Angiogeneza możliwości, problemy, perspektywy

Transkrypt

1 Angiogeneza możliwości, problemy, perspektywy STRESZCZENIE Angiogeneza to tworzenie nowych cienkościennych naczyń krwionośnych z już istniejących. Proces ten zachodzi poprzez tzw. pączkowanie (ang. sprouting angiogenesis) komórek śródbłonka w okresie życia pozapłodowego. Proces ten ma zasadnicze znaczenie dla wielu zjawisk fizjologicznych i patologicznych, tj. wzrost nowotworów litych, rozwój chorób niedokrwiennych i przewlekłych zapaleń. Poznano różne mechanizmy tworzenia nowych naczyń krwionośnych i odkryto szereg czynników działających proangiogennie i antyangiogennie. Zrozumienie funkcji tych czynników, przyczynia się do tworzenia nowych narzędzi terapii klinicznych w procesach patologicznych. W pracy przedstawiono charakterystykę procesów regulacji angiogenezy z uwzględnieniem najważniejszych czynników proangiogennych i ich inhibitorów. Opisuje wybrane mechanizmy, na których opiera się działanie obecnie stosowanych leków antyangiogennych oraz jest przeglądem prowadzonych badań wykorzystujących czynniki w terapii antyangiogenicznej. WPROWADZENIE Angiogeneza, czyli tworzenie nowych naczyń krwionośnych, jest sekwencją procesów o kluczowym znaczeniu fizjologicznym i patologicznym [1-3]. Jest zjawiskiem ściśle regulowanym, a regulacji podlega zarówno lokalizacja, jak i czas trwania tego procesu. W warunkach fizjologicznych zachodzi między innymi na pewnych etapach cyklu menstruacyjnego w śluzówce macicy czy formowania ciałka żółtego. Odgrywa znaczącą rolę podczas implantacji zarodka do błony śluzowej macicy i tworzeniu łożyska. W warunkach patologicznych jest jednym z elementów zaangażowanych w powstawanie i przebieg schorzeń kardiologicznych, gastrologicznych i reumatoidalnych. Jest także związana z tworzeniem tkanki tłuszczowej, zatem bierze udział w powstawaniu otyłości. W procesie nowotworzenia proces angiogenezy wymyka się spod kontroli dając w efekcie warunki korzystne dla rozwoju guza [1,2,6]. ROLA KOMÓREK ŚRÓDBŁONKA W PROCESIE ANGIOGENEZY Podczas rozwoju embrionalnego układ krążenia powstaje z hemangioblastu. We wczesnym stadium rozwoju, komórki krwi i naczynia krwionośne powstają z angioblastu, który w życiu postnatalnym nie występuje [5,7], natomiast komórki o podobnym do angioblastu potencjalne różnicowania, znajdują się we krwi obwodowej osób dorosłych. Populację tych komórek nazwano prekursorami komórek śródbłonka (EPC, ang. endothelial progenitor cells) [4,5]. Głównymi markerami błonowymi tej populacji są antygeny: CD133, CD34, CD31 oraz receptor czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGFR-2. W procesie formowania nowego naczynia włosowatego, czoło naczynia utworzone zostaje przez komórki EPC, które migrują do otaczającej tkanki, tworząc strukturę rurki otoczonej pojedynczą warstwą komórek, stanowiącej w dalszym etapie wewnętrzną ścianę naczynia. Podczas migracji, komórki przylegają do białek macierzy pozakomórkowej (np. fibrynogenu) za pośrednictwem receptorów integrynowych. Poza tym, komórki śródbłonka wydzielają liczne czynniki wpływające m.in. na proces krzepnięcia i fibrynolizę (wydzielają przeciwzakrzepowe czynniki syntetyzowane przez trombomoduliny). Biorą też udział w regulacji procesów zapalnych, interakcji pomiędzy ścianą naczyń a komórkami krwi oraz wpływają na przepuszczalność ściany naczyń [4,5]. Agata Kurzyk Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Warszawa Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Zakład Onkologii Molekularnej i Translacyjnej, Pracownia Inżynierii Komórkowej, ul. Roentgena 5, Warszawa; tel: (22) , faks: (22) , akurzyk@coi.pl Artykuł otrzymano 25 sierpnia 2014 r. Artykuł zaakceptowano 5 listopada 2014 r. Słowa kluczowe: angiogeneza, śródbłonek, czynnik proangiogenny, czynnik antyangiogenny, antyangiogenna terapia, nowotwór, komórki macierzyste Wykaz skrótów: AML (ang. acute myeloid leukemia) ostra białaczka szpikowa; FGF (ang. fibroblast growth factor) czynnik wzrostu fibroblastów; MMP (ang. matrix metalloproteinases) metaloproteazy macierzy pozakomórkowej; PDGF (ang. platelet-derived growth factor) płytkowy czynnik wzrostu; PF (ang. plasmapheresis) plazmaferaza; PIGF (ang. placental growth factor) łożyskowy czynnik wzrostu; TGF-β (ang. Transforming Growth Factor beta) transformujący czynnik wzrostu; VEGF (ang. vascular endothelial growth factor) czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego Podziękowania: Praca powstała podczas realizacji projektu badawczego finansowanego ze środków UE dla Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka BIO- IMPLANT dla potrzeb leczenia ubytków tkanki kostnej u chorych onkologicznych POIG / MECHANIZMY TWORZENIA NACZYŃ KRWIONOŚNYCH Odkryto kilka mechanizmów wieloetapowego procesu tworzenia naczyń krwionośnych [7,8]: Postępy Biochemii 61 (1)

2 1. Tzw. pączkowanie (ang. sprouting angiogenesis) polega na formowaniu się kolumn ( pączków ) komórek śródbłonkowych (ang. endothelial sprouts), których wydłużanie odbywa się w kierunku guza nowotworowego i ostatecznie prowadzi do powstawania zamkniętych pętli i sieci kapilarnych. Jest to proces najczęściej występujący w przebiegu nowotworzenia i jednocześnie najlepiej opisany. 2. Podział naczynia matki w wyniku nacisku tkanek pozanaczyniowych (ang. intusussception). 3. Podział naczynia matki poprzez powstawanie wewnątrznaczyniowych, śródbłonkowych przegród (ang. splitting angiogenesis). Powyższe mechanizmy, w różnych kombinacjach występują we wszystkich procesach prowadzących do powstania nowych naczyń krwionośnych: 1. Waskulogenezy która zachodzi głównie we wczesnej embriogenezie [2,8] i polega na formowaniu naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka hemangioblastów, powstających w wyspach krwionośnych woreczka żółtkowego zarodka. Efektem jest wytworzenie pierwotnego splotu naczyniowego w trzecim tygodniu embriogenezy. Angioblasty okrywające komórki hematopoetyczne charakteryzują się produkcją antygenu CD34. W życiu pozapłodowym nie dochodzi do tworzenia naczyń krwionośnych na drodze waskulogenezy. Wyjątkiem są pewne stany patologiczne takie jak: choroby nowotworowe czy niedokrwiennne [4,8,9] 2. Arteriogenezy prowadzącej do tworzenia dojrzałych naczyń, przekształcających się w funkcjonalne tętnice, w wyniku pogrubienia ich warstwy mięśniowej. Arteriogeneza zachodzi także w życiu pozapłodowym organizmu (np. w przebiegu niedotlenienia mięśnia sercowego czy niedokrwistość) [10,11]. 3. I wreszcie angiogenezy czyli tworzenia nowych naczyń krwionośnych w drodze tzw. pączkowania komórek śródbłonka ścian i końców naczyń włosowatych [7,8]. Proces ten jest regulowany szeregiem czynników proangiogennych i antyangiogennych. W zależności od tego, która grupa czynników dominuje, ma miejsce indukcja lub hamowanie angiogenezy. W zdrowym organizmie naczynia włosowate, a także naczynia przed- i pozawłosowate uczestniczą w wymianie gazów i substancji pomiędzy krwią a tkankami. Pozostałe, większe naczynia stanowią jedynie drogi transportu krwi. Równowaga pomiędzy czynnikami pro- i antyangiogennymi stanowi gwarancję prawidłowego funkcjonowania organizmu, zaś wynikiem jej naruszenia jest rozwój chorób naczyniowo-sercowych czy niedokrwiennych [9]. Szczególnym przypadkiem jest proces naczyniotwórczy w chorobie nowotworowej. Przesunięcie równowagi w kierunku angiogenezy staje się punktem zwrotnym dla transformacji złośliwej, powstają sieci naczyń przenikających guz, którego odżywione komórki zaczynają się intensywnie namnażać. Dostępność czynników wzrostu (w tym pochodzących z tworzących się naczyń) warunkuje szybki wzrost nowotworu i tworzenie nacieków nowotworowych [6,9]. ETAPY POWSTAWANIA NACZYŃ Neowaskularyzacja, czyli tworzenie de novo (nowych naczyń) naczyń krwionośnych dokonuje się w następujących etapach: 1. Inicjacja - Sygnałem zapoczątkowującym kaskadę neowaskularyzacji jest zwiotczenie ściany naczynia krwionośnego, najczęściej pod wpływem tlenku azotu. Dochodzi do pobudzenia komórek śródbłonka i zmian morfologicznych powodujących zmniejszenie ich przylegania. Etap ten opiera się na interakcji różnego rodzaju komórek, składników macierzy zewnątrzkomórkowej oraz związków o charakterze stymulującym bądź hamującym angiogenezę. Kluczową rolę odgrywa VEGF zwiększając przepuszczalność naczyń krwionośnych, co umożliwia gromadzenie się białek osocza w przestrzeni pozakomórkowej. Kolejnym procesem jest destabilizacja naczyń i degradacja błony podstawnej. Procesy te przygotowują tkankę do następnego etapu, w którym dochodzi do inwazji, migracji i proliferacji komórek śródbłonka [7,8]. 2. Migracja i proliferacja komórek śródbłonka - Migracji komórek śródbłonka towarzyszy wytwarzanie nowej błony podstawnej naczyń. Wbudowane w nią perycyty (komórki przydanki) stabilizują i utrzymują nowo powstające naczynie. Komórki śródbłonka, dzięki obecnym na powierzchni błony komórkowej cząstek adhezyjnych (np. integryny, E- -selektyny), mają zdolność przylegania do siebie i nowej błony podstawnej. Reakcją komórek śródbłonka na działania takich czynników jak VEGF, FGF, angiopoetyny i angiogeniny jest ich proliferacja. Skutkuje ona pojawianiem się Rycina 1. Etapy powstania naczyń krwionośnych [15]. Proangiogenne czynniki (VEGF i FGF) wiążą się z receptorami (VEGFR i FGFR). MMP rozkładają błonę podstawną. Działanie integryn α i β ułatwiających adhezję i migrację komórek. Proliferacja komórek śródbłonka. Dojrzewanie i stabilizacja przy udziale angiopoetyny-1 za pomocą receptora Tie

3 wydłużonych pędów łączących się końcami, tworząc w ten sposób pętle naczyń włosowatych [8,9]. 3. Dojrzewanie nowych naczyń krwionośnych - Ostatnim etapem jest dojrzewanie nowego naczynia i jego stabilizacja. Odbywa się to przy udziale VEGF, angiopetyny-1 (Ang-1, ang. angiopoietin), uwalnianej przez komórki mezenchymalne i wiążącej się z receptorami Tie-2 (receptor kinaz tyrozynowej, ang. receptor tyrosine kinase) [12] i angiopoetyny 2 (Ang-2). W rozwoju naczyń VEGF i angiopoetyny uzupełniają się. Aktywacja receptora Tie-2 uruchamia kaskadę sygnałów, poprzez aktywację oddziaływań pomiędzy komórkami śródbłonka i otaczającymi je komórkami podporowymi, co powoduje przebudowę prymitywnych naczyń oraz stabilizuje naczynia dojrzałe. Ang-2 występuje głównie w miejscach przebudowy naczyń, gdzie jest w stanie blokować działanie stabilizujące Ang-1. Angiopoetyna 2, kiedy brak jest VEGF, powoduje regresję naczyń przez indukcję apoptozy komórek śródbłonka, natomiast w obecności dużych stężeń VEGF aktywuje proces angiogenezy. Ważnym regulatorem procesu dojrzewania naczynia są monocyty/ makrofagi, które kontrolują oddziaływania między komórkami wchodzącymi w skład nowo powstałego naczynia [13-15] (Ryc. 1). METODY OCENY ANGIOGENEZY Metody oceny procesu angiogenezy można podzielić na bezpośrednie [16-22] i pośrednie [25-36]. W tych pierwszych podstawową techniką jest badanie histopatologiczne, polegające na mikroskopowej analizie pobranego wycinka materiału. Zazwyczaj analizuje się 10 pól widzenia o największej liczbie naczyń tzw. hot spots, a następnie dokonuje się oceny całkowitej powierzchni TVA (ang. total microvascular area). Bezpośrednim wykładnikiem intensywności neoangiogenezy jest ocena gęstości mikrounaczynienia (MVD, ang. microvessel density), którą wykonuje się za pomocą badań immunohistochemicznych, przy użyciu przeciwciał przeciw antygenom specyficznym dla śródbłonka naczyń. Należą do nich m.in. antygen CD34, CD31 oraz czynnik von Willebrandta; pozwalają określić lokalizację naczyń krwionośnych, średnią ich długość oraz średnią powierzchnię pojedynczego naczynia [23]. Czynnik von Willebrandta (czynnik VIII; (FVIII)) jest najlepiej poznanym i opisanym markerem komórek śródbłonka. Glikoproteina ta odgrywa istotną rolę w adhezji komórek i jest umiejscowiona na ich powierzchni. Kolejnym markerem charakterystycznym dla komórek śródbłonka jest sialomucyna, przezbłonowa glikoproteina CD34, regulująca migrację komórek podczas dojrzewania nowych naczyń, pojawia się we wczesnych etapach ich tworzenia i jest obecna w trakcie ich różnicowania [16-18]. Innym markerem komórek śródbłonka jest CD31, glikoproteina należąca do nadrodziny immunoglobulin zwanych PECAM (płytkowo-śródbłonkowa cząsteczka adhezji komórkowej, ang. platelet endothelial cell adhesion molekule). W porównaniu z czynnikiem von Willebranda CD34 występuje w o wiele wyższym stężeniu, stąd jest najłatwiejsza do zlokalizowania [25]. Biorąc pod uwagę brak specyficzności komórkowej w/w markerów, analiza komórek śródbłonka opiera się na wyznakowaniu ich wszystkimi trzema markerami, a za wynik pozytywny uważa się potrójne wybarwienie komórek. Ostatnie doniesienia sugerują przydatność antygenu CD105 (endoglina, ENG, ang. endoglin) w obrazowaniu procesów angiogenezy. Glikoproteina ta jest koreceptorem dla transformującego czynnika wzrostu TGF-β. Wykazano, że CD105 ulega nadprodukcji w śródbłonku naczyń krwionośnych tkanek, w których dochodzi do waskularyzacji. Badania tego markera znajdują coraz większe zastosowanie w analizie procesów neoangiogenezy fizjologicznej, jak i w procesach nowotworzenia [24]. Do metod pośrednich oceny angiogenezy należy oznaczenie produkcji cytokin angiogennych. Wśród czynników najsilniej stymulujących ten proces wyróżnia się VEGF oraz bfgf [25,26]. Poziom syntezy tych czynników i ich receptorów oznacza się testem immunoenzymatycznym ELISA [30,34], który pozwala ilościowo oznaczyć poziom tych czynników i jest on wprost proporcjonalny do poziomu stopnia zaangażowania procesu angiogenezy wpływającej na migrację i proliferację komórek epitelialnych [29-31]. Do nowszych metod, opartych na technikach biologii molekularnej należy ocena stopnia produkcji różnych receptorów, czynników zaangażowanych w angiogenezę najczęściej flt-1 (ang. vascular endothelial growth factor receptor 1) i flk-1 (ang. kinase insert domain receptor) [32,33]. Charakterystyka i obrazowanie procesu angiogenezy oparta na opisanych technikach jest wciąż niewystarczająca dla pełnego zrozumienia tego procesu i bezpośredniego przełożenia jego znaczenia na procesy nowotworzenia tkankowego [34-36]. NACZYNIA KRWIONOŚNE A NOWOTWORZENIE Nowotworzenie jest procesem zależnym od genetycznych i epigenetycznych zmian kumulowanych w komórkach w trakcie ich fizjologicznych podziałów. Komórki nowotworowe są oporne na apoptozę i są zdolne do nieograniczonej liczby podziałów. Wydzielają i wykorzystują własne czynniki wzrostu, stając się oporne na te dostarczone z zewnątrz. Wytwarzają własną sieć naczyń krwionośnych, które odgrywają ważną rolę w powstawaniu immunosupresyjnego środowiska ułatwiającego ucieczkę nowotworu przed układem odpornościowym. Nowe naczynia pośredniczą w rozsiewie komórek nowotworowych i utrzymaniu specyficznego mikrośrodowiska nowotworowego. Wykazują wiele strukturalnych i funkcjonalnych nieprawidłowości. Chaotyczny przebieg naczyń i ślepe zakończenia spowalniają przepływ krwi obwodowej, a nieszczelności naczyń powodują wzrost ciśnienia śródmiąższowego, który jest przyczyną wspomnianego ograniczenia w dopływie krwi obwodowej do tkanki guza [35]. Judah Folkman jako pierwszy 1 postawił hipotezę, że wzrost guza nowotworowego wydaje się być zależny od angiogenezy (ang. tumor growth is angiogenesis dependent) i hamowanie angiogenezy może stanowić cel bezpośredniej interwencji terapeutycznej w leczeniu przeciwnowotworowym [3]. Do rozwoju nowotworu, zarówno miejscowego 1 Judah Folkman J (1971) Tumor angiogenesis. Therapeutic implications. N Engl J Med 285: Postępy Biochemii 61 (1)

4 jak i rozsiewu, niezbędne są składniki odżywcze dostarczane przez sieć nowych naczyń krwionośnych [18,34]. Zahamowanie proliferacji komórek śródbłonkowych naczyń przez leki antyangiogenne może prowadzić do zahamowania wzrostu guzów pierwotnych i przerzutów. Ten kierunek walki z chorobą nowotworową stanowi obecnie intensywnie rozwijającą się dziedziną badań [18,34,35,37]. REGULACJA PROCESU ANGIOGENEZY Powstanie nowych naczyń krwionośnych następuje w momencie kompleksowego zaburzenia syntezy czynników hamujących angiogenezę [8,9]. W rezultacie prowadzi to do wzrostu stężenia tak, aby przewagę uzyskały czynniki stymulujące angiogenezę czynników proangiogennych. Folkman nazwał ten proces pojęciem przełącznika angiogennego (ang. angiogenic switch). W warunkach fizjologicznych proces tworzenia nowych naczyń jest praktycznie wyłączony. Jednym z mechanizmów utrzymujących ten stan równowagi jest oddziaływanie VEGF i angiostatyny. Czynnik wysoce proangiogenny jakim jest VEGF, ułatwia aktywację plazminogenu, którego proteolityczny fragment to angiostatyna, jeden z najsilniejszych inhibitorów angiogenezy. Czynniki regulujące angiogenezę mogą działać endokrynnie, parakrynnie lub autokrynnie zaś zasadniczym celem ich działania w każdym przypadku są komórki śródbłonka (Tab. 1) [3-9,29]. CZYNNIKI ANGIOGENNE Tabela 1. Działanie stymulatorów i inhibitorów angiogenezy na poszczególnych jej etapach [29]. Etapy angiogenezy Migracja błony podstawnej Proliferacja komórek śródbłonka Proliferacja komórek śródbłonka Tworzenie zawiązków światła naczynia Stabilizacja przewodu powstałego naczynia Czynniki stymulujące upa, TPA, MMPs VEGF-A,-B,-C,-D PDGF, PDECGF, FGF angioopetyna 1 TGF-α EGF angiogenina Czynniki hamujące TiMPs, PAI trombospondyna angiostatyna endostatyna prolaktyna interferony angiopoetyna-2 upa (ang. urokinase plasminogen activator) urokinazowy aktywator plazminogenu; TPA (ang. tissue plasmingoen activator) tkankowy aktywator plazminogenu; MMPs (ang. metallproteinases)-metaloproteinazy; TiMPs (ang. tissue inhibitors of metalloproteinases) tkankowe inhibitory metaloproteinaz; TGF (ang. tumor growth factor) czynnik wzrostu nowotworu; EGF (ang. epidermal growth factor) naskórkowy czynnik wzrostu; PDG F(ang. platelet-derived growth factor) czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego; PDECGF (ang. platelet-derived endothelial cell growth factor) czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego komórek śródbłonka; FGF (ang. fibroblast growth factor) fibroblastyczny czynnik wzrostu Tabela 2. Ważniejsze endogenne czynniki stymulujące angiogenezę [30,39]. Czynniki wzrostu Proteazy Pierwiastki śladowe Onkogeny Cytokiny Inne angiogeniny angiotropiny nabłonkowy czynnik wzrostu (EGF) czynnik stymulujący wzrost kolonii granulocytarnych (GCSF) czynnik wzrostowy hepatocytów (HGF) płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) czynnik martwicy nowotworów (TNF-α) transformujący czynnik wzrostu (TGF α i β) czynnik wzrostowy fibroblasów (a i b FGF) aktywatory plazminogenu typu urokinazy (upa) macierzy pozakomórkowej miedź c-myc, ras, c-src, v-raf, c-jun interleukina-1 (IL-1) interleukina-6 (IL-6) interleukina-8 (IL-8) integryna αvβ3 angiopoetyna-1 angiostatyna II endotelina erytropoetyna hipoksja tlenek azotu czynnik aktywujący płytki prostaglandyna E1 i E2 trombopoetyna ceruloplazmina urokinaza Większość czynników proangiogennych występuje w dużych stężeniach w przestrzeni pozanaczyniowej. Natomiast prawie wszystkie z substancji hamujących powstawanie naczyń działają endokrynnie i oddziałują na komórki, które wraz z krwią obwodową krążą po całym organizmie. Są one strażnikami pilnującymi, aby neowaskularyzacja była w stanie uśpienia. Lokalnie, w miejscu gdzie konieczne jest powstanie nowych naczyń, następuje wzmożona produkcja aktywatorów, które przełamują ogólnoustrojową blokadę angiogenezy (Tab. 2 i 3) [18,30,34,39]. Do czynników proangiogennych zalicza się szereg cytokin i mediatorów komórkowych, które stymulują proliferację i dojrzewanie komórek śródbłonka (np. FGF,VEG- F,IGF-1), degradują macierz zewnątrzkomórkową (np. MMP,TF,IL-8), bądź wpływają na dojrzewanie naczyń krwionośnych (np. PDGF,FGF-1,Tie-1,Tie-2) [3,9,40,41]. bfgf - ZASADOWY CZYNNIK FIBROBLASTÓW Pierwszą molekułą proangiogenną, która została odkryta [27,28] był zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów. bfgf jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych modulatorów angiogenezy. Może działać jako czynnik wzrostu i stymulować neowaskulogenezę wpływając na wzrost nowych naczyń krwionośnych podczas gojenia ran, jak i w czasie embriogenezy [36]. Cytokina ta wywiera biologiczne działanie za pośrednictwem receptorów należących do rodziny receptorów kinazy tyrozynowej. bfgf jest uznawany za silny induktor angiogenezy w przebiegu chorób takich jak: niedokrwienie kończyn i choroby niedokrwiennej serca. Choroby te są skutkiem znacznego zwężenia lub zamknięcia głównych szlaków tętniczych, u podstaw których leży szereg zmian patologicznych związanych z rozwojem miażdżycy [35]. 28

5 VEGF - CZYNNIK WZROSTU ŚRÓDŁONKA NACZYNIOWEGO VEGF jest jednym z kluczowych regulatorów tworzenia naczyń krwionośnych, określanym początkowo jako czynnik przepuszczalności naczyń (VPF, ang. vascular permeability factor) [28,37]. 2 VEGF jest syntetyzowany przez wiele typów komórek, a jego produkcja stymulowana w środowisku o niedostatecznej ilości tlenu. Przewlekła hipoksja indukuje komórkową produkcję HIF (ang. hypoxia inducible factor), czynnika transkrypcji, który stymuluje produkcję i nasila uwalnianie VEGF [21,22,39,42]. Rodzina VEGF składa się z: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF- -F oraz łożyskowego czynnika wzrostu PlGF. Czynniki te wiążą się do swoistych specyficznych receptorów, obecnych na komórkach śródbłonka. Receptory te ulegają dimeryzacji, aktywują wewnątrzkomórkowe kinazy tyrozynowe, przekazując sygnał promujący angiogenezę. Receptory te, to przede wszystkim VEGFR-1, VEGFR-2, i VEGFR-3 kolejne dwa to neuropilina-1 i neuropilina-2, które zwiększają powinowactwo wiązania VEGF z jego receptorami [27,28,38,40,41]. Aktywacja receptora VEGFR prowadzi w efekcie do indukcji czynników antyapoptotycznych wpływających na komórki śródbłonka w nowych naczyniach [6,8,9,20]. Indukuje ich proliferację, wzrost i migrację oraz organizację przestrzenną podczas formowania się naczyń [9]. Zwiększa ich przepuszczalność poprzez tworzenie przerw między komórkami, powodując wyciek białek osocza do przestrzeni zewnątrzkomórkowej i formowanie się międzykomórkowej macierzy (Ryc. 2). Produkcję VEGF stwierdzono również w wielu guzach nowotworowych, tj. raku płuc [41 ], piersi [43], żołądka [44], nerek [45], pęcherza moczowego [46], jajników, trzonu i szyjki macicy [47], glejaku wielopostaciowym [48]. W licznych badaniach wykazano obecność korelacji pomiędzy stopniem unaczynienia, złośliwością guza oraz ekspresją 2 Po raz pierwszy opisany przez Napoleone Ferrarę i współpracowników z University of California, San Diego Moores Cancer Center. Tabela 3. Ważniejsze czynniki hamujące angiogenezę [30,39]. Inhibitory proteaz Pierwiastki śladowe Produkty genów supresorowych Cytokiny Inne tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP-1,TIMP-2), inhibitor aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1) cynk P53, RB Interleukina-10 (IL-10) Interleukina-12 (IL-12) angiopoetyna-2 angiotensyna angiostatyna endostatyna interferony α, β, γ, czynnik płytkowy-4 prolaktyna trombospondyna 1 i 2 troponina-1 somatostatyna witamina A retinoidy laminina Rycina 2. Komórki nowotworowe jak i komórki mikrośrodowiska biorące udział w stymulacji angiogenezy. Nowo powstałe naczynia krwionośne są w wysokim stopniu niesprawne. Wokół takich naczyń pojawia się niedotlenienie. W niedotlenowanych komórkach nowotworowych, pod wpływem czynnika transkrypcyjnego HIF-1 indukowanych jest wiele różnych procesów, które modyfikują fenotyp komórek nowotworowych [42]. genu kodującego VEGF. Stąd jednym z rozwijających się kierunków doświadczalnej terapii antynowotworowej jest miejscowe podanie przeciwciał anty VEGF lub anty VEGFR [32]. ANGIOPOETYNA Kolejnym białkiem o silnym działaniu proangiogennym jest angiopoetyna (ang, angiopoietin) [50]. Parakrynnie działająca angiopoetyna 1 indukuje migrację, adhezję, a także przeżycie komórek śródbłonka [5]. Produkowana jest głównie w perycytach, fibroblastach i komórkach mięśni gładkich [51,52]. Ich synteza jest regulowana przez czynnik indukowany hipoksją (HIF-1α) [48,49], a działanie Ang-1 jest głównie miejscowe [52]. Angiopoetyna 2 (Ang-2, ang. angiopoietin-2) lokalizowana jest w komórkach śródbłonka w miejscach przebudowy naczyń [50,53]. Jej autokrynne działanie osłabia oddziaływania pomiędzy komórkami śródbłonka i otaczającymi je komórkami, zwłaszcza perycytami [53]. Regulacja jej syntezy odbywa się z udziałem HIF-1α i VEGF [49]. Angiopoetyna 2 przy braku VEGF powoduje regresję naczyń poprzez indukcję apoptozy komórek śródbłonka. W obecności dużych stężeń VEGF aktywuje proces angiogenezy, zatem poziom syntezy Ang-2 i VEGF może decydować o tym czy nastąpi regresja naczyń, czy też ich rozwój. Angiopoetyny uczestniczą również w regulacji angiogenezy nowotworowej. Badania doświadczalne pokazują, że Ang-1 może być zarówno czynnikiem proangiogennym, jak i antyangiogennym. Z jednej strony mogą promować wzrost guza poprzez indukcję angiogenezy nowotworowej i zahamowanie apoptozy komórek nowotworowych [42]. Z kolei z drugiej strony, nadprodukcja Ang-1 może powodować hamowanie wzrostu guza [54,56]. Niejasną rolę we Postępy Biochemii 61 (1)

6 wzroście guzów nowotworowych odgrywa również Ang-2. Według Cao i wsp. [55] nadprodukcja Ang-2 prowadzi do masywnej regresji naczyń (nawet bez zahamowania VEGF), aktywacji apoptozy i zahamowania wzrostu guza. Z kolei Oliner i wsp. dowiedli [54], że zastosowanie inhibitora Ang- 2 powoduje zahamowanie proliferacji komórek śródbłonka, ale i wzrost guza. Jakkolwiek wzrost produkcji angiopoetyn w komórkach nowotworowych wykazano, np. w raku jelita grubego [56], wątroby [57], w glejaku czy zwojaku zarodkowym [58,59], to rola ich w procesie nowotworzenia wymaga dalszych badań. CZYNNIKI ANTYANGIOGENNE Mechanizmy działania tych czynników mogą być różne, od hamowania proliferacji komórek śródbłonka, ich migracji, poprzez, proteolizę błony podstawnej. Spośród wielu inhibitorów angiogenezy (Tab. 4) na większą uwagę zasługują dwa: Tabela 4. Najważniejsze endogenne inhibitory angiogenezy. Inhibitor Endogenne inhibitory angiogenezy Mechanizm działania angiostatyna hamowanie migracji komórek śródbłonka i apoptoza endostatyna hamowanie proliferacji komórek hamowanie przekazywania sygnału VEGF fragment 16kD i bfgf, prolaktyny utrzymujące w spoczynku komórki śródbłonka w normalnej tkance trombospondyna-1 hamowanie migracji i proliferacji komórek śródbłonka trombospondyna-2 hamowanie migracji komórek śródbłonka TIMPs (tkankowe) hamowanie proteolizy błony podstawnej inhibitory metaloproteinaz macierzy PAI-1, PAI-2 hamowanie proteolizy błony podstawnej TGF-β hamowanie migracji i proliferacji komórek śródbłonka TNF-α hamowanie proliferacji komórek śródbłonka wzrost wytwarzania IP-10 i zmniejszenie IFN-α syntezy bfgf, wytwarzania IL-8, GRO ( ang. growth-related oncogene) i ENA-78 IL-1 hamowanie proliferacji komórek śródbłonka i hamowanie syntezy receptorów bfgf IL-10 obniżenie wytwarzania VEGF pochodzenia makrofagowego IL -12 indukcja wytwarzania INF-γ F-4 hamowanie działania VEGF, bfgf, IL-8 PAI-1, PAI-2 (ang. plasminogen activator inhibitor-1) inhibitor aktywatora plazminogenu; TNF-α (ang. Tumor Necrosis Factor) czynnik martwicy guza, czynnik nekrozy nowotworów; IFN-α (ang. Interferon type I) interferony typu I); ENA-78 (ang. epithelial neutrophil activating peptide-78) nabłonkowo-neutrofilowy peptyd aktywujący. ANGIOSTATYNA (ang. angiostatin) jest jednym z najsilniejszych inhibitorów angiogenezy [60,62]. Jest produktem proteolizy plazminogenu, wykazującym swoiste działanie w stosunku do komórek śródbłonka naczyń, w odwracalny sposób hamując proliferację. Angiostatyna aktywując kinazy FAK (ang. focal adhesion kinase), prowadzi do wzbudzenia sygnałów, zaburzających prawidłowe funkcjonowanie połączeń pomiędzy komórkami śródbłonka, indukując tym samym apoptozę. Poprzez wzbudzenie przejściowej defosforylacji w komórkach śródbłonka, angiostatyna zmniejsza wpływ proangiogennych czynników tj. bfgf i VEGF na aktywację kinaz. Badania w układzie in vitro jednoznacznie pokazują, że dodatek do hodowli plazminogenu blokuje tak proliferację jak i rozprzestrzenianie się komórek śródbłonka. Antyangiogenne działanie angiostatyny pozwala mieć nadzieję na możliwość wykorzystania jej w terapii antynowotworowej. Wykazano już, że znacząco podnosi się poziom apoptozy w komórkach nowotworowych, co jest skutkiem, jak się wydaje, zmniejszenia unaczynienia guza [62,65] (Tab. 4). ENDOSTATYNA (ang. endostatin) powstaje w wyniku proteolitycznego odszczepienia NCI, końcowego fragmentu kolagenu XVIII (NCI), lokalizującego się dalej w błonie podstawnej ściany naczyń [63]. Hamuje proliferację komórek śródbłonka i ich migrację stymulowaną przez VEGF. W wyniku działania endostatyny zmniejsza się napływ komórek śródbłonka do nowo tworzonej błony podstawnej oraz dochodzi do indukcji apoptozy. Molekularny mechanizm komórkowego działania endostatyny niestety nie jest jeszcze w pełni poznany [60,63]. Tak jak w poprzednim przypadku jest to czynnik pozytywnie działający w terapii antynowotworowej. REGULACJA ANGIOGENEZY ZASTOSOWANIA KLINICZNE Znaczny postęp w opracowaniu strategii antyangiogennych datuje się na lata 90., kiedy poznano dokładnie mediatory neowaskularyzacji i mechanizm ich działania. Umożliwiło to opracowanie terapii celowanych hamujących powstanie nowych naczyń w zastosowaniu szczególnie w terapii antynowotworowej. Obecnie znanych jest ponad 20 czynników o działaniu antyangiogennym, które przechodzą kolejne fazy badań klinicznych. W grupie leków antyangiogennych znajdują się substancje otrzymane technikami inżynierii molekularnej np. przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko i blokujące działanie czynników proangiogennych, jak również rekombinowane inhibitory krwiotworzenia. Działanie leków (substancji) hamujących proces powstawania naczyń krwionośnych opiera się na dwóch podstawowych mechanizmach: 1) bezpośrednich: - hamowanie proliferacji komórek śródbłonka (taxol, herbimycyna, TNP-470, talidomid) [33], - hamowanie migracji komórek śródbłonka (linomid, genistenina) [17]; 2) pośrednich: - blokowanie cytokin proangiogennych oraz substancji współdziałających, oparte głównie na zastosowaniu skierowanych przeciwko nim specyficznych przeciwciał monoklonalnych (np. bevacizumab-vegf) lub brokerów receptorów komórek śródbłonka (np. sorafenib, sunitinib) [71], 30

7 - hamowanie angiogenezy, poprzez zastosowanie rekombinowanych czynników hamujących takich jak angiostatyna i endostatyny, retinoidy, - hamowanie enzymów proteolitycznych (inhibitory metaloproteinaz np. marimastat, prinomastat) [27]. Jakkolwiek zastosowanie leków antyangiogennych celowane jest głównie na terapię antynowotworową (pierwszy oficjalnie zatwierdzony specyfik tego typu: bewacizumab był wykorzystywany w leczeniu raka jelita) [74], to znajduje ono zastosowanie również w takich przypadkach jak: zwyrodnienie plamki żółtej [72], cukrzycowa ślepota [72,73], reumatoidalne zapalenie stawów, łuszczyca, wszędzie tam, gdzie mamy do czynienia z anomaliami fizjologicznymi w zakresie tworzenia naczyń krwionośnych [3]. Zastosowanie leków/specyfików antyangiogennych w terapii antynowotworowej obejmuje większość guzów i znajduje się na różnych etapach badań klinicznych. Ostatnie doniesienia opisują aktywną fazę III w przypadkach takich jak: rak piersi [76], rak jelita grubego [77], rak przełyku [78], nowotwór podścieliska przewodu pokarmowego (GIST) [79], nowotwór nerek [80], nowotwór wątroby [81], chłoniak [82], czerniak [83], niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) [84], nabłonkowy rak jajnika [85], rak trzustki [86], rak prostaty [87], rak żołądka [88]. Jednym z rozwiązań, w którym nie powinno pojawić się zjawisko oporności, może być indukcja odpowiedzi odpornościowej skierowanej przeciwko białkom swoistym dla komórek śródbłonkowych naczyń nowotworowych. Odpowiedź ta powinna łamać tolerancję immunologiczną wobec własnych antygenów i eliminować komórki śródbłonkowe naczyń nowotworowych przez aktywowane cytotoksyczne limfocyty T. Odpowiedź taką można uzyskać przeciwko endoglinie (CD105) [60-62,64-69]. Endoglina (CD105) (ENG, ang. endoglin) to glikoproteina towarzysząca receptorowi TGF-β, występuje na proliferujących, aktywnych komórkach śródbłonkowych naczyń krwionośnych [64-69]. TGF-β reguluje główne procesy komórkowe, takie jak: proliferacja, migracja, programowana śmierć komórki, adhezja, organizacja cytoszkieletu, przekształcanie macierzy pozakomórkowej i plastyczność fenotypowa. Produkcja endogliny w warunkach fizjologicznych jest niewielka, w stanach patologicznych występuje w formujących się komórkach śródbłonka w obrębie tkanek zmienionych zapalnie, nowotworowo i regenerujących się, przez co odgrywa ważną rolę m.in. w progresji nowotworu oddziałując na procesy angiogenezy, migracji i przerzutowania [67,69] (Ryc. 3). Nowatorskim podejściem w terapii antyangiogennej jest wykorzystanie właściwego układu immunologicznego w blokowaniu angiogenezy. Tworzenie specyficznych szczepionek immunologicznych sprowadza się do produkcji w warunkach in vitro limfocytów T uczulonych na jakieś proangiogenne mediatory i miejscowe ich podanie. Pozytywne efekty uzyskano tutaj w odniesieniu do wspomnianej już endogliny (CD105) [30,64,65,67]. Rycina 3. Poziom endogliny i wpływ na angiogenezę, migrację i przerzutowanie [69]. TERAPEUTYCZNA ANGIOGENEZA W CHOROBACH SERCA Odwrotnymi do opisanych powyżej terapii są te, których efektem ma być wywołanie angiogenezy i poprawienie unaczynienia danego obszaru ciała czy narządu. Dotyczy to takich schorzeń jak choroba niedokrwienna serca, niewydolność krążeniowa, kardiomiopatia czy terapia pozawałowa. Zastosowaną techniką może w takich przypadkach być podanie proangiogennych substancji i czynników wzrostowych, co jest stosowane w klinice dość pospolicie [1-3,8,9,17] lub przeszczepienie namnożonych wcześniej w układzie in vitro komórek, biorących udział w angiogenezie, jak chociażby komórki śródbłonka [89]. Zarówno czynniki jak i wybrane komórki podawane są miejscowo do naczyń wieńcowych. Takie podanie mioblastów, w układzie doświadczalnym, powodowało znaczący wzrost VEGF w miejscu ich podania i znaczące przyspieszenie procesów angiogennych [57]. Bardzo obiecującą i szeroko badaną w ostatnich czasach techniką wspomagania angiogenezy jest przeszczepienie w wybrane miejsce prekursorów komórek śródbłonka (EPC). Komórki te w miejscu docelowym różnicują się w komórki śródbłonkowe znacząco przyspieszając proces tworzenia naczyń. Obiecujące efekty otrzymano przy zastosowaniu tej metody w eliminacji skutków zawału serca w zwierzęcym modelu doświadczalnym [90]. KOMÓRKI MACIERZYSTE W TERAPII UKŁADU WIEŃCOWEGO Użycie komórek macierzystych w przypadkach konieczności regeneracji tkanek czy narządów pomału zaczyna być rutyną i staje się metodą z wyboru. Podanie ich dożylne w przypadkach chorób niedokrwiennych serca [91,92] powoduje znaczące przyspieszenie regeneracji funkcji serca, jednak wydajność takiej ich aplikacji nie jest satysfakcjonująca. Stąd sposób aplikacji komórek w uszkodzone miejsca jawi się obecnie kluczowym problemem w tej metodzie terapii. Obiecujące wydaje się tutaj rozwiązanie zaproponowane przez Liao i wsp. [91]. Technika zwana UTMD (ang. ultrasound targeted microbubble destruction) polega na podaniu do krążenia lipidowych pęcherzyków, wewnątrz których zamknięte mogą być bioaktywne substancje, jak i komór- Postępy Biochemii 61 (1)

8 Rycina 4. Mechanizm działania techniki UTMD (ang. Ultrasound Targeted Microbubble Destruction) [91]. ki. Przy pomocy USG droga tych pęcherzyków może być śledzona i po dotarciu do miejsca przeznaczenia, pęcherzyk taki jest degradowany impulsem ultradźwiękowym, a zawartość uwalniana do środowiska. Jakkolwiek technika UTMD dedykowana była dystrybucji na terenie organizmu czynników wzrostowych, wektorów czy genów, to w ostatnim roku wiele doświadczalnych modeli wykazuje jej skuteczność w dystrybucji komórek krwiotwórczych ze szpiku, komórek mezenchymalnych ze szpiku czy z tkanki tłuszczowej, czy komórek EPC [93-95,98,99] w takich schorzeniach jak zawał serca, choroba niedokrwienna mięśnia sercowego czy przewlekłe niedokrwienie kończyn (Ryc. 4) [91]. PODSUMOWANIE Komórki śródbłonka odgrywają podstawową rolę w migracji i tworzeniu się sieci naczyń, a czynniki angiogenne zostają aktywowane poprzez ściśle regulowane procesy kontrolujące stan komórki. Szeroko rozwinięte badania nad wykorzystaniem tych czynników podczas leczenia chorych, mogą wspomóc założenia, że proces angiogenezy, w zależności od zastosowanych czynników może być regulowany na wielu poziomach. Jakkolwiek badania prowadzone nad terapiami angiogennymi są nadal w fazach klinicznych lub nawet na poziomie badań podstawowych. Obiecujące wydaje się połączenie klasycznych koncepcji komórkowego wspomagania procesu angiogenezy w połączeniu z innowacyjnymi technikami ich podania. Jakkolwiek proces tworzenia nowych naczyń krwionośnych jest poznany w dość dużym zakresie to pełne jego wykorzystanie w klinice wymaga długich i zaawansowanych na szeroką skalę badań. PIŚMIENNICTWO 1. Kinja K, Rohit S, Mandloi A, Sharma I, Savita S (2011) Anti-angiogenic therapy - past, present and future. Rec Res Sci Tech 3: King A, Balaji S, Keswani SG, Crombleholme TM (2014) The Role of Stem Cells in Wound Angiogenesis. Adv Wound Care (New Rochelle) 3: Shojaei F (2012) Anti-angiogenesis therapy in cancer: Current challenges and future perspectives. Cancer Lett 320: Tomczyk M, Nowak W, Jaźwa A (2013) Śródbłonek w fizjologii i patogenezie chorób. Postepy Biochem 59: Lee PS, Poh KK (2014) Endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases. World J Stem Cells 6: Shahneh FZ, Baradaran B, Zamani F, Aghebati-Maleki L (2013) Tumor angiogenesis and anti-angiogenic therapies. Hum Antibodies 22: De Bock K, Georgiadou M, Carmeliet P (2013) Role of endothelial cell metabolism in vessel sprouting. Cell Metab 18: Skóra J, Biegus J, Pupka A, Pupka A, Barć P, Sikora J, Szyber P (2006) Molekularne podstawy angiogenezy. Postepy Hig Med Dosw (online) 60: Zielonka TM (2003) Angiogeneza - część I. Mechanizm powstawania nowych naczyń krwionośnych. Alergia Astma Immunologia 8: Xu WH (2014) Large artery: an important target for cerebral small vessel diseases. Ann Transl Med 2: Tian XL, Li Y (2014) Endothelial Cell Senescence and Age-Related Vascular Diseases. J Genet Genomics 41: Moss A (2013) The angiopoietin:tie 2 interaction: a potential target for future therapies in human vascular disease. Cytokine Growth Factor Rev 24: Benton G, Arnaoutova I, George J Kleinman HK, Koblinski J (2014) Matrigel: From discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev 79-80C: Bai Y, Zhao M, Zhang C, Li S, Qi Y, Wang B, Huang L, Li X (2014) Antiangiogenic effects of a mutant endostatin: a new prospect for treating retinal and choroidal neovascularization. PLoS One 9: e Harper J, Moses MA (2006) Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS 96: Cao Y (2014) VEGF-targeted cancer therapeutics-paradoxical effects in endocrine organs. Nat Rev Endocrinol 10: Eichholz A, Merchant S, Gaya A (2010) Anti-angiogenesis therapies: their potential in cancer management. OncoTargets Therapy 3: Ausprunk DH, Folkman J (1977) Migration and proliferation of endothelial cells in preformed and newly formed blood vessels during tumor angiogenesis. Microvasc Res 14: Pan Q, Wang M (2011) Predictive biomarkers for bevacizumab in antitumor therapy. Zhongguo Fei Ai Za Zhi 14: Poulsen HS, Urup T, Michaelsen SR, Staberg M, Villingshøj M, Lassen U (2014) The impact of bevacizumab treatment on survival and quality of life in newly diagnosed glioblastoma patients. Cancer Manag Res 6: Dong R, Yang GD, Luo NA, Qu YQ (2014) HuR: a promising therapeutic target for angiogenesis. Qu YQ Gland Surg 3: Choi KS, Bae MK, Jeong J, Moon HE, Kim KW (2003) Hypoxia-induced angiogenesis during carcinogenesis. J Biochem Mol Biol 36: Bamias A, Kyriakou F, Chorti M (2008) Microvessel density (MVD) and cyclooxygenase-2 (COX-2)/ beta-catenin interaction are associated with relapse in patients with transitional carcinoma receiving adjuvant chemotherapy with paclitaxel/carboplatin: a hellenic cooperative oncology group (HECOG) study. Anticancer Res 28: Kuiper P, Hawinkels LJAC, de Jonge-Muller ESM, Biemond I, Lamers CB, Verspaget HW (2011) Angiogenic markers endoglin and vascular endothelial growth factor in gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. World J Gastroenterol 17: Funakoshi T, Lee CH, Hsieh JJ (2014) A systematic review of predictive and prognostic biomarkers for VEGF-targeted therapy in renal cell carcinoma. Cancer Treat Rev 40: Eriksson U, Alitalo K (2002) VEGF receptor 1 stimulates stem-cell recruitment and new hope for angiogenesis therapies. Nature Medicine 8: Keerl S, Gehmert S, Gehmert S, Song YH, Alt E (2010) PDGF and bfgf modulate tube formation in adipose tissue-derived stem cells. Ann Plas Sur 64: Katoh M, Nakagama H (2014) FGF receptors: cancer biology and therapeutics. Med Res Rev 34:

9 29. Dmoszyńska A (2009) Angiogeneza i leczenie antyangiogenne w szpiczaku mnogim. Onkologia w Praktyce Klinicznej, tom 5, supl. A, A56 A Brem H, Folkman J (1975) Inhibition of tumor angiogenesis mediated by cartilage. J Exp Med 141: Eleutherakis-Papaiakovou V, Karali M, Kokkonouzis I, Tiliakos I, Dimopoulos MA (2003) Bone marrow angiogenesis and progression in multiple myeloma:clinical significance and therapeutic approach. Leukemia Lymphoma 44: De Falco S (2012) The discovery of placenta growth factor and its biological activity. Exp Mol Med 44: Losordo DW, Isner JM, Diaz-Sandoval LJ (2003) Endothelial recovery. The next target in restenosis prevention. Circulation 107: Hanahan D, Folkman J (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 86: Döme B, Hendrix MJC, Paku S, Tóvári J, Tímár J (2007) Alternative Vascularization Mechanisms in Cancer: Pathology and Therapeutic Implications. Am J Pathol 170: Amat D, Becerra J, Medina MA, Quesada AR, Marí-Beffa M (2012) Stem cell therapies embryology - updates and highlights on classic topics stem cell therapies, chapter 8, ISBN Kerbel RS (2000) Tumor angiogenesis: past, present and the nearest future. Carcinogenesis 21: Prigent A, Chaumet-Riffaud P (2014) Clinical problems in renovascular disease and the role of nuclear medicine. Semin Nucl Med 44: Hawighorst T, Skobe M, Streit M, Hong YK, Velasco P, Brown LF, Riccardi L, Lange-Asschenfeldt B, Detmar M (2002) Activation of the tie2 receptor by angiopoietin-1 enhances tumor vessel maturation and impairs squamous cell carcinoma growth. Am J Pathol 160: Gong Y, Koh DR (2010) Neutrophils promote inflammatory angiogenesis via release of preformed VEGF in an in vivo corneal model. Cell Tissue Res 339: Wójcik E, Jakubowicz J, Skotnicki P, Sas-Korczyńska B, Kulpa JK (2010) IL-6 and VEGF in small cell lung cancer patients. Anticancer Res 30: Szala S (2009) Angiogeneza i immunosupresja: jin i jang progresji nowotworów? Postepy Hig Med Dosw 63: Adams J, Carder PJ, Downey S, Forbes MA, MacLennan K, Allgar V, Kaufman S, Hallam S, Bicknell R, Walker JJ, Cairnduff F, Selby PJ, Perren TJ, Lansdown M, Banks RE (2000) Vascular endothelial growth factor (VEGF) in breast cancer: comparison of plasma, serum, and tissue VEGF and microvessel density and effects of Tamoxifen. Cancer Res 60: Wang X, Chen X, Fang J, Yang C (2013) Overexpression of both VEGF- A and VEGF-C in gastric cancer correlates with prognosis, and silencing of both is effective to inhibit cancer growth. Int J Clin Exp Pathol 6: Schrijvers BF, Flyvbjerg A, De Vriese AS (2004) The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney Int 65: Yang Y, Zhang X, Song D, Wei J (2014) Association between vascular endothelial growth factor gene polymorphisms and bladder cancer risk. J Mol Clin Oncol 2: Shimizu T, Hoshino Y, Miyazaki H, Sato E (2012) Angiogenesis and microvasculature in the female reproductive organs: physiological and pathological implications. Curr Pharm Des 18: Kumar S, Arbab AS (2013) Neovascularization in Glioblastoma: Current Pitfall in Anti-angiogenic therapy. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi 1: Yamakawa M, Liu LX, Date T, Belanger AJ, Vincent KA, Akita GY, Kuriyama T, Cheng SH, Gregory RJ, Jiang C (2003) Hypoxia-inducible factor-1 mediates activation of cultured vascular endothelial cells by inducing multiple angiogenic factors. Circ Res 93: Harfouche R, Hussain SN (2006) Signaling and regulation of endothelial cell survival by angiopoietin-2. Am J Physiol Heart Circ Physiol 291: H Stuart J (2005) Cyclo-Oxygenase-2 Inhibitors Beneficial or Detrimental for Athletes with AcuteMusculoskeletal Injuries? Warden Sports Med 35: Yeo NH, Woo J, Shin KO, Park JY, Kang S (2012) The effects of different exercise intensity on myokine and angiogenesis factors. J Sports Med Phys Fitness 52: Fiedler U, Krissl T, Koidl S, Weiss C, Koblizek T, Deutsch U, Martiny- Baron G, Marmé D, Augustin HG (2003) Angiopoietin-1 and angiopoietin-2 share the same binding domains in the Tie-2 receptor involving the first Ig-like loop and the epidermal growth factor-like repeats. J Biol Chem 278: Oliner J, Min H, Leal J Yu D, Rao S, You E, Tang X, Kim H, Meyer S, Han SJ, Hawkins N, Rosenfeld R, Davy E, Graham K, Jacobsen F, Stevenson S, Ho J, Chen Q, Hartmann T, Michaels M, Kelley M, Li L, Sitney K, Martin F, Sun JR, Zhang N, Lu J, Estrada J, Kumar R, Coxon A, Kaufman S, Pretorius J, Scully S, Cattley R, Payton M, Coats S, Nguyen L, Desilva B, Ndifor A, Hayward I, Radinsky R, Boone T, Kendall R (2004) Supression of angiogenesis and tumor growth by selective inhibition of angiopoietin-2. Cancer Cell 6: Cao Y, Sonveaux P, Liu S, Zhao Y, Mi J, Clary BM, Li CY, Kontos CD, Dewhirst MW (2007) Systemic overexpression of angiopoietin-2 promotes tumor microvessel regression and inhibits angiogenesis and tumor growth. Cancer Res 67: Conde-Agudelo A, Papageorghiou AT, Kennedy SH, Villar J (2013) Novel biomarkers for predicting intrauterine growth restriction: a systematic review and meta-analysis. BJOG 120: Moon WS, Rhyu KH, Kang, Lee DG, Yu HC, Yeum JH, Koh GY, Tarnawski AS (2003) Overexpression of VEGF and angiopoietin 2: a key to high vascularity of hepatocellular carcinoma? Mod Pathol 16: Koga K, Todaka T, Morioka M, Hamada J, Kai Y, Yano S, Okamura A, Takakura N, Suda T, Ushio Y (2001) Expression of angiopoietin-2 in human glioma cells and its role for angiogenesis. Cancer Res 61: Reiss Y, Machein MR, Plate KH (2005) The role of angiogenesis during angiogenesis in gliomas. Brain Pathol 15: Zielonka TM (2004) Angiogeneza - część II. Czynniki modulujące proces powstawania nowych naczyń krwionośnych. Alergia Astma Immunologia 9: Pérez-Gómez E, Del Castillo G, Juan Francisco S, Lopez-Novoa JM (2010) The role of the TGF-β coreceptor endoglin in cancer. Sci World J 10: Wietecha MS, Cerny WL, DiPietro LA (2013) Mechanisms of vessel regression: toward an understanding of the resolution of angiogenesis. Curr Top Microbiol Immunol 367: Yamaguchi Y, Feghali-Bostwick CA (2013) Role of endostatin in fibroproliferative disorders.-as a candidate for anti-fibrosis therapy. Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 36: Bernabeu C, Lopez-Novoa JM, Quintanilla M (2009) The emerging role of Tgf-β superfamily co-receptors in cancer. Biochim Biophys Acta 1792: O Reilly MS, Holmgren L, Shing Y, Chen C, Rosenthal RA, Moses M, Lane WS, Cao Y, Sage EH, Folkman J (1994) Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma. Cell 79: Hawinkels LJ, Kuiper P, Wiercinska, Verspaget HW, Liu Z, Pardali E, Sier CF, ten Dijke P (2010) Matrix metalloproteinase-14 (MT1-MMP)- mediated endoglin shedding inhibits tumor angiogenesis. Cancer Res 70: Romero D, O Neill C, Terzic A, Contois L, Young K, Conley BA, Bergan RC, Brooks PC, Vary CP (2011) Endoglin regulates cancer-stromal cell interactions in prostate tumors. Cancer Res 71: Pardali E, van der Schaft DW, Wiercinska E, Gorter A, Hogendoorn PC, Griffioen AW, ten Dijke P (2010) Critical role of endo- glin in tumor cell plasticity of Ewing sarcoma and melanoma. Oncogene 30: Jarosz M, Szala S (2013) Endoglina jako cel terapii przeciwnowotworowej. Postepy Hig Med Dosw 67: Postępy Biochemii 61 (1)

10 70. Vosooghi M, Amini M (2014) The discovery and development of cyclooxygenase-2 inhibitors as potential anticancer therapies. Expert Opin Drug Discov 9: Gotink KJ, Verheul HM (2010) Anti-angiogenic tyrosine kinase inhibitors: what is their mechanism of action? Angiogenesis 13: Ng EW, Adamis AP (2005) Targeting angiogenesis, the underlying disorder in neovascular age-related macular degeneration. Can J Ophthalmol 40: Małecki M, Jastrzębski Z, Przybyszewska M, Proczka R, Janik P (2004) Antiangiogenic Gene Therapy Applications of Soluble FLT-1 Receptor. Adv Clin Exp Med 2: Khoo CP, Micklem K, Watt SM (2011) A comparison of methods for quantifying angiogenesis in the Matrigel assay in vitro. Tissue Eng Part C Methods 17: Siemann DW (2011) The unique characteristics of tumor vasculature and preclinical evidence for its selective disruption by tumor-vascular disrupting agents. Cancer Treatment Rev 37: id= id= id= id= id= id= id= id= id= id= hid= id= id= Reiner Ž, Catapano AL, Backer De G (2011) The Task Force for the Management of Dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Atherosclerosis Society (EAS). Eur Heart J 32: Kawamoto A, Gwon HC, Iwaguro H, Yamaguchi JI, Uchida S, Masuda H, Silver M, Ma H, Kearney M, Isner JM, Asahara T (2001) Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia. Circulation 103: Liao Y-Y Chen Z-Y, Wang YX, Lin Y, Yang F, Zhou QL (2014) New Progress in Angiogenesis Therapy of Cardiovascular Disease by Ultrasound Targeted Microbubble Destruction. Biomed Res Int 2014: Imada T, Tatsumi T, Mori T, Nishiue T, Yoshida M, Masaki H, Okigaki M, Kojima H, Nozawa Y, Nishiwaki Y, Nitta N, Iwasaka T, Matsubara H (2005) Targeted delivery of bone marrow mononuclear cells by ultrasound destruction of microbubbles induces both angiogenesis and arteriogenesis response. Arterioscler Thromb Vasc Biol 25: Otani K, Yamahara K, Ohnishi S, Obata H, Kitamura S, Nagaya N (2009) Nonviral delivery of sirna into mesenchymal stem cells by a combination of ultrasound and microbubbles. J Control Release 133: Xu Y-L, Gao Y-H, Liu Z, Tan KB, Hua X, Fang ZQ, Wang YL, Wang YJ, Xia HM, Zhuo ZX (2010) Myocardium-targeted transplantation of mesenchymal stem cells by diagnostic ultrasound-mediated microbubble destruction improves cardiac function in myocardial infarction of New Zealand rabbits. Int J Cardiol 138: Ucuzian AA, Greisler HP (2007) In vitro models of angiogenesis. World J Surg 31: Ling ZHI Yu, Shu SY, Zhongetal SG (2013) Ultrasoundtargeted microbubble destruction promotes angiogenesis and heart function by inducing myocardial microenvironment change. Ultrasound Med Biol 39: Song X, Zhu H, Jin L, Zhang CM, Liu L, Pan SH, Wu CJ (2009) Ultrasound-mediated microbubble destruction enhances the efficacy of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation and cardiac function. Clin Exp Pharmacol Physiol 36: Kuliszewski MA, Kobulnik J, Lindner JR, Stewart DJ, Leong-Poi H (2011) Vascular gene transfer of SDF-1 promotes endothelial progenitor cell engraftment and enhances angiogenesis in ischemic muscle. Molec Ther 19: Zhong S, Shu S, Wang W, Luo J, Zhong W, Ran H, Zheng Y, Yin Y, Ling Z (2012) Enhanced homing of mesenchymal stem cells to the ischemic myocardium by ultrasound-targeted microbubble destruction. Ultrasonics 52: Angiogenesis - possibilities, problems and perspectives Agata Kurzyk M. Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center and Insitute of Oncology, Department of Molecular and Translational Oncology, Laboratory of Cell Engineering, 5 Roentgena St., Warsaw, Poland akurzyk@coi.pl Key words: angiogenesis, endothelium, pro-angiogenic factor, antiangiogenic factor, antiangiogenic therapy, cancer, stem cells ABSTRACT Angiogenesis is the formation of new blood vessels from existing vessels. This process occurs via budding endothelial cells in postnatal period, which is essential to many physiological phenomena (e.g. wound healing, formation of the placenta) and pathological ones such as cancer, ischemic diseases, and chronic inflammation. Various mechanisms of the formation of new blood vessels have been discovered and a number of pro-angiogenic and anti-angiogenic factors have been found. Understanding the function of these factors contributes to the creation of new tools and applications in the treatment of pathological processes. Article describes the regulation of angiogenesis and is a review of the most significant angiogenic factors and their inhibitors. It shows the selected mechanisms which underlie the action of currently used anti-angiogenic drugs and is a review of research which use these factors in anti-angiogenic therapy. 34