOLOGY: USING FRET TO EXPLORE FOLDING AND CONFORMATIONAL DYNAMICS OF RIBOZYMES Marta Hajdziona, Andrzej Molski Pracownia Dynamiki Procesów Fizykochemicznych, Wydzia³ Chemii, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza ul. Grunwaldzka 6, Poznañ Marta.Hajdziona@amu.edu.pl, amolski@amu.edu.pl Abstract Wstêp 1. Budowa, wystêpowanie i rola rybozymów 2. FRET pojedynczych par cz¹steczek (spfret) 3. Fa³dowanie rybozymów 3.1. Rybozym Tetrahymena thermophila 3.2. Rybozym typu hairpin 3.3. Inne uk³ady 4. Aktywnoœæ katalityczna rybozymów i jej sprzê enie z dynamik¹ konformacyjn¹ 4.1. Rybozym Tetrahymena thermophila 4.2. Rybozym typu hairpin 4.3. Inne uk³ady 5. Analiza danych w badaniach pojedynczych cz¹steczek RNA 5.1. Rozk³ady czasów on i off 5.2. Modelowanie i symulacje eksperymentów spfret Podsumowanie i perspektywy Piœmiennictwo cytowane

3 174 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Mgr Marta Hajdziona ukoñczy³a studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Od 2006 roku jest doktorantk¹ w Pracowni Dynamiki Procesów Fizykochemicznych. Prowadzi miêdzy innymi badania dotycz¹ce wyznaczania parametrów kinetycznych z pomiarów FRET pojedynczych cz¹steczek. Celem jej pracy jest znalezienie optymalnych metod analizy danych w pomiarach FRET pojedynczych cz¹steczek. Prof. dr hab. Andrzej Molski jest absolwentem Wydzia³u Matematyki, Fizyki i Chemii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza w Poznaniu. Od roku 2002 kieruje Pracowni¹ Dynamiki Procesów Fizykochemicznych. Obecnie prowadzi badania dotycz¹ce teorii spektroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cz¹steczek. Jest cz³onkiem Polskiego Towarzystwa Chemicznego.

4 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 175 ABSTRACT Ribozymes are biologically important macromolecules that play a crucial role in cell metabolism and functions. Knowledge of folding and catalytic properties of ribozymes can be useful in biotechnology and medicine. In this work, we present a review of single-molecule RNA enzymology with particular emphasis on folding and catalysis observed with single-molecule FRET. Single-molecule spectroscopy provides insight into behaviors of individual molecules without averaging inherent in bulk measurements. In the first section we introduce ribozymes as RNA enzymes [1, 2]. In the second section, we present the structure of RNA molecules and examples of reaction mechanisms (Fig. 1) and function of different types of ribozymes (Fig. 2 5). Next, we review single-molecule FRET spectroscopy (Fig. 6, 7, Eqs. 1, 2). In the fourth section, we present examples of folding dynamics of ribozymes. In the fifth part, we focus on ribozyme catalysis (Fig. 8, 9). We discuss the coupling of conformational dynamics with catalytic reactions. In the last part we present methods of data analysis that can be used to obtain the kinetic rates from single molecule FRET experiments (Fig. 10). Keywords: ribozymes, single-molecule fluorescence spectroscopy, FRET S³owa kluczowe: rybozymy, spektroskopia fluorescencyjna pojedynczych cz¹steczek, FRET

5 176 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI WSTÊP Cz¹steczki RNA maj¹ce w³aœciwoœci katalityczne nazywane s¹ rybozymami. Do lat 80. ubieg³ego wieku uwa ano, e jedynymi substancjami katalizuj¹cymi reakcje w ywych organizmach s¹ bia³ka (enzymy). Prze³om nast¹pi³, gdy Thomas Cech, prowadz¹c badania splicingu RNA maj¹ce na celu znalezienie enzymu katalizuj¹cego wycinanie intronów RNA u Tetrahymena thermophila, stwierdzi³, e w badanych cz¹steczkach splicing zachodzi nawet w nieobecnoœci bia³ek, co oznacza, e sama cz¹steczka RNA ma w³aœciwoœci katalityczne [1]. Równolegle Sidney Altman doszed³ do podobnego wniosku badaj¹c dojrzewanie trna (ang. transfer RNA) w rybosomach [2]. W 1989 r. Cech i Altman otrzymali Nagrodê Nobla z chemii za odkrycie w³aœciwoœci katalitycznych RNA. Istnieje szereg powodów, dla których podejmowane s¹ badania aktywnoœci enzymatycznej rybozymów. Po pierwsze, rybozymy uczestnicz¹ w wa nych reakcjach, których poznanie jest niezbêdne do zrozumienia metabolizmu komórkowego. Po drugie, rybozymy maj¹ zazwyczaj prostsz¹ budowê od enzymów bia³kowych, poniewa sk³adaj¹ siê jedynie z czterech rodzajów monomerów, a tak e ze wzglêdu na komplementarnoœæ miêdzy adenin¹ i uracylem oraz guanin¹ i cytozyn¹. Poniewa rybozymy s¹ mniej z³o one ni enzymy bia³kowe, mechanizm ich dzia³ania powinien byæ prostszy do rozwik³ania. Po trzecie, selektywnoœæ dzia³ania rybozymów mo e byæ wykorzystana w terapii celowanej w RNA, choæ wymaga to jeszcze pokonania wielu problemów zwi¹zanych m.in. ze stabilnoœci¹ chemiczn¹ oligonukleotydów w œrodowisku komórkowym, transportem do odpowiedniego miejsca w komórce, fa³dowaniem do aktywnej konformacji. Po czwarte, najnowsze osi¹gniêcia spektroskopii pojedynczych cz¹steczek pozwalaj¹ na obserwowanie fa³dowania i aktywnoœci pojedynczych cz¹steczek rybozymów, co dostarcza informacji, które s¹ niedostêpne z powodu uœredniania towarzysz¹cego badaniom zespo³ów cz¹steczek w roztworze. Ukaza³ siê szereg prac przegl¹dowych dotycz¹cych rybozymów [3 8]. Niniejsza praca poœwiêcona jest enzymologii pojedynczych cz¹steczek RNA, a w szczególnoœci badaniom ich fa³dowania i sprzê eniu dynamiki konformacyjnej z aktywnoœci¹ katalityczn¹ rybozymów. Jedn¹ z technik s³u ¹cych do badania dynamiki pojedynczych cz¹steczek rybozymów jest rezonansowe przeniesienie energii FRET (ang. Förster Resonance Energy Transfer) pomiêdzy par¹ fluoroforów donorem i akceptorem do³¹czonych do biopolimeru. Fluorescencja pary donor akceptor zale y od odleg³oœci pomiêdzy nimi. Obserwuj¹c zmiany intensywnoœci fluorescencji donora i akceptora mo na uzyskaæ informacje o zmianach konformacyjnych w cz¹steczce. W przypadku rybozymów aktywnoœæ katalityczna jest œciœle zwi¹zana ze zmianami konformacyjnymi w ich strukturze trzeciorzêdowej.

6 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA BUDOWA, WYSTÊPOWANIE I ROLA RYBOZYMÓW Cz¹steczki RNA maj¹ strukturê pierwszorzêdow¹ jednoniciowych ³añcuchów. Cztery zasady nukleinowe mog¹ wytwarzaæ miêdzy sob¹ wi¹zania wodorowe (adenina z uracylem i cytozyna z guanin¹). Powstaj¹ w ten sposób motywy strukturalne (pêtle, wybrzuszenia, spinki), bêd¹ce elementami struktury drugorzêdowej cz¹steczki RNA. Elementy te mog¹ oddzia³ywaæ ze sob¹, tworz¹c przestrzennie sfa³dowan¹ strukturê trzeciorzêdow¹. Ze wzglêdu na fakt, e ka dy rybonukleotyd niesie ze sob¹ jeden ³adunek ujemny, fa³dowaniu RNA, tj. procesowi tworzenia siê struktury trzeciorzêdowej, przeszkadza elektrostatyczne odpychanie miêdzy elementami sk³adowymi ³añcucha. Z tego powodu do wytworzenia siê prawid³owej (natywnej) struktury RNA konieczna jest obecnoœæ jonów dodatnich. W komórce mog¹ to byæ m.in. kationy magnezowe lub sodowe. Po opublikowaniu odkryæ Cecha i Altmana pojawi³o siê wiele doniesieñ o aktywnoœci katalitycznej RNA, a tak e o samo-tn¹cych i samo-sk³adaj¹cych siê cz¹steczkach [9, 10]. Ze wzglêdu na budowê i rodzaj przeprowadzanej reakcji wœród rybozymów wyró nia siê introny grupy I, introny grupy II, RNA RNazy P, rybozymy typu hammerhead, hairpin, HDV (ang. Hepatitis Delta Virus), VS (ang. Varkud Satellite), oraz makrokompleksy rybonukleoproteinowe, i spliceosomy [3]. Choæ zdarza siê, e w ywych organizmach dzia³anie rybozymów wspomagane jest przez bia³ka, sam¹ aktywnoœæ katalityczn¹ wykazuje cz¹steczka RNA. Rybozymy przeprowadzaæ mog¹ reakcje transestryfikacji (miêdzy innymi rybozym typu hairpin), transferu nukleotydu (introny grupy I i II), hydrolizy (RNA RNazy P), a tak e syntezy wi¹zania peptydowego (rybosom). Inny podzia³ rybozymów opiera siê na wielkoœci cz¹steczek. Wyró nia siê rybozymy ma³e, o niezbyt skomplikowanej budowie oraz du e, z³o one z licznych czêœci helikalnych i pêtli. Z³o ona struktura trójwymiarowa rybozymów pozwala im na przeprowadzenie reakcji katalitycznej w œciœle okreœlonym miejscu. Rybozymy potrafi¹ nie tylko przeorganizowaæ swoje miejsce aktywne, ale tak e katalizowaæ reakcje poprzez zbli enie do siebie dwóch substratów [11]. Wiêkszoœæ znanych obecnie rybozymów katalizuje reakcje, w wyniku których nastêpuje nieodwracalna zmiana rybozymu, a w konsekwencji utrata w³aœciwoœci katalitycznych. O takich rybozymach bêdziemy mówili, e katalizuj¹ tylko jeden obrót reakcji. Istniej¹ jednak rybozymy, które, podobnie jak enzymy bia³kowe, pozostaj¹ niezmienione w wyniku reakcji. Jest to rybozym wystêpuj¹cy w rybosomie [12], a tak e RNA RNazy P [13]. Rybozymy te mog¹ przeprowadzaæ wiele obrotów reakcji i s¹ katalizatorami w klasycznym rozumieniu tego terminu. W badaniach in vitro wykorzystuje siê czêsto modyfikacje rybozymów zdolnych do katalizowania tylko jednego obrotu reakcji do form mog¹cych katalizowaæ wiele obrotów reakcji.

7 178 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 1. Figure 1. Dwa przyk³ady mechanizmów aktywnoœci katalitycznej rybozymów. A) Intron grupy I: nukleofilowy atak tlenu 3 guanozyny, która nie nale y do rozcinanego ³añcucha RNA. B) Intron grupy II: nukleofilowy atak tlenu 2 nukleotydu, bêd¹cego czêœci¹ intronu wycinanego ³añcucha. W obu przypadkach produktem jest egzon z grup¹ hydroksylow¹ na koñcu 3. Dwa oddzielone wczeœniej intronem egzony ³¹cz¹ siê, a dodatkowym produktem jest intron, na którego koñcu 5 znajduje siê reszta guanozyny Two examples of catalytic activity of ribozymes. A) Group I intron: nucleophilic attack of a 3 oxygen from guanosine that is not part of the cleaved RNA chain. B) Group II intron: nucleophilic attack of a 2 oxygen from nucleotide that belongs to the intron part of the cleaved RNA chain. In both cases the reaction product is an exon with a hydroxyl group at the 3 end. Two exons, separated by an intron, combine, and an additional product is an intron with a guanozine at the 5 end W niniejszej pracy skupiono siê na najlepiej dot¹d zbadanych rybozymach: rybozymie Tetrahymena thermophila (intron grupy I) oraz rybozymie typu hairpin przeprowadzaj¹cym reakcjê transestryfikacji 2'O, zaliczanych odpowiednio do grupy du ych i ma³ych rybozymów. W obu przypadkach s¹ to cz¹steczki, które in vivo katalizuj¹ tylko jeden obrót reakcji. Dla porównania omówiono tak e inne uk³ady, m.in. RNA RNazy P, który katalizuje reakcjê hydrolizy oraz Diels-Alderazê (DAzê), katalizuj¹c¹ reakcjê cykloaddycji substratów nie bêd¹cych nukleotydami [11, 14 15]. Rybozym Tetrahymena thermophila katalizuje wycinanie intronów (niekoduj¹cych fragmentów) w³asnego ³añcucha RNA. Rybozym Tetrahymena thermophila nale y do grupy du ych rybozymów, sk³ada siê z wielu czêœci helikalnych oraz licznych pêtli wewnêtrznych (Rys. 2). Rybozymy typu hairpin bior¹ udzia³ miêdzy innymi w replikacji wirusa mozaiki tytoniowej [16]. W trakcie namna ania tworzy siê ³añcuch komplementarny do satelitarnego RNA, rybozym typu hairpin rozcina komplementarny ³añcuch a nastêpnie liguje go i w ten sposób powstaje matryca, na podstawie której syntetyzowane s¹ potomne cz¹steczki RNA.

8 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 179 Rysunek 2. Figure 2. Budowa rybozymu Tetrahymena thermophila Structure of Tetrahymena thermophila ribozyme Rybozymy typu hairpin mog¹ znacznie ró niæ siê miêdzy sob¹ budow¹. Na Rysunku 3 przedstawiono ogólny schemat budowy dla tej grupy cz¹steczek RNA. Czêœæ aktywna katalitycznie pozostaje niezmienna i sk³ada siê z dwóch helikalnych ramion, na których znajduj¹ siê pêtle wewnêtrzne, z³o one zawsze z takich samych nukleozydów. W sk³ad pozosta³ej, niekatalitycznej czêœci mog¹ wchodziæ ró ne struktury drugorzêdowe. Na przyk³ad naturalna forma rybozymu typu hairpin wirusa mozaiki tytoniowej sk³ada siê z czterech helikalnych ramion: dwóch aktywnych katalitycznie, z pêtlami wewnêtrznymi i dwóch dodatkowych, dziêki którym dzia³anie rybozymu jest szybsze. Zagadnienie to zostanie dok³adniej omówione w rozdzia- ³ach 3.2 i 4.2.

9 180 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 3. Figure 3. Budowa rybozymów typu hairpin. Lini¹ kropkowan¹ oznaczono czêœci budowy cz¹steczki, ró - ni¹ce siê znacznie dla ró nych rybozymów i mog¹ce tworzyæ ró norodne struktury drugorzêdowe. Lini¹ ci¹g³¹ oznaczono g³ówn¹ czêœæ aktywn¹ katalitycznie, sk³adaj¹c¹ siê z dwóch helikalnych ramion, których sk³ad nukleotydowy mo e byæ ró ny. Na tych ramionach znajduj¹ siê pêtle wewnêtrzne, które zbudowane s¹ zawsze z takiej samej sekwencji nukleotydowej i to w ich obrêbie przeprowadzana jest w³aœciwa reakcja katalityczna. Obszar, który jest niezmienny dla ró nych rybozymów nale ¹cych do tej samej grupy nazywa siê regionem konserwatywnym Structure of the hairpin ribozyme. Dotted line: parts of the molecule which can have different secondary structure for different ribozymes. Solid line the main catalytic part containing two helical arms which can be constructed from different nucleotide pairs. The helical arms contain internal loops, always built from the same nucleoside sequence, regardless of the kind of ribozyme. The actual catalytic act takes place at the internal loops. A region that is invariant for different ribozymes is called a conservative region W eksperymentach in vitro badano zarówno naturaln¹ formê rybozymu (Rys. 4A), jak i jego ró ne modyfikacje. W formie naturalnej, po zajœciu reakcji katalitycznej jedna z czêœci substratu pozostaje przy³¹czona do rybozymu [16 18]. Uniemo liwia to przy³¹czenie kolejnego substratu. Podobnie zachowuje siê uproszczona forma rybozymu, pozbawiona dwóch ramion nie zawieraj¹cych pêtli wewnêtrznych (Rys. 4B) [19, 20]. Dalsza modyfikacja, dziêki której obie czêœci rozciêtego substratu od³¹czaj¹ siê, pozwala na odtworzenie rybozymu po reakcji rozcinania i umo liwia przy³¹czanie kolejnego substratu [21 24]. Tak¹ formê nazywaæ bêdziemy form¹ minimaln¹ (Rys. 4C).

10 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 181 Rysunek 4. Figure 4. Modyfikacje rybozymu hairpin wykorzystywane w badaniach pojedynczych cz¹steczek. Lini¹ ci¹g³¹ zaznaczono regiony aktywnie katalitycznie, lini¹ kropkowan¹ oznaczono obszary, które maj¹ wp³yw na szybkoœæ reakcji. Strza³kami oznaczono miejsce unieruchamiania (MU) cz¹steczki oraz miejsce ciêcia (MC) ³añcucha. A) Forma naturalna, B) forma uproszczona pozbawiona ramion nie zawieraj¹cych pêtli wewnêtrznych, C) forma minimalna, która mo e katalizowaæ wielu obrotów reakcji Modifications of the hairpin ribozyme. Solid line: catalytically active regions, dotted line: noncatalytic regions that determine the reaction rate. Arrows: immobilization place (MU) and cleavage place (MC). A) Natural form of the ribozyme, B) Simplified form without the helical arms which do not contain internal lops, C) Minimal form that can catalyze multicyclic reactions RNaza P odgrywa kluczow¹ rolê w dojrzewaniu koñca 5' trna zarówno u bakterii [2], archeowców jak i u organizmów eukariotycznych [25]. RNaza P in vivo wystêpuje w postaci holoenzymu (w akcie katalitycznym wspó³uczestniczy bia³kowy kofaktor). U bakterii kofaktor sk³ada siê z jednej cz¹steczki bia³ka, u archeowców z czterech i u organizmów eukariotycznych z dziewiêciu lub dziesiêciu cz¹steczek bia³ka [13]. In vitro RNaza P wykazuje, w odpowiednich warunkach ph i stê- enia jonów dodatnich, w³aœciwoœci katalityczne nawet w nieobecnoœci czêœci bia³kowych. Rybozymy pochodz¹ce z organizmów eukariotycznych dzia³aj¹ nawet do kilku rzêdów wielkoœci wolniej od bakteryjnych [25]. Mo e byæ to spowodowane faktem wystêpowania ró nic w budowie miejsca przy³¹czania substratu. Innym ciekawym przyk³adem rybozymu jest rybozym katalizuj¹cy cykloaddycjê Dielsa-Aldera [11]. Rybozym ten katalizuje reakcjê miêdzycz¹steczkow¹ miêdzy substratami nie bêd¹cymi cz¹steczkami RNA. Kataliza przeprowadzana jest poprzez zbli anie do siebie substratów. Dzia³anie tego ma³ego rybozymu jest inhibitowane przez powstaj¹cy produkt [15]. DAza (ang. Diels-Alder reaction) katalizuje stereospecyficzne formowanie siê wi¹zania wêgiel wêgiel miêdzy antracenem (dien) i imidem kwasu maleinowego (dienofil).

11 182 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 5. Figure 5. Struktura formy sfa³dowanej Diels-Alderazy. Zaznaczono miejsce unieruchomienia (MU), które stosuje siê w badaniach na poziomie pojedynczych cz¹steczek Folded Diels-Alderase structure. MU immobilization place used in single-molecule measurements 2. FRET POJEDYNCZYCH PAR CZ STECZEK (spfret) Zjawisko FRET polega na bezpromienistym przeniesieniu energii pomiêdzy dwoma fluoroforami, ze wzbudzonego donora na akceptor. Wydajnoœæ przeniesienia energii zale y od stopnia nak³adania siê widm emisji donora i absorpcji akceptora i zmniejsza siê gwa³townie ze wzrostem odleg³oœci miêdzy fluoroforami. Wydajnoœæ przeniesienia energii mo na zapisaæ wzorem [26]: (1) gdzie E wydajnoœæ FRET, R odleg³oœæ miêdzy donorem i akceptorem, a R 0 odleg³oœæ, dla której wydajnoœæ FRET wynosi 0,5. Zasiêg przeniesienia energii FRET to ok. 100 Å. Ze wzglêdu na wysok¹ czu³oœæ na zmianê po³o enia miêdzy fluoroforami zjawisko FRET mo e byæ wykorzystywane do mierzenia zmian odleg³oœci wewn¹trz makrocz¹steczek biologicznych [27, 28]. Wraz z postêpem technicznym sta³o siê mo liwe obserwowanie zjawiska FRET dla pojedynczych par cz¹steczek (ang. single-pair FRET, spfret). Do wykonywania pomiarów wykorzystuje siê miêdzy innymi mikroskop konfokalny. Inn¹ technik¹ jest TIR (ang. Total Internal Reflection), gdzie wykorzystywany jest fakt, e œwiat³o przy przejœciu z oœrodka o wy szym do oœrodka o ni szym wspó³czynniku za³amania pod k¹tem wiêkszym od k¹ta granicznego ulega ca³kowitemu odbiciu wewnêtrznemu. Przystêpny opis technik pomiaru FRET dla pojedynczych par cz¹steczek mo na znaleÿæ w pracy [29].

12 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 183 W idealnych warunkach œwiat³o laserowe wzbudza jedynie cz¹steczkê donora, a fluorescencja akceptora pochodzi jedynie od bezpromienistego przeniesienia energii z donora na akceptor. Wydajnoœæ przeniesienia energii definiuje siê wtedy jako: (2) gdzie: E wydajnoœæ przeniesienia energii, I A intensywnoœæ fluorescencji akceptora, I D intensywnoœæ fluorescencji donora. Zasadê dzia³ania techniki spfret przedstawiono na Rysunku 6. Rysunek 6. Figure 6. Zasada techniki spfret. Po lewej: cz¹steczka donora (szara) i akceptora (czarna) przy³¹czone do biopolimeru. Na œrodku: trajektorie fluorescencji donora (linia szara) i akceptora (linia czarna). Po prawej: trajektorie FRET. A) Du a odleg³oœæ miêdzy fluoroforami powoduje nisk¹ wydajnoœæ przeniesienia energii i obserwuje siê tylko fluorescencjê donora. B) Odleg³oœæ miêdzy fluoroforami jest porównywalna z R 0 (wzór 1), tak e oba barwniki (donor i akceptor) emituj¹ fotony fluorescencji. C) Ma³a odleg³oœæ miêdzy fluoroforami powoduje wysok¹ wydajnoœæ przeniesienia energii i obserwuje siê g³ównie fluorescencjê akceptora Principle of the spfret technique. Left: biopolymer with a donor (gray) and acceptor (black), middle: donor (gray line) and acceptor (black line) fluorescence trajectories. Right: FRET trajectories. A) The distance between the dyes is large, energy transfer is low so only the donor fluorescence is observed. B) The distance between dyes is equal to R 0 (eqn 1), donor and acceptor emit photons of fluorescence. C) Short inter-dye distance and high FRET: the acceptor fluorescence is observed Jeœli donor i akceptor przy³¹czone s¹ do odpowiednio dobranych miejsc rybozymu, zaobserwowaæ mo na charakterystyczn¹ trajektoriê wydajnoœci spfret, która zmienia siê skokowo miêdzy wartoœci¹ wysok¹ (np. E on = 0,8) i nisk¹ (np. E off = 0,2), (Rys. 7).

13 184 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Rysunek 7. Figure 7. A) Przyk³adowe trajektorie fluorescencji pojedynczej cz¹steczki donora (I D linia szara) i akceptora (I A linia czarna) oraz B) obliczona na ich podstawie trajektoria spfret (E = I A /( I A + I D )) A) Example of single-molecule fluorescence trajectories of donor (I D gray line) and acceptor (I A black line). B) the calculated spfret trajectory (E = I A /( I A + I D )) Ze wzglêdu na istnienie ruchów Browna, cz¹steczki zawieszone w roztworze mog¹ opuœciæ objêtoœæ wzbudzania. Aby tego unikn¹æ, cz¹steczki unieruchamia siê na powierzchni szk³a [29]. Jeden ze sposobów polega na pokryciu powierzchni kwarcowej glikolem polietylenowym (ang. PEG), a nastêpnie na³o eniu bia³ka bêd¹cego pochodn¹ awidyny, np. neutrawidynê lub streprawidynê. Bia³ka te wykazuj¹ du e powinowactwo do biotyny, do której przy³¹cza siê z kolei badan¹ cz¹steczkê kwasu nukleinowego (DNA, lub RNA) [29]. Na przyk³ad, bardzo silne oddzia³ywania niekowalencyjne prowadz¹ do sta³ej dysocjacji M dla kompleksu biotyna i streptawidyna. Unieruchomienie mo e wp³ywaæ na w³aœciwoœci cz¹steczek. Istnieje niebezpieczeñstwo, e pozbawiona pewnej liczby stopni swobody cz¹steczka zachowuje siê inaczej ni w warunkach naturalnych. Mo na to (do pewnego stopnia) zweryfikowaæ porównuj¹c wyniki otrzymane dla pojedynczych, unieruchomionych cz¹steczek z wynikami otrzymanymi dla zespo³u cz¹steczek w roztworze. Innym problemem jest fotowybielanie. Jeœli cz¹steczka jest unieruchomiona, fluorofory znajduj¹ siê pod ci¹g³ym dzia³aniem promieniowania wzbudzaj¹cego, co mo e znacznie przyœpieszyæ ich fotowybielanie. Konieczne jest zatem zoptymalizowanie intensywnoœci wzbudzenia, wybór odpowiednich barwników, a tak e zastosowanie efektywnych metod analizy danych. 3. FA DOWANIE RYBOZYMÓW Cz¹steczki RNA wykazuj¹ w³aœciwoœci katalityczne jedynie po uzyskaniu odpowiedniej struktury trzeciorzêdowej. Zrozumienie zale noœci drogi fa³dowania od czynników zewnêtrznych, takich jak stê enie jonów i temperatura, jest niezbêdne dla mo liwoœci kontrolowania procesu uzyskiwania zdolnoœci katalitycznych przez cz¹steczkê biopolimeru. Dotyczy to zarówno enzymów bia³kowych jak i enzymów RNA. Warunkiem poprawnego sfa³dowania RNA jest obecnoœæ dodatnich jonów

14 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 185 metali (np. sodowych, magnezowych). Od ich stê enia zale y po³o enie punktu pocz¹tkowego fa³dowania na powierzchni energii swobodnej, co z kolei determinuje drogê jak¹ musi przebyæ cz¹steczka aby uzyskaæ formê natywn¹. Sfa³dowane cz¹steczki rybozymów wykazuj¹ lokaln¹ dynamikê konformacyjn¹. Na przyk³ad w cz¹steczce rybozymu typu hairpin po³o enie helikalnych ramion fluktuuje pomiêdzy dwoma konformacjami. Konformacjê, w której ramiona zawieraj¹ce pêtle wewnêtrzne znajduj¹ siê blisko siebie nazywaæ bêdziemy form¹ zwiniêt¹ (ang. docked), zaœ konformacjê, w której ramiona zawieraj¹ce pêtle wewnêtrzne oddalone s¹ od siebie na pewn¹ odleg³oœæ nazywaæ bêdziemy form¹ rozwiniêt¹ (ang. undocked) RYBOZYM TETRAHYMENA THERMOPHILA Fa³dowanie rybozymu Tetrahymena thermophila by³o badane zarówno w eksperymentach dla zespo³ów cz¹steczek [30, 31] jak i dla pojedynczych cz¹steczek [32 34]. Stwierdzono, e mo e siê on znajdowaæ w 3 stanach: rozfa³dowanym, niepoprawnie sfa³dowanym i poprawnie sfa³dowanym (natywnym). Forma rozfa³dowana wykazuje wydajnoœæ przeniesienia na poziomie E = 0,1, sfa³dowana niepoprawnie E = 0,3, a poprawnie sfa³dowana E = 0,9. W procesie fa³dowania niezbêdna jest obecnoœæ jonów magnezowych, natomiast wybór drogi fa³dowania zale y od stê- enia jonów sodowych. Dla wysokiego stê enia (> 250 mmol/dm 3 ) fa³dowanie przebiega bardzo szybko do stanu natywnego, przy œrednim stê eniu ( mmol/dm 3 ) obserwuje siê stan przejœciowy, z którego cz¹steczka mo e przejœæ do stanu natywnego, lub niepoprawnie sfa³dowanego. Natomiast dla ma³ego stê enia jonów sodowych (< 150 mmol/dm 3 ) obserwuje siê na drodze fa³dowania, oprócz stanu przejœciowego, pu³apkê energetyczn¹. Stwierdzono tak e, e wczeœniejsze wytworzenie struktury drugorzêdowej nie jest konieczne do poprawnego sfa³dowania. Rybozym Tetrahymena thermophila wykazuje lokalne fluktuacje struktury. W badaniach na zespole cz¹steczek wyznaczono sta³¹ równowagow¹ zwijania (K dock = 7 ± 3), stwierdzono, e tworzenie struktury trzeciorzêdowej przebiegaæ mo e ró nymi drogami a tak e zaobserwowano d³ugo yj¹ce stany rozfa³dowane. Badania pojedynczych cz¹steczek pozwoli³y na wyznaczenie sta³ych szybkoœci zwijania i rozwijania [33] oraz kszta³tu powierzchni energii swobodnej fa³dowania [32]. Na poziomie pojedynczych cz¹steczek wyznaczono sta³¹ rozwijania (k undock = 1,62 ± 0,08 s 1 ) i zwijania (k dock = 0,224 ± 0,015 s 1 ), a tak e obliczono sta³¹ równowagow¹ zwijania (K dock = k dock /k undock = 7,2 ± 0,8) [33].

15 186 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI 3.2. RYBOZYM TYPU HAIRPIN W naturalnych warunkach rybozym ten wystêpuje w postaci struktury Holliday a, w której na dwóch s¹siaduj¹cych ze sob¹ ramionach znajduj¹ siê pêtle wewnêtrzne. Wykazano jednak e, e aktywnoœæ katalityczn¹ mog¹ mieæ formy zmodyfikowane pozbawione ramion nie zawieraj¹cych pêtli (Rys. 4). Rybozymy znakowano fluorescencyjnie na dwóch ramionach zawieraj¹cych pêtle wewnêtrzne. W eksperymencie obserwowano trzy ró ne wydajnoœci FRET. Wartoœci wysoka (E = 0,81) i niska (E = 0,15) odpowiada³y rybozymowi odpowiednio w formie zwiniêtej i rozwiniêtej z przy³¹czonym substratem, natomiast poœrednia (E = 0,38) odnosi³a siê do wolnego rybozymu. Stwierdzono, e rybozym, do którego przy³¹czony jest nie rozciêty substrat wykazuje inn¹ dynamikê konformacyjn¹, ni rybozym z przy³¹czonym, rozciêtym substratem. Badaj¹c formê minimaln¹ (Rys. 4C), wyznaczono sta³¹ zwijania rybozymu z nierozciêtym substratem, której wartoœæ by³a taka sama jak dla zespo³u cz¹steczek (0,008 s 1 ). Stwierdzono, e ró ne cz¹steczki wykazuj¹ ró ne sta³e rozwijania. Najwolniejsza sta³a rozwijania (0,005 s 1 ) zgadza³a siê z wynikami otrzymanymi dla zespo³u cz¹steczek. Zaobserwowano tak e efekt pamiêci pomimo, e ró ne cz¹steczki rybozymu wykazuj¹ ró ne sta³e szybkoœci rozwijania, to jedna, konkretna cz¹steczka charakteryzuje siê tym, e jej sta³a szybkoœci rozwijania nie zmienia siê w trakcie eksperymentu. Dla porównania, rybozym z rozciêtym substratem wykazuje sta³¹ szybkoœci zwijania równ¹ 0,02 s 1, zaobserwowano ró norodnoœæ kinetyczn¹ sta³ej rozwijania. Tak wiêc sta³a zwijania rybozymu z przy³¹czonym, rozciêtym substratem jest 2,5 razy wiêksza ni sta³a zwijania rybozymu, do którego przy³¹czony jest nie rozciêty substrat. Porównuj¹c wyniki eksperymentalne otrzymane dla formy minimalnej i naturalnej rybozymu stwierdzono, e forma minimalna wymaga dwa do trzy razy wiêkszego stê enia jonów magnezowych, a jej sta³a zwijania jest o trzy rzêdy wielkoœci mniejsza ni sta³a zwijania dla formy naturalnej INNE UK ADY Domena katalityczna RNazy P RNA z Bacillus Subtilis jest dobrym modelem do badañ kinetyki fa³dowania, poniewa obszar energii swobodnej nie zawiera pu³apek energetycznych [35, 36]. Dodatkowo jest to rybozym na tyle du y, by stosowaæ dla niego zasady fa³dowania du ych cz¹steczek RNA. Badania na poziomie pojedynczych cz¹steczek potwierdzi³y wczeœniejsze spostrze enia o fa³dowaniu z udzia- ³em stanów przejœciowych. Pozwoli³y tak e stwierdziæ, e nie jest to jeden, a trzy stany przejœciowe. Warunki pocz¹tkowe (stê enie jonów dodatnich, ph roztworu) determinuj¹ punkt startowy fa³dowania na powierzchni energii swobodnej, a co za

16 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 187 tym idzie maj¹ bezpoœredni wp³yw na drogê fa³dowania (czy przebiega ona z udzia- ³em pu³apek energetycznych, czy te bez nich). Wykorzystuj¹c technikê FRET pojedynczych cz¹steczek stwierdzono, e fa³dowanie DAzy do formy aktywnej przebiega poprzez stan przejœciowy. Cz¹steczki DAzy znakowano fluoresencyjnie, wykorzystuj¹c Cy3 jako donor i Cy5 jako akceptor. Stan rozfa³dowany stanowi k³êbek statystyczny, w którym nie wytworzy³y siê jeszcze wi¹zania wodorowe miêdzy komplementarnymi parami zasad. Po dodaniu jonów jednododatnich (Na + ) wytwarza siê struktura drugorzêdowa, na któr¹ sk³adaj¹ siê czêœci helikalne i pêtle wewnêtrzne. W ten sposób cz¹steczka przechodzi do stanu poœredniego. Wytworzenie struktury trzeciorzêdowej (a wiêc przejœcie do stanu sfa³dowaniego) nastêpuje po dodaniu do uk³adu jonów dwudodatnich. Wtedy to czêœci struktury drugorzêdowej zaczynaj¹ oddzia³ywaæ ze sob¹. 4. AKTYWNOŒÆ KATALITYCZNA RYBOZYMÓW I JEJ SPRZÊ ENIE Z DYNAMIK KONFORMACYJN Badania pojedynczych cz¹steczek pokazuj¹, e ró ne cz¹steczki rybozymów wykazuj¹ ró n¹ aktywnoœæ katalityczn¹. Rozk³ady aktywnoœci katalitycznej rybozymów s¹ zgodne z wartoœciami œrednimi uzyskanymi w badaniach zespo³ów cz¹steczek [21, 33]. Jak wszystkie makrocz¹steczki biologiczne, rybozymy wykazuj¹ dynamikê konformacyjn¹. W przypadku rybozymów stwierdzono sprzê enie aktywnoœci katalitycznej z dynamik¹ konformacyjn¹. Na przyk³ad dla rybozymu typu hairpin polega to na zmianie czêstoœci przejœæ pomiêdzy stanem zwiniêtym i rozwiniêtym rybozymu, gdy przy³¹czony substrat ulega rozciêciu RYBOZYM TETRAHYMENA THERMOPHILA Aktywnoœæ katalityczn¹ Tetrahymena thermophila badano dla pojedynczych, unieruchomionych cz¹steczek [33]. Schemat reakcji przedstawiono na Rysunku 8. Poniewa po rozciêciu produkt oznakowany barwnikiem fluorescencyjnym oddziela siê od rybozymu, mo liwe by³o okreœlenie momentu rozciêcia jako nag³ego zmniejszenia fluorescencji pojedynczej cz¹steczki. Rysunek 8. Figure 8. Mechanizm katalizy enzymu Tetrahymena thermophila dla oligonukleotydowego substratu (S-A = CCCUCUA), do którego do³¹czony jest barwnik fluorescencyjny Cy3. Guanozyna (G) przy³¹cza siê do rybozymu E, który katalizuje rozciêcie substratu, a produkt (GACy3) oddziela siê od rybozymu Enzymatic catalysis mechanism of Tetrahymena thermophila ribozyme for oligonucleotide substrate (S-A = CCCUCUA) with a fluorescent dye (Cy3) attached. Guanosine (G) attaches to ribozyme E and catalyzes substrate cleavage, product (GACy3) dissociates from the ribozyme

17 188 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI Etapem limituj¹cym szybkoœæ jest etap rozciêcia. Zale noœæ szybkoœci rozciêcia v od stê enia guanozyny [G] by³a zgodna z równaniem Michaelisa-Menten [37], v = k [G]/ (K 1/2 + [G]), ze sta³¹ szybkoœci rozciêcia k = 0,21 ± 0,01 s 1 i sta³¹ Michaelisa-Menten K 1/2 = 0,26 ± 0,04 mmol/dm 3. Wyniki te zgadza³y siê z tymi otrzymanymi dla zespo³u cz¹steczek i wynosz¹cymi k max = 0,21 ± 0,01 s 1, a K 1/2 = 0,30 ± 0,05 mmol/dm 3. Reakcja rozcinania zachodzi³a tylko wtedy, gdy rybozym znajdowa³ siê w konformacji poprawnie zwiniêtej, której wydajnoœæ spfret wynosi³a E = 0, RYBOZYM TYPU HAIRPIN Mechanizm aktywnoœci katalitycznej formy minimalnej rybozymu typu hairpin przedstawiono na Rysunku 9. Poniewa poszczególne etapy reakcji maj¹ porównywalne szybkoœci, zale noœci kinetyczne s¹ z³o one i wymagaj¹ analizy numerycznej [21]. Rysunek 9. Figure 9. Mechanizm katalizy formy minimalnej rybozymu hairpin. Do cz¹steczki przy³¹czono dwa barwniki fluorescencyjne: Cy3 jako donor (szary) i Cy5 jako akceptor (czarny). (A) wolny rybozym i przy³¹czaj¹cy siê do niego substrat, (B) rozwiniêty rybozym z przy³¹czonym substratem, (C) zwiniêty rybozym z przy³¹czonym substratem, (D) rybozym z rozciêtym substratem, (E) rozwiniêty rybozy z rozciêtym substratem, (F) wolny rybozym i uwolnione produkty Mechanism of catalysis for the minimal form of the hairpin ribozyme. Two fluorescent dyes are attached to the ribozyme: Cy3 as a donor (gray) and Cy5 as an acceptor (black). (A) free ribozyme and the substrate, (B) undocked ribozyme-substrate complex, (C) docked ribozyme-substrate complex, (D) docked ribozyme with cleaved substrate, (E) undocked ribozyme with cleaved substrate, (F) free ribozyme and products Wydajnoœæ FRET w stanie zwiniêtym wynosi ok. 0,8, natomiast dla formy rozwiniêtej ok. 0,15. Rybozym (zarówno w formie minimalnej jak i naturalnej), do którego przy³¹czony jest rozciêty substrat wykazuje szybkie przejœcia miêdzy stanami zwiniêtym i rozwiniêtym. Dziêki temu mo na na podstawnie trajektorii FRET okreœliæ moment rozciêcia. Widoczne jest to jako przejœcie z d³ugotrwaj¹cego stanu wysokiego FRET (E = 0,8) do szybkich fluktuacji miêdzy wartoœciami E = 0,2 i 0,8. Akt katalityczny obserwuje siê poœrednio, znaj¹c dynamikê konformacyjn¹ form rybozymu z przy³¹czonym rozciêtym i nierozciêtym substratem. Dla formy minimalnej (Rys. 4C) wyznaczono sta³¹ równowagi rozcinania K 0,5, oraz przedzia³, 0,1 do 0,4 s 1, w którym mieœci siê sta³a rozcinania, a tak e odpowiedni przedzia³, 0,2 do 0,8 s 1, dla sta³ej ligacji [21]. Dla formy naturalnej

18 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 189 sta³e rozcinania i ligacji wahaj¹ siê wed³ug ró nych autorów [16, 18] miêdzy 0,6 a 1 min 1 dla sta³ej rozcinania i min 1 dla sta³ej ligacji INNE UK ADY Porównywano kinetykê dzia³ania RNA RNazy P dla organizmów prokariotycznych (bakterie, archeowce), jak i eukariotycznych [25, 38], w warunkach kiedy mo - liwy jest jeden obrót reakcji. Stwierdzono, e bez udzia³u bia³ek, sta³e rozcinania przeprowadzanego przez rybozymy eukariotyczne (ludzki i G. lamblia) wynosz¹ odpowiednio 2, i 3, min 1, przy czym prokariotyczny RNA RNazy P przeprowadza proces rozcinania ze sta³¹ szybkoœci 8,4 min 1. Powodem tak du ych rozbie noœci mo e byæ fakt nieobecnoœci w rybozymach eukariotycznych fragmentów odpowiedzialnych za przy³¹czanie substratu w organizmach prokariotycznych. Zmodyfikowano wiêc rybozym bakteryjny, usuwaj¹c te fragmenty i stwierdzono, e sta³a rozcinania zmniejszy³a siê do wartoœci 2, min 1. Pozostaje wiêc nadal ró nica dwóch rzêdów wielkoœci. Stwierdzono, e najprawdopodobniej w wyniku ewolucji RNA RNazy P coraz bardziej uzale nia³ siê od pomocy kofaktorów bia³kowych, niemniej jednak nie utraci³ w³aœciwoœci katalitycznych. 5. ANALIZA DANYCH W BADANIACH POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA Przegl¹d metod statystycznej analizy danych w zastosowaniu do badañ nad pojedynczymi cz¹steczkami znaleÿæ mo na w pracach [39, 40]. Analiza danych w enzymologii pojedynczych cz¹steczek RNA polega czêsto na analizie trajektorii spfret wykazuj¹cych skoki pomiêdzy stanami o ró nej wydajnoœci przeniesienia energii fluorescencji E. Jeœli poziom szumu jest niski, liczbê stanów FRET mo na okreœliæ wizualnie z wykresu trajektorii. Podobnie mo na ustaliæ progi pozwalaj¹ce przypisaæ zmierzone wartoœci E do poszczególnych stanów, a nastêpnie wyznaczyæ d³ugoœci interwa³ów czasu przebywania w tych stanach. Analiza histogramów czasów przebywania w poszczególnych stanach FRET pozwala wyznaczyæ sta³e szybkoœci przejœæ pomiêdzy stanami. Wyznaczenie liczby stanów i rozk³ad trajektorii na odcinki odpowiadaj¹ce poszczególnym stanom s¹ trudne jeœli szum eksperymentalny jest du y, jak to ma czêsto miejsce w badaniach spfret. Dlatego poszukuje siê nowych metod statystycznej analizy danych. Interesuj¹ce mo liwoœci daje modelowanie trajektorii spfret jako ukrytego procesu Markowa [41], lub modelowanie zliczeñ w kana³ach donora jako modulowanych procesów Poissona [42].

19 190 M. HAJDZIONA, A. MOLSKI 5.1. ROZK ADY CZASÓW ON I OFF W spektroskopii spfret rejestruje siê trajektorie fluorescencji donora i akceptora. W badaniach rybozymów trajektorie te wykazuj¹ czêsto dwa lub wiêcej dyskretnych wartoœci wydajnoœci przeniesienia energii E, a przejœcia miêdzy stanami zachodz¹ w sposób skokowy. W najprostszym przypadku obserwuje siê dwie wartoœci E odpowiadaj¹ce wysokiej (E on ) i niskiej (E off ) wydajnoœci przeniesienia energii. Na podstawie trajektorii E dobierana jest wartoœæ progowa, np. E p = (E on + E off )/2, rozdzielaj¹ca trajektoriê na okresy o wysokiej (on) wydajnoœci (E > E p ) i okresy o niskiej (off) wydajnoœci przeniesienia energii (E < E p ). Kolejne czasy przebywania w stanach on i off, s¹ zmiennymi losowymi o rozk³adach zale nych od mechanizmu zmian konformacyjnych. W celu wyznaczenia sta³ych szybkoœci przejœæ, do histogramu czasów on i off dopasowuje siê krzywe wynikaj¹ce z modelu zmian konformacyjnych (Rys. 10). Otrzymuje siê w ten sposób sta³e kinetyczne ucieczki ze stanów on i off (k on i k off ), bêd¹ce odwrotnoœciami œrednich czasów przebywania w ka dym ze stanów (τ on i τ off ). Wariantem tej metody jest dopasowywanie modelu do kumulatywnych histogramów czasów on i off [19]. Rysunek 10. Przyk³ad analizy on-off: histogramy czasów przebywania w stanie on (A) i off (B) wraz z dopasowanymi krzywymi wyk³adniczymi (linie ci¹g³e) i wartoœciami sta³ych kinetycznych ucieczki (k on, k off ) u ytymi do symulacji (indeks teor) i odzyskanymi (indeks dop) w wyniku dopasowañ Figure 10. Example of an on-off analysis: on- (A) and off- (B) time histograms with fitted exponential curves (solid lines) and the kinetic rates (k on, k off ) used in simulations ( teor ) and those obtained from fitting ( dop ) Jeœli szum eksperymentalny jest du y mo na zastosowaæ wyg³adzanie trajektorii spfret [43] MODELOWANIE I SYMULACJE EKSPERYMENTÓW spfret W pracy [39] zaproponowano model trajektorii wydajnoœci jako realizacji ukrytego modelu Markowa. Ukryte modele Markowa zosta³y pocz¹tkowo zastosowane w automatycznym rozpoznawaniu mowy, a póÿniej znalaz³y zastosowanie w innych dziedzinach [44].

20 ENZYMOLOGIA POJEDYNCZYCH CZ STECZEK RNA 191 Model Markowa sk³ada siê z dyskretnych stanów, pomiêdzy którymi nastêpuj¹ przeskoki. Szybkoœæ przejœæ miêdzy stanami opisana jest równaniami kinetycznymi. Przyk³adem modelu Markowa jest model zmian konformacyjnych cz¹steczki RNA przedstawiony na Rysunku 9. Proces zmian konformacyjnych jest ukryty poniewa obserwujemy go jedynie poœrednio, w postaci trajektorii wydajnoœci FRET. Wartoœæ wydajnoœci E informuj¹ca o konformacji cz¹steczki jest zmienna losow¹ o rozk³adzie, który z dobrym przybli eniem jest rozk³adem Gaussa. Trajektoria FRET jest traktowana jako generowana przez ukryty model Markowa, a celem analizy danych jest okreœlenie liczby stanów i sta³ych szybkoœci przejœæ tego modelu. Przyk³ad zastosowania w eksperymencie z rybozymami znajduje siê w pracy [19]. W pracy [45] zastosowano symulacje do okreœlenia mo liwoœci wyznaczania liczby stanów i wyznaczania parametrów kinetycznych dla krótkich trajektorii spfret. Eksperymentalna trajektoria wydajnoœci spfret jest szeregiem czasowym obliczanym jako E i = n Ai / (n Ai + n Di ), gdzie n Ai i n Di s¹ liczbami zliczeñ fotonów odpowiednio w kanale akceptora i donora, w przedziale czasowym (ih, (i + 1)h) o szerokoœci h. Liczby zliczeñ n Ai i n Di s¹ zmiennymi losowymi, których wartoœci œrednie s¹ równe I Ai h i I Di h, gdzie I Ai i I Di s¹ œrednimi intensywnoœciami fluorescencji akceptora i donora w interwale (ih, (i + 1)h). E i jest oszacowaniem œredniej wydajnoœci FRET w i-tym interwale (ih, (i + 1)h). Oznacza to uœrednienie informacji po szerokoœci interwa³u h. Metod¹ analizy spfret, która unika tego ograniczenia jest metoda najwiêkszej wiarygodnoœci zastosowana bezpoœrednio do trajektorii czasów detekcji fotonów w kana³ach donora i akceptora. Gopich i Szabo [42] opracowali podstawy teoretyczne tego podejœcia i zademonstrowali, e mo e byæ ono stosowane do estymacji parametrów w spfret. PODSUMOWANIE I PERSPEKTYWY Rybozymy s¹ wa nymi biologicznie cz¹steczkami RNA wystêpuj¹cymi we wszystkich ywych organizmach. Dziêki badaniom na zespole cz¹steczek mo liwe by³o okreœlenie mechanizmów dzia³ania rybozymów i wyznaczenie niektórych sta- ³ych kinetycznych. Zastosowanie spektroskopii pojedynczych cz¹steczek pozwoli³o na pe³niejszy opis aktywnoœci rybozymów. Wyznaczono sta³e kinetyczne, których okreœlenie w badaniach na zespole cz¹steczek by³o niemo liwe. Zaobserwowano tak e zjawiska, uœredniaj¹ce siê w pomiarach na zespole cz¹steczek. Na przyk³ad, stwierdzono istnienie heterogenicznoœci polegaj¹cej na tym, e ró ne cz¹steczki, pomimo takiej samej budowy chemicznej i identycznych warunków eksperymentalnych katalizuj¹ reakcje z ró nymi sta³ymi szybkoœci. Nale y przypuszczaæ, e kolejne lata przynios¹ dalsze zastosowania metod pojedynczych cz¹steczek do badania zarówno enzymów RNA jak i enzymów bia³kowych.